ABC HF ABC: Heart Failure & Cardiomyopathy ABC Heart Fail Cardiomyop 2764-3107 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC abchf.20220027 10.36660/abchf.20220027 Editorial Heart Transplant from a Genetically-Modified Pig: A Paradigm Shift? 0000-0001-7603-2752 Bacal Fernando 1 2 3 Universidade de São Paulo São Paulo SP Brazil Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina InCor- FMUSP Instituto do Coração do Hospital das Clínicas São Paulo SP Brazil InCor- FMUSP Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil Hospital Albert Einstein Programa de Insuficiência Cardíaca e Transplante São Paulo SP Brazil Programa de Insuficiência Cardíaca e Transplante do Hospital Albert Einstein, São Paulo, SP – Brazil Mailing Address: Fernando Bacal • Av. Divino Salvador 395, ap 201. Postal Code 04078-011, Moema, São Paulo, SP – Brazil. E-mail: fbacal@uol.com.br 29 06 2022 Apr-Jun 2022 2 2 133 135 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Keywords Heart Transplantation Transplantation Heterologous Allergy and Immunology Genetically Modified Animals Swine

Heart transplant remains the therapy of choice for patients with end-stage heart failure but is limited by chronic shortage of donated organs. Mechanical circulatory support (MCS) devices, with modern designs, have been used as destiny therapy, yielding better results that have positively impacted patient survival.1 The indications for MCS have significantly increased and become part of the current context of potential candidates for transplant, be it as destiny therapy, bridge-to-transplant or bridge-to candidacy. However, there remains a considerable number of patients who would benefit from the transplant if the availability of donated organs was higher. According to the Brazilian Organ Transplant Association (ABTO), approximately 400 heart transplants are performed yearly in Brazil, but the demand for this procedure is 1,600 per year, i.e., many patients die waiting for an organ.

A possible solution for this issue is xenotransplantation, the process of transplanting organs from other animals, which has gained increasing interest in the last years2,3 for a combination of reasons. First, the efficacy of preclinical models has improved, with an increase in survival time of xenografts. Second, the rapid advances in genome editing, particularly the advent of CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), which allowed the generation of donor pigs with multiple genetic protection modifications; what used to take years can now be done in months, with more accurate and comprehensive results. Third, the spectrum of the porcine endogenous retrovirus (PERV) significantly reduced. There is no evidence of PERV transmission in clinical trials of preclinical models, and novel treatment options and even elimination of these viral diseases are now available.4 Due to its potential, the importance of xenotransplantation as a solution for the shortage of human organs and tissues remains a great hope for the transplant community, especially for the patients who face advanced disease and high mortality while waiting for a donated heart.

Many questions and ethical concerns have been raised about xenotransplantation. The risk of infection transmission from pigs may require a lifelong surveillance not only for transplant recipients but also for their family members. Another issue concerns the performance of animal experiments with a specific purpose of producing genetically engineered pigs for transplants and to save lives. Discussions among the community, regulatory agencies and animal protection agencies have played an important role in the advancement of research, that may become true in a near future.5

This year, with enthusiasm, we received the news of the first heart transplant from a pig to a male patient at the University of Maryland Medical Center. The regulatory agency of the U.S.A federal government (Food and Drug Administration) had approved xenotransplantation under “compassionate use” rules for emergency situations. The patient had refractory heart failure, severe sarcopenia, was in prolonged extracorporeal membrane oxygenation (ECMO), and considered not eligible for conventional heart transplant according to the medical staff.

The patient died approximately 50 days after the transplant, due to progressive cardiac hypertrophy and severe diastolic dysfunction. The patient had been transitioned back to ECMO support until the end. Biopsy and pathologic examination did not reveal any signs of humoral or cellular rejection. Many hypotheses have been proposed, that will probably be elucidated in the final publication of the data. One of the hypotheses is that the patient heart was affected by porcine cytomegalovirus, which may have contributed to refractory and irreversible dysfunction. Also, the physiological functioning and even gravitational aspects could have affected the graft function.

