ijcsInternational Journal of Cardiovascular SciencesInt. J. Cardiovasc. Sci.2359-48022359-5647Sociedade Brasileira de CardiologiaNLpmkbyPNPztMrL4RFxNKgrS2359-5647201800020011410.5935/2359-4802.20180002Original ArticlesDecrease in the Inflammatory Marker TNF-α after Consumption of Flaxseed by Hypercholesterolemic RabbitsMartinsMaynara Leonardi Schuh1LimaAniely Bacelar Rocco de1ChamposkiAna Flavia1PereiraPamela Cristiani1MartinsFernando2TanizawaCarlos1PrécomaLeonardo1CampeloPatrícia1Guarita-SouzaLuiz César1PrécomaDalton Bertolim1Pontifícia Universidade Católica do ParanáParanáPRBrazilPontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR), Paraná, PR, BrazilPontifícia Universidade Católica do ParanáUniversidade Federal da Grande DouradosMato Grosso do SulMSBrazilUniversidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Mato Grosso do Sul, MS – BrazilUniversidade Federal da Grande DouradosMailing Address: Maynara Leonardi Schuh Martins, Rua Prof. Sebastião Paraná 762. Vila Izabel. Curitiba. Postal Code 80320-070, Novo Mundo, Curitiba, Paraná, PR – Brazil. E-mail: may.schuh@hotmail.com; fernando.ecoatividade@hotmail.com
Author contributions
Conception and design of the research: Martins MLS, Lima ABR, Champoski AF, Précoma L, Precoma DB. Acquisition of data: Martins MLS, Lima ABR, Tanizawa C. Analysis and interpretation of the data: Martins MLS, Champoski AF, Pereira PC, Martins F, Precoma DB. Statistical analysis: Martins MLS, Campelo P. Obtaining financing: Martins MLS, Lima ABR, Pereira PC. Writing of the manuscript: Martins MLS, Martins F. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Martins MLS, Lima ABR, Martins F, Campelo P, Souza LCG. Supervision / as the major investigador: Precoma DB.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Mar-Apr201831211412227220172262017772017This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly citedAbstractBackground:
Functional foods such as flaxseed have been commonly consumed to prevent atherosclerosis.
Objectives:
To assess the effects of flaxseed in atherogenesis in rabbits consuming a high-cholesterol diet.
Methods:
Thirty male albino rabbits were randomized to three groups based on a 12-week dietary treatment: control group (G1), standard diet; high-cholesterol diet (G2), standard diet plus 0.25% cholesterol from lyophilized eggs; and high-cholesterol plus flaxseed (G3), similar diet as G2 plus flaxseed. Biochemical (total cholesterol [TC], high-density lipoprotein [HDL-C], low-density lipoprotein cholesterol [LDL-C], and triglycerides) and immunohistochemical (intercellular adhesion molecule 1 [ICAM-1] and tumor necrosis factor alpha [TNF-α]) analyses were performed in all groups. P values < 0.05 indicated statistical significance.
Results:
At 12 weeks, serum TC levels increased significantly in G2 and G3 compared with G1. Serum LDL-C levels were higher in group G2, and the increase in group G3 was approximately six times lower than that in G2. HDL-C levels increased in all groups, with the highest increase observed in G2. Triglycerides levels in G3 decreased by ~70% and differed significantly in G1 and G3 (p = 0.034) and G2 and G3 (p = 0.015). ICAM-1 levels increased only in aortic segment 4 in G3. TNF-α levels in G3 were similar to those in the control group, while the levels in G2 were greater than twice as those in the control group (p < 0.05).
Conclusions: The group fed with a functional diet (flaxseed) showed decreased development of atherosclerosis, reduced serum triglycerides levels, and lower TNF-α levels on immunohistochemistry.
Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease marked by endothelial dysfunction affecting the intimal layer of medium- and large-caliber arteries.1 This process occurs slowly over the course of decades and has the potential of evolving into more advanced lesions, which may rupture and trigger thrombus formation, potentially leading to acute myocardial infarction and death.2
Several factors are implicated in the etiology of atherosclerosis, including persistent elevation of atherogenic serum lipoproteins (such as low-density lipoprotein cholesterol [LDL-C]), which are associated with lifestyle factors such as poor eating habits, sedentary lifestyle, and obesity, as well as deposition of these lipoproteins in the inner tunica.2,3
Many food products with functional/nutraceutical properties have been studied with the aim of preventing the development of atherosclerotic plaques and promote positive cardiovascular effects. These products contain dietary fibers, phytosterols, omega-3 fatty acids, antioxidants, and polyphenols,4 which can significantly decrease the effect of atherosclerotic factors. One such product is flaxseed (Linum usitatissimum L.).
The nutritional composition of flaxseed comprises fats (41%), dietary fibers (28%), proteins (21%), moisture (7.7%), ashes (3.5%), and soluble sugars (1 – 2%),5,6 and their lipid content includes 51 – 55% of alpha-linolenic acid.7 Additionally, flaxseed is the richest source of lignan secoisolariciresinol-diglucoside (SDG), which has potent antioxidant and antiatherogenic properties.
Based on these considerations, the study of the functional properties of flaxseed becomes essential for the scientific community and the general population. The aim of the present study was to assess the potential effects of flaxseed on atherogenesis in rabbits subjected to a high-cholesterol diet (containing 0.25% cholesterol) of lyophilized eggs. For this purpose, we analyzed the lipid levels and performed immunohistochemical analysis of inflammatory markers in the aortic segments of the rabbits.
Methods
The present study was approved by the Animal Research Ethics Committee of PUC-PR under the protocol number 720/2012 and was conducted in the Laboratory of Experimental Surgery at Hospital Angelina Caron (HAC), the Experimental Pathology Laboratory at PUC-PR, and the Central Animal Facility at PUC-PR.
Animals
Thirty male New Zealand white rabbits (Oryctolagus cuniculus) weighing approximately 3 kg and with a mean age of 4 months were selected for the experiment. Calculation of the sample size was based on the study by Prim et al., (2008).8 The rabbits were kept in the animal facility at PUC-PR in a macroenvironment with light/dark cycles of 12/12 hours, fresh air changes, and temperature controlled between 19°C and 23°C. The animals were identified on an individual basis and maintained in individual cages cleaned daily.
Experimental period and group distribution
The study was conducted over 12 weeks (84 days). The animals were maintained in individual cages and randomized to three groups according to dietary treatment. The control group (G1, n = 10) received a standard diet for rabbits (Nuvital® Nutrientes S.A. Colombo, PR, Brazil). The high-cholesterol diet group (G2, n = 10) received a standard diet for rabbits (Nuvital®) plus 0.25% cholesterol from lyophilized eggs. The high-cholesterol plus flaxseed diet group (G3, n = 9) received a standard diet for rabbits (Nuvital®), 0.25% cholesterol from lyophilized eggs, and 8 g of ground flaxseed per kg of body weight.
Preparation of supplementary feed
The high-cholesterol diet offered to groups G2 and G3 throughout the experimental period contained 0.25% cholesterol, which was added to induce atherosclerotic lesions in the aorta. In order to achieve that, 5 kg of standard feed (Nuvital®), weighed and ground for each animal group, was added to 1,800 g of egg powder diluted in 2,000 mL of water.
The flaxseed concentration was 8 g per kg of body weight. The seeds were ground in a food processor and stored under refrigeration before added to the feed.
The feed given to groups G2 and G3 was supplemented with lyophilized eggs. This mixture was processed using an industrial meat grinder (Poli®, model PCP-22LR-N, feeder #10, Siemsen, Brusque, SC, Brazil). For group G3, the mixture was supplemented with ground flaxseed. After grinding the mixture, the feed was pelleted, and the pellets were heated in an electric oven for 10 min at a temperature of 180°C.
The prepared feed was stored under refrigeration until use.
Animal preparation and sample collection
The animals were anesthetized, and blood was collected according to the method described by Précoma et al.,9 and Alessi et al.,10 Xylazine (Coopazineâ; Schering-Plough-Coopers, Cotia, SP, Brazil) at 5 mg/kg mixed with ketamine (Vetanarcolâ, König, Mairinque, SP, Brazil) at 30 mg/kg was administered intramuscularly into the rabbits’ thigh area. Biochemical analyses performed on days 1 and 84 included total cholesterol (TC), LDL-C, high-density lipoprotein (HDL-C), and triglycerides (TG), which were assessed using an automated equipment (ADVIA 1200, Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Newark, DE, USA) and commercial kits.
Histological analysis
The thoracic aorta was removed at the level of the aortoiliac bifurcation following a midline thoracotomy and laparotomy, and cross sections with a thickness of 2 to 3 mm were cut from different aortic segments. Each segment was labeled, placed in a microtome (Leica® RM2145, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Germany) for overnight processing, and dehydrated with a graded ethanol series (70%, 80%, and 90%). The tissue samples were subsequently diaphanized for 12 hours in xylol containing serial concentrations of paraffin. Paraffin blocks were obtained by embedding the samples in hot paraffin using a tissue embedding console system (Leica® EG1160, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Germany), according to the standard procedure.
The paraffin blocks were cut into 5 µm sections using the microtome (Leica® RM 2145). Each section was stained with hematoxylin and eosin (HE) and orcein (elastic tissue staining) according to conventional techniques and mounted on permanent slides.
Blocks with four aortic segments were prepared by selecting one proximal segment near the aortic arch (point 1), one segment located in the thoracic aorta (point 2), one proximal segment in the abdominal aorta (point 3), and one distal segment in the abdominal aorta (point 4). These segments were selected according to the histological findings in HE staining.
Immunohistochemical analysis
The tissue microarray (TMA) technique was used for immunohistochemical analysis. The samples were incubated with intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) monoclonal antibodies at a dilution of 1:50, and mixed with tumor necrosis factor alpha (TNF-α) monoclonal antibody for 1 hour. The antibodies were detected by incubating the slides with the substrate 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride-dihydrate (DAB; DakoCytomation A/S, Glostrup, Denmark). Counterstaining was performed with Mayer’s hematoxylin, followed by sample dehydration with different concentrations of 100% ethanol and deparaffinization with xylol. The slides were mounted with Canada balsam. The protocol described above was standardized at our department. Positive and negative controls were used for each reaction.
The histological sections were digitized with a scanner (Axio Scan Z1, Zeiss, Jena, Germany) and the images were analyzed using Image-Pro Plus® software, version 4.5. The color morphometry method was applied, staining the areas with positive antibody imaging in pink and those with negative imaging in brown. The data were transferred to an Excel spreadsheet and subjected to statistical analysis.
Statistical analysis
The results are expressed as mean, median, minimum and maximum, and standard deviation values. The assumption of normality of the variables was assessed using the Kolmogorov-Smirnov test. The variables not meeting the normality assumption were analyzed using the Kruskal-Wallis nonparametric test. P values below 0.05 were considered statistically significant. The data were analyzed using the IBM SPSS Statistics software, version 20.0.
Results
One death occurred in group G3 at experimental week 12, resulting in a total of 29 rabbits in the final study sample.
Lipid profileTotal cholesterol
Serum TC levels increased significantly in groups G2 and G3 compared with G1. This result demonstrates that the diet was effective in increasing cholesterol levels in the rabbits (Table 1).
Mean, median, minimum and maximum, standard deviation, and p values for total cholesterol in all groups
Variable
Group
n
Mean
Median
Minimum
Maximum
Standard deviation
p value*
Total cholesterol (baseline)
Control (G1)
10
35.60
34.00
14.00
69.00
15.13
Cholesterol (G2)
10
24.60
24.50
12.00
43.00
9.51
Flaxseed (G3)
9
28.33
24.00
15.00
54.00
13.51
0.174
Total cholesterol (end of the study)
Control (G1)
10
23.64
21.50
8.90
57.00
15.72
Cholesterol (G2)
10
62.09
24.54
12.90
336.00
100.23
Flaxseed (G3)
8
36.21
34.20
16.40
72.00
17.32
0.204
Difference (end of the study - baseline)
Control (G1)
10
-11.96
-13.50
-31.00
6.00
12.50
Cholesterol (G2)
10
37.49
2.55
-28.00
305.00
97.79
Flaxseed (G3)
9
3.86
3.00
-19.00
18.00
10.83
0.029
Nonparametric Kruskal-Wallis test, p < 0.05.
LDL-C and HDL-Cl
There were no significant differences in the levels of LDL-C and HDL-C among the groups (Tables 2 and 3). However, serum LDL-C levels in the biochemical analysis were higher in group G2 at the end of the experiment. The increase in LDL-C in group G3 was approximately six times lower than that in G2. HDL-C levels increased in groups G1 (12.93 mg/dL), G2 (82.26 mg/dL), and G3 (12.03 mg/dL), with the highest increase observed in G2.
Mean, median, minimum and maximum, standard deviation, and p values for LDL C in all groups
Variable
Group
n
Mean
Median
Minimum
Maximum
Standard deviation
p value*
LDL-C (baseline)
Control (G1)
10
8.64
8.45
2.90
18.10
5.61
Cholesterol (G2)
10
7.83
6.30
1.20
27.10
7.60
Flaxseed (G3)
9
11.92
7.40
4.50
27.30
7.94
0.305
LDL- C (end of the study)
Control (G1)
10
21.57
16.45
3.90
81.00
21.49
Cholesterol (G2)
10
90.09
32.00
7.50
348.00
123.47
Flaxseed (G3)
8
26.95
22.00
2.40
93.00
29.82
0.145
Difference (end of the study - baseline)
Control (G1)
10
12.93
11.65
-5.70
63.50
19.71
Cholesterol (G2)
10
82.26
21.95
4.90
341.80
124.45
Flaxseed (G3)
9
12.03
0.50
-27.30
79.40
30.61
0.085
Nonparametric Kruskal-Wallis test, p < 0.05.
Mean, median, minimum and maximum, standard deviation, and p values for HDL C in all groups
Variable
Group
n
Mean
Median
Minimum
Maximum
Standard deviation
p value*
HDL-C (baseline)
Control (G1)
10
19.29
16.45
10.30
37.30
8.60
Cholesterol (G2)
10
17.15
17.70
9.80
25.40
5.78
Flaxseed (G3)
9
15.79
13.40
7.70
33.50
8.35
0.475
HDL-C (end of the study)
Control (G1)
10
21.55
22.50
1.00
41.90
12.80
Cholesterol (G2)
10
48.76
25.65
4.30
290.70
85.99
Flaxseed (G3)
8
28.16
26.25
4.20
60.00
17.71
0.780
Difference (end of the study - baseline)
Control (G1)
10
2.26
-2.15
-13.30
14.90
10.39
Cholesterol (G2)
10
31.61
9.00
-15.30
278.70
87.50
Flaxseed (G3)
9
9.24
8.00
-16.50
46.60
17.48
0.570
Nonparametric Kruskal-Wallis test, p < 0.05.
Triglycerides
The diet did not increase the TG levels in the study groups. In addition, TG levels in G3 decreased by approximately 70% (Table 4). At the end of the experiment, the results indicated significant differences in TG levels between G1 and G3 (p = 0.034), and between G2 and G3 (p = 0.015).
Mean, median, minimum and maximum, standard deviation, and p values for triglycerides in all groups
Variable
Group
n
Mean
Median
Minimum
Maximum
Standard deviation
p value*
Triglycerides (baseline)
Control (G1)
10
65.30
50.00
36.00
206.00
50.87
Cholesterol (G2)
10
59.50
56.50
25.00
146.00
32.74
Flaxseed (G3)
9
79.44
78.00
32.00
149.00
38.20
0.308
Triglycerides - (end of the study)
Control (G1)
10
67.50
65.00
7.00
228.00
63.27
Cholesterol (G2)
10
64.60
44.50
20.00
204.00
53.31
Flaxseed (G3)
8
22.50
14.00
11.00
53.00
15.26
0.042
Difference (end of the study - baseline)
Control (G1)
10
2.20
13.50
-56.00
47.00
33.98
Cholesterol (G2)
10
5.10
-17.50
-98.00
148.00
66.92
Flaxseed (G3)
9
-59.44
-63.00
-149.00
16.00
48.12
0.022
Nonparametric Kruskal-Wallis test, p < 0.05.
