ijcs International Journal of Cardiovascular Sciences Int. J. Cardiovasc. Sci. 2359-4802 2359-5647 Sociedade Brasileira de Cardiologia dDSyHL54qDLzLjy68cY4gHG S2359-56472017000600476 10.5935/2359-4802.20170075 S2359-56472017005001103 Original Articles Safflower Oil (Carthamus tinctorius L.) Intake Increases Total Cholesterol and LDL-cholesterol Levels in an Experimental Model of Metabolic Syndrome Santana Lidiani Figueiredo 1 Dutra Thaisa da Silva 2 Souza Marcos Alexandre de 2 Freitas Karine de Cássia 1 Oesterreich Silvia Aparecida 2 Kassuya Cândida Aparecida Leite 2 Soares Fabíola Lacerda Pires 3 Universidade Federal do Mato Grosso do Sul Campo Grande MS Brazil Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (UFMS), Campo Grande, MS Universidade Federal de Mato Grosso do Sul Universidade Federal da Grande Dourados Faculdade de Ciências da Saúde Dourados MS Brazil Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Dourados, MS Universidade Federal da Grande Dourados Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências da Saúde Espírito Santo ES Brazil Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Espírito Santo, ES - Brazil Universidade Federal do Espírito Santo Mailing Address: Lidiani Figueiredo Santana, Av. Costa e Silva, s/n - Cidade Universitária, Postal Code: 79070-900. Campo Grande, MS - Brazil E-mail: lidi_lfs@hotmail.com; lidi_lfs@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Santana LF, Dutra TS, Freitas CF, Soares FLP. Acquisition of data: Santana LF, Dutra TS, Souza MA, Freitas CF, Oesterriech AS, Kassuya CPL, Soares FLP. Analysis and interpretation of the data: Santana LF, Souza MA, Freitas CF, Oesterriech AS, Kassuya CPL, Soares FLP. Statistical analysis: Santana LF, Souza MA, Freitas CF, Oesterriech AS, Kassuya CPL, Soares FLP. Writing of the manuscript: Santana LF, Freitas CF, Kassuya CPL, Soares FLP. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Santana LF, Freitas CF, Kassuya CPL, Soares FLP.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 21 09 2017 Nov-Dec 2017 30 6 476 483 11 10 2016 01 11 2016 24 03 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Overweight has been considered an important public health problem. To reverse this situation, various types of treatment are proposed. The safflower oil (Carthamus tinctorius L.) has been used in the prevention/treatment of obesity.

 Objectives:

The aim of this study was to evaluate the therapeutic effects of this oil in an experimental model of metabolic syndrome.

 Methods:

Male Wistar rats initially received a highly palatable (HP) diet for ten weeks for validation of a metabolic syndrome model. Following confirmation, the animals were treated with a HP diet and soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA) supplementation (1.0 mL/1000 g of animal weight). At the end of the experiment, the body composition, lipid profile and blood glucose levels of the animals were assessed. Student t test was used for statistical analysis.

 Results:

In the first stage (induction of metabolic syndrome), the animals given the HP diet showed gain weight (p < 0.001), visceral adiposity (p = 0.001), and significantly higher levels of blood glucose (p = 0.001) and triglycerides (p = 0.03) than those of the control group. Also, there was a difference in liver weight (p = 0.01). These results demonstrate that the HP diet administration is an effective model for the experimental metabolic syndrome study. In the second stage, the animals of the HPSA group showed increased total cholesterol (p < 0.05) and LDL-cholesterol (p < 0.001) levels.

 Conclusion:

Under the referred experimental conditions, the use of safflower oil can cause possible deleterious effects on the lipid profile in a metabolic syndrome experimental model.

 Keywords Oils Carthamus Cholesterol Metabolic Syndrome Dyslipidemias Obesity / prevention & control Introduction

Obesity is a chronic, multifactorial disease defined as abnormal or excessive fat accumulation, representing a serious health risk. The prevalence of overweight and obesity is increasing, and 12% of the world population is considered obese.1 According to Brazilian studies, 52.5% of the adult population is over ideal healthy weight and 17.9% are considered obese. The accumulation of adipose tissue, particularly visceral fat, can contribute to changes in the body, triggering the metabolic syndrome. This syndrome can be defined as a complex disorder characterized by a set of cardiovascular risk factors related to central fat deposition and insulin resistance.2

In general, the pathophysiological basis for cardiovascular events is atherosclerosis, which is characterized by a chronic inflammatory process of the vascular wall and elevation of circulating serum inflammatory markers, such as C-reactive protein (CRP). Regarding dyslipidemia, the primary goal in cardiovascular prevention is to achieve lower LDL-cholesterol (LDL-c) levels, and then reduce triglyceride levels and raise HDL-cholesterol (HDL-c) levels, and this latter goal is considered potentially beneficial for inhibiting the atherothrombotic process.3

To reduce these levels, dietary treatments that require changes in eating habits are proposed.4 In this context, the use of safflower oil (Carthamus tinctorius L.) is proposed to prevent or treat obesity. Safflower oil is extracted from saffron, a plant belonging to the Asteraceae family,5,6 contains high content of polyunsaturated (75% linoleic acid) and monounsaturated fatty acids.7 This composition stimulated further studies that demonstrated that dietary supplementation with safflower oil had a positive effect on lipid profile, with an antiatherogenic role.

