Obtiveram-se ratos machos adultos com peso médio de 250 g no Biotério Geral da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Eles foram mantidos em um ambiente climaticamente controlado em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com livre acesso à água e ração padrão. O número de animais alocados para cada grupo experimental baseou-se em estudos anteriores, com base na expectativa de alta mortalidade, especialmente nos grupos que receberam a infusão de DOXO. Essa expectativa fundamentou-se em uma série de relatórios anteriores na literatura sobre o uso de DOXO, para induzir um modelo experimental de CMD não isquêmica, no qual observou-se mortalidade em torno de 50% a 60%.^15,22 O Comitê de Ética em Pesquisa aprovou todos os procedimentos experimentais da FMRP (protocolo nº 041/2005).

Adriablastin^® RD (cloreto de doxorrubicina) da Pfizer (Pharmacia, Milão, Itália) foi dissolvido em soro fisiológico (10 mg/100 ml) e administrado por injeção intravenosa. Além disso, para anestesia utilizaram-se injeções intramusculares de cloridrato de ketamina (Vetbrands, Jacarei, SP, Brasil) e xilazina (Calier, Les Franqueses del Vallés, Barcelona, Espanha).

Ao total, incluíram-se 60 animais no protocolo. Os animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos experimentais (D-8, D-12 e D-16) e 1 grupo controle (CTR), sem critérios específicos, recebendo infusões intravenosas com doses cumulativas crescentes de 2 mg/kg/semana de DOXO ou solução salina. O grupo D-8 (n=20 animais) recebeu uma infusão total de 8 mg/kg durante 4 semanas, o D-12 (n=30 animais) recebeu uma infusão total de 12 mg/kg durante 6 semanas, e o D-16 (n=28 animais) recebeu uma infusão total de 16 mg/kg durante 8 semanas. O CTR consistia de 8 animais pareados por idade que receberam o mesmo volume de solução salina durante 8 semanas.

Todos os animais foram submetidos no início e 2 semanas após o final da infusão a avaliação in vivo da função ventricular por ecocardiograma. Em seguida, os animais foram submetidos a eutanásia para avaliação histológica e análise quantitativa das áreas de colágeno.

Os animais foram mantidos em gaiolas com o mesmo grupo e incluíam apenas animais machos. Todos foram submetidos às mesmas condições de estresse e à mesma ordem de medidas, para minimizar potenciais confundidores. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia para reduzir o estresse e a dor. Não houve restrição à alimentação e à água.

A função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia 2D inicialmente e após o tratamento com doxorrubicina, como descrito anteriormente.²³

Após a sedação com ketamina e xilazina (20 e 8 mg/kg), o ecocardiograma foi registrado com o sistema de ecocardiografia bidimensional de alta resolução Sonos 5500 Philips (Andover, MA, EUA), com transdutor linear de alta frequência de 15 MHz. Empregando-se a janela paraesternal para obter imagens de eixo longo e curto do VE a nível papilar, utilizaram-se imagens em modo M para medir o septo interventricular, a espessura da parede posterior do VE e os diâmetros diastólico (DDVE) e sistólico (DSVE) da extremidade do VE. O DDVE foi medido na dimensão diastólica ventricular máxima e o DSVE foi obtido durante o movimento interno máximo do septo e da parede posterior.

A FEVE foi calculada pelo método bidimensional no qual mediu-se a área bidimensional de encurtamento do VE a partir das vistas apical, subcostal e, particularmente, as vistas do eixo curto. Além disso, as imagens das áreas endocárdicas do VE em diástole e sístole foram digitalizadas e medidas offline. Determinou-se a área de encurtamento pela fórmula FE (2D) = (AD-AS)/AD, na qual AD e AS são áreas de diástole e sístole, respectivamente.

As imagens foram registradas por um ecocardiografista experiente no trabalho de laboratório com animais de pequeno porte, que era indiferente quanto ao grupo ao qual os animais pertenciam, para a análise offline ao final do estudo.

Todas as medições representaram a média de 5 ciclos cardíacos consecutivos usando a mesma posição e ângulo do transdutor no mesmo quadro de imagem congelada. Mediu-se o intervalo entre 2 ciclos cardíacos consecutivos para calcular a frequência cardíaca.

Utilizaram-se 6 animais escolhidos aleatoriamente de cada grupo para a análise histopatológica. Os corações foram rapidamente retirados, enxaguados em solução salina gelada a 0,9% e fixados como um todo por imersão em formalina com tampão de fosfato a 10% durante 24 horas a 4°C, para estudo histológico. Ambos os ventrículos de cada coração foram isolados e cortados em 2 fragmentos pela seção coronal ventricular média. Cada bloco foi cortado sequencialmente na mesma direção a uma espessura apropriada de 4-7 µm para cada coloração, sendo as seções coradas com hematoxilina-eosina (HE) e vermelho picrosirius.

As seções coradas com vermelho picrosirius foram usadas para quantificar a fração de volume de colágeno intersticial usando o programa Leica Qwin, versão 3.2.0 (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, Reino Unido) juntamente com um microscópio Leica DMR (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Suíça), uma câmera de vídeo (Leica DC300F, Leica Microsystems AG, Heerbrugg, Suíça) e um computador online. Selecionaram-se 20 campos de alta ampliação (×400) da parede livre do VE em cada animal, e os valores da fração de volume de colágeno intersticial foram expressos como percentual da área total do VE.

Os dados das variáveis contínuas são reportados como média (DP), e as variáveis nominais são reportadas como frequência absoluta (n) e relativa (%). Os dados foram analisados utilizando o software estatístico GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Utilizou-se o teste Kolmogorov-Smirnov para verificar a distribuição Gaussiana das variáveis. Para comparar os resultados entre os grupos experimentais e controle, utilizou-se o teste t de Student. Utilizou-se o teste não paramétrico Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn, para avaliar as diferenças entre os escores médios obtidos na quantificação da fibrose. Na comparação das distribuições de frequência utilizou-se o teste exato de Fischer. O nível de significância foi estabelecido em p<0,05, bicaudal em todas as análises.

Após 2 semanas do término do período de infusão dos fármacos, 4 (20%) dos 20 animais que haviam iniciado o experimento morreram no grupo D-8. A taxa de mortalidade foi de 30% (9/30 animais) no grupo D-12, enquanto a mortalidade foi extremamente elevada, 67,6% (19/28 animais) no grupo D-16. No CTR, nenhum (0%) animal morreu. Detectou-se diferença significativa na mortalidade somente entre o grupo D-16 e seu CTR (p<0,001) (Figura 1).

Observou-se redução significativa do peso corporal em relação aos respectivos CTR nos animais do grupo D-8 368 g (DP, 32 g) vs 444 g (DP, 19 g), p<0,01, grupo D-12 366 g (DP, 30 g) vs 505 g (DP, 23 g), p<0,0001 e grupo D-16 331 g (DP, 21 g) vs 534 g (DP, 29 g), p<0,0001. Essa diferença foi progressivamente mais evidente com o aumento da dose de DOXO, já que os animais dos CTR pesavam, em média, 20%, 38% e 61% a mais do que os animais dos grupos D-8, D-12 e D-16, respectivamente.

Avaliação basal: Os dados da ecocardiografia basal são apresentados na tabela 1. Não se detectou diferença significativa nos parâmetros da ecocardiografia basal entre os grupos de estudo (p>0,05) antes da administração de DOXO.

Avaliação após a infusão de doxorrubicina: Os dados de ecocardiografia obtidos após a infusão de DOXO são apresentados na tabela 2.

O DSVE foi maior no grupo D-16 em comparação com seu CTR, 5,1 mm (DP, 0,8 mm) vs 4,3 mm (DP, 0,5 mm), p<0,05. Essa variável não apresentou diferença nos demais grupos experimentais. O DSVE dos animais dos grupos D-8, D-12 e D-16 foi semelhante ao de seus CTRs, p>0,05.

Os resultados da FEVE obtidos pelo método bidimensional revelaram que os grupos D-12 e D-16 apresentaram redução significativa da função sistólica do VE em comparação com seus respectivos CTRs: 68,3% (DP, 5%) vs 58,4% (DP, 9%), p<0,01, para o grupo CTR-12 vs D-12 e 66,0% (DP, 6%) vs 47,6% (DP, 15); (p<0,01), para o grupo CTR-16 vs D-16. Assim, pode-se observar redução de 14,5% da FEVE no grupo D-12 e redução de 27,9% no grupo D-16. Não se detectou diminuição da FEVE no grupo D-8, p>0,05. (Figura 2).

A frequência cardíaca observada durante a ecocardiografia foi significativamente menor entre os animais do grupo D-16 227 bpm (DP, 30 bpm) do que entre os do CTR 272 bpm (DP, 18 bpm), p<0,01. Esse parâmetro não apresentou diferença nos demais grupos experimentais.

A massa estimada pelo ecocardiograma do VE foi significativamente reduzida nos animais dos grupos D-12 e D-16 em comparação com os dos CTRs, p<0,05. Não houve diferença na massa estimada do VE entre os animais do grupo D-8 e os do CTR.

A análise comparativa dos grupos que recebem diferentes doses de DOXO revelou uma diminuição progressiva da FEVE (FEVE 2D) entre os grupos D-8 e D-12 (p<0,05), D-8 e D-16 (p<0,001) e D-12 e D-16 (p<0,05) (Tabela 2).

A análise histopatológica do coração dos animais dos CTRs corados com HE não revelou nenhuma alteração patológica, enquanto que os corações dos animais infundidos com DOXO mostraram lesão de miócitos com redução e degeneração das fibras miocárdicas e diminuição significativa das miofibrilas, com perda da organização miofibrilar, fibrose periarteriolar no miocárdio e interstícios, associada à deposição de colágeno (Figura 3). As alterações detectadas no grupo D-8 foram menos pronunciadas que em D-12 e D-16.

Para a análise quantitativa de fibrose, as amostras foram coradas com vermelho picrosirius. Observou-se um porcentual maior de fibrose nos grupos D-8 6,0% (DP, 2,3%), D-12 10,6% (DP,3,3%) e D-16 9,8%, (DP, 2,3%) em comparação com o CTR 2,3% (DP, 1,0%), p<0,001. Além disso, os grupos D-12 e D-16 apresentaram área de fibrose maior do que o grupo D-8, p<0,001, mas não diferiram um do outro (Figura 4).

A alta taxa de mortalidade observada no presente estudo coincide com os valores relatados em estudos anteriores, variando de 36% a 82%.^15,18,24,25 Estudos anteriores mostraram que variações nas taxas de mortalidade estão relacionadas a 3 razões principais: dose total administrada, duração do período de infusão e tempo de observação. A mortalidade aumenta proporcionalmente à dose maior, menor período de administração e maior período de observação.^15,24,26

Além da lesão miocárdica, altas doses cumulativas de DOXO produzem toxicidade renal, da medula óssea e gastrointestinal, que podem contribuir para o aumento das taxas de mortalidade devido à indução de hipercalemia, hipervolemia, anemia, diarreia e desnutrição.^24,27 Além de perder peso e massa muscular, os animais tornam-se fracos e incapazes de se alimentar adequadamente, resultando em fraqueza muscular progressiva e generalizada, que pode contribuir para o aumento da mortalidade. No presente estudo, os animais dos grupos D-12 e D-16 apresentaram diferenças significativas no aspecto geral e no peso em comparação com seus respectivos CTRs, corroborando indiretamente a presença desses mecanismos debilitantes. Essas alterações também foram descritas por outros autores.^15,22,24,27

Em geral, realizaram-se estudos utilizando DOXO para a investigação de lesões histopatológicas²⁸ e estudo da cardiotoxicidade do fármaco,²⁹ com ênfase principalmente em alterações metabólicas e estresse oxidativo desse modelo,^15,30-32 e não na avaliação do grau de disfunção ventricular in vivo ou mortalidade. Assim, o objetivo desses modelos não era caracterizar um modelo de IC ou CMD. Observamos, pois, uma ampla variedade de protocolos na literatura. Nosso estudo pretendia descrever um protocolo que fosse adequado, eficaz e de melhor rendimento, reproduzindo um modelo experimental de CMD não isquêmica baseado em alterações estruturais e funcionais in vivo, mas com taxas de mortalidade aceitáveis.

Ressaltamos que, neste estudo, escolhemos a infusão intravenosa de DOXO em doses cumulativas crescentes. Em um estudo anterior com ratos, O’Connel et al.³³ compararam 2 protocolos de tempo de infusão de DOXO, um curto e um longo, para a indução de CMD. Neste estudo, observamos que ambos os protocolos geraram lesões histológicas similares, embora apenas a infusão prolongada estivesse associada a alterações estruturais e funcionais similares àquelas detectadas na CMD clínica. Essas descobertas respaldam a ideia de que a infusão prolongada é mais eficaz que a infusão curta quando o desfecho primário é a indução de alterações estruturais e funcionais.³³

No presente estudo, observamos uma clara correlação entre a dose cumulativa de DOXO e o grau de disfunção ventricular que ocorre progressivamente, a partir da dose cumulativa de 12 mg/kg. Nossos resultados mostram que os animais que receberam uma dose cumulativa de 16 mg/kg apresentaram alterações funcionais e estruturais cardíacas mais marcantes, avaliadas por ecocardiograma bidimensional in vivo, em comparação com seus respectivos CTRs, caracterizados principalmente por um aumento do DSVE, redução da FEVE e da massa estimada do VE. No entanto, as taxas de mortalidade para esse grupo foram excessivas, uma vez que mais de dois terços dos animais não sobreviveram até 2 semanas após a indução da CMD.

Por outro lado, a dose cumulativa de 12 mg/kg foi associada a alterações estruturais que não foram tão acentuadas quanto as observadas com a dose de 16 mg/kg, mas foi suficiente para causar redução significativa da FEVE e aumento da fibrose miocárdica. Além disso, a taxa de mortalidade para o grupo D-12 (30%) foi aceitável, levando-nos a concluir que esse protocolo poderia ser adequado para a indução de disfunção ventricular com o uso de DOXO em ratos.

Nossos resultados corroboram os de estudos anteriores, que sugerem que doses cumulativas acima de 12 mg/kg estão associadas a aumento da mortalidade.^18,22,34 Os resultados obtidos por Spivak et al.,³⁴ usando um tempo de dosagem mais curto de DOXO, sugeriram que doses cumulativas acima de 12 mg/kg estão associadas a taxa de mortalidade superior a 40%, sendo assim inadequada para pesquisas in vivo sobre IC.³⁴ Com efeito, o estudo de Schwarz et al.²² demonstrou que doses maiores, como 25 mg/kg, durante um período de 10 semanas, estão associadas a maior grau de disfunção ventricular, mas com altas taxas de mortalidade, que chegam a 52%.²²

No presente estudo, observamos diferenças morfológicas nítidas entre os grupos que receberam DOXO. As lesões foram as tipicamente relatadas na CMD induzida por DOXO em humanos³⁵ e em outros modelos animais,^36-38 ou seja, predominantemente danos aos miócitos, com perda e degeneração das fibras miocárdicas, redução significativa das miofibrilas, fibrose e deposição de colágeno, além de edema e vacuolização cardiomiocitária, edema intracelular e desorganização das miofibrilas. Observamos que a deposição de colágeno foi semelhante à relatada em estudos anteriores que utilizavam esse modelo experimental.^23,39 A dose cumulativa de DOXO associada a danos histológicos significativos em nosso estudo foi semelhante aos achados relatados em outros, que sugeriram uma dose de 15 mg/kg como a mais eficaz na indução de lesões histopatológicas.⁴⁰

Deve-se ressaltar que embora a disfunção ventricular tenha sido mais acentuada na dose de 16 mg/kg, o grau de lesão tecidual representada pela fibrose foi semelhante para os grupos D-12 e D-16, sugerindo possível dissociação entre esses 2 parâmetros nessa faixa de doses cumulativas de DOXO. Esses resultados confirmam evidências anteriores obtidas por nosso grupo de pesquisa, revelando relativa dissociação entre o grau de lesão tecidual e a intensidade da disfunção ventricular esquerda com o uso de diferentes regimes de infusão de DOXO.³³

Os resultados atuais mostram que o modelo de indução usando uma dose cumulativa total de 16 mg/kg de DOXO, com 8 injeções semanais de 2 mg/kg, é o que melhor induz a alterações morfológicas e funcionais em animais, embora implique em mortalidade elevada e eticamente inaceitável, o que desencoraja o uso desse protocolo. Além disso, a dificuldade em manter um modelo altamente agressivo de disfunção ventricular pelo período mínimo de tempo suficiente para a avaliação de uma determinada intervenção terapêutica é um fator relevante na escolha do protocolo mais eficiente.