This pioneering experiment provided valuable indications for the possibility of the normal functioning of a genetically modified pig heart in a human person while the immune system is adequately suppressed. It is important that the valuable insights from this case guide future research and indications of the procedure.

The application of this groundbreaking research in a patient was only possible due to numerous previous work that helped to define the genetic engineering required to overcome the feared immunological and infectious barriers. This research started more than 30 years ago and constructed the basis for making this procedure feasible.

The reason for choosing pigs as donors was these animals have a shorter gestational period and time to maturity (around one year) and similar size for organs as compared with humans. Pigs have long been used in Human Medicine, for example for skin grafts and cardiac valve implants. However, organ transplantations are far more complex than the use of highly processed tissues. The gene-edited pigs were produced by Revivicor (United Therapeutics Corporation, Virginia, USA), one of the several animal biotechnology companies at the frontiers of knowledge focused on producing organs for transplantation into humans. According to available information, 10 genes were supposedly manipulated – three knockout genes, one gene was inactivated to prevent hypertrophy and six human genes were inserted into its genome.

The next challenge was to neutralize the effect of pre-existing antibodies (AB) and manage potential incompatibility between the complement and the coagulation systems, and infection of the receptor by endogenous retroviruses.

The introduction of the CRISPR technology into xenotransplantation increased the speed of genetic manipulation in pigs. Thanks to this technology, researchers cannot only produce knockout and knock-in animas targeting multiple genes, but also exclude the expression that increases the risk of specific viral diseases. Genetically modified pigs using the CRIPSR technology have been used in several important studies involving AB and coagulation dysfunction. Today, there are more than 26 types of gene-edited pigs available for xenotransplantation research.6

Endothelial injury may occur within minutes due the activity of pre-existing AB against pig specificities. The AB-antigen binding triggers a hyperacute rejection after reperfusion of the xenograft. To prevent this complication, using genetic engineering, the three main genes responsible for the α-1,3-Gal, β4Gal and Neu5Gc proteins were inactivated by gene knockout, creating the triple-gene knockout pig.

The activation of the complement pathway and changes in the coagulation system may lead to the xenograft dysfunction within days or weeks, and consequent loss of the graft. At the human blood-porcine endothelial interface, porcine thromboregulatory molecules such as thrombomodulin, endothelial protein C receptor (EPCR), and thrombin activatable fibrinolysis inhibitor interact inappropriately with human coagulation pathway molecules. This can result in thrombotic microangiopathy in the xenograft and disseminated intravascular coagulation in the receptor.

To prevent the production of new AB or increase in pre-existing AB, the use of anti-CD40 monoclonal AB has been proposed, along with other components of a more comprehensive immunosuppressive regimen.7

The cardiac xenotransplantation, performed by Mohiuddin et al. evidenced the possibility of the long-term survival of cardiac grafts of genetically modified pigs.8 Genetic modifications in pigs, combined with an intensive immunosuppressive therapy, based on a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody, prevented humoral rejection and dysregulation of systemic coagulation pathway, promoting the cardiac xenograft survival, in addition to controlling inflammation and coagulation.9

Some lessons can be learnt from this first, groundbreaking case. Preoperative clinical conditions, such as sarcopenia, prolonged inactivity, and infections, made difficult the prompt recovery of the patient after transplantation. In this case the patient had pancytopenia, which prevented the use of the ideal immunosuppressive regimen. The severe interstitial edema, with myocardial necrosis and no cellular infiltrate, which led to ventricular dysfunction, will need to be better understood, including whether or not there was an influence of immunological components.10

We are truly experiencing an important paradigm shift in the field of transplantation. In the next years, we will witness great progress and research continuation towards feasible, safe and effective procedure in clinical practice. The University of São Paulo is planning the construction of a pig facility, focusing on research to make suitable clinical transplantation within the next five years. Again, research and science are playing their role in the progress of humanity. The future is happening now, right in front of our eyes.11