Immunohistochemical analysis
Immunohistochemistry was used to investigate the presence of ICAM-1 and TNF-α in all four aortic segments.
The results indicated that ICAM-1 levels increased only in aortic segment 4 in group G3; however, there was no significant difference in relation to median levels (Figure 1).
Mean intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) values at the animals’ aortic segment 4 in each group.
A similar result was found for TNF-α, that is, the level of this marker was significantly increased in the aortic segment 4 (Figure 2). TNF-α levels in group G3 were similar to those in the control group, while the levels in group G2 were greater than twice as those in the control group (p < 0.05).
Mean tumor necrosis factor alpha (TNF-α) values at the animals’ aortic segment 4 in each group.
Discussion
Atherosclerosis is a major cardiovascular disease, and the understanding of its development is required for its prevention and treatment. This knowledge can be acquired using experimental models. In this respect, several animal studies have shown that a high-fat diet leads to obesity, hypercholesterolemia, and other complications such as endothelial lesions.11 The experimental protocol in the present study was an early model of atherosclerosis and involved the addition of 0.25% cholesterol from lyophilized eggs to the diet of rabbits aiming at causing atherosclerotic lesions.12 The use of rabbits as an experimental model suits the objectives of this study because these animals develop aortic lesions fast.
This study assessed the biochemical and immunochemical changes caused by a high-cholesterol diet with and without flaxseed, which is considered a functional food.
The increase in TC found in the biochemical analysis in groups G2 and G3 was not expected in the group treated with flaxseed. A similar result was obtained by Dupasquier et al., 13 who observed no changes in TC in animals receiving a diet with 10% of flaxseed. This unexpected result may be explained by several factors, including the concentration of flaxseed used, the form of flaxseed administration (ground seeds), feed heating for the incorporation of components, and the duration of seed intake. Previous results have indicated that alpha-linolenic and linoleic acids are sensitive to light, heating, and oxygen, and undergo oxidation when exposed to temperatures between 120°C and 270°C.14 Therefore, the process of production of feed containing flaxseed in the present study may have caused a decrease in the level of these acids, thereby compromising their nutraceutical function.
LDL-C levels increased in the groups treated with high cholesterol; however, the levels remained similar between these groups. Similar results were obtained in a study in humans involving the consumption of flaxseed, in which the levels of TC and LDL-C remained unchanged,15 even though the experimental period of 4 weeks may not have been sufficient to cause this reduction. Zheng et al.,16 conducted a randomized clinical trial in individuals diagnosed with hypercholesterolemia and used a lignan extract from flaxseed during an 8-week period. The LDL-C levels in the group that received 600 mg of the extract decreased between weeks 6 and 8. These authors concluded that the lignan extract decreased the concentration of cholesterol in a dose-dependent manner. One study investigated the effect of phytosterol intake and indicated that blood cholesterol levels decreased after 4 weeks.17 In addition, cholesterol levels remained unchanged between weeks 8 and 12,18,19 which suggested that seasonal factors may have affected the results.
In the present study, TC increased in all tested groups. Studies have shown that lignans present in flaxseed reduce serum cholesterol. This effect is probably related to their antioxidant properties, provided by secoisolariciresinol lignan (SDG), enterolactone, and enterodiol, which inhibit the peroxidation of polyunsaturated fatty acids in vitro and favor the decrease in cholesterol levels.20 One hypothesis to explain the discrepancy between the results of this study from others in the literature is the high concentration of ingested cholesterol. Another hypothesis is the duration of the functional diet (8 weeks), which may have been too short to induce a significant reduction in LDL-C and TC.
In the present study, no differences in HDL-C levels were observed among the three groups. Higher levels of HDL-C increase the protection against the development of atherosclerotic plaques in the heart. Studies have shown that flaxseed intake at a dose of 15% was strongly associated with protection from inflammation, estrogens, and genotoxicity.21
The results that we found most fascinating were those of TG levels. There was a significant decrease (by approximately 70%) in this biochemical parameter in group G3, which demonstrates that the administration of feed containing flaxseed (a functional food that contains primarily omega-3 fatty acids, fibers, and lignans) was effective in decreasing TG levels. This result is in line with those from previous studies and suggests that dietary supplementation with omega-3 via the consumption of flaxseed helps decrease TG levels, possibly via the decrease of remaining chylomicron particles and the inhibition of the synthesis and secretion of very low-density lipoprotein (VLDL-C) by the liver.22
Cintra et al.,23 tested the effect of the consumption of a high-fat flaxseed-based diet in Wistar rats and observed a reduction in TC and TG levels, higher fecal excretion of lipids, and lower deposition of cholesterol in the liver. This result was similar to that obtained by Bhathena (2003).23
Immunohistochemistry was used to investigate the presence of two markers involved in inflammation, a cellular adhesion molecule (ICAM-1) and a proinflammatory cytokine (TNF-α). Several studies have used ICAM-1 as a marker of inflammation. In a study with 60 rabbits (10 in the control group and 50 in the atherosclerotic group), animals fed a high-fat diet exhibited higher levels of ICAM-1 in the aorta compared with those in the control group (p < 0.01), which indicates a role for ICAM-1 as a predictor of cardiovascular disease.25
The importance of the present study lies in the analysis of ICAM-1 in four aortic segments. The results indicated an increase in ICAM-1 levels in all animal groups and all tissue sections; however, the results were not statistically significant. A similar result was obtained in an animal study conducted by Prim et al.,8 and in human studies, which also showed nonsignificant reductions in the levels of ICAM-1 and VCAM-1 markers.26
We should emphasize that no antiinflammatory activity was observed in the group that received flaxseed (G3), suggesting that the findings of the antiinflammatory effect of omega-3 fatty acids are contradictory. In addition, the results of ICAM-1 suggest that this activity is dependent on the duration of consumption of omega-3 fatty acids.
The results of the TNF-α analysis indicated a significant difference among the groups. TNF-α levels were higher in G1 than G3. This result demonstrated an effect of flaxseed, but was not statistically significant. Moreover, the levels of TNF-α increased in G2, which indicates that this marker is associated with stress and inflammation. A similar result was observed in a previous study,27 in which the elevated levels of TNF-α were associated with recurrent coronary events after myocardial infarction.
Levels of the inflammatory marker TNF-α decreased significantly in group G3 (flaxseed group), which favors the hypothesis that flaxseed components can reduce antiinflammatory and antiatherogenic activity. A previous study has observed a decrease in TNF-α levels after the consumption of omega-3 fatty acids by most patients.28
Conclusion
The results of this study are aligned with others in the literature and showed a decreased development of atherosclerosis in the group fed a functional diet.
The results obtained in the flaxseed group showed significant changes in serum TG and decreased TNF-α levels on immunohistochemical analysis. These findings corroborate observations from previous studies that have shown flaxseed as having a strong tendency to act effectively in reducing TNF-α levels, thus preventing injury and development of atherosclerotic plaques in the intima of coronary arteries.
However, several differences may arise when changes are made to the experiment or study protocol, so it we suggest that a larger number of studies should be conducted directly comparing these functional seeds.
Sources of Funding
There were no external funding sources for this study.
Study Association
This article is part of the thesis of master submitted by Maynara Leonardi Schuh Martins, from Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee of the Pontifícia Universidade Católica do Paraná under the protocol number 720-2012. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.
Acknowledgments
We are thankful to Jasmine Alimentos Ltda. (Curitiba, PR, Brazil) for donating the flaxseed used in the study. We are also grateful for the medical students (Pontifical Catholic University of Paraná) Carlos Humberto Guilman Tanizawa, Bruno Carnevalli, Alexandre da Silva Phaco Jr. and Eduardo Hubbe Buss for their assistance in feeding the animals.