Thus, given the lack of studies on the use of safflower oil on metabolic syndrome, and the existence of conflicting results in the literature, the present study aimed to assess the therapeutic effects of safflower oil on body composition, lipid profile and blood glucose in an experimental model of metabolic syndrome.

 Methods Animals and diet

The animals were provided by the central vivarium of the Health Sciences School of the Federal University of Grande Dourados (UFGD), city of Dourados, Mato Grosso do Sul state, Brazil. The procedures used in this study were approve by the Ethics Committee on Animal Use at UFGD (Nº 016/2013), according to the standards established by the Brazilian Committee for the protection of animals used for scientific purposes.8

A highly palatable (HP) diet was prepared based on the study by Naderali et al.,9 using 33% of ground Labina Purina® food preparation, 33% of condensed milk, 27% of water and 7% of sucrose (2.78 calories/g). The diet was kept under refrigeration until the moment of use, and the normal diet given to the control group was commercial food preparation of the Labina Purina® brand.

The experiment was divided into two stages. In the first stage, an animal model of metabolic syndrome was developed, and, in the second stage, intervention with safflower oil was performed in a disease model similar to the one observed in humans. Male Wistar rats aged 90 days (adult) were used in both experiments.

In the first stage, the animals were divided into two groups (n = 8): one group was fed a normal diet and water ad libitum, and the other group was fed a HP diet and water ad libitum, for ten weeks. In the second stage, the animals were also divided into two groups (n = 5-6), and both groups were fed a HP diet and water ad libitum, for ten weeks. The HP diet and soybean oil (HPSO) and HP diet and safflower oil (HPSA) were given by oral gavage to the animals. The daily administered dose was 1.0 mL/1000 g of animal weight.10,11

The safflower oil (Galena®) and soybean oil (Liza®) used in this study were purchased at a local store in the city of Dourados.

The same parameters were assessed in both stages. Therefore, food consumption and animal weight were daily measured. After ten weeks of treatment, the animals were fasted for 12 hours, anesthetized with xylazine and ketamine (10 mg/kg: 75 mg/kg) and euthanized by exsanguination via the inferior vena cava. The blood samples were centrifuged at 3000rpm for 15 minutes, and the serum was kept in freezer at -20°C until analysis. Adipose tissue samples from five sites was removed and weighed. The livers were subjected to histological analysis for the presence of hepatic steatosis.

 Fasting blood glucose

For blood glucose assessment, the animals were fasted for 16 hours, and glucose was measured in blood collected from the tail artery, by using a glucometer (Testline Striptsl25), according to Formagio et al.11

Concentration of total cholesterol, HDL-c, LDL-c and triglycerides

The determination of total cholesterol, HDL-c and triglycerides in serum was based on the colorimetric enzymatic method, using commercial kit (Labtest®), according to the manufacturer's instructions. The results were obtained with a spectrophotometer (Aaker/Bel - SF325NM - S05®). The concentration of LDL-c was obtained with a formula, according to the instructions of the manufacturer of the kit for quantification of HDL-c, using the Friedewald equation, where: VLDL-c = Triglycerides / 5 and LDL-c = Total Cholesterol - (HDL-c + VLDL-c).

 Liver weight

The extracted liver was immediately immersed in saline solution to remove excess blood and then dried on paper and weighed.

 Weight of adipose tissue

Adipose tissue samples from five sites (epididymal, retroperitoneal, perirenal, mesenteric and omental) were removed and weighed, and subsequently the animal fat (percentage of adipose tissue in each site to final body weight) was determined.

 Liver histology

After euthanasia, the liver was removed for histological analysis and fixed in 10% formaldehyde solution until it was embedded in paraffin. Then, microtome sections, 7 µm thick, were made and then mounted on glass slides. Each slide had a total of four sections removed from the paraffin block. The slides were then stained with hematoxylin and eosin, and analyzed under the microscope coupled to a digital camera with 200x magnification, for the classification of the presence of steatosis, according to Abbas et al.12 and Alves and Mello.13

Statistical analysis

The results were expressed in mean ± standard error of mean (SEM), and analyzed with Prisma 5.0 software (GraphPad Software, USA). Student t test was used to assess whether the means of the groups were statistically significant, and p < 0.05 values were considered statistically significant.

 Results

The results of the first stage of the study where we attempted to develop an animal model of metabolic syndrome can be seen in Table I. There was no statistically significant difference between the groups regarding water intake (unreported data).

Total diatary intake, body composition, liver weight and biochemical parameters in rats fed with a normal diet and a highly palatable diet
Control Highly Palatable
Dietary intake (calories/group/week) 2606 ± 33.32 3084 ± 66.56 ***
Visceral Adiposity (%) 4.5 ± 0.3 6.401 ± 0.3 ***
Liver weight (g) 11.3 ± 0.4 12.8 ± 0.4 **
Total cholesterol (mg/dl) 82.8 ± 13.2 86.2 ± 7.1
Triglycerides (mg/dl) 96.6 ± 13.1 150.2 ± 19.0 *
Fasting blood glucose (mg/dl) 73.7 ± 1.4 85.6 ± 2.2 ***

Values expressed in man ± standard error of mean (SEN). Student t test.

p < 0.05;

p < 0.01;

p < 0.001; n = 8-9.

In the second stage, the animals were fed a HP diet (that induces metabolic syndrome) supplemented with soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA). Food and water intake of the animals was measured. However, there was no statistically significant difference between the groups for these parameters (unreported data).

Significant changes were observed in the lipid profile of the animals, and the HPSA group showed a higher concentration of total cholesterol and LDL-c than the control group (HPSO) (Figures 1A and 1B, p = 0.03 and p = 0.001, respectively). In contrast, HDL-c and triglycerides did not statistically differ between the groups (Figures 1C and 1D).

Concentration of total cholesterol (A), LDL-cholesterol (B), HDL-cholesterol (C) and triglycerides (D) of rats fed with a highly palatable (HP) diet for 10 weeks, supplemented with soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA). n = 5-6. Values expressed in mean ± standard error of mean (SEM). Student t test. * p < 0.05; ** p < 0.01.

The HPSA group showed lower levels of fasting blood glucose as compared to the control group, but this difference was not statistically significant (Figure 2).

Fasting blood glucose of rats fed with a highly palatable (HP) diet for 10 weeks, supplemented with soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA). n = 5-6. Values expressed in mean ± standard error of mean (SEM). Student t test.

According to our results, there was no statistically significant difference regarding liver weight and weight gain between the control group and the HPSA group (Figures 3 and 4A, respectively). However, the HPSA group showed higher values of total adipose tissue, and epididymal and visceral adiposity, which were not statistically significant though (Figures 4B, 4C and 4D, respectively).

Liver weight of rats fed with a highly palatable (HP) diet for 10 weeks, supplemented with soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA). n = 5-6. Values expressed in mean ± standard error of mean (SEM). Student t test.

Body weight gain (A), weight of total adipose tissue (B), epididymal adipose tissue (C) and visceral adiposity (D) of rats fed with a highly palatable (HP) diet for 10 weeks, supplemented with soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA). n = 5-6. Values expressed in mean ± standard error of mean (SEM). Student t test.

Regarding histological analysis of the liver, groups HPSO and HPSA showed mild microvesicular steatosis and moderate micro- and macrovesicular steatosis, respectively (Figure 5).

Histological section of liver stained with Hematoxylin and Eosin (H&E) of rats fed with a highly palatable (HP) diet for 10 weeks, supplemented with soybean oil (HPSO) or safflower oil (HPSA) for 10 weeks n = 5-6. HPSO group: mild microgoticular steatosis. HPSA group: moderate micro and macrogoticular steatosis.

Discussion

Several experimental models have been proposed for the study of obesity and its metabolic disorders, most of them based on genetic modifications.14,15 However, the animal model that most resembles the etiology of human obesity is the one involving high intake of dietary fat.16 However, the extrapolation of many of these animal models to human obesity is limited by the difficulty in reproducing disorders that characterize metabolic syndrome, such as central obesity and changes in the metabolism of lipids and glucose. Also, they require long periods of time for the induction of obesity.17,18 Thus, the model used in this study is the most suitable for the research of metabolic syndrome interventions, because it effectively mimics the disorder observed in humans, and requires a relatively lower induction time compared to other studies,19,20 which reduces research costs.

Such findings (visceral obesity, hyperglycemia and hypertriglyceridemia) are consistent with the diagnosis of metabolic syndrome, also including hepatic steatosis. Several studies indicate an association between obesity and metabolic disorders, particularly the intake of hypercaloric and high carbohydrate diets, which is also demonstrated in our study.16-21

According to the results obtained in the second stage of the study, there was no statistically significant difference between the groups regarding weight gain, which is similar to the findings obtained in a study by Fernandes et al.,22 where no significant difference was found in the weight gain of animals in the groups given a diet supplemented with 1% of conjugated linoleic acid (CLA) compared to the groups that were not given the referred supplement. This finding is also corroborated by the study by Bhattachaya et al.,23 where BALB/C mice fed with a high-fat diet supplemented with 0.4% of CLA showed no change in body weight.

Nevertheless, different results were obtained by DeLany et al.19 and Park and Pariza.21 According to these studies, changes in body composition following the supplementation of CLA may be related to decreased proliferation and differentiation of preadipocytes, elevation of energy expenditure and changes in the concentration of leptin, a protein synthesized and secreted by adipocytes, involved in energy homeostasis. In contrast with the suggestions of these studies, in our study the group supplemented with safflower oil showed higher visceral adiposity, although this difference was not statistically significant. This fact indicates that there are conflicting reports in the literature regarding changes in body composition associated with the use of safflower or its main component, CLA.

Analysis of the lipid profile of the animals showed that the HPSA group had a higher concentration of total cholesterol and LDL-c compared to the control group (HPSO). Similar results were obtained by Fernandes et al.,22 who demonstrated increase in cholesterol levels following supplementation with 1% of CLA. This fact can be explained by changes in hepatic lipid metabolism caused by CLA, which may affect metabolic interconversion of fatty acids in the liver, resulting in a modified composition of fatty acids, causing changes in lipoproteins.24

Still regarding cholesterol, in the above-mentioned study by Fernandes et al.22 with animals supplemented with CLA distributed into active and sedentary, there was improvement in HDL-c levels in the sedentary group supplemented with CLA. However, in our study, as well as in the study by Marques et al.,25 which used safflower oil other than CLA, there was no statistically significant difference between the groups regarding HDL-c and serum triglycerides.

In turn, analysis of fasting blood glucose showed that the HPSA group had higher values compared to the control group, though this difference was not statistically significant. Marques et al.25 concluded that exclusive supplementation with 2% CLA affected the metabolism of glucose in mice, and these animals had severe hyperglycemia compared to the control group. This difference may not have been observed in our study because we used safflower oil, not isolated CLA.

The study by Tanaka et al.26 indicate that supplementation with CLA induces insulin resistance in animals and humans. However, other studies had controversial results, such as the study of Parra et al.,27 these authors demonstrated that the mixture of CLA isomers did not increase insulin resistance in rats given oral supplementation.

Therefore, there is no consensus on the relationship between CLA intake and insulin sensitivity. Further studies are needed to clarify such metabolic changes.

Also, there were no differences in the groups regarding the relative liver weight. The study by Gaiva et al.28 with rats fed diets rich in polyunsaturated fatty acids reported increased liver weight. It can be suggested that in our study there was no statistically significant difference in liver weight between the groups because soybean oil and safflower oil are both sources of polyunsaturated fatty acids, and, thus, have the same action on liver.

However, analysis of liver histological sections showed that supplementation with safflower oil interferes with hepatic steatosis, and the presence of micro- and macrovesicular steatosis is noticeable in this group. According to Reddy,29 fatty acid synthesis is stimulated to promote the storage of energy substrate in adipose tissue, a process that affects lipid metabolism, especially oxidation homeostasis and lipid synthesis, resulting in obesity, resistance to insulin, dyslipidemia and hepatic steatosis.

 Conclusion

Our results showed that animals fed a HP diet constitute an effective model for the experimental study of metabolic syndrome, due to its similarity with the etiology of the syndrome observed in humans, and also because that model does not require the use of genetically modified animals, has shorter induction time and relatively low costs.

We concluded that the effect of safflower oil on the prevention of adverse impacts on body composition, lipid profile and blood glucose was not confirmed under the conditions of the present study. Instead, supplementation with safflower oil resulted in the elevation of total serum cholesterol and its most atherogenic fraction, LDL-c, as well as in hepatic steatosis, indicating that the use of safflower oil may have deleterious effects on lipid profile and health.

Sources of Funding

The present study had no external sources of funding.

Study Association

This article is part of the conclusion of the Bachelor's Degree in Nutrition from Lidiani Figueiredo Santana of the Federal University of Grande Dourados (UFGD).

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J Nutr Biochem. 2010;21(2):107-15. Parra P Serra F Poleu A Moderate doses of conjugated linoleic acid isomers mix contribute to lowering body fat content maintaining insulin sensitivity and a noninflammatory pattern in adipose tissue in mice J Nutr Biochem 2010 21 2 107 115 28 Gaiva MH, Couto RC, Oyama LM, Couto GE, Silveira VL, Ribeiro EB. Diets rich in polyunsaturated fatty acids: effect on hepatic metabolism in rats. Nutrition. 2000;19(2):144-9. Gaiva MH Couto RC Oyama LM Couto GE Silveira VL Ribeiro EB Diets rich in polyunsaturated fatty acids: effect on hepatic metabolism in rats Nutrition 2000 19 2 144 149 29 Reddy JK. Nonalcoholic steatosis and steatohepatitis. III. Peroxisomal beta-oxidation, PPAR alpha, and steatohepatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001;281(6):1333-9. Reddy JK Nonalcoholic steatosis and steatohepatitis. III. Peroxisomal beta-oxidation, PPAR alpha, and steatohepatitis Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001 281 6 1333 1339 Artigos Originais Óleo de Cártamo (Carthamus tinctorius) Aumenta os Níveis de Colesterol Total e LDL-Colesterol em Modelo Experimental de Síndrome Metabólica Santana Lidiani Figueiredo 1 Dutra Thaisa da Silva 2 Souza Marcos Alexandre de 2 Freitas Karine de Cássia 1 Oesterreich Silvia Aparecida 2 Kassuya Cândida Aparecida Leite 2 Soares Fabíola Lacerda Pires 3 Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (UFMS), Campo Grande, MS Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Dourados, MS Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Espírito Santo, ES - Brasil Correspondência: Lidiani Figueiredo Santana, Av. Costa e Silva, s/n - Cidade Universitária, CEP: 79070-900. Campo Grande, MS - Brasil. E-mail: lidi_lfs@hotmail.com; lidi_lfs@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Santana LF, Dutra TS, Freitas CF, Soares FLP. Obtenção de dados: Santana LF, Dutra TS, Souza MA, Freitas CF, Oesterriech AS, Kassuya CPL, Soares FLP. Análise e interpretação dos dados: Santana LF, Souza MA, Freitas CF, Oesterriech AS, Kassuya CPL, Soares FLP. Análise estatística: Santana LF, Souza MA, Freitas CF, Oesterriech AS, Kassuya CPL, Soares FLP. Redação do manuscrito: Santana LF, Freitas CF, Kassuya CPL, Soares FLP. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Santana LF, Freitas CF, Kassuya CPL, Soares FLP.