References Bacal F Marcondes-Braga FG Rohde LEP Xavier JL Jr Brito FS Moura LAZ 3ª Diretriz Brasileira de Transplante Cardíaco Arq Bras Cardiol 2018 111 2 230 289 10.5935/abc.20180153 1 Bacal F, Marcondes-Braga FG, Rohde LEP, Xavier JL Jr, Brito FS, Moura LAZ, et al. 3ª Diretriz Brasileira de Transplante Cardíaco. Arq Bras Cardiol. 2018;111(2):230-89. doi: 10.5935/abc.20180153. Cowan PJ Tector AJ The Resurgence of Xenotransplantation Am J Transplant 2017 17 10 2531 2536 10.1111/ajt.14311 2 Cowan PJ, Tector AJ. The Resurgence of Xenotransplantation. Am J Transplant. 2017;17(10):2531-6. doi: 10.1111/ajt.14311. Shu S Ren J Song J Cardiac Xenotransplantation: A Promising Way to Treat Advanced Heart Failure Heart Fail Rev 2022 27 1 71 91 10.1007/s10741-020-09989-x 3 Shu S, Ren J, Song J. Cardiac Xenotransplantation: A Promising Way to Treat Advanced Heart Failure. Heart Fail Rev. 2022;27(1):71-91. doi: 10.1007/s10741-020-09989-x. Mohiuddin MM Reichart B Byrne GW McGregor CGA Current Status of Pig Heart Xenotransplantation Int J Surg 2015 23 Pt B 234 239 10.1016/j.ijsu.2015.08.038 4 Mohiuddin MM, Reichart B, Byrne GW, McGregor CGA. Current Status of Pig Heart Xenotransplantation. Int J Surg. 2015;23(Pt B):234-39. doi: 10.1016/j.ijsu.2015.08.038. Cooper DKC Pierson RN 3rd Hering BJ Mohiuddin MM Fishman JA Denner J Regulation of Clinical Xenotransplantation-Time for a Reappraisal Transplantation 2017 101 8 1766 1769 10.1097/TP.0000000000001683 5 Cooper DKC, Pierson RN 3rd, Hering BJ, Mohiuddin MM, Fishman JA, Denner J, et al. Regulation of Clinical Xenotransplantation-Time for a Reappraisal. Transplantation. 2017;101(8):1766-9. doi: 10.1097/TP.0000000000001683. Pierson RN 3rd Fishman JA Lewis GD D’Alessandro DA Connolly MR Burdorf L Progress Toward Cardiac Xenotransplantation Circulation 2020 142 14 1389 1398 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.048186 6 Pierson RN 3rd, Fishman JA, Lewis GD, D’Alessandro DA, Connolly MR, Burdorf L, et al. Progress Toward Cardiac Xenotransplantation. Circulation. 2020;142(14):1389-98. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.048186. Mohiuddin MM Singh AK Corcoran PC Hoyt RF Thomas ML 3rd Lewis BG Role of anti-CD40 Antibody-mediated Costimulation Blockade on Non-Gal Antibody Production and Heterotopic Cardiac Xenograft Survival in a GTKO.hCD46Tg Pig-to-baboon Model Xenotransplantation 2014 21 1 35 45 10.1111/xen.12066 7 Mohiuddin MM, Singh AK, Corcoran PC, Hoyt RF, Thomas ML 3rd, Lewis BG, et al. Role of anti-CD40 Antibody-mediated Costimulation Blockade on Non-Gal Antibody Production and Heterotopic Cardiac Xenograft Survival in a GTKO.hCD46Tg Pig-to-baboon Model. Xenotransplantation. 2014;21(1):35-45. doi: 10.1111/xen.12066. Chan JL Mohiuddin MM Heart Xenotransplantation Curr Opin Organ Transplant 2017 22 6 549 554 10.1097/MOT.0000000000000461 8 Chan JL, Mohiuddin MM. Heart Xenotransplantation. Curr Opin Organ Transplant. 2017;22(6):549-54. doi: 10.1097/MOT.0000000000000461. Burki T Pig-heart Transplantation Surgeons Look to the Next Steps Lancet 2022 399 10322 347 347 10.1016/S0140-6736(22)00097-6 9 Burki T. Pig-heart Transplantation Surgeons Look to the Next Steps. Lancet. 2022;399(10322):347. doi: 10.1016/S0140-6736(22)00097-6. Mehra MR Cardiac Xenotransplantation: Rebirth Amidst an Uncertain Future J Card Fail 2022 S1071-9164(22)00011-2 10.1016/j.cardfail.2022.01.006 10 Mehra MR. Cardiac Xenotransplantation: Rebirth Amidst an Uncertain Future. J Card Fail. 2022:S1071-9164(22)00011-2. doi: 10.1016/j.cardfail.2022.01.006. Platt JL Piedrahita JA Cascalho M Clinical Xenotransplantation of the Heart: At the Watershed J Heart Lung Transplant 2020 39 8 758 760 10.1016/j.healun.2020.06.002 11 Platt JL, Piedrahita JA, Cascalho M. Clinical Xenotransplantation of the Heart: At the Watershed. J Heart Lung Transplant. 2020;39(8):758-60. doi: 10.1016/j.healun.2020.06.002. Editorial Transplante Cardíaco de Coração de Porco Geneticamente Alterado: Mudança de Paradigma? 0000-0001-7603-2752 Bacal Fernando 1 2 3 São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil São Paulo SP Brasil InCor- FMUSP Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil São Paulo SP Brasil Programa de Insuficiência Cardíaca e Transplante do Hospital Albert Einstein, São Paulo, SP – Brasil Correspondência: Fernando Bacal • Av. Divino Salvador 395, ap 201. CEP 04078-011, Moema, São Paulo, SP – Brasil. E-mail: fbacal@uol.com.br Palavras-chave Transplante de Coração Transplante Heterólogo Alergia e Imunologia Animais Geneticamente Modificados Suínos

O transplante cardíaco persiste a terapia de escolha para pacientes com doença cardíaca terminal, mas ainda é limitado pela escassez crônica de órgãos doados. Dispositivos de suporte circulatório mecânico (SCM) vêm sendo utilizados como terapia de destino, com modernos modelos de bombas e resultados cada vez melhores, que impactaram muito a sobrevida dos pacientes.1 As indicações de SCM aumentaram significativamente e faz parte do contexto atual de candidatos potenciais ao transplante cardíaco, quer seja como terapia de destino, ponte para transplante ou ponte para candidatura. Permanece, no entanto, um grupo significativo de pacientes que ainda se beneficiariam do transplante, se os órgãos doados tivessem maior disponibilidade. Segundo dados da Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos (ABTO), realizamos cerca de 400 transplantes cardíacos, ao ano, no Brasil, porém a demanda seria de 1600 procedimentos ao ano, mostrando que um número grande de pacientes morre à espera do órgão a ser doado.

Uma possível solução para este problema seria o uso de enxerto de outros animais, denominado xenotransplantes, que vem ganhando interesse crescente nos últimos anos,2,3 por uma combinação de fatores. Primeiro, houve uma melhora na eficácia em vários modelos pré-clínicos, com aumento nos tempos máximos de sobrevivência do xenoenxerto. Em segundo lugar, o rápido desenvolvimento da tecnologia de edição de genoma, particularmente o advento do CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), que revolucionou a capacidade de gerar novos porcos doadores com múltiplas modificações genéticas protetoras; o que antes levava muitos anos para ser alcançado agora pode ser realizado em meses, com muito mais precisão e alcance. Terceiro, o espectro do retrovírus endógeno suíno (PERV) diminuiu significativamente. Não houve evidência de transmissão de PERV em ensaios clínicos e modelos pré-clínicos, e novas opções para o tratamento ou mesmo eliminação dessas viroses estão agora disponíveis.4 Em virtude do seu potencial, o xenotransplante como solução para a escassez de órgãos e tecidos humanos para transplante permanece uma grande esperança para a comunidade transplantadora e obviamente para os pacientes que aguardam em filas de espera, convivendo com doença avançada e alta mortalidade.

Várias preocupações e questionamentos éticos foram levantados em relação ao xenotransplante. A questão da transmissão de infecção do suíno para o humano, deverá exigir que o paciente passe por vigilância vitalícia que pode ser estendida até mesmo aos membros da família. Outro ponto é a questão de experimentos em animais; no caso do xenotransplante, há o propósito específico de produzir porcos geneticamente modificados para transplante e salvar vidas. Debates com a comunidade, agências reguladoras e entidades protetoras de animais, têm tido papel preponderante para que essas pesquisas avancem e possam se tornar realidade em um futuro breve.5

Este ano, recebemos com entusiasmo a notícia da realização do primeiro xenotransplante em um paciente internado no Hospital da Universidade de Maryland. A agência reguladora do governo federal americano (Food and Drug Administration) havia permitido o xenotransplante a ser realizado nessa universidade, sob as regras de “uso compassivo” para situação de emergência. O paciente tinha insuficiência cardíaca refratária, em suporte com oxigenação por membrana extracorpórea (ECMO) por tempo prolongado, evoluindo com sarcopenia importante. Segundo definido pela equipe que o assistia, o paciente não elegível para o transplante cardíaco convencional.

O óbito do paciente ocorreu aproximadamente 50 dias após a cirurgia, em virtude de evolução progressiva de hipertrofia cardíaca, disfunção diastólica grave, tendo sido novamente colocado em ECMO, até o final. Tanto as biópsias como o estudo anatomopatológico posterior não revelaram indícios das rejeições humorais ou celulares. Várias hipóteses têm sido levantadas, que poderão ser melhor esclarecidas com a publicação final dos dados. Aventou-se também a hipótese de que citomegalovírus do porco pudesse ter agredido o novo coração, contribuindo para a disfunção refratária e irreversível. Outro aspecto seria o próprio funcionamento fisiológico e até questões gravitacionais, que claramente diferem nas espécies e que podem ter comprometido o funcionamento do enxerto.

Esta experiência pioneira trouxe informações valiosas ao entendimento que o coração de porco geneticamente modificado pode funcionar adequadamente, enquanto o sistema imunológico é adequadamente suprimido. É importante que as lições advindas deste caso possam nortear as futuras pesquisas e indicações do procedimento para os pacientes.

A aplicação desta revolucionária pesquisa em um paciente só foi possível devido a muitas pesquisas que ajudaram a definir quais seriam as modificações genéticas necessárias para vencer as temíveis barreiras imunológicas e as infecciosas. Estas pesquisas já duravam mais de 30 anos, construindo as bases para que o procedimento pudesse finalmente ser realizado.

O porco foi o animal escolhido por ter gestação mais curta, atingir a maturidade por volta de um ano e por apresentar um órgão de tamanho muito semelhante ao humano. Os porcos têm sido usados há muito tempo na medicina humana, incluindo enxertos de pele e implante de valvas cardíacas. No entanto, transplantar órgãos inteiros é muito mais complexo do que usar tecidos altamente processados. Os porcos editados geneticamente usados nesses experimentos foram fornecidos pela empresa Revivicor (United Therapeutics Corporation, Virgínia, EUA), uma das várias empresas de biotecnologia na fronteira do conhecimento para desenvolver órgãos adequados para um possível transplante humano.

As informações disponíveis relatam que 10 genes foram supostamente manipulados (três genes knockout, uma alteração para evitar hipertrofia, 6 outros genes humanos adicionados ao genoma).

O desafio a seguir foi combater a expressão pré-existente de anticorpos (AC), a incompatibilidade entre as vias do complemento e da coagulação e a possibilidade de infecção do receptor por retrovírus endógenos.

A introdução da tecnologia CRISPR no xenotransplante aumentou a velocidade com que as manipulações genéticas podem ser alcançadas em suínos. Hoje, grupos de pesquisa podem produzir porcos knockout ou knock in de múltiplos genes, usando esta tecnologia, que também pode ser usada para excluir a expressão que aumenta risco de viroses específicas. Porcos geneticamente modificados usando a tecnologia CRIPSR foram usados em vários estudos importantes relacionados à ligação de AC e disfunção da coagulação e existem agora mais de 26 tipos desses animais para pesquisa de xenotransplantes.6

A lesão endotelial pode ocorrer em minutos devido à presença de AC pré-formados direcionados principalmente a certas estruturas suínas. Esta ligação desencadeia uma rejeição hiperaguda, após a reperfusão do xenoenxerto. Para evitar o desenvolvimento dessa complicação, foram removidos os três principais genes responsáveis pelas proteínas α-1,3-Gal, β4Gal e Neu5Gc por engenharia genética, por meio de um “nocaute de gene”, surgindo o porco triple-gene knockout.

A ativação do complemento e a alteração do sistema de coagulação podem levar a disfunção do xenoenxerto em dias ou semanas, causando perda do enxerto. Na interface endotelial entre o sangue suíno e humano, as moléculas tromborreguladoras suínas, como a trombomodulina, o receptor de proteína C endotelial, e o inibidor de fibrinólise ativável por trombina, interagem de forma errátil com moléculas da via de coagulação humana. Isso pode resultar no desenvolvimento de microangiopatia trombótica no xenoenxerto e de coagulopatia de consumo no receptor.

No sentido de evitar o surgimento de novos AC ou aumento de AC preexistentes, foi proposta a utilização de AC monoclonais anti-CD40, associados aos outros componentes do regime imunossupressor mais amplo.7

O xenotransplante cardíaco realizado Mohiuddin e cols, foi capaz de demonstrar que a sobrevivência a longo prazo de enxertos cardíacos de porcos geneticamente modificados pode ser alcançada.8 Modificações genéticas no porco, combinadas com um regime de tratamento imunossupressor intenso, baseado em um anticorpo monoclonal anti-CD40 quimérico, impediriam a rejeição humoral e a desregulação da via de coagulação sistêmica, sustentando a sobrevivência do xenoenxerto cardíaco, além de controlar inflamação e coagulação.9

Algumas lições foram tiradas deste primeiro e revolucionário caso, que servirão para o futuro. Condições clínicas pré-operatórias, tais como sarcopenia, inatividade prolongada e infecções, dificultaram o pronto restabelecimento após o transplante. No paciente em questão, operado nos EUA, pancitopenia impediu a utilização do esquema imunossupressor ideal. O intenso edema intersticial, com necrose miocárdica e sem infiltrado celular, que levou à disfunção ventricular, precisará ser mais bem compreendido, inclusive quanto ao envolvimento ou não de componente imunológico.10

Realmente estamos vivendo uma importante mudança de paradigma no campo dos transplantes. Nos próximos anos, veremos grandes progressos e a continuidade das pesquisas, que procurarão viabilizar esse procedimento para ser aplicada na prática clínica de forma segura e efetiva. A Universidade de São Paulo prepara-se para construção de uma pig facility, que contribuirá também para pesquisas que possam resultar em transplantes para pacientes nos próximos cinco anos. Novamente, a importância da pesquisa e da ciência no progresso da humanidade; o futuro está acontecendo já, na frente dos nossos olhos.11