References1 Xavier HT, Izar MC, Faria Neto JR, Assad MH, Rocha VZ, Sposito AC, et al; Sociedade Brasileira de Cardiologia. [;V Brazilian Guidelines on Dyslipidemias and Prevention of Atherosclerosis];. Arq Bras Cardiol. 2013;101(4 Suppl 1):1-20. doi: 105935/abc20135010.XavierHTIzarMCFariaJRNetoAssadMHRochaVZSpositoACSociedade Brasileira de Cardiologia V Brazilian Guidelines on Dyslipidemias and Prevention of AtherosclerosisArq BrasCardiol20131014 Suppl 1120105935/abc201350102 Castro PS, Oliveira FL. Prevention of atherosclerosis and drug treatment of high-risk lipid abnormalities in children and adolescents. J Pediatr (Rio J). 2009;85(1):6-14. doi:10.2223/JPED.1852.CastroPSOliveiraFLPrevention of atherosclerosis and drug treatment of high-risk lipid abnormalities in children and adolescentsJ Pediatr (Rio J)200985161410.2223/JPED.18523 Schoenhagen P, Tuzcu EM. Atherosclerosis imaging in progression/regression trials: surrogate marker or direct window into the atherosclerotic disease process? Arq Bras Cardiol. 2008;91(6):385-98. PMID: 19142366.SchoenhagenPTuzcuEMAtherosclerosis imaging in progression/regression trials: surrogate marker or direct window into the atherosclerotic disease process?Arq Bras Cardiol2008916385398191423664 Bloedon LT, Szapary PO. Flaxseed and cardiovascular risk. Nutr Rev. 2004;62(1):18-27. PMID: 14995053.BloedonLTSzaparyPOFlaxseed and cardiovascular riskNutr Rev20046211827149950535 Kasote DM. Flaxseed phenolics as natural antioxidants. Int Food Res J. 2013;20(1):27-34.KasoteDMFlaxseed phenolics as natural antioxidantsInt Food Res J201320127346 Prasad K. Flaxseed and cardiovascular health. J Cardiovasc Pharmacol. 2009;54(5):369-77. doi: 10.1097/FJC.0b013e3181af04e5.PrasadKFlaxseed and cardiovascular healthJ Cardiovasc Pharmacol200954536937710.1097/FJC.0b013e3181af04e57 Padilha PC, Pinheiro RL. O papel dos alimentos funcionais na prevenção e controle do câncer de mama. Rev Bras Cancerol. 2004;50(3):251-60.PadilhaPCPinheiroRLO papel dos alimentos funcionais na prevenção e controle do câncer de mamaRev Bras Cancerol20045032512608 Prim CR, Baroncini LA, Précoma LB, Caron PH, Winter G, Poletti MO, et al. Effects of linseed consumption for a short period of time on lipid profile and atherosclerotic lesions in rabbits fed a hypercholesterolaemic diet. Br J Nutr. 2012;107(5):660-4. doi: 10.1017/S0007114511003539.PrimCRBaronciniLAPrécomaLBCaronPHWinterGPolettiMOEffects of linseed consumption for a short period of time on lipid profile and atherosclerotic lesions in rabbits fed a hypercholesterolaemic dietBr J Nutr2012107566066410.1017/S00071145110035399 Précoma DB, Noronha L, Moura AV, Yamada AS, Knopfholz J, Dusilek CL, et al. Vascular radiolesion as a deleterious effect of high-dose-rate intraarterial brachytherapy with samarium-153 in hypercholesterolemic rabbits. Arq Bras Cardiol. 2006;87(4):512-9. PMID: 17128322.PrécomaDBNoronhaLMouraAVYamadaASKnopfholzJDusilekCLVascular radiolesion as a deleterious effect of high-dose-rate intraarterial brachytherapy with samarium-153 in hypercholesterolemic rabbitsArq Bras Cardiol20068745125191712832210 Alessi A, França Neto OR, Brofman PR, Camila Prim C, Noronha L, Kuenzer RF, et al. Use of rosiglitazone before and after vascular injury in hypercholesterolemic rabbits: assessment of neointimal formation. Thromb J. 2008;6:12. doi: 10.1186/1477-9560-6-12.AlessiAFrançaORNetoBrofmanPRCamila PrimCNoronhaLKuenzerRFUse of rosiglitazone before and after vascular injury in hypercholesterolemic rabbits: assessment of neointimal formationThromb J20086121210.1186/1477-9560-6-1211 Martins F, Campos SH, Pagan UL, Martinez PF, Okoshi K, Okoshi MP, et al. High-fat diet promotes cardiac remodeling in an experimental model of obesity. Arq Bras Cardiol. 2015;105(5):479-86. doi: 10.5935/abc.20150095.MartinsFCamposSHPaganULMartinezPFOkoshiKOkoshiMPHigh-fat diet promotes cardiac remodeling in an experimental model of obesityArq Bras Cardiol2015105547948610.5935/abc.2015009512 Bocan TM, Mueller SB, Mazur MJ, Uhlendorf PD, Brown EQ, Kieft KA. The relationship between the degree of dietary-induced hypercholesterolemia in the rabbit and atherosclerotic lesion formation. Atherosclerosis. 1993;102(1):9-22. PMID: 8257456.BocanTMMuellerSBMazurMJUhlendorfPDBrownEQKieftKAThe relationship between the degree of dietary-induced hypercholesterolemia in the rabbit and atherosclerotic lesion formationAtherosclerosis19931021922825745613 Dupasquier CH, Weber AM, Ander BP, Rampersad PP, Steigerwald S, Wigle JT, et al. Effects of dietary flaxseed on vascular contractile function and atherosclerosis during prolonged hypercholesterolemia in rabbits. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006;291(6):H2987-96, doi: 10.1152/ajpheart.01179.2005.DupasquierCHWeberAMAnderBPRampersadPPSteigerwaldSWigleJTEffects of dietary flaxseed on vascular contractile function and atherosclerosis during prolonged hypercholesterolemia in rabbitsAm J Physiol Heart Circ Physiol20062916H2987H299610.1152/ajpheart.01179.200514 Marques AC, Hautrive TP, Moura GB, Callegaro MG, Hecktheuer LH. Effect of flaxseed (Linum usitatissimum L.) prepared by different methods on the biological response of rats. Rev Nutr. 2011;24(1):131-41.MarquesACHautriveTPMouraGBCallegaroMGHecktheuerLHEffect of flaxseed (Linum usitatissimum L. ) prepared by different methods on the biological response of ratsRev Nutr201124113114115 Stuglin C, Prasad K. Effect of flaxseed consumption on blood pressure, serum lipids, hemopoietic system and liver and kidney enzymes in healthy humans. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2005;10(1):23-7. doi: 10.1177/107424840501000103.StuglinCPrasadKEffect of flaxseed consumption on blood pressure, serum lipids, hemopoietic system and liver and kidney enzymes in healthy humansJ Cardiovasc Pharmacol Ther2005101232710.1177/10742484050100010316 Zheng Y, Weisenborn DP, Tostenson K, Kangas N. Energy analysis in the screw pressing of whole and dehulled flaxseed. Journal of Food Engineering. 2005;66(2):193-202. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2004.03.005.ZhengYWeisenbornDPTostensonKKangasNEnergy analysis in the screw pressing of whole and dehulled flaxseedJournal of Food Engineering200566219320210.1016/j.jfoodeng.2004.03.00517 Kris-Etherton PM, Dietschy J. Design criteria for studies examining individual fatty acid effects on cardiovascular disease risk factors: human and animal studies. Am J Clin Nutr. 1997;65(5 Suppl):1590S-6S. PMID: 9129499.Kris-EthertonPMDietschyJDesign criteria for studies examining individual fatty acid effects on cardiovascular disease risk factors: human and animal studiesAm J Clin Nutr19976551590S1596S912949918 Nguyen TT, Dale LC, Von Bergmann K, Croghan IT. Cholesterollowering effect of stanol ester in a US population of mildly hypercholesterolemic men and women: a randomized controlled trial. Mayo Clin Proc. 1999:74(12):1198-206. doi: 10.4065/74.12.1198.NguyenTTDaleLCVon BergmannKCroghanITCholesterollowering effect of stanol ester in a US population of mildly hypercholesterolemic men and women: a randomized controlled trialMayo Clin Proc1999747410.4065/74.12.119819 Blair SN, Capuzzi DM, Gottlieb SO, Nguyen T, Morgan JM, Cater NB. Incremental reduction of serum total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol with the addition of plant stanol estercontaining spread to statin therapy. Am J Cardiol. 2000;86(1):46-52. PMID: 10867091.BlairSNCapuzziDMGottliebSONguyenTMorganJMCaterNBIncremental reduction of serum total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol with the addition of plant stanol estercontaining spread to statin therapyAm J Cardiol200086146521086709120 Prasad K. Hypocholesterolemic and antiatherosclerotic effect of flax lignan complex isolated from flaxseed. Atherosclerosis. 2005;179(1):269-75. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2004.11.012.PrasadKHypocholesterolemic and antiatherosclerotic effect of flax lignan complex isolated from flaxseedAtherosclerosis2005179126927510.1016/j.atherosclerosis.2004.11.01221 Dikshit MA, Gomes Filho E, Eilati S, McGee C, Small C, Gao T. Flaxseed reduces the pro-carcinogenic micro-environment in the ovaries of normal hens by altering the PG and oestrogen pathways in a dose dependent manner. Br J Nutr. 2015;113(9):1384-95. doi: 10.1017/S000711451500029X.DikshitMAGomesEFilhoEilatiSMcGeeCSmallCGaoTFlaxseed reduces the pro-carcinogenic micro-environment in the ovaries of normal hens by altering the PG and oestrogen pathways in a dose dependent mannerBr J Nutr201511391384139510.1017/S000711451500029X22 AdkinsY, Kelley DS. Mechanisms underlying the cardioprotective effects of omega-3 polyunsaturated fatty acids. J Nutr Biochem. 2010:21(9):781-92. doi: 10.1016/j.jnutbio.2009.12.004.AdkinsYKelleyDSMechanisms underlying the cardioprotective effects of omega-3 polyunsaturated fatty acidsJ Nutr Biochem2010212110.1016/j.jnutbio.2009.12.00423 Cintra DE, Costa AV, Penuzio Mdo C, Matta SL, Silva MT, Costa, NM. Lipid profile of rats fed high-fat diets based on flaxseed, peanut, trout or chicken skin. Nutrition. 2006:22(2):197-205. doi: 10.1016/j.nut.2005.09.003.CintraDECostaAVPenuzio MdoCMattaSLSilvaMTCostaNMLipid profile of rats fed high-fat diets based on flaxseed, peanut, trout or chicken skinNutrition2006222210.1016/j.nut.2005.09.00324 Bhathena SJ, Ali AA, Haudenschild C, Latham P, Ranich T, Mohamed AI, et al. Dietary flaxseed mealis more protective than soy protein concentrate against hypertriglyceridemia and steatosis of the liver in an animal model of obesity. J Am Coll Nutr. 2003;22(2):157-64. PMID: 12672712.BhathenaSJAliAAHaudenschildCLathamPRanichTMohamedAIDietary flaxseed mealis more protective than soy protein concentrate against hypertriglyceridemia and steatosis of the liver in an animal model of obesityJ Am Coll Nutr20032221571641267271225 Li M, Wang X, Yang L, Gao C, Ma Y. Psychological stress increases expression of aortic plaque intercellular adhesion molecule-1 and seruminflammatory cytokines in atherosclerotic rabbit model. J Geriatr Cardiol. 2008;5(4):235-42.LiMWangXYangLGaoCMaYPsychological stress increases expression of aortic plaque intercellular adhesion molecule-1 and seruminflammatory cytokines in atherosclerotic rabbit modelJ Geriatr Cardiol20085423524226 Abe Y, El-Masri B, Kimball KT, Pownall H, Reilly CF, Osmundsen K, et al. Soluble cell adhesion molecules in hypertrigliceridemia and potential significance on monocyte adhesion. Aterioscler Thoromb Vasc Biol. 1998;18(5):723-31. PMID: 9598830.AbeYEl-MasriBKimballKTPownallHReillyCFOsmundsenKSoluble cell adhesion molecules in hypertrigliceridemia and potential significance on monocyte adhesionAterioscler Thoromb Vasc Biol1998185723731959883027 Ridker PM, Rifai N, Pfeffer M, Sacks F, Lepage S, Braunwald E. Elevation of tumor necrosis factor-alpha and increased risk of recurrent coronary events after myocardial infarction. Circulation.2000;101(18):2149-53. PMID: 10801754.RidkerPMRifaiNPfefferMSacksFLepageSBraunwaldEElevation of tumor necrosis factor-alpha and increased risk of recurrent coronary events after myocardial infarctionCirculation200010118214921531080175428 Grunfeld C, Kotler DP, Shigenaga JK, Doerrler W, Tierney A, Wang J, et al. Circulating interferon-alpha levels and hypertriglyceridaemia in the acquired immunodeficiency syndrome. Am J Med. 1991;90(2):154-62. PMID: 1996584.GrunfeldCKotlerDPShigenagaJKDoerrlerWTierneyAWangJCirculating interferon-alpha levels and hypertriglyceridaemia in the acquired immunodeficiency syndromeAm J Med.19919021541621996584Artigos OriginaisRedução do Marcador Inflamatório TNF-α após Consumo de Semente de Linhaça por Coelhos HipercolesterolêmicosMartinsMaynara Leonardi Schuh1LimaAniely Bacelar Rocco de1ChamposkiAna Flavia1PereiraPamela Cristiani1MartinsFernando2TanizawaCarlos1PrécomaLeonardo1CampeloPatrícia1Guarita-SouzaLuiz César1PrécomaDalton Bertolim1Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR), Paraná, PRUniversidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Mato Grosso do Sul, MS – BrasilAutor Correspondente: Maynara Leonardi Schuh Martins, Rua Prof. Sebastião Paraná 762. Vila Izabel. Curitiba. CEP 80320-070, Novo Mundo, Curitiba, Paraná, PR – Brasil. E-mail: may.schuh@hotmail.com; fernando.ecoatividade@hotmail.com
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Martins MLS, Lima ABR, Champoski AF, Précoma L, Precoma DB. Obtenção de dados: Martins MLS, Lima ABR, Tanizawa C. Análise e interpretação dos dados: Martins MLS, Champoski AF, Pereira PC, Martins F, Precoma DB. Análise estatística: Martins MLS, Campelo P. Obtenção de financiamento: Martins MLS, Lima ABR, Pereira PC. Redação do manuscrito: Martins MLS, Martins F. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Martins MLS, Lima ABR, Martins F, Campelo P, Souza LCG. Supervisão / como investigador principal: Precoma DB.
Potencial Conflito de Interesse
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamentos:
Alimentos funcionais, como a linhaça, têm sido consumidos com frequência para prevenção da aterosclerose.
Objetivos:
Avaliar os efeitos da linhaça sobre a aterogênese em coelhos submetidos a uma dieta rica em colesterol.
Métodos:
Trinta coelhos albinos machos foram randomizados em três grupos com base em um tratamento dietético por 12 semanas: grupo controle (G1), dieta padrão; dieta rica em colesterol (G2), dieta padrão mais 0,25% de colesterol proveniente de ovos liofilizados; e dieta rica em colesterol mais linhaça (G3), dieta semelhante à do G2 adicionada de linhaça. Análise bioquímica (colesterol total [CT], lipoproteína de alta densidade [HDL-colesterol], lipoproteína de baixa densidade [LDL-colesterol] e triglicérides) e imunohistoquímica (molécula de adesão intercelular 1 [ICAM-1] e fator de necrose tumoral alfa [TNF-α]) foram realizadas em todos os grupos. Valores de p < 0,05 indicaram significância estatística.
Resultados:
Às 12 semanas, os níveis séricos de CT aumentaram significativamente nos grupos G2 e G3 em comparação com o G1. Os níveis séricos de LDL-colesterol foram mais altos no grupo G2, e o aumento no grupo G3 foi cerca de seis vezes menor do que no G2. Os níveis de HDL-colesterol aumentaram em todos os grupos, com o maior aumento observado no G2. Os níveis de triglicérides no G3 reduziram em ~70% e diferiram significativamente entre o G1 e G3 (p = 0,034) e G2 e G3 (p = 0,015). Níveis de ICAM-1 aumentaram apenas no segmento aórtico 4 no G3. Os níveis de TNF-α no grupo G3 foram semelhantes aos do grupo controle, enquanto os níveis no G2 foram maiores do que o dobro em relação aos do grupo controle (p < 0,05).
Conclusões:
O grupo alimentado com uma dieta funcional (linhaça) mostrou redução no desenvolvimento de aterosclerose, níveis séricos mais baixos de triglicérides e níveis mais baixos de TNF-α à imunohistoquímica. (Int J Cardiovasc Sci. 2018;31(2)114-122)
Palavras-chave:CoelhosLinho / sementesAterosclerose / prevenção e controleDieta AterogênicaColesterol na DietaObesidadeEstilo de Vida SedentárioIntrodução
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica marcada por disfunção endotelial que afeta a camada íntima das artérias de médio e grande calibre.1 Este processo ocorre lentamente ao longo de décadas e tem o potencial de evoluir para lesões mais avançadas que podem romper e desencadear a formação de trombo, potencialmente levando ao infarto agudo do miocárdio e morte.2
Vários fatores estão implicados na etiologia da aterosclerose, incluindo elevação persistente de lipoproteínas séricas aterogênicas (como a lipoproteína de baixa densidade [LDL-C]), que estão associadas com fatores de estilo de vida como hábitos alimentares inadequados, sedentarismo e obesidade, além de deposição dessas lipoproteínas na túnica média.2,3
Muitos produtos alimentares com propriedades funcionais/nutracêuticas têm sido estudados com o objetivo de impedir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas e promover efeitos cardiovasculares positivos. Esses produtos contêm fibras alimentares, fitoesteróis, ácidos graxos ômega 3, antioxidantes e polifenóis,4 o que pode diminuir significativamente o efeito de fatores ateroscleróticos. Um destes produtos é a linhaça (Linum usitatissimum L.).
A composição nutricional da linhaça compreende gorduras (41%), fibras alimentares (28%), proteínas (21%), umidade (7,7%), cinzas (3,5%) e açúcares solúveis (1 – 2%)5,6 e seu conteúdo lipídico inclui 51 – 55% de ácido alfa-linoleico.7 Além disto, a linhaça é a fonte mais rica da lignana secoisolariciresinol-diglicosídeo (SDG), que tem propriedades antioxidantes e antiaterogênicas potentes.
Com base nestas considerações, o estudo das propriedades funcionais da linhaça torna-se essencial para a comunidade científica e a população em geral. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos potenciais da linhaça na aterogênese em coelhos submetidos a uma dieta rica em colesterol (contendo 0,25% de colesterol) com uso de ovos liofilizados. Para este fim, foi realizada análise do perfil lipídico e análise imunohistoquímica de marcadores inflamatórios em segmentos aórticos de coelhos.
Métodos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da PUC-PR sob o protocolo de número 720/2012 e foi conduzido no Laboratório de Cirurgia Experimental do Hospital Angelina Caron (HAC), no Laboratório de Patologia Experimental da PUC-PR e no Biotério da PUC-PR.
Animais
Trinta coelhos New Zealand (Oryctolagus cuniculus) machos, brancos, com peso aproximado de 3 kg e idade média de 4 meses foram selecionados para o experimento. O cálculo do tamanho da amostra foi baseado no estudo de Prim et al., 8 Os coelhos foram mantidos no biotério da PUC-PR em um macroambiente com ciclos luz/escuro de 12/12 horas, mudanças de ar fresco e temperatura controlada entre 19°C e 23°C. Os animais foram identificados individualmente e mantidos em gaiolas individuais limpas diariamente.
Período experimental e distribuição de grupos
O estudo foi realizado ao longo de 12 semanas (84 dias). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais e randomizados em três grupos de acordo com o tratamento dietético. O grupo controle (G1, n = 10) recebeu uma dieta padrão para coelhos (Nuvital® Nutrientes S.A. Colombo, PR, Brasil). O grupo randomizado para uma dieta rica em colesterol (G2, n = 10) recebeu uma dieta padrão para coelhos (Nuvital®) mais 0,25% de colesterol a partir de ovos liofilizados. O grupo randomizado para uma dieta rica em colesterol mais linhaça (G3, n = 9) recebeu uma dieta padrão para coelhos (Nuvital®), 0,25% de colesterol a partir de ovos liofilizados e 8 g de linhaça moída por kg de peso corporal.
Preparação da alimentação complementar
A dieta rica em colesterol oferecida aos grupos G2 e G3 durante todo o período experimental continha 0,25% de colesterol, que foi adicionado com o objetivo de induzir lesões ateroscleróticas na aorta. Para este efeito, 5 kg de ração padrão (Nuvital®), pesada e moída para cada grupo de animais foi adicionada a 1.800 g de ovo em pó diluído em 2.000 mL de água.
A concentração de linhaça foi de 8 g por kg de peso corporal. As sementes foram moídas em um processador de alimentos e armazenadas sob refrigeração antes de serem adicionadas aos alimentos.
A alimentação para os grupos G2 e G3 foi complementada com ovos liofilizados. Esta mistura foi processada com utilização de um triturador de carne industrial (Poli®, modelo PCP-22LR-N, boca #10, Siemsen, Brusque, SC, Brasil). Para o grupo G3, a mistura foi complementada com a linhaça moída. Após a mistura ter sido triturada, foi transformada em pelotas, que foram aquecidas em um forno elétrico por 10 minutos a uma temperatura de 180°C.
O preparado alimentar foi armazenado sob refrigeração até o uso.
Preparação dos animais e coleta da amostra
Os animais foram anestesiados e sangue foi coletado de acordo com o método descrito por Précoma et al.,9 e Alessi et al.,10 Xilazina (Coopazineâ; Schering-Plough-Coopers, Cotia, SP, Brasil) a 5 mg/kg misturada com cetamina (Vetanarcolâ, König, Mairinque, SP, Brasil) a 30 mg/kg foi administrada por via intramuscular na região da coxa dos coelhos. Análises bioquímicas realizadas nos dias 1 e 84 incluíram colesterol total (CT), LDL-C, lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e triglicérides (TG), que foram avaliados com equipamento automatizado (ADVIA 1200, Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Newark, EUA) e kits comerciais.
Análise histológica
A aorta torácica foi removida ao nível da bifurcação aortoilíaca após toracotomia e laparotomia mediana. Seções transversais com 2 a 3 mm de espessura foram cortadas a partir de diferentes segmentos aórticos. Cada segmento foi identificado, montado em um micrótomo (Leica® RM2145, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Alemanha) para processamento durante a noite e desidratado com etanol em concentrações seriadas (70%, 80% e 90%). As amostras de tecido foram posteriormente diafanizadas por 12 horas em xilol contendo concentrações seriadas de parafina. Blocos de parafina foram obtidos através da incorporação das amostras em parafina quente com utilização de um inclusor (Leica® EG1160, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Alemanha), de acordo com o procedimento padrão.
Os blocos de parafina foram cortados em seções de 5 µm com utilização do micrótomo (Leica® RM 2145). Cada seção foi corada com hematoxilina e eosina (HE) e orceína (coloração para tecido elástico) de acordo com técnicas convencionais e montada em lâminas permanentes.
Blocos com quatro segmentos de aorta foram preparados por meio de seleção de um segmento proximal perto do arco aórtico (ponto 1), um segmento localizado na aorta torácica (ponto 2), um segmento proximal na aorta abdominal (ponto 3) e um segmento distal da aorta abdominal (ponto 4). Estes segmentos foram selecionados de acordo com os achados histológicos na coloração com HE.
Análise imunohistoquímica
A técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais (tissue microarray; TMA) foi utilizada para a análise imunohistoquímica. As amostras foram incubadas com anticorpos monoclonais contra a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) a uma diluição de 1:50 e misturadas com anticorpo monoclonal contra o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por 1 hora. Os anticorpos foram detectados por incubação das lâminas com o substrato 3,3-diaminobenzidina (DAB; DakoCytomation A/S, Glostrup, Dinamarca). Contracoloração foi realizada com hematoxilina de Mayer, seguida por desidratação da amostra com diferentes concentrações de etanol a 100% e desparafinizadas com xilol. As lâminas foram montadas com bálsamo do Canadá. O protocolo descrito acima foi padronizado em nosso departamento. Controles positivos e negativos foram utilizados para cada reação.
Os cortes histológicos foram digitalizados com um scanner (Axio Scan Z1, Zeiss, Jena, Alemanha) e as imagens foram analisadas com o programa Image-Pro Plus®, versão 4.5. O método de morfometria de cores foi aplicado, colorindo em rosa as áreas com imagens positivas de anticorpos e em marrom aquelas com imagens negativas. Os dados foram transferidos para uma planilha do Excel e submetidos à análise estatística.
Análise estatística
Os resultados estão expressos como média, mediana, valor mínimo e máximo e desvio padrão. A suposição de normalidade das variáveis foi avaliada através do teste de Kolmogorov-Smirnov. As variáveis que não satisfizeram a suposição de normalidade foram analisadas com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Os valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os dados foram analisados com o programa estatístico IBM SPSS, versão 20.0.
Resultados
Ocorreu um óbito no grupo G3 na semana experimental 12, resultando em um total de 29 coelhos na amostra final do estudo.
Perfil lipídicoColesterol total
Os níveis séricos de CT foram significativamente mais altos nos grupos G2 e G3 em comparação com o G1. Este resultado demonstra que a dieta foi eficaz em aumentar os níveis de colesterol nos coelhos (Tabela 1).
Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para o colesterol total nos três grupos
Variável
Grupo
n
Média
Mediana
Mínimo
Máximo
Desvio padrão
Valor de p*
Colesterol total (basal)
Controle (G1)
10
35,60
34,00
14,00
69,00
15,13
Colesterol (G2)
10
24,60
24,50
12,00
43,00
9,51
Linhaça (G3)
9
28,33
24,00
15,00
54,00
13,51
0,174
Colesterol total (final do estudo)
Controle (G1)
10
23,64
21,50
8,90
57,00
15,72
Colesterol (G2)
10
62,09
24,54
12,90
336,00
100,23
Linhaça (G3)
8
36,21
34,20
16,40
72,00
17,32
0,204
Diferença (final do estudo - linha de base)
Controle (G1)
10
-11,96
-13,50
-31,00
6,00
12,50
Colesterol (G2)
10
37,49
2,55
-28,00
305,00
97,79
Linhaça (G3)
9
3,86
3,00
-19,00
18,00
10,83
0,029
Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.
LDL-colesterol e HDL-colesterol
Não houve diferenças significativas nos níveis de LDL-colesterol e HDL-colesterol entre os grupos (Tabelas 2 e 3). No entanto, os níveis séricos de LDL-colesterol na análise bioquímica foram mais altos no grupo G2 ao final do experimento. O aumento no LDL-colesterol no grupo G3 foi cerca de seis vezes inferior ao do G2. Os níveis de HDL-colesterol aumentaram nos grupos G1 (12,93 mg/dL), G2 (82,26 mg/dL) e G3 (12,03 mg/dL), com o maior aumento observado no G2.
Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para o LDL-colesterol nos três grupos
Variável
Grupo
n
Média
Mediana
Mínimo
Máximo
Desvio padrão
Valor de p*
LDL-colesterol (basal)
Controle (G1)
10
8,64
8,45
2,90
18,10
5,61
Colesterol (G2)
10
7,83
6,30
1,20
27,10
7,60
Linhaça (G3)
9
11,92
7,40
4,50
27,30
7,94
0,305
LDL-colesterol (final do estudo)
Controle (G1)
10
21,57
16,45
3,90
81,00
21,49
Colesterol (G2)
10
90,09
32,00
7,50
348,00
123,47
Linhaça (G3)
8
26,95
22,00
2,40
93,00
29,82
0,145
Diferença (final do estudo - linha de base)
Controle (G1)
10
12,93
11,65
-5,70
63,50
19,71
Colesterol (G2)
10
82,26
21,95
4,90
341,80
124,45
Linhaça (G3)
9
12,03
0,50
-27,30
79,40
30,61
0,085
Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.
Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para o HDL-colesterol nos três grupos
Variável
Grupo
n
Média
Mediana
Mínimo
Máximo
Desvio padrão
Valor de p*
HDL-colesterol (basal)
Controle (G1)
10
19,29
16,45
10,30
37,30
8,60
Colesterol (G2)
10
17,15
17,70
9,80
25,40
5,78
Linhaça (G3)
9
15,79
13,40
7,70
33,50
8,35
0,475
HDL-colesterol (final do estudo)
Controle (G1)
10
21,55
22,50
1,00
41,90
12,80
Colesterol (G2)
10
48,76
25,65
4,30
290,70
85,99
Linhaça (G3)
8
28,16
26,25
4,20
60,00
17,71
0,780
Diferença (final do estudo - linha de base)
Controle (G1)
10
2,26
-2,15
-13,30
14,90
10,39
Colesterol (G2)
10
31,61
9,00
-15,30
278,70
87,50
Linhaça (G3)
9
9,24
8,00
-16,50
46,60
17,48
0,570
Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.
Triglicérides
A dieta não aumentou os níveis de TG nos grupos do estudo. Além disso, os níveis de TG no G3 reduziram cerca de 70% (Tabela 4). Ao final do estudo, os resultados indicaram diferenças significativas nos níveis de TG entre G1 e G3 (p = 0,034) e entre G2 e G3 (p = 0,015).
Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para os triglicérides nos três grupos
Variável
Grupo
n
Média
Mediana
Mínimo
Máximo
Desvio padrão
Valor de p*
Triglicérides (basal)
Controle (G1)
10
65,30
50,00
36,00
206,00
50,87
Colesterol (G2)
10
59,50
56,50
25,00
146,00
32,74
Linhaça (G3)
9
79,44
78,00
32,00
149,00
38,20
0,308
Triglicérides - (final do estudo)
Controle (G1)
10
67,50
65,00
7,00
228,00
63,27
Colesterol (G2)
10
64,60
44,50
20,00
204,00
53,31
Linhaça (G3)
8
22,50
14,00
11,00
53,00
15,26
0,042
Diferença (final do estudo - linha de base)
Controle (G1)
10
2,20
13,50
-56,00
47,00
33,98
Colesterol (G2)
10
5,10
-17,50
-98,00
148,00
66,92
Linhaça (G3)
9
-59,44
-63,00
-149,00
16,00
48,12
0,022
Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.
Análise imunohistoquímica
A imunohistoquímica foi utilizada para investigar a presença da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e TNF-α nos quatro segmentos da aorta.
Os resultados indicaram que os níveis de ICAM-1 só aumentaram no segmento aórtico 4 no grupo G3, porém não houve diferença significativa em relação aos níveis medianos (Figura 1).
Média dos níveis da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) no segmento aórtico 4 dos animais em cada grupo.
Um resultado semelhante foi encontrado para o TNF-α, ou seja, o nível desse marcador foi significativamente mais elevado no segmento aórtico 4 (Figura 2). Os níveis de TNF-α no grupo G3 foram semelhantes aos do grupo controle, enquanto que os níveis no grupo G2 foram maiores do que o dobro em relação ao grupo controle (p < 0,05).
Média dos níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) no segmento aórtico 4 dos animais em cada grupo.
Discussão
A aterosclerose é uma doença cardiovascular importante e a compreensão do seu desenvolvimento é necessária para a sua prevenção e tratamento. Este conhecimento pode ser adquirido através de modelos experimentais. Neste contexto, vários estudos em animais têm demonstrado que uma dieta rica em gorduras conduz à obesidade, hipercolesterolemia e outras complicações como lesões endoteliais.11 O protocolo experimental do presente estudo foi um modelo precoce de aterosclerose e envolveu a adição de 0,25% de colesterol a partir de ovos liofilizados à dieta de coelhos com o objetivo de causar lesões ateroscleróticas.12 A utilização de coelhos como modelo experimental atende os objetivos do presente estudo porque esses animais desenvolvem lesões aórticas rapidamente.
Este estudo avaliou as alterações bioquímicas e imunoquímicas causadas por uma dieta rica em colesterol com e sem linhaça, considerada um alimento funcional.
O aumento no CT encontrado à análise bioquímica dos grupos G2 e G3 não era esperado no tratamento com linhaça. Um resultado semelhante foi obtido por Dupasquier et al., 13 que não observaram alterações de CT em animais que receberam uma dieta com 10% de linhaça. Este resultado inesperado pode ser explicado por vários fatores, incluindo a concentração de linhaça utilizada, a forma de administração da linhaça (sementes moídas), aquecimento do alimento para incorporação de componentes e a duração do consumo das sementes. Resultados anteriores indicaram que os ácidos alfa-linoleico e linoleico são sensíveis à luz, aquecimento e oxigênio, e sofrem oxidação quando exposto a temperaturas entre 120°C e 270°C.14 Por conseguinte, o processo de produção de alimentos contendo linhaça no presente estudo podem ter provocado uma redução do nível destes ácidos, comprometendo sua função nutracêutica.
Os níveis de LDL-colesterol aumentaram nos grupos tratados com a dieta rica em colesterol; no entanto, os níveis permaneceram semelhantes entre esses grupos. Resultados semelhantes foram obtidos em um estudo em seres humanos envolvendo o consumo de linhaça, no qual os níveis de CT e LDL-colesterol permaneceram inalterados,15 embora o período experimental de 4 semanas pode não ter sido suficiente para causar esta redução. Zheng et al.,16 realizaram um ensaio clínico randomizado em indivíduos com diagnóstico de hipercolesterolemia e utilizaram extrato de lignana de linhaça durante um período de 8 semanas. Os níveis de LDL-colesterol no grupo que recebeu 600 mg do extrato reduziram entre as semanas 6 e 8. Os autores concluíram que o extrato de lignana diminuiu a concentração de colesterol de maneira dose-dependente. Um estudo investigou o efeito da ingestão de fitoesterol e indicou que os níveis de colesterol no sangue reduziram após 4 semanas.17 Além disso, os níveis de colesterol permaneceram inalterados entre as semanas 8 e 12,18,19 o que sugere que fatores sazonais podem ter afetado os resultados.
No presente estudo, o CT aumentou em todos os grupos testados. Estudos têm mostrado que lignanas presentes na linhaça reduzem o colesterol sérico. Este efeito está provavelmente relacionado às suas propriedades antioxidantes, fornecidas pela lignana secoisolariciresinol-diglicosídeo (SDG), enterolactona e enterodiol, que inibem a peroxidação de ácidos graxos poli-insaturados in vitro e favorecem a diminuição dos níveis de colesterol.20 Uma hipótese para explicar a discrepância entre os resultados do presente estudo e outros na literatura é a alta concentração de colesterol ingerida. Outra hipótese é a duração da dieta funcional (8 semanas), o que pode ter sido demasiadamente curta para induzir uma redução significativa do LDL-colesterol e CT.
No presente estudo não houve diferença nos níveis de HDL-colesterol observados entre os três grupos. Níveis mais elevados de HDL-colesterol aumentam a proteção contra a formação de placas ateroscleróticas no coração. Estudos demonstraram que o consumo de linhaça a 15% esteve fortemente associado à proteção contra inflamação, estrógenos e genotoxicidade.21
Os resultados que consideramos mais fascinantes foram os relacionados aos níveis de TG. Houve uma diminuição significativa (aproximadamente 70%) neste parâmetro bioquímico no grupo G3, o que demonstra que a administração de alimentos contendo linhaça (um alimento funcional que contém principalmente ácidos graxos ômega 3, fibras e lignana) foi eficaz na redução dos níveis de TG. Este resultado está alinhado com os de estudos anteriores e sugere que a suplementação com ômega 3 através do consumo de linhaça ajuda a reduzir os níveis de TG, possivelmente através da redução de partículas de quilomícrons remanescentes e inibição da síntese e secreção de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-colesterol) pelo fígado.22
Cintra et al.,23 testaram o efeito do consumo de uma dieta rica em gordura e baseada em linhaça em ratos Wistar e observaram uma redução nos níveis de CT e TG, maior excreção fecal de lipídios e menor deposição de colesterol no fígado. Esse resultado foi semelhante ao obtido por Bhathena et al.,23
A imunohistoquímica foi utilizada para investigar a presença de dois marcadores envolvidos com inflamação, uma molécula de adesão celular (ICAM-1) e uma citocina pró-inflamatória (TNF-α). Vários estudos têm utilizado o ICAM-1 como um marcador de inflamação. Em um estudo com 60 coelhos (10 em um grupo controle e 50 em um grupo com aterosclerose), os animais alimentados com uma dieta rica em gordura apresentaram níveis mais elevados de ICAM-1 na aorta comparados com os do grupo controle (p < 0,01), o que indica um papel para a ICAM-1 como preditora de doença cardiovascular.25
A importância do presente estudo reside na análise do ICAM-1 em quatro segmentos da aorta. Os resultados indicaram um aumento nos níveis de ICAM-1 em todos os grupos de animais e todas as seções de tecido; no entanto, os resultados não foram estatisticamente significantes. Um resultado semelhante foi obtido em um estudo animal realizado por Prim et al.,8 em 2012 e em estudos em humanos, que também mostraram reduções não significativas nos níveis dos marcadores ICAM-1 e VCAM-1.26
Devemos salientar que nenhuma atividade anti-inflamatória foi observada no grupo que recebeu a linhaça (G3), sugerindo que os resultados do efeito anti-inflamatório dos ácidos graxos ômega 3 são contraditórios. Além disso, os resultados da ICAM-1 sugerem que esta atividade é dependente da duração do consumo de ácidos graxos ômega 3.
Os resultados da análise do TNF-α indicaram uma diferença significativa entre os grupos. Os níveis de TNF-α estiveram mais elevados no grupo G1 do que no G3. Este resultado demonstrou um efeito da linhaça, mas não foi estatisticamente significativo. Além disso, os níveis de TNF-α aumentaram no G2, o que indica que este marcador está associado com estresse e inflamação. Um resultado semelhante foi observado em um estudo anterior,27 no qual os níveis elevados de TNF-α estiveram associados com eventos coronarianos recorrentes após infarto do miocárdio.
Níveis do marcador inflamatório TNF-α reduziram significativamente no grupo G3 (grupo da linhaça), o que favorece a hipótese de que os componentes da linhaça possam reduzir a atividade anti-inflamatória e antiaterogênica. Um estudo anterior observou uma diminuição dos níveis de TNF-α após o consumo de ácidos graxos ômega 3 pela maioria dos pacientes.28
Conclusão
Os resultados do presente estudo estão alinhados com a literatura e mostraram uma redução no desenvolvimento de aterosclerose no grupo alimentado com uma dieta funcional.
Os resultados obtidos no grupo da linhaça mostraram alterações significativas nos níveis séricos de TG e diminuição dos níveis de TNF-α na análise imunohistoquímica. Esses achados corroboram as observações de estudos anteriores que demonstraram a linhaça como tendo uma forte tendência para agir efetivamente na redução dos níveis de TNF-α, evitando assim lesão e desenvolvimento de placas ateroscleróticas na íntima das artérias coronárias.
No entanto, várias diferenças podem surgir quando alterações são feitas no experimento ou protocolo de estudo. Por isso, sugerimos que mais estudos sejam conduzidos comparando diretamente estas sementes funcionais.
Agradecimentos
Agradecimentos à Jasmine Alimentos Ltda. (Curitiba, PR, Brasil) pela doação da linhaça utilizada no estudo. Estamos também gratos aos estudantes de medicina (Pontifícia Universidade Católica do Paraná) Carlos Humberto Guilman Tanizawa, Bruno Carnevalli, Alexandre da Silva Phaco Jr. e Eduardo Hubbe Buss pela ajuda na alimentação dos animais.
Fontes de Financiamento
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Vinculação Acadêmica
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Maynara Leonardi Schuh Martins pela Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
Aprovação Ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Pontifícia Universidade Católica do Paraná sob o número de protocolo 720-2012. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.