Potencial Conflito de Interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

O excesso de peso vem sendo considerado um importante problema de saúde pública. Na tentativa de reverter esse quadro, são propostos diversos tipos de tratamento. O óleo de cártamo (Carthamus tinctorius) vem sendo utilizado na prevenção/tratamento da obesidade.

 Objetivos:

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos terapêuticos desse óleo em um modelo experimental de síndrome metabólica.

 Métodos:

Inicialmente foram utilizados ratos Wistar alimentados com dieta altamente palatável (AP) por dez semanas. Após, os animais receberam a dieta AP com suplementação de óleo de soja (APOS) ou óleo de cártamo (APOC), na dosagem 1,0 ml/1000 g de peso do animal. No final do experimento, a composição corporal, o perfil lipídico e glicemia dos animais foram avaliados. Para a análise estatística, utilizou-se o teste t de Student.

 Resultados:

Na primeira fase (indução da síndrome metabólica), os animais que receberam a dieta AP mostraram ganho de peso (p < 0,001), adiposidade visceral (p = 0,001), glicemia (p = 0,001) e triglicerídeos séricos (p = 0,03) significativamente mais elevados do que aqueles do grupo controle. Além disso, houve uma diferença no peso do fígado (p = 0,01). Esses resultados demonstram que a administração de dieta AP é um modelo eficaz para o estudo experimental da síndrome metabólica. Na segunda etapa, os animais do grupo APOC mostraram aumento de colesterol total (p < 0,05) e de LDL-colesterol (p < 0,001).

 Conclusão:

Sob as condições experimentais referidas, conclui-se que a utilização de óleo de cártamo pode causar efeitos deletérios sobre o perfil lipídico em um modelo experimental de síndrome metabólica.

 Palavras-chave: Óleos Carthamus Colesterol Síndrome Metabólica Dislipidemias Obesidade / controle & prevenção Introdução

A obesidade é uma doença crônica multifatorial definida como acúmulo anormal ou excessivo de gordura, representando um sério risco à saúde. A prevalência de sobrepeso e obesidade está aumentando, sendo 12% da população mundial considerada obesa.1 Segundo estudos brasileiros, 52,5% da população adulta acha-se acima do peso saudável ideal, sendo 17,9% dela considerada obesa. O acúmulo de tecido adiposo, em particular gordura visceral, pode contribuir para mudanças corporais, desencadeando síndrome metabólica. Essa síndrome pode ser definida como um distúrbio complexo, caracterizado por um conjunto de fatores de risco cardiovascular relacionados à deposição de gordura central e resistência à insulina.2

Em geral, a base fisiopatológica para os eventos cardiovasculares é a aterosclerose, caracterizada por um processo inflamatório crônico da parede vascular e elevação dos marcadores inflamatórios séricos circulantes, como a proteína C reativa (PCR). Com relação à dislipidemia, o objetivo primário na prevenção cardiovascular é baixar os níveis de LDL-colesterol (LDL-c), reduzir os níveis de triglicerídeos e elevar os de HDL-colesterol (HDL-c), sendo esse último objetivo considerado potencialmente benéfico para inibir o processo aterotrombótico.3

Para reduzir esses níveis, foram propostos tratamentos dietéticos que requerem mudanças nos hábitos alimentares.4 Nesse contexto, o uso de óleo de cártamo (Carthamus tinctorius) foi proposto para prevenir ou tratar a obesidade. O óleo de cártamo é extraído do açafrão, uma planta da família Asteraceae,5,6 e contém alto teor de ácidos graxos poli-insaturados (75% ácido linoleico) e monoinsaturados.7 Tal composição estimulou estudos posteriores que demonstraram ter a suplementação dietética com óleo de cártamo um efeito positivo no perfil lipídico e desempenhar um papel antiaterogênico.

Devido à falta de estudos sobre o uso do óleo de cártamo na síndrome metabólica, além da existência de resultados conflitantes na literatura, o presente estudo buscou avaliar os efeitos terapêuticos do óleo de cártamo sobre a composição corporal, o perfil lipídico e a glicemia em um modelo experimental de síndrome metabólica.

 Métodos Animais e dieta

Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Dourados, Mato Grosso do Sul. Os procedimentos usados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais Experimentais da UFGD (Nº 016/2013), segundo os padrões estabelecidos pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal.8

Uma dieta altamente palatável (AP) foi preparada com base no estudo de Naderali et al.,9 usando 33% de ração moída da marca Labina Purina®, 33% de leite condensado, 27% de água e 7% de sucrose (2,78 calorias/g). A dieta foi mantida sob refrigeração até ser usada, tendo o grupo controle recebido dieta normal (ração comercial da marca Labina Purina®).

O experimento foi dividido em duas etapas. Na primeira, desenvolveu-se um modelo animal de síndrome metabólica e, na segunda, realizou-se intervenção com óleo de cártamo em um modelo da doença similar ao observado em seres humanos. Ratos Wistar machos com 90 dias (adultos) foram usados nas duas etapas.

Na primeira etapa, os animais foram divididos em dois grupos (n = 8): um grupo recebeu dieta normal e água ad libitum, e o outro recebeu uma dieta AP e água ad libitum, por 10 semanas. Na segunda etapa, os animais também foram divididos em dois grupos (n = 5-6), tendo ambos os grupos recebido uma dieta AP e água ad libitum, por 10 semanas. A dieta AP com óleo de soja (APOS) e a dieta AP com óleo de cártamo (APOC) foram administradas por gavagem aos animais. A dose diária administrada foi de 1,0 ml/1000 g de peso do animal.10,11

O óleo de cártamo (Galena®) e o óleo de soja (Liza®) usados neste estudo foram comprados em estabelecimentos comerciais da cidade de Dourados.

Os mesmos parâmetros foram avaliados nas duas etapas. O consumo de alimento e o peso dos animais foram medidos diariamente. Após 10 semanas de tratamento, os animais foram submetidos a jejum de 12 horas, anestesiados com xilazina e cetamina (10 mg/kg: 75 mg/kg) e sacrificados por exsanguinação pela veia cava inferior. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 rpm por 15 minutos, sendo o soro mantido congelado a -20°C até a análise. Amostras de tecido adiposo de cinco locais foram removidas e pesadas. Os fígados foram submetidos a estudo histológico para a presença de esteatose hepática.

 Glicemia de jejum

Para a avaliação da glicemia, os animais foram submetidos a jejum de 16 horas, sendo o sangue coletado da artéria da cauda, e usando-se um glicosímetro (Testline Striptsl25), segundo Formagio et al.11

Concentrações de colesterol total, HDL-c, LDL-c e triglicerídeos

A determinação de colesterol total, HDL-c e triglicerídeos séricos baseou-se no método enzimático colorimétrico, usando-se kit comercial (Labtest®), segundo as instruções do fabricante. Os resultados foram obtidos com um espectrofotômetro (Aaker/Bel - SF325NM - S05®). A concentração de LDL-c foi obtida com uma fórmula, segundo as instruções do fabricante do kit para quantificação de HDL-c, usando-se a equação de Friedewald, onde: VLDL-c = Triglicerídeos / 5 e LDL-c = Colesterol total - (HDL-c + VLDL-c).

 Peso do fígado

Logo após ser extraído, o fígado foi imerso em solução salina para remover o excesso de sangue, sendo em seguida secado com papel e pesado.

 Peso do tecido adiposo

As amostras de tecido adiposo de cinco sítios (epididimal, retroperitoneal, perirrenal, mesentérico e omental) foram removidas e pesadas, com determinação subsequente da gordura do animal (porcentagem de tecido adiposo em cada sítio em relação ao peso corporal).

 Histologia hepática

Após a eutanásia, o fígado foi removido para estudo histológico, sendo fixado em solução de formaldeído a 10% até inclusão em parafina. Foram então realizados cortes de 7 µm de espessura no micrótomo, com posterior montagem em lâminas de vidro. Cada lâmina tinha quatro cortes extraídos do bloco de parafina. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina, sendo analisadas em microscópio acoplado a câmara digital com aumento de 200x para classificação quanto à presença de esteatose, segundo Abbas et al.12 e Mello e Alves.13

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro-padrão da média (EPM), sendo analisados com o programa Prisma 5.0 (GraphPad Software, EUA). O teste t de Student foi usado para avaliar se as médias dos grupos eram estatisticamente significativas, sendo p < 0,05 considerado estatisticamente significativo.

 Resultados

Os resultados da primeira etapa do estudo, em que se tentou desenvolver um modelo animal de síndrome metabólica, podem ser vistos na Tabela 1. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos com relação à ingestão de água (dados não relatados).

Ingestão dietética total, composição corporal, peso do fígado e parâmetros bioquímicos em ratos recebendo uma dieta normal e uma dieta altamente palatável
Controle Altamente palatável
Ingestão dietética (calorias/grupo/semana) 2606 ± 33,32 3084 ± 66,56 ***
Adiposidade visceral (%) 4,5 ± 0,3 6,401 ± 0,3 ***
Peso do fígado (g) 11,3 ± 0,4 12,8 ± 0,4 **
Colesterol total (mg/dl) 82,8 ± 13,2 86,2 ± 7,1
Triglicerídeos (mg/dl) 96,6 ± 13,1 150,2 ± 19,0 *
Glicemia de jejum (mg/dl) 73,7 ± 1,4 85,6 ± 2,2 ***

Valores expressos em média ± erro-padrão da média (EPM). Test t de Student.

p < 0,05;

p < 0,01;

p < 0,001; n = 8-9.

Na segunda etapa, os animais receberam uma dieta AP (que induz síndrome metabólica) suplementada com óleo de soja (APOS) ou óleo de cártamo (APOC). A ingestão de alimentos e água dos animais foi medida. Entretanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos quanto àqueles parâmetros (dados não relatados).

Observaram-se mudanças significativas no perfil lipídico dos animais, tendo o grupo APOC apresentado mais alta concentração de colesterol total e LDL-c do que o grupo controle (APOS) (Figuras 1A e 1B, p = 0,03 e p = 0,001, respectivamente). Por outro lado, os níveis de HDL-c e triglicerídeos não diferiram estatisticamente entre os grupos (Figures 1C e 1D).

Concentração de colesterol total (A), LDL-colesterol (B), HDL-colesterol (C) e triglicerídeos (D) de ratos recebendo uma dieta altamente palatável (AP) por 10 semanas, suplementada com óleo de soja (APOS) ou óleo de cártamo (APOC), n = 5-6. Valores expressos em média ± erro-padrão da média (EPM). Test t de Student. * p < 0,05; ** p < 0,01.

O grupo APOC apresentou níveis mais baixos de glicemia de jejum em comparação ao grupo controle, mas tal diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 2).

Glicemia de jejum de ratos alimentados com uma dieta altamente palatável (AP) durante 10 semanas, suplementado com óleo de soja (APSO) ou óleo de cártamo (APOC). N = 5-6. Valores expressos em média ± erro padrão de média (SEM). Teste t de Student.

Segundo nossos resultados, não houve diferença estatisticamente significativa quanto ao peso do fígado e ao ganho de peso entre o grupo controle e o grupo APOC (Figuras 3 e 4A, respectivamente). Entretanto, o grupo APOC apresentou valores mais altos de tecido adiposo total, e adiposidade epididimal e visceral, mas sem significado estatístico (Figuras 4B, 4C e 4D, respectivamente).

Peso do fígado de ratos recebendo uma dieta altamente palatável (AP) por 10 semanas, suplementada com óleo de soja (APOS) ou óleo de cártamo (APOC), n = 5-6. Valores expressos em média ± erro-padrão da média (EPM). Test t de Student.

Ganho de peso corporal (A), peso do tecido adiposo total (B), tecido adiposo epididimal (C) e adiposidade visceral (D) de ratos recebendo uma dieta altamente palatável (AP) por 10 semanas, suplementada com óleo de soja (APOS) ou óleo de cártamo (APOC), n = 5-6. Valores expressos em média ± erro-padrão da média (EPM). Test t de Student.

Com relação à análise histológica do fígado, os grupos APOS e APOC apresentaram leve esteatose microvesicular e moderada esteatose micro- e macrovesicular, respectivamente (Figura 5).

Cortes histológicos de fígado corados com Hematoxilina e Eosina (H&E) de ratos recebendo uma dieta altamente palatável (AP) por 10 semanas, suplementada com óleo de soja (APOS) ou óleo de cártamo (APOC), n = 5-6. Grupo APOS: leve esteatose microvesicular; grupo HPSA: moderada esteatose micro- e macrovesicular.

Discussão

Vários modelos experimentais foram propostos para o estudo de obesidade e seus distúrbios metabólicos, a maioria deles com base em modificações genéticas.14,15 O modelo animal que mais se aproxima da etiologia da obesidade humana envolve alta ingestão de gordura dietética.16 Entretanto, a extrapolação de muitos desses modelos animais para obesidade humana é limitada pela dificuldade em se reproduzir os distúrbios que caracterizam a síndrome metabólica, como obesidade central e alterações no metabolismo dos lipídeos e da glicose. Além disso, requerem longos períodos de tempo para a indução de obesidade.17,18 O modelo usado neste estudo é, portanto, o mais adequado para a pesquisa de intervenções de síndrome metabólica, por efetivamente imitar o distúrbio observado em seres humanos, necessitando de tempo de indução relativamente menor comparado ao de outros estudos,19,20 reduzindo os custos da pesquisa.

Tais achados (obesidade visceral, hiperglicemia e hipertrigliceridemia) são consistentes com o diagnóstico de síndrome metabólica, que também inclui esteatose hepática. Vários estudos indicam existir uma associação entre obesidade e distúrbios metabólicos, em particular a ingestão de dietas hipercalóricas e ricas em carboidratos, também demonstrado no nosso estudo.16-21

Segundo os resultados obtidos na segunda etapa deste estudo, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos com relação a ganho de peso. Tal achado é similar ao do estudo de Fernandes et al.,22 que não obtiveram significativa diferença no ganho de peso dos animais nos grupos recebendo uma dieta suplementada com 1% de ácido linoleico conjugado (CLA) em comparação ao dos grupos que não receberam o referido suplemento. Tal achado é ainda corroborado pelo estudo de Bhattacharya et al.,23 em que camundongos BALB/C alimentados com uma dieta rica em gordura suplementada com 0,4% de CLA não apresentaram alteração no peso corporal.

Diferentes resultados, no entanto, foram obtidos por DeLany et al.19 e Park e Pariza.21 Segundo esses autores, mudanças na composição corporal após suplementação com CLA podem estar relacionadas à reduzida proliferação e diferenciação de pré-adipócitos, elevação do gasto de energia e mudanças na concentração de leptina, uma proteína sintetizada e secretada por adipócitos, envolvida na homeostase energética. Diferentemente do sugerido por esses autores, no nosso estudo, o grupo suplementado com óleo de cártamo apresentou maior adiposidade visceral, embora tal diferença não tenha significado estatístico. Na literatura, portanto, há relatos conflitantes com relação às mudanças na composição corporal associadas ao uso de cártamo ou seu principal componente, CLA.

A análise do perfil lipídico dos animais mostrou que o grupo APOC tinha uma maior concentração de colesterol total e LDL-c em comparação ao grupo controle (APOS). Resultados similares foram obtidos por Fernandes et al.,22 que demonstraram elevação dos níveis de colesterol após suplementação com 1% de CLA. Tal fato pode ser explicado por mudanças no metabolismo lipídico hepático causadas por CLA, que podem afetar a interconversão metabólica de ácido graxos no fígado, resultando em composição modificada de ácido graxos, alterando as lipoproteínas.24

Ainda em relação ao colesterol, no já mencionado estudo de Fernandes et al.22 com animais suplementados com CLA distribuídos em grupos 'ativos' e 'sedentários', houve melhora nos níveis de HDL-c no grupo 'sedentários' suplementados com CLA. No nosso estudo, entretanto, assim como no de Marques et al.,25 que usaram óleo de cártamo em lugar do CLA, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos com relação a HDL-c e triglicerídeos séricos.

Ao analisar a glicemia de jejum, o grupo APOC mostrou valores mais altos em comparação ao grupo controle, embora sem significado estatístico. Marques et al.25 relataram que suplementação exclusiva com 2% de CLA afetou o metabolismo da glicose em camundongos, que apresentaram grave hiperglicemia em comparação ao grupo controle. A não observação dessa diferença em nosso estudo, pode dever-se ao fato de termos usado óleo de cártamo em lugar de CLA isolado.

O estudo de Tanaka et al.26 indica que a suplementação com CLA induz resistência à insulina em animais e seres humanos. Entretanto, outros estudos, como o de Parra et al.,27 apresentaram resultados controversos. Aqueles autores demonstraram que a mistura de isômeros CLA não aumentou a resistência à insulina em ratos recebendo suplementação oral.

Logo, não há consenso quanto à relação entre ingestão de CLA e sensibilidade à insulina. Estudos adicionais são necessários para esclarecer tais alterações metabólicas.

Além disso, não houve diferença nos grupos quanto ao peso relativo do fígado. O estudo de Gaiva et al.28 com ratos recebendo dieta rica em ácidos graxos poli-insaturados relatou aumento do peso hepático. Pode-se sugerir que, no nosso estudo, não houve diferença estatisticamente significativa no peso do fígado entre os grupos, pois o óleo de soja e o óleo de cártamo são fontes de ácido graxos poli-insaturados, exercendo a mesma ação no fígado.

Entretanto, a análise dos cortes histológicos do fígado mostrou que a suplementação com óleo de cártamo interfere com a esteatose hepática, sendo a presença de esteatose micro- e macrovesicular perceptível naquele grupo. Segundo Reddy,29 a síntese de ácido graxo é estimulada para promover o armazenamento de substrato energético em tecido adiposo, um processo que afeta o metabolismo lipídico, em especial homeostase oxidativa e síntese lipídica, resultando em obesidade, resistência à insulina, dislipidemia e esteatose hepática.

 Conclusão

Nossos resultados mostram que animais recebendo uma dieta AP constituem um modelo efetivo para o estudo experimental da síndrome metabólica, devido às suas semelhanças com a etiologia da síndrome observada em seres humanos. Ademais, tal modelo não requer o uso de animais geneticamente modificados, tem menor tempo de indução e relativamente baixo custo.

Concluindo, a ação do óleo de cártamo na prevenção de efeitos adversos na composição corporal, perfil lipídico e glicemia não foi confirmada nas condições do presente estudo. Ao contrário, a suplementação com óleo de cártamo resultou em elevação do colesterol sérico total e de sua fração mais aterogênica, LDL-c, assim como em esteatose hepática, indicando que o uso de óleo de cártamo possa ter efeitos deletérios no perfil lipídico e na saúde.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte do trabalho de conclusão do curso Bacharel em Nutrição da Lidiani Figueiredo Santana da Universidade Federal da Grande Dourados