ijcs International Journal of Cardiovascular Sciences Int. J. Cardiovasc. Sci. 2359-5647 2359-4802 Sociedade Brasileira de Cardiologia tbSvGwp5gwVgBH5djVsFrwD S2359-56472017000300262 10.5935/2359-4802.20170034 Review Articles Methods of Endothelial Function Assessment: Description and Applications Storch Amanda Sampaio Mattos João Dario de Alves Renata Galdino Iuri dos Santos Rocha Helena Naly Miguens Universidade Federal Fluminense Niterói RJ Brazil Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, RJ - Brazil Universidade Federal Fluminense Mailing Address: Amanda Sampaio Storch, Universidade Federal Fluminense - UFF Rua Professor Hernani Pires de Melo, 101 São Domingos, Niterói, RJ - Brazil. E-mail: amandasstorch@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Acquisition of data: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Analysis and interpretation of the data: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Writing of the manuscript: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 May-Jun 2017 30 3 262 273 15 08 2016 21 11 2016 23 03 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Keywords: Endothelium, Vascular Function, Endothelim Atherosclerosis Vasodilatation. Introduction

The endothelium is a monolayer of cells, called endothelial cells, that lines the interior of blood vessels, including arteries, veins and cardiac chambers,1 acting as a protective layer between circulating blood and other tissues.2 The endothelium is crucial for the control of vascular homeostasis, and is involved in the regulation of intracellular signaling,1 vascular tonus and permeability,3 coagulation cascade and angiogenesis,4 among others. One of the main activities of the endothelium is the release of autocrine and paracrine substances in response to stimuli.2 Injuries to the endothelium trigger an inflammatory response with participation of several cell types - lymphocytes, monocytes, platelets and smooth muscle cells5 - culminating in endothelial cell dysfunction, stiffness of vessel wall and atherosclerotic plaque formation.6

Endothelial dysfunction is an early, key characteristic of development and progression of atherosclerotic plaque and subsequent complications. This is characterized by a reduced bioavailability of endothelium-derived vasodilators, such as nitric oxide (NO), along with a relative or absolute increase in available vasoconstrictors. Such unbalanced condition impairs the endothelium-dependent vasodilation, a functional marker of endothelial dysfunction.7

At the beginning of atherosclerotic plaque formation, endothelial dysfunction is characterized by increased expression and release of adhesion molecules, including endothelial selectin (E-selectin), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). These molecules are released in response to stimuli of inflammatory cytokines, bacterial lipopolysaccharides and oxidized low-density lipoproteins (ox-LDL). They promote cell-cell and cell-extracellular matrix adhesion, leading to foam cell accumulation on the subendothelial space,8 increased vessel wall thickness and consequent reduction or even complete obstruction of vascular lumen.9

Assessment of endothelial function consists of the analysis of endothelial cells responsiveness to vasodilator or vasoconstrictor stimuli, contributing to advances in the understanding of atherosclerosis and possible therapeutic targets.2 The methods include in vitro analysis, such as culture of endothelial cells, and in vivo analysis, such as flow-mediated dilation (FMD), venous occlusion plethysmography (VOP) and measurement of serum markers. However, none of these methods have been currently applied in the clinical setting, due to invasiveness, high costs and difficult standardization of the techniques.1

Endothelial dysfunction precedes morphological atherosclerotic changes and may contribute to the development of lesions and clinical complications. Cardiovascular diseases (CVD) are the main cause of natural death in the world, including in Brazil. Recent data shows CVD accounted for approximately 30% of deaths in the country. In this context, the use of the aforementioned techniques in clinical research allows a better understanding of this problem and the development of new prevention and treatment strategies to decrease morbidity, mortality and also public costs. A deep understanding of endothelial dysfunction assessment tools by healthcare professionals allows the improvement of these techniques and enables the transition from clinical research to clinical practice.

Here we describe the most recent methods for the assessment of endothelial dysfunction.

 <italic>In vitro</italic> analysis Endothelial cell cultures

Culture of endothelial cells has been widely described in the literature, especially in studies on the effect of oxidative stress and inflammation on mobilization and proliferation of these cells in vitro.1 The yield of endothelial cells culture from peripheral blood represents an important step in research on circulating angiogenic cells, since these cells were firstly isolated for research purpose.

However, the use of cell culture for assessment of endothelial function has its pros and cons. The possibility of investigating a wide variety of intracellular signaling pathways allows the development of different studies, with different purposes. For example, the discovery of surface markers, monoclonal antibodies, and magnetic beads for immunoassays has facilitated the isolation, quantification and characterization of endothelial cells. However, this process has limitations related to phenotypic changes of the cells, dependent on cell cuture media and time. Also, the culture of endothelial cells has not been fully established as a model comparable to in vivo ones.10 Therefore, the protocol for cell culture should be carefully prepared, since many growing factors have been recognized to stimulate different phenotypes in proliferating cells.11

Due to the difficulty in studying the endothelium in vivo, several in vitro techniques have been developed.12 Among these, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have been widely used as a source of human endothelial cells, since they are free from pathogens and are physiologically more relevant than other available lineages.13 Primary HUVECs preserve endothelial cell native characteristics, including the expression of specific surface markers and intracellular signaling pathways.14

In culture media, HUVECs change from a dispersed to a clustered pattern within days of incubation, covering most of the bottom surface of the plate.15 Once the plate is completed covered, the cells polarize, form tight junctions, and finally achieve the cobblestone stage, which mimic the in vivo condition.16 HUVECs have been used in molecular biology research, contributing to advances in the pathophysiology of atheroma plaque formation and mechanisms involved in the control of angiogenesis and vascularization of affected areas.12,17 Cultures of HUVECs are applied in studies on cell interactions (resulting in analysis of adhesion molecules and cytokines), effects of shear rate and oscillatory flow in cell signaling (mimicking what occurs in the vessel lumen), and allows the discovery of receptors and transcription factors involved in the development and progression of endothelial dysfunction.18-20 However, caution is needed in interpreting the results because of the limitations of this method.

 <italic>In vitro</italic> functional studies

In the last decades, different techniques have been used to assess endothelial function in vitro including the organ bath technique, and myographic recordings, and shown to be essential for the discovery of endothelium derived relaxing factors (EDRFs). The most widely studied EDRF is nitric oxide (NO).21These studies allow the measurement of endothelium-dependent relaxation of vascular in response to well-known agonists, such as acetylcholine (ACh) and sodium nitroprusside.22

Isolated organ bath is an in vitro technique that assesses vascular reactivity in response to agonists, yielding a dose-response curve used to investigate physiological and pharmacological responses of biological preparations isolated from a variety of species (rabbit, rat, etc). Tissues and organs used in this method include artery and vein rings or strips, atrium, ventricle, papillary muscle, diaphragm, fundus of stomach, small bowel (duodenum, jejunum, and ileum), trachea, uterus, among others. The method aims to mimic an optimal physiological condition regarding temperature, aeration and nutrients for analysis of these preparations. An organ bath system is composed of a double-jacketed glass chambers with capacity varying from 5 to 50mL connected to a helical warming coil through which the nutritive solution is conducted. The warming coil was submerged in water maintained at 37°C, which was perfused with a peristaltic pump. The isolated organ or tissue is maintained in muscle chamber; one end was attached to a glass rod connected to an air pump that provided aeration of the nutritive solution, and the other end was fixed to a lever connected to a force transducer by a cotton thread.23,24

From this point on, the experiments have involved the cumulative addition of drugs to the muscle chamber or electrical stimulation (when the organ was mounted between to platinum electrodes connected to an electrical stimulator), resulting in contraction or relaxation of the muscle studied. Changes in tension are recorded by myographs (kymograph, physiography or digital system),1 that register the intensity and kinetics of different contraction stages (velocity, frequency or decay). Dose-response or stimulus-response curves are generated from the experimental results.23 Displacement of the dose-response curve shifts to the right indicates impairment of EDRF/NO release in the endothelium.25

The organ bath technique is hence an important method for enabling the control of experimental conditions - nutritive solution, temperature, etc. - and isolation of endothelial function elements by using, for example, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitors (e.g. L-NAME). Other advantages of the method include a relatively simple preparation, which allows the analysis of simultaneous preparations; the possible use of electrical stimulation; and an accurate quantification of the response.23

One disadvantage of this method is the fact that its use is restricted to animal experimental studies, due to ethical considerations regarding the required availability and amount of human samples, and to the variability of patients' responses to controlled events. Another one is the necessity to use relatively large tissue samples (>1 mm diameter), which limits the assessment of smaller diameter vessels.23 Although this has been the most widely used method for endothelial function assessment in animal models, one major limitation is to not distinguish the biological processes occurring in the vessel lumen and outside the blood vessel.

 <italic>In vivo</italic> analysis Flow-mediated dilation (FMD)

There is strong evidence supporting that the detection of brachial artery endothelial dysfunction is an important indicator of systemic endothelial dysfunction.26 Vascular function can be measured by several methods, including invasive and non-invasive techniques.27

Invasive techniques consist mainly of intra-arterial administration of compounds that stimulate NO release, which induces dilation of vascular beds in healthy subjects. In this situation, detection of vasoconstriction may indicate endothelial dysfunction.28 Nevertheless, the invasive nature of these techniques unables their use in the general population and, for this reason, non-invasive methods could be more practical and more accessible alternatives for measurement of vascular function.27

Among the non-invasive techniques for assessment of vascular function, the most important, and most commonly used combines arterial imaging (especially of brachial artery) in response to reactive hyperemia, causing a flow increase and expected endothelium-dependent dilation.22,27 In this method, an arterial occlusion cuff is inflated for occlusion of arteries in the distal hand or distal forearm, followed by deflation allowing vasodilation in response to reactive hyperemia in distal and proximal vascular beds, which is mediated by release of endothelial factors, such as NO.29 NO induces increased shear stress and dilation, resulting in increased flow in the proximal artery.22 Such response is known as flow-mediated dilation (FMD). The method involves ultrasound arterial imaging in two conditions, at rest (baseline) and during reactive hyperemia (after a five-minute arterial occlusion).27,30

Brachial FMD is an indirect measure of NO release by the endothelium due to a transient flow stimulus.31 Dependence of FMD on NO was demonstrated by intra-arterial infusion of NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA), a specific eNOS inhibitor, which decreased arterial dilation by approximately 66% in response to shear stress.32

A proportional relationship between the magnitude of dilation and endothelial function has been suggested.22 Impaired FMD is one of the early, reversible manifestations of vascular disease, and may be an important indicator of endothelial damage.33 In addition, endothelial dysfunction detected by FMD can potentially predict a risk factor even in the absence of coronary diseases.26,34 Assessment of FMD has been proposed as a method with potential clinical applicability in the identification of risk factors for cardiovascular events, even in asymptomatic patients.35

Furthermore, measurement of FMD can stratify individuals at low, moderate or high risk for future cardiometabolic events.31 Gokce et al.36 have suggested that impaired FMD has long-term prognostic value and that the technique may be used to influence therapeutical strategies on a particular patient. In this context, studies have demonstrated an association between impaired FMD and risk factors for cardiovascular events.34-36

In methodological perspectives, some aspects should be taken into account in assessing FMD. Due to variations in dilation between post-prandial periods, particularly after high fat meals and fasting periods, or during menstrual cycle, it is recommended that FMD be assessed during fasting and at the same menstrual cycle phase (folicular phase).33

However, similar to other methods, FMD has a few limitations that should be considered. First, the lack of standardization and variations in cuff placement or positioning make comparison of results difficult. Besides, in some situations, the degree of reactive hyperemia may vary even under the same stimulus. Also, changes in the structure of blood vessels and impaired dilation may be limiting factors during FMD assessment.1 It is worth pointing out that the method is highly observer-dependent, which may lead to different FMD values.

 Laser Doppler flowmetry (LDF)

LDF is an excellent method for measuring skin microcirculation.37,38 The method is based on the direction of a laser light beam to a tissue sample at a known frequency and measurement of the Doppler shift that arises in light that has been scattered by moving red blood cells.22 LDF has been widely used because of its non-invasiveness, simplicity and possibility of continuous measurement.37 LDF does not provide a direct measurement of blood flow, but rather an index of cutaneous perfusion.

The technique is based on diffusion and refraction of a monochromatic light beam. The light has its wavelength changed (Doppler effect) after being scattered by moving red blood cells.38 The frequency and size of this effect are associated with velocity and amount of red blood cells. The wavelength commonly used in laser-Doppler flowmeter is 780 nm, which can penetrate into the skin regardless of color or oxygen saturation.38,39

When combined to other techniques, such as the infusion of vasoactive substances, iontophoresis of small charged molecules and techniques that induce reactive hyperemia, LDF has been used to determine changes in skin microcirculation at real time.22 For example, LDF combined with the intradermal administration of ACh by iontophoresis induces endothelium-dependent dilation that allows quantification of local blood flow.40

LDF has good precision in quantifying rapid changes in cutaneous blood flow. However, the characteristic heterogeneity of the tissue, due to differences in anatomy, causes spatial variability that leads to a relatively low reproducibility of the method. On the other hand, the use of integrated probes may reduce spatial variability and increases in reproducibility.38 Another advantage of this technique is its non-invasiveness; even when combined with intradermal infusion, the method is relatively safe due to the small amount of drug infused. LDF is less challenging than FMD, but has good clinical potential for assessment of vascular health.22

Venous occlusion plethysmography (VOP)

VOP has been studied for more than 90 years, and its primary objective was to evaluate blood flow in the organs.41 Today, VOP is widely used in the evaluation of endothelial function, in the assessment of the autonomic nervous system that regulates blood flow, and the vasodilation response to several stimuli, such as exercise and stress.41,42 For its easy applicability, VOP has been widely used in in vivo studies on vascular physiology in humans, both in healthy individuals and in several disease conditions.43

VOP is a non-invasive method that involves inflation of the upper arm cuff to a pressure lower than systolic pressure. Usually, an inflation pressure of around 40 mmHg is used for intervals of approximately 10 seconds, followed by 5 seconds of deflation, during 2-3 minutes44,45

The inflation pressure used is sufficient to arrest venous return without impairing arterial flow towards the forearm, causing a linear increase in blood flow to the limb. This is measured by a strain gauge, which detects any change in tissue volume, placed in the point of maximal circumference of the forearm.43

At resting conditions, blood flow in the forearm is divided into 70% in striated skeletal muscle and 30% in the skin. There are multiple arteriovenous communications in the hand related to skin supply. To avoid that such blood supply affects the measurement of forearm blood flow, a wrist cuff is inflated to suprasystolic pressure just before flow measurement.42,43,46,47

Vessel responsiveness is assessed by evaluation of volume changes in the limb in response to stimuli, which can be a mechanical stimulus that promotes reactive hyperemia, or a chemical stimulus via administration of vasoactive compounds (invasive technique). A decreased or impaired response may be an evidence of endothelial dysfunction,48 which is considered a critical factor for the development, progression and complications of coronary artery disease.49 Preserved endothelial function acts as an important regulator of vascular inflammation and remodeling.43,47,48,50

Endothelium-dependent vasodilation can be measured by reactive hyperemia which is induced by inflation of a forearm cuff as described above. The stimulus triggers the release of vasodilators, particularly NO, in the microvasculature, and increases flow velocity. The shear stress resulting from the friction of blood against the wall of the vessel promotes vasodilation. The cuff is rapidly deflated and changes in the vessels are measured.50 This response can also be measured by administration of ACh, which is an agonist of muscarinic receptors located on the endothelium, and used in the assessment of endothelium-dependent vasodilation. Usually, increasing doses of ACh are administered during 5 minutes and the forearm blood flow is measured (as mL.100mL-1.min-1) in the last two minutes of infusion.43,47

Endothelium-independent vasodilation is evaluated by the infusion of vasoactive substances that act as NO precursors, such as sodium nitroprusside, for example. Vascular changes will be detected by strain gauges, which confirm whether an adequate response has occurred. When the response is consistent with the stimulus, the endothelial function is preserved.43

Invasive VOP, i.e., involving intra-arterial infusion of vasoactive substances, is considered a gold standard tool for analysis of vascular behavior, but is largely impractical in the clinical setting.

 Pulse wave velocity (PWV)

At the end of ventricular ejection, a pressure wave propagates from the heart to the periphery at certain velocity. This velocity is named PWV.51 Some authors have defined PWV as the distance traveled by blood flow divided by the time taken to travel that distance (in meters/second).52

PWV has been used as an important marker of cardiovascular risk.53 The lower the PW, the more elastic and healthier the vessel. However, increased arterial stiffness is related to increased propagation of pulse waves in the aorta and large vessels, and early return of pulse waves from the periphery.54 Pulse waves are normally reflected at discontinuities throughout the arterial tree, and retrograde waves are generated in the ascending aorta. This early return in the end of systole causes a cardiac overload.51

The association between arterial stiffness and risk factors such as coronary artery disease, diabetes mellitus, arterial hypertension, diastolic function and age has been well established.51 PWV values are lower in healthy young individuals, but increases with age, as the elastic properties of blood vessels decrease.55 The cutoff value of PWV for prediction of cardiovascular events is still controversial, but a value greater than 12 m/s has been suggested as indicator of cardiovascular risk.51

Technical differences exist between the methods for PWV measurement. However, the carotid-femoral relation has been considered the gold standard in the literature, for its non-invasiveness and for expressing PWV values directly related to the aorta artery.56-58 The method is performed with the individual in the supine position, and two transducers are used for the measurement, one is placed on the right common carotid artery and one on the right femoral artery. The difference between the time for the onset of carotid pulse wave and femoral pulse wave, and the distance between the two transducers are used to calculate PWV.51,57,58

Another method that has been widely recommended for pulse wave analysis is applanation tonometry. This technique is used to estimate aortic pulse wave from the common carotid artery or the radial artery pulse waves. However, as radial artery is supported by a bony structure, which makes the measurement easier, radial artery tonometry has been the most commonly recommended approach. A transducer is placed on the skin at protruding parts of the vessel to record pressure wave signals, and then a transfer function is applied to calculate aortic pressure wave.57

Since arterial stiffness is a strong evidence of cardiovascular disease, analysis of pulse wave in the clinical practice may identify changes that might be related to vascular health, even before the occurrence of signs and symptoms.58

Limitations of the method are related to associated comorbidities, including metabolic syndrome, obesity and diabetes, which may affect the femoral pulse wave recordings. Besides, men with abdominal obesity and women with large breast size can cause errors in distance measurements.57

Serum markers of endothelial dysfunction

Biomarkers are analytic tools used in the analysis of biological parameters. In 2001, the National Institutes of Health Biomarkers Definitions Working Group defined a biomarker or biological markers as "a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention". Today, biomarkers have been used in: 1) identification of individuals at high cardiovascular risk; 2) fast and accurate diagnosis of diseases; 3) effective prognosis and treatment. Regardless of its purpose, a biomarker has clinical relevance when it is accurate, standardized and reproducible, appropriate for the patients' condition, of easy interpretation by clinicians, and if it has high sensitivity and/or specificity for the parameter it proposes to identify.59

Advantages of the use of serum biomarkers in the assessment of endothelial function include simplicity of the procedures and the fact that samples of venous blood are widely used in laboratory routine. The use of these biological markers in the prognosis and/or diagnosis of vascular diseases is most common at initial stages, but this is an area of great potential.1

Cell adhesion molecules (ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin)

Endothelial cells play a key role in the transport of another cell types and metabolic substrates between blood and interstitial space, including a complex signaling system that regulates innate immune responses in the vascular bed. When these cells are activated by pro-inflammatory stimuli, such as bacterial endotoxins, interleukin 1B (IL-1B), tumoral necrosis factor alpha (TNF-α), C-reactive protein (CRP), and ox-LDL, or by blood flow-related hemodynamic forces, the expression of adhesion molecules is increased and, thus, are considered early markers of endothelial activation and systemic inflammation.60

Transendothelial migration of leukocytes is regulated by soluble cell adhesion molecules, such as ICAM-1, VCAM-1 and E-selectins. ICAM-1 is a member of the immunoglobulin supergene family and ligand for the β2 integrin molecules present on leukocytes,61 and is highly expressed in endothelial cells and subendothelial macrophages.62 ICAM-1 mediates a number of cell-cell interactions, including adhesion and transmigration of leukocytes to the vascular endothelial wall. Data from the literature support the hypothesis that ICAM-1 expression activates endothelial cells and leads to inflammation, which, in turn, are important steps for the initiation and progression of atherosclerosis.63

VCAM-1 also belongs to the immunoglobulin supergene family and is ligand to the very late antigen-4, a β-integrin found on the surface of mononuclear cells.64 VCAM-1 expression is restricted to endothelial cells and occasional fusiform cells. In contrast to ICAM-1, which is produced in low concentrations, VCAM-1 is not expressed on healthy endothelial cells.62 It has been suggested that VCAM-1 expression may result in endothelial activation, as it increases the recruitment of monocytes and improves the monocyte-endothelial interaction in the initial steps of the atherosclerotic lesion formation.65

E-selectin, a molecule belonging to the family of C-type lectins, is probably the most specific endothelial activation marker.66,67 Its expression is restricted to vascular endothelium and induced by inflammatory cytokines. This adhesion molecule is involved in leukocyte recruitment to inflammation sites, and participates in slow leukocyte rolling in inflamed venules.67

Inflammatory markers

Recent evidence has demonstrated that inflammation is closely related to the pathogenesis of atherosclerosis and its complications. CRP, CD40 ligand (CD40L), IL-18, monocyte chemotactic protein 1 (MCP1), among others, are inflammatory markers that result in endothelial activation.68 There is also strong scientific evidence that inflammatory activation is an important pathway involved in the development and progression of atherosclerosis. The inflammatory cascade is involved in the entire process of plaque formation, from the early stages of endothelial dysfunction to the development of acute coronary syndromes.69

Interleukin-18 (IL-18)

IL-18, a member of the IL-1 cytokine family, is highly expressed in atherosclerotic plaques and found mainly in macrophages. IL-18 promotes the increase of adhesion molecule expression in vascular endothelium and, for this reason, increased IL-18 expression is directly associated with the development of endothelial dysfunction.68

C-reactive protein (CRP)

CRP is a circulating pentraxin consisting of five identical subunits arranged as a cyclic pentamer that has an important role on human innate immune response.70 Research of the last twenty years have suggested that CRP may have proatherosclerotic effect, and directly affect adhesion molecule expression and fibrinolysis, thereby participating in inflammatory process of endothelial cells and development of endothelial dysfuntion.71-73

These studies have demonstrated that CRP promotes endothelial activation by expression of ICAM-1, VCAM-1, E-selectins and MCP-1, and activates macrophages to express cytokine and tissue factor, leading to enhanced LDL uptake by other lipoproteins.73 In addition, CRP negatively modulates the production of endothelium-derived vasoactive factors, especially NO, which is the main regulator of vascular homeostasis. This process may facilitate endothelial cells apoptosis and attenuate important compensatory mechanisms to angiogenesis.71

Besides, CRP may stimulate the production of endothelin-1 (ET-1), a powerful endothelium-dependent vasoconstrictor, and IL-6, a key proinflammatory cytokine.72 These data corroborate the hypothesis that CRP is a predictor of atherosclerosis and vascular death. CRP serum concentrations may reflect endothelial health, since this protein has the potential to change endothelial cell phenotype, and contribute to lesion formation, plaque rupture and coronary thrombosis. Therefore, CRP acts not only as an inflammatory biomarker, but also as a mediator of vascular disease.60

CD40 ligand (CD40L)

CD40L, found either in free or soluble form, is a type II transmembrane protein belonging to TNF superfamily, involved in a pathophysiologic pathway closely related to inflammation and atherogenesis.74 Most circulating CD40L is expressed in platelets, which are not only critical elements for homeostasis, but also have the potential to trigger an inflammatory response in the vascular wall.75 Once activated, platelets promptly express CD40L, which, in turn, induces endothelial cells to secrete chemokines and to express adhesion molecules, thereby promoting the recruitment and extravasation of leukocytes at the site of injury.76

CD40L can be quickly released from the platelet membrane as a soluble form. Both forms have prothrombotic and proinflammatory effects, enhancing platelet activation and aggregation, and platelet-leukocyte and leukocyte-endothelium conjugation. CD40L also increases the release of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen from stimulated platelets.77 In summary, CD40L activation system promotes a chronic inflammatory state in the vascular wall, contributing to the development of endothelial dysfunction, atherogenesis and respective complications.74

Monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1)

Monocytes adhered to the vascular wall due to the effect of cell adhesion molecules transmigrate from the endothelium into the tunica intima, the innermost layer of the arterial wall. This monocyte migration is mediated by a concentration gradient of MCP-1, via interaction with the monocyte receptor CCR2. In the arterial intima, monocytes develop into macrophages and begin to express scavenger receptors, such as SR-A, CD36, and LOX-1, that internalize modified lipoproteins. This process gives rise to macrophages or foam cells that act in lipid transportation, which characterize early atherosclerotic lesions.78

MCP-1 induces the recruitment of monocytes after endothelial lesion, and this lesion seems crucial for the expression of MCP-1 in adherent platelets. Therefore, MCP-1 expression after vascular lesion is a highly specialized mechanism and exerts a key role in vascular remodeling in injury. Measurement of plasma MCP-1 may reflect the degree of endothelial dysfunction.78

Circulating endothelial cells (CEC) and endothelial microparticles (EMP)

Endothelial function reflects the balance between vascular endothelial lesion and repair. Based on this relationship, measurement of mobilization of mature endothelial cells and derived microparticles has been performed to estimate the endothelial injury degree. Circulating endothelial cells (CEC) are detached in activation or loss of integrity of vascular endothelium, and may be measured by flow cytometry or fluorescence microscopy. Once endothelial apoptosis begins, there is an abrupt increase in calcium release from sarcoplasmic reticulum, changing the status of the resting cell membrane.54 Data in the literature have suggested a direct relationship between increased CEC levels in peripheral circulation and the extent of endothelial lesion in patients with atherosclerotic disease and vascular inflammation.78

Endothelial microparticles (EMP) are small vesicles that are released from the membrane of activated or injured CEC cells in response to activation and/or apoptosis.78 Once released from the cells of origin, EMP express on their surface adhesion molecules, enzymes, receptors, and constitutive antigens,53 whose composition may characterize the endothelial progenitor cells. Normally, there is a local, slight, reversible endothelial activation, i.e., when the endothelium in the basal state starts to express cytokines and adhesion molecules, triggering inflammatory mechanisms, and circulating EMP are rarely found. Increased EMP levels have been found in a variety of conditions associated with endothelial activation or apoptosis.66 suggesting a direct relationship of EMP with thrombogenesis and atheroma plaque formation,55 and involvement of these molecules in inflammation, vascular injury and angiogenesis.54

Myeloperoxidase (MPO) and Reactive oxygen species (ROS)

MPO, a member of the heme peroxidase superfamily, is an enzyme released from activated neutrophils, monocytes, and tissue macrophages, that catalyzes ROS formation.60 In addition to its activity against infectious diseases, MPO has been also recognized for its role in the onset and progression of atherosclerosis.7,79 MPO can bind to glycosaminoglycans in the vascular walls and impair the release of endothelium-derived NO leading to local endothelial function.7

Products of MPO activity, such as hypochlorous acid, tyrosyl radical and nitrogen dioxide reacts with hydrogen peroxide and may contribute to oxidative damages in lipids and proteins in the body. Therefore, literature corroborates the idea that MPO levels may predict the development of endothelial dysfunction and coronary artery disease. Low MPO levels and certain specific MPO polymorphisms have been described as cardioprotectors.60,79

Although oxidative stress may promote endothelial dysfunction by numerous mechanisms, the main pathway involves the reduction in NO bioavailability. In certain circumstances, a chronic ROS production may exceed enzymatic and non-enzymatic antioxidant capacity, leading to an increase in oxidized biomolecules and associated tissue damage. Evidence has suggested that oxidative stress has a central role in atherogenesis, probably via development and progression of endothelial dysfunction.66

Vascular endothelial growth factor (VEGF)

VEGF, also known as vascular permeability factor, is widely known for its role in angiogenesis, promoting the proliferation and migration of endothelial cells, and increasing vascular permeability. It is produced by different cell types, including endothelial cells. VEGF binds mainly to cell surface receptor tyrosine kinases named VEGFR-1, VEGFR-2 and VEGFR-3.80 Concerning the assessment of endothelial function, VEGFR-2 stands out among these receptors due to its expression restricted to vascular endothelial cells. It also has an important role in cell migration, endothelium-dependent vasodilation and angiogenesis.

VEGFR-2 activation occurs by its binding to VEGF or by increased blood flow shear rate, which triggers a signaling cascade and consequent activation of the MEK-MAPK pathway (proliferation and migration), the PI3K-Akt pathway (survival), and the Src-eNOS pathway (permeability). In adults, VEGFR-2 is physiologically detectable in low amounts in the blood. In adverse conditions, such as tumoral growth, injury repair, and inflammatory diseases, VEGFR-2 participates in the local revascularization process.80

Others

Ox-LDLs are proinflammatory, immunogenic molecules that may affect a great variety of atherosclerotic processes, from early events, such as adhesion molecule expression and activation of the immune system, to late events, such as platelet aggregation and destabilization of the atherosclerotic plaque.7 Ox-LDL is produced by oxidative processes during LDL migration through blood vessel walls, and has been suggested as a marker of endothelial dysfunction and atherogenesis.68

Another endothelial function marker is free fatty acids (FFAs). FFAs may enhance ROS levels by increased cytokine production in mononuclear cells. In addition, FFAs may induce the activation of proinflammatory NF-kB pathways in human endothelial cells. Because to these characteristics, FFAs are considered an early biomarker of endothelial lesion and atherosclerosis, with important implications for the prevention and treatment of cardiovascular diseases.60

Procoagulant consequences of endothelial activation can be measured by changes in the balance between tissue plasminogen activator (tPA) and its endogenous inhibitor, plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). Von Willebrand factor, a glycoprotein extensively produced in activated endothelium, has an additional role in the activation of cells and platelets, and induction of coagulation. In addition, fibrinogen may also be considered an endothelial function biomarker. This glycoprotein, synthesized mainly in hepatic cells and megakaryocytes, may bind to glycoprotein (GP) IIb/IIIa surface proteins and for bridges to platelets. Fibrinogen stimulates migration of smooth muscle cells and platelet aggregation and increases blood viscosity; hence, it is associated with development of atherosclerosis.66

Conclusion

Evidence has shown the importance of endothelial dysfunction for the development and progression of cardiovascular diseases. Numerous in vivo or in vitro, and invasive or non-invasive methods have been used for the investigation of endothelial function. Although these techniques have been widely used in the clinical research, these methods cannot be used for diagnostic purposes due to their invasiveness, high cost and difficult standardization. Therefore, further studies and investments in the field are suggested to make these methods applicable in the clinical practice and, hence, minimize public health problems related to cardiovascular diseases by means of an early diagnosis of endothelial dysfunction.

Limitations

The present study is a narrative review of the literature and, for this reason, does not present a well-established, reproducible methodology. Identification, selection, analysis and interpretation of the studies reviewed were left to the authors' discretion. However, it is worth highlighting that the aim of this review was to provide an update of current methods used for the assessment of endothelial dysfunction and to point out new perspectives in this field.

Sources of Funding

This study was partially funded by CAPES, FAPERJ, CNPq.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Acknowledgements

The authors thank the Laboratory of Exercise Science of the Fluminense Federal University for the support provided during the study.

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Lange C Storkebaum E de Almodóvar CR Dewerchin M Carmeliet P Vascular endothelial growth factor: a neurovascular target in neurological diseases Nat Rev Neurol 2016 12 8 439 454 Artigos de Revisão Métodos de Investigação da Função Endotelial: Descrição e suas Aplicações Storch Amanda Sampaio Mattos João Dario de Alves Renata Galdino Iuri dos Santos Rocha Helena Naly Miguens Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, RJ - Brasil Correspondência: Amanda Sampaio Storch, Universidade Federal Fluminense - UFF Rua Professor Hernani Pires de Melo, 101 São Domingos, Niterói, RJ - Brasil. E-mail: amandasstorch@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Obtenção de dados: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Análise e interpretação dos dados: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Redação do manuscrito: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Storch AS, Mattos JD, Alves R, Galdino IS, Rocha HNM.

Potencial Conflito de Interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Palavras-chave: Endotélio Vascular Função endotelial Aterosclerose Vasodilatação Introdução

O endotélio é a monocamada celular que reveste o interior dos vasos sanguíneos, incluindo artérias, veias e as câmaras do coração,1 atuando como uma camada protetora entre os demais tecidos e o sangue circulante.2 Essas células são denominadas células endoteliais. O endotélio exerce função determinante no controle da homeostase vascular, participando da regulação de sinais intracelulares,1 permeabilidade e tônus vascular,3 cascata de coagulação e angiogênese,4 entre outros. Uma das principais funções do endotélio é a liberação de substâncias frente a estímulos, que atuam de forma autócrina e/ou parácrina.2 Dessa forma, agressões ao endotélio geram uma resposta inflamatória, com atuação de diversos tipos celulares (linfócitos, monócitos, plaquetas e células musculares lisas),5 levando a um quadro de disfunção da célula endotelial, enrijecimento da parede vascular e formação da placa de aterosclerose.6

A disfunção endotelial é uma característica precoce chave no desenvolvimento e progressão da placa aterogênica e suas respectivas complicações. Essa condição é caracterizada por uma redução na biodisponibilidade de vasodilatadores derivados do endotélio, tais como o óxido nítrico (NO), e um aumento, relativo ou absoluto, da biodisponibilidade de vasoconstritores. Este desequilíbrio prejