abchfabchfABC Heart Fail CardiomyopABC Heart Fail Cardiomyop2764-3107Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC10.36660/abchf.20230077abchf.20230077Original ArticleEvaluation the In Vitro Action of Ciprofloxacin Hydrochloride, Naproxen, and Folic Acid on Trypanosoma cruzi, using Benznidazole as a Gold Standard0000-0002-4056-3380FacciniCristiane CastroConception and design of the researchAcquisition of dataAnalysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for contentWriting of the manuscript10000-0002-8609-0347LourençoAngela MariaConception and design of the researchAcquisition of dataAnalysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for content10000-0002-9322-3662FragataAbilio AugustoFilhoConception and design of the researchAcquisition of dataAnalysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for contentStatistical analysis1Instituto Dante Pazzanese de CardiologiaLaboratório de Doença de Chagas Elias BoainainSão PauloSPBrazilInstituto Dante Pazzanese de Cardiologia – Laboratório de Doença de Chagas Elias Boainain, São Paulo, SP – BrazilMailing Address: Cristiane Castro Faccini • Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia – Laboratório de Doença de Chagas – Av. Dr. Dante Pazzanese, 500. Postal Code 04012-909, Prédio 1, São Paulo, SP – Brazil E-mail: cristiane.faccini@dantepazzanese.org.br
Potential conflict of interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
31122023202334e20230077091020232802202406032024This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution LicenseAbstractBackground:
Benznidazole is the only drug against Trypanosoma cruzi (T. cruzi) available in Brazil. However, it has limited efficacy and frequent side effects. Recent studies suggest that ciprofloxacin hydrochloride, naproxen, and folic acid may have beneficial effects in treating the Chagas disease.
Objective:
To assess the in vitro parasiticidal action of ciprofloxacin, naproxen, and folic acid on the Y strain of T. cruzi, using benznidazole as a gold standard.
Methods:
Tablets of benznidazole, ciprofloxacin hydrochloride, naproxen, and folic acid were macerated, weighed, and added to test tubes with a culture medium containing 100,000 forms per ml of T. cruzi trypomastigotes (strain Y). Samples from each tube were analyzed and counted in a Neubauer hemocytometer under an optical microscope for four days after adding the drugs. Thus, the minimum effective dose of each drug was determined.
Results:
As compared with benznidazole, higher concentrations of ciprofloxacin and naproxen were effective as in vitro parasiticides. In contrast, folic acid showed no direct in vitro parasiticidal action. Hence, previous observations reporting its effectiveness are probably due to indirect action.
Conclusion:
In our experiment, ciprofloxacin and naproxen showed a trypanosomicidal effect in vitro, but folic acid did not show this effect.
Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, was discovered and described by Carlos Chagas in 1909. The disease is caused by Trypanosoma cruzi, a unicellular flagellate parasite. Data from the World Health Organization estimate that there are about six to seven million contaminated people and a population of 70 million at risk of being infected.1
The disease transmission may be vectorial, by transfusion of blood and blood derivatives, organ transplantation, transplacental, and oral routes, among other mechanisms. Nowadays, the oral transmission related to the intake of açaí juice is the most critical of these mechanisms in Brazil, predominantly in the country's northern region.2
Chagas disease has two phases: acute and chronic. The acute phase follows infection and, usually, is not very expressive from a clinical point of view, with high parasitemia and inflammation. This phase lasts about eight to 10 weeks and after that, parasitemia and inflammation decrease substantially. The chronic phase begins at this point, lasting a variable period that can extend over a lifetime, with positive serology only and no clinical manifestations (indeterminate form). About 30 to 50% of the patients develop clinical signs 10 or 20 years after the infection, showing cardiac, digestive, or mixed manifestations, with increased morbidity and mortality.3
There are two drugs with parasiticidal effects on T. cruzi that have been used for more than 40 years: nifurtimox and benznidazole. However, these drugs have shown low efficacy when administered in the disease's chronic (late) phase.4 Other pharmacological agents have been tested, for instance, amiodarone. This agent showed an effective in vitro parasiticidal action against the trypomastigotes of T. cruzi, requiring in vivo evaluations.5
Other tested compounds are ciprofloxacin, naproxen, and folic acid. Ciprofloxacin, a broad-spectrum antibiotic belonging to the quinolone group, has been tested as parasiticidal because it inhibits the trans-sialidase enzyme, which is vital for T. cruzi.6,7 On the other hand, naproxen is an anti-inflammatory, antipyretic, and analgesic drug derived from propionic acid. This drug inhibits the isoforms I and II of the cyclooxygenase, related to the synthesis of prostaglandin, prostacyclin, and thromboxane from arachidonic acid. Naproxen has also been tested against Trypanosoma due to its inhibiting action on the synthesis of the farnesyl pyrophosphate enzyme, leading to cellular alterations in the parasite.8,9 Folic acid is a manufactured form of folate used as a dietary supplement since it is not produced in the human body. The deficiency of folic acid is related to several diseases, such as cancer, Alzheimer's, and megaloblastic anemia. Although the in vivo action of this compound against T. cruzi has been demonstrated, its mechanism of action remains unclear, with uncertainties about whether the anti-parasitic effect of folic acid is direct or by stimulating the immune system.10
Adasme et al.11 showed the parasiticidal action of ciprofloxacin, naproxen, and folic acid on the Mexican strains NINOA and INC-5 of T. cruzi using a murine model. Given the need for new drugs to treat Chagas disease, these encouraging data require further studies to confirm the results, since they have been below expected levels.11,12 Therefore, our study aims to assess the in vitro parasiticidal action of ciprofloxacin, naproxen, and folic acid on the Y strain of T. cruzi.
MethodParasites
The trypomastigotes of T.cruzi (strain Y) used in this study were derived from in vivo culture maintained in the laboratory by successive passages in mice of the A/Snell strains, each weighing 23g on average. This parasite culture is part of the routine of the Chagas Disease Laboratory of the Dante Pazzanese Institute of Cardiology. We used the red blood cell concentrate of blood samples collected from these mice on the seventh day after infection, which corresponds to the peak of parasitemia; this material is routinely discarded. This was an entirely sterile procedure performed in a laminar flow cabinet, and all instruments used had been sterilized in an autoclave, following the laboratory's standard operating procedures.
In vitro proliferation
The trypomastigote forms of the parasite were cultured in three test tubes containing 5 mL of liver infusion tryptose (LIT) medium supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum.13 Each tube received 1 mL of the infected red blood cell concentrate and was placed in a germination chamber at 28°C. After 10 days, fresh preparations were mounted using slides and 22x22mm coverslips and examined under an optical microscope following the blood culture method of Chiari et al. 1989.14 In a laminar flow cabinet, 1 mL of culture was collected on each of the 10 days and transferred to tubes containing 5 mL of LIT medium. These tubes were kept in the germination chamber at 28°C for four days. The material was then mounted between slides and coverslips and examined as previously described. The parasites in the samples were counted using a Neubauer hemocytometer to determine growth, and the tubes that contained 100,000 forms per mL were sorted to test the parasiticidal activity of the evaluated compounds.15 For the experiment on drug effects, benznidazole was used as a gold standard for ciprofloxacin hydrochloride, naproxen, and folic acid.
Tablets of each drug were individually macerated, weighed on a precision scale, and homogenized with 1 mL of LIT medium. Subsequently, the test tubes containing 5 mL of the solution with the parasites received the tested compounds at three concentrations (10, 20, and 100 mg) — except for folic acid (one dose of 5 mg) (Table 1).
Experimental design for testing different drug doses on culture of Trypanosoma cruzi trypomastigote (5mL-tubes)
Drugs tested
Treatment 1
Treatment 2
Treatment 3
Benznidazole
100mg
20mg
10mg
Ciprofloxacin hydrochloride
100mg
20mg
10mg
Naproxen
100mg
20mg
10mg
Folic acid
5mg
The choice of doses was based on commercial presentations whose use has already been widely evaluated.
After completing the experiments, the minimum effective dose of each drug added to the culture was determined. This procedure was performed twice for each dose of the medication. Two control tubes without the addition of medication were used for comparison in all procedures. At the end of the fourth day of exposure to the tested drugs, the material of each tube was analyzed and counted in a Neubauer hemocytometer under an optical microscope.
Results
Table 2 shows the weight of each drug added to each test tube and the drug's final concentration in the 6mL solution (culture medium with parasites and drug). It also describes the absolute number of parasites in each tube on the first, second, third, and fourth days of treatment and the percentage of parasites in each vial on the fourth day in relation to the first day. These data represent the average values after two experiments with each tested compound and control (Central Illustration).
Absolute number of parasites per treatment in each tube on the first, second, third, and fourth days of treatment and the percentage of parasites in each vial on the fourth day
Control
Folic acid
Cipro. Hydrochloride
Cipro. Hydrochloride
Cipro. Hydrochloride
Naproxen
Naproxen
Naproxen
Naproxen
BenZ
BenZ
BenZ
BenZ
5mg
100mg
20mg
10mg
100mg
50 mg
20mg
10mg
100mg
50 mg
20mg
10mg
1st day
188.5
200
66
125
189
46.5
34
85.5
288
164
56.5
180
298.5
2nd day
282.5
610
23.5
100
120
107
29
77
417.5
125
7
134.5
189
3rd day
335
611
10.5
56.5
40.5
0
12
81
157
11.5
3.5
32
51.5
4th day
410
632
6
36
44
0
7.5
60
103
0
0.5
2
4.5
Percentage of parasites remaining on the 4th day
217.50%
316
9.09%
28.80%
23:28
0%
22.05%
70.17%
35.76%
0%
0.88%
1.11%
1.50%
Concentration per tube in mg/ml
0.83
16.66
3.33
1.66
16.66
8.33
3.33
1.66
16.66
8.33
3.33
1.66
6 ml of total volume in each culture tube – two experiments per sample. Cipro: ciprofloxacin; BenZ: benznidazole.
Control Group
The number of parasites in the control group increased by 217.5% on the fourth day of treatment.
Folic acid
There was an increase of 316% of parasites on the fourth day of treatment with folic acid at 0.83mg/mL, a result similar to that in the control group (Figure 1).
Variation in Trypanosoma cruzi in vitro culture cell count after treatment with 5mg folic acid.
Ciprofloxacin
Treatment with 100mg of ciprofloxacin (16.66mg/mL) decreased the number of parasites to 9.09% on the fourth day. Despite less pronounced than the treatment with 100mg, the decreased concentration was still evident when applying 20mg (3.33mg/mL) and 10mg (1.66mg/mL) of ciprofloxacin, with 28.8% and 23.3% remaining parasites in relation to the first day, respectively (Figure 2).
Variation in Trypanosoma cruzi in vitro culture cell count after treatment with 10mg, 20mg and 100mg ciprofloxacin hydrochloride, along with control culture counts.
Naproxen
The culture was negative for parasites with 100mg of naproxen (16.66mg/mL) on the fourth day of treatment. Although less significant than treatment with 100mg, the concentrations of parasites also decreased for the remaining treatments, as follows: 22.05% with 50mg (8.33mg/ml); 70.17% with 20mg (3.33mg/ml); 35.76% with 10mg (1.66mg/ml) (Figure 3).
Variation in Trypanosoma cruzi in vitro culture cell count after treatment with 10mg, 20mg, 50mg and 100mg naproxen, along with control culture counts.
Benznidazole
This drug represented the parasiticidal gold standard in the present study, as it resulted in negative culture for parasites with the treatment of 100mg (16.66mg/mL). In addition, the number of parasites decreased to 0.88% with 50mg (8.33mg/ml), 1.11% with 20mg (3.33mg/ml), and 1.5% with 10mg (1.66mg/ml) treatments (Figure 4).
Variation in Trypanosoma cruzi in vitro culture cell count after treatment with 10mg, 20mg, 50mg and 100mg benznidazole, along with control culture counts.
Discussion
The only drugs with proven parasiticidal action currently used to treat Chagas disease are benznidazole and nifurtimox, although both have non-negligible side effects. Although their efficacy is recognized in the acute phase of the disease in children, their effects in the late chronic phase remain debatable.
The search for new compounds that can act on T. cruzi has led researchers to study compounds with potential action on parasite metabolism and its consequent destruction. Moreover, the in vitro parasiticidal activity of amiodarone has been recently shown to be similar to that of benznidazole.16 All these studies have investigated the parasiticidal effects of drugs regularly used in various clinical situations based on their pharmacological properties. Thus, three drugs attracted attention — ciprofloxacin, folic acid, and naproxen17 — and hence we developed the present in vitro study based on these findings.
Ciprofloxacin is a broad-spectrum synthetic antibiotic of the fluoroquinolone class; it has potential parasiticidal action by inhibiting trans-sialidase.18 We showed an important parasiticidal action of ciprofloxacin at 16.66mg/mL (treatment with 100mg). Only 9.09% of the parasites remained alive at this concentration on the fourth day of culture growth. When using 20mg (3.33 mg/mL) and 10mg (1.66 mg/mL) of this antibiotic, parasite reduction in the culture was less pronounced though still important, with 28.8% and 23.3% of surviving parasites, respectively. These in vitro results are encouraging since ciprofloxacin has been used for a long time against several infectious conditions, with a well-known and safe handling.
Naproxen is a propionic acid derivative with analgesic, antipyretic, and anti-inflammatory properties, classified as a non-hormonal anti-inflammatory compound. Its action is based on the inhibition of cyclooxygenase (Cox I and II), which interferes with the synthesis of prostaglandins, prostacyclins, and thromboxane, from arachidonic acid.19
Naproxen at 100mg in vitro (16.66 mg/mL) eliminated the parasites from the culture. However, this action was much less expressive at 50mg (8.33 mg/mL), 20mg (3.33 mg/ml), and 10mg (1.66 mg/ml), resulting in concentrations of parasites of 22.05%, 70.17%, and 35.76%, respectively. Naproxen has been used in clinical practice for many years, with well-established mechanism of actions and contraindications.
Folic acid has been used as a dietary supplement for a long time, especially in patients with various types of anemia. Folate deficiency is related to several diseases, such as certain types of cancer, Alzheimer's disease, hypertension, and some maternal-fetal complications.17 It is also known that cellular immunity is significantly compromised in folate deficiency.20
In the present study, folic acid did not inhibit parasitic growth at 5 mg (0.83 mg/ml), resulting in an increase of 316% in the T. cruzi in culture in relation to the initial number of parasites.
Benznidazole was used as a gold standard due to its indisputable parasiticidal action, as observed for the doses of 100mg (16.6 mg/mL; 0%), 50mg (8.3 mg/mL; 0.88%), 20mg (3.3 mg/mL; 1.11%) and 10mg (1.7 mg/mL; 1.5%).
Ciprofloxacin and naproxen were also effective in vitro as parasiticides at higher concentrations compared to this gold standard. In contrast, folic acid showed no direct in vitro parasiticidal action. Thus, previous observations about its effectiveness are probably due to indirect action by improving the immune profile.17,20 Further studies are needed to confirm this hypothesis.
Conclusion
The use of ciprofloxacin hydrochloride, naproxen, and folic acid is well established and safely controlled. Therefore, in vivo studies, including human tests, are needed to determine whether the parasiticidal effect of these drugs on the parasite's life cycle is direct or indirect. This could bring new perspectives to the treatment of Chagas disease.
In our experiment, ciprofloxacin and naproxen showed a trypanosomicidal effect in vitro, but folic acid did not show this effect.
Limitations of the study
Our study examined the ability of these drugs to eliminate or to prevent the proliferation of the T. cruzi Y strain and in an in vitro culture medium only.
Sources of funding
There were no external funding sources for this study.
Study association
This study is not associated with any thesis or dissertation work.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee of the Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia under the protocol number 026/2022. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.
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Dr. Dante Pazzanese, 500. CEP 04012-909, Prédio 1, São Paulo, SP – Brasil E-mail: cristiane.faccini@dantepazzanese.org.br
Potencial conflito de interesse
Não há conflito com o presente artigo.
ResumoFundamento:
O benzonidazol é a única droga contra o Trypanosoma cruzi (T. cruzi) disponível no Brasil. No entanto, ele tem eficácia limitada e efeitos colaterais frequentes. Estudos recentes sugerem que o cloridrato de ciprofloxacino, o naproxeno, e o ácido fólico possam ter efeitos benéficos no tratamento da doença de Chagas.
Objetivo:
Avaliar a ação parasiticida in vitro do ciprofloxacino, do naproxeno, e do ácido fólico na cepa Y do T. cruzi, usando o benzonidazol como padrão-ouro.
Métodos:
Comprimidos de benzonidazol, ciprofloxacino, naproxeno, e ácido fólico foram macerados, pesados, e adicionados a tubos de ensaio com um meio de cultura contendo 100 000 formas por mL e tripomastigotas de T. cruzi (cepa Y). Amostras de cada tubo foram analisadas e contadas com um hemocitômetro em um microscópio ótico por quatro dias após a adição da droga. Assim, a dose mínima efetiva de cada droga foi determinada.
Resultados:
Em comparação ao benzonidazol, concentrações mais altas de ciprofloxacino e de naproxeno foram efetivas como parasiticidas in vitro. Por outro lado, o ácido fólico não apresentou ação parasiticida in vitro. Assim, as observações prévias de sua efetividade provavelmente relacionam-se à sua ação indireta.
Conclusão:
Em nosso experimento, a ciprofloxacina e o naproxeno apresentaram efeito tripanosomicida in vitro, mas o ácido fólico não apresentou esse efeito.
Palavras-chave:Trypanosoma cruziTécnicas In VitroÁcido FólicoNaproxenoIntrodução
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, foi descoberta e descrita por Carlos Chagas em 1909. A doença é causada pelo Trypanosoma cruzi, um parasita flagelado unicelular. Dados da Organização Mundial da Saúde estimam que existam cerca de seis a sete milhões de pessoas contaminadas e 70 milhões de pessoas em risco de serem infectadas.1
A transmissão da doença pode ser vetorial, por transfusão de sangue e de derivados, por transplante de órgãos, transplacentária, por via oral, entre outros mecanismos. Atualmente, a transmissão oral relacionada à ingestão de suco de açaí é a mais crítica desses mecanismos no Brasil, predominantemente na região norte do país.2
A doença de Chagas tem duas fases: aguda e crônica. A fase aguda sucede a infecção, e geralmente não é muito expressiva do ponto de vista clínico, com elevada parasitemia e inflamação. Essa fase dura cerca de oito a 10 semanas e em seguida, a parasitemia e a inflamação diminuem substancialmente. A fase crônica inicia-se nesse ponto, durando um período variável que pode se estender por toda a vida, somente com sorologia positiva e sem manifestações clínicas (forma indeterminada). Cerca de 30 a 50% dos pacientes desenvolvem sinais clínicos 10 ou 20 anos após a infecção, apresentando manifestações cardíacas, digestivas ou mistas, com aumento na morbidade e mortalidade.3
Existem dois medicamentos com efeitos parasiticidas sobre o T. cruzi que têm sido utilizados por mais de 40 anos: o nifurtimox e o benzonidazol. No entanto, essas drogas têm baixa eficácia quando administradas na fase crônica (tardia) da doença.4 Outros agentes farmacológicos foram testados, por exemplo, a amiodarona. Esse agente apresentou uma ação parasiticida contra os tripomastigotas do T. cruzi, requerendo avaliações in vivo.5
Outros componentes testados incluem o ciprofloxacino, o naproxeno, e o ácido fólico. O ciprofloxacino, um antibiótico de amplo espectro pertencente ao grupo das quinolonas, foi testado como um parasiticida por inibir a enzima trans-sialidase, que é vital para o T.cruzi.6,7 Por outro lado, o naproxeno é uma droga anti-inflamatória, antipirética e analgésica derivada do ácido propiônico. Essa droga inibe as isoformas I e II da ciclooxigenase, relacionadas com a síntese de prostaglandina, prostaciclina, e tromboxano a partir do ácido araquidônico. O naproxeno também foi testado contra o Trypanosoma, dada sua ação inibitória sobre a síntese da enzima farnesil pirofosfato, levando a alterações celulares no parasita.8,9 O ácido fólico é uma forma sintética do folato usado como um suplemento dietético uma vez que ele não é produzido no corpo humano. A deficiência de ácido está relacionada a várias doenças, tais como câncer, doença de Alzheimer, e anemia megaloblástica. Embora sua atividade in vivo contra o T.cruzi tenha sido demonstrada, seu mecanismo de ação permanece pouco clara, com incertezas sobre se o efeito antiparasitário do ácido fólico é direto ou por estímulo do sistema imune.10
Adasme et al.11 mostraram a ação parasiticida do ciprofloxacino, do naproxeno, e do ácido fólico nas cepas mexicanas NINOA e INC-5 do T. cruzi usando um modelo murino. Dada a necessidade de novos medicamentos para o tratamento da doença de Chagas, esses dados encorajadores requerem mais estudos para confirmar os resultados, já que seus níveis foram abaixo do esperado.11,12 Portanto, nosso estudo tem como objetivo avaliar a ação parasiticida in vitro do ciprofloxacino, do naproxeno, e do ácido fólico sobre a cepa Y do T. cruzi.
MétodosParasitas
Tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) usados neste estudo derivaram da cultura in vivo mantida no laboratório por passagens sucessivas em camundongos das linhagens A/Snell, cada um pesando em média 23 gramas. A cultura do parasita é parte da rotina do Laboratório de Doença de Chagas do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia. Utilizamos o concentrado de hemácias obtido das amostras de sangue coletadas dos camundongos no sétimo dia após a infecção, o que corresponde ao pico de parasitemia; esse material é geralmente descartado. Esse foi um procedimento totalmente estéril, realizado em uma cabine de fluxo laminar, seguindo os procedimentos operacionais padrões do laboratório.
Proliferação in vitro
As formas tripomastigotas do parasita foram cultivadas em três tubos de ensaio contendo 5mL do meio de cultura LIT (liver infusion triptose), suplementado com 10% de soro bovino fetal inativo.13 Cada tubo recebeu 1mL do concentrado de hemácias infectadas e colocado em uma câmara de germinação a 28oC. Dez dias depois, preparados frescos em lâminas e lamínulas de 22x22mm foram feitos, e examinados com microscópio ótico seguindo-se o método de cultura de sangue de Chiari et al.14 Em uma cabine de fluxo laminar, 1 mL de cultura foi coletada em cada um dos dez dias e transferido para tubos contendo 5mL de meio LIT. Esses tubos foram mantidos na câmara de germinação a 28oC por quatro dias. O material foi então colocado entre as lâminas e lamínulas e examinado conforme descrito anteriormente. Os parasitas nas amostras foram contados usando um hemocitômetro Neubauer para determinar o crescimento, e os tubos que continham 100 000 formas por mL foram separados para serem testados quanto à atividade parasiticida dos compostos avaliados.15 Para o experimento sobre efeitos dos medicamentos, o benzonidazol foi usado como padrão ouro para o cloridrato de ciprofloxacino, naproxeno e ácido fólico.
Os comprimidos de cada medicamento foram individualmente macerados, pesados em uma balança de precisão, e homogeneizados com 1mL de meio LIT. Em seguida, os tubos de ensaio contendo 5mL de solução com parasitas receberam os compostos testados em três concentrações (10, 20, e 100mg) – exceto o ácido fólico (uma dose de 5mg) (Tabela 1).
Delineamento experimental para o teste de diferentes doses de medicamentos na cultura de tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (tubos de 5mL)
Drogas testadas
Tratamento 1
Tratamento 2
Tratamento 3
Benzonidazol
100mg
20mg
10mg
Cloridrato de ciprofloxacino
100mg
20mg
10mg
Naproxeno
100mg
20mg
10mg
Ácido fólico
5mg
A escolha das doses foi baseada nas apresentações comerciais cujo uso já é amplamente avaliado.
Depois que os experimentos foram concluídos, a dose efetiva mínima de cada droga adicionada à cultura foi determinada. Esse procedimento foi realizado duas vezes para cada dose de medicamento. Dois tubos controles sem adição da medicação foram usados para comparação de todos os procedimentos. Ao final do quarto dia de exposição às drogas testadas, o material de cada tubo foi analisado e contado com um hemocitômetro Neubauer em um microscópio ótico.
Resultados
A Tabela 2 apresenta o peso de cada medicamento adicionado à cada tubo de ensaio e a concentração final da droga na solução de 6mL (meio de cultura com parasitas e medicamento). A tabela descreve ainda o número absoluto de parasitas em cada tubo no primeiro, segundo, terceiro e quarto dias de tratamento, bem como a porcentagem de parasitas em cada recipiente no quarto dia em relação ao primeiro dia. Esses dados representam os valores médios após dois experimentos com cada composto e controle testado (Figura Central).
Número absoluto de parasitas por tratamento em cada tubo no primeiro, segundo, terceiro e quarto dias de tratamento e a porcentagem em cada tubo no quarto dia
Controle
Ácido fólico
Cloridrato de Cipro.
Cloridrato de Cipro
Cloridrato de Cipro
Naproxeno
Naproxeno
Naproxeno
Naproxeno
BenZ
BenZ
BenZ
BenZ
5mg
100mg
20mg
10mg
100mg
50 mg
20mg
10mg
100mg
50 mg
20mg
10mg
1o dia
188,5
200
66
125
189
46,5
34
85,5
288
164
56,5
180
298,5
2o dia
282,5
610
23,5
100
120
107
29
77
417,5
125
7
134,5
189
3o dia
335
611
10,5
56,5
40,5
0
12
81
157
11,5
3,5
32
51,5
4o dia
410
632
6
36
44
0
7,5
60
103
0
0,5
2
4,5
Porcentagem de parasitas remanescentes no 4° dia
217,50%
316
9,09%
28,80%
23:28
0%
22,05%
70,17%
35,76%
0%
0,88%
1,11%
1,50%
Concentração por tubo (mg/mL)
0,83
16,66
3,33
1,66
16,66
8,33
3,33
1,66
16,66
8,33
3,33
1,66
6 mL do volume total em cada tubo de cultura – dois experimentos por amostra. Cipro.: ciprofloxacino; BenZ: benzonidazol.
Grupo Controle
O número de parasitas no grupo controle aumentou em 217,5% no quarto dia de tratamento.
Ácido fólico
Observou-se um aumento de 316% de parasitas no quarto dia de tratamento com ácido fólico na concentração de 0,83mg/mL, um resultado similar ao observado no grupo controle (Figura 1).
Variação na contagem de células em cultura in vitro de Trypanosoma cruzi após tratamento com 5 mg de ácido fólico.
Ciprofloxacino
O tratamento com 100mg de ciprofloxacino (16,66mg/mL) diminuiu o número de parasitas para 9,09% no quarto dia. Embora menos marcante que o tratamento com 100mg, a redução na concentração foi ainda evidente aplicando-se 20 mg (3,33mg/mL) e 10 mg (1,66mg/mL) de ciprofloxacino, com 28,8% e 23,3% de parasitas remanescentes em relação ao primeiro dia, respectivamente (Figura 2).
Variação na contagem de células de cultura in vitro de Trypanosoma cruzi após tratamento com 10 mg, 20 mg e 100 mg de cloridrato de ciprofloxacina, juntamente com contagens de cultura de controle.
Naproxeno
A cultura foi negativa para parasitas com 100mg de naproxeno (16,66mg/mL) no quarto dia de tratamento. Embora de modo menos significativo que com o tratamento com 100mg, as concentrações dos parasitas também diminuíram com os demais tratamentos – 22,05% com 50mg (8,33mg/mL); 70,17% com 20mg (3,33mg/mL); 35,76% com 10mg (1,66mg/mL) (Figura 3).
Variação na contagem de células de cultura in vitro de Trypanosoma cruzi após tratamento com 10 mg, 20 mg, 50 mg e 100 mg de naproxeno, juntamente com contagens de cultura de controle.
Benzonidazol
Este composto representou o padrão ouro para a atividade parasiticida no estudo, ao resultar em uma cultura negativa para parasitas com o tratamento com 100mg (16,66mg/mL). Além disso, o número de parasitas diminuiu para 0,88% com tratamento com 50mg (8,33mg/mL), 1,11% com 20mg (3,33mg/mL), e 1,5% com 10mg (1,66mg/mL) (Figura 4).
Variação na contagem de células de cultura in vitro de Trypanosoma cruzi após tratamento com 10 mg, 20 mg, 50 mg e 100 mg de benznidazol, juntamente com contagens de cultura de controle.
Discussão
Atualmente, o benzonidazol e o nifurtimox são as únicas drogas com ação parasiticida comprovada, utilizadas para tratar doença de Chagas, apesar de seus efeitos colaterais não desprezíveis. Apesar de sua eficácia ser reconhecida na fase aguda da doença em crianças, seus efeitos na fase crônica tardia continuam discutíveis.
A busca por novos compostos que possam atuar sobre o T. cruzi levou os pesquisadores a estudar compostos com ação potencial sobre o metabolismo do parasita e sua consequente destruição. Ainda, recentemente, demonstrou-se que a atividade parasiticida in vitro da amiodarona foi similar à do benzonidazol.16 Todos esses estudos investigaram os efeitos parasiticidas de medicamentos regularmente utilizados em várias situações clínicas, com base em suas propriedades farmacológicas. Portanto, esses três compostos atraíram atenção – ciprofloxacino, ácido fólico e naproxeno17 – e assim desenvolvemos o presente estudo in vitro baseado nesses achados.
O ciprofloxacino é um antibiótico sintético de amplo espectro da classe das fluoroquinolonas; ele tem potencial ação parasiticida por inibir a trans-sialidase.18 Mostramos uma importante ação parasiticida do ciprofloxacino a 16,66mg/mL (tratamento com 100 mg). Somente 9,09% dos parasitas permaneceram vivos nessa concentração no quarto dia de crescimento da cultura. Ao usar somente 20 mg (3,33mg/mL) e 10 mg (1,66 mg/mL) desse antibiótico, a redução do parasita na cultura foi menos pronunciado, mas importante, com 28,8% e 23,3% de parasitas sobreviventes, respectivamente. Esses resultados in vitro são encorajadores, uma vez que o ciprofloxacino tem sido usado por muito tempo contra várias condições infecciosas, com manuseio seguro e bem conhecido.
O naproxeno é um derivado do ácido propiônico, com propriedades analgésica, antipirética, e anti-inflamatória, classificado como um composto anti-inflamatório não hormonal. Sua ação baseia-se na inibição da ciclooxigenase (Cox I e II), que interfere na síntese de prostaglandinas, prostaciclinas, e tromboxano, a partir do ácido araquidônico.19
O naproxeno, na dose de 100mg in vitro (16,66mg/mL) eliminou totalmente os parasitas da cultura. No entanto, essa ação foi bem menos expressiva a 50 mg (8,33mg/mL), 20mg (3,33 mg/mL), e 10mg (1,66 mg/mL), resultando em concentrações de parasitas de 22,05%, 70,17%, e 35,76%, respectivamente. O naproxeno tem sido usado na prática clínica por muitos anos, com mecanismos de ações e contraindicações bem estabelecidos.
O ácido fólico tem sido usado como um suplemento dietético por um longo tempo, principalmente em pacientes com vários tipos de anemia. A deficiência de folato está relacionada com várias doenças, tais como alguns tipos de cânceres, doença de Alzheimer, hipertensão, e algumas complicações materno-fetais.17 Sabe-se, também, que a imunidade celular está significativamente comprometida na deficiência de folato.20
No presente estudo, o ácido fólico não inibiu o crescimento de parasitas na dose de 5mg (0,83mg/mL), resultando em um aumento de 316% na cultura de T. cruzi em relação ao número inicial de parasitas.
O benzonidazol foi usado como um padrão-ouro devido à sua inquestionável atividade parasiticida, como observado para as doses de 100mg (16,6 mg/mL; 0%), 50mg (8,33 mg/mL; 0,88%), 20mg (3,33 mg/mL; 1,11%) e 10mg (1,66 mg/mL; 1,5%).
O ciprofloxacino e o naproxeno também foram efetivos como parasiticidas in vitro em concentrações mais altas em comparação ao padrão-ouro. Por outro lado, o ácido fólico não apresentou ação parasiticida direta in vitro. Assim, observações prévias sobre sua eficácia devem-se provavelmente à sua ação indireta melhorando o perfil imune.17,20
Conclusão
O uso de cloridrato de ciprofloxacino, naproxeno e ácido fólico está bem estabelecido e controlado. Portanto, estudos in vivo, incluindo humanos, são necessários para determinar se o efeito parasiticida dessas drogas no ciclo de vida do parasita é direto ou indireto. Isso poderia trazer novas perspectivas para o tratamento da doença de Chagas.
Em nosso experimento, a ciprofloxacina e o naproxeno apresentaram efeito tripanosomicida in vitro, mas o ácido fólico não apresentou esse efeito.
Limitações do estudo
Nosso estudo avaliou a capacidade dessas drogas em eliminar e prevenir a proliferação somente da cepa Y do T. cruzi e somente em meio de cultura in vitro.
Fontes de financiamento
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Vinculação acadêmica
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Aprovação ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia sob o número de protocolo 026/2022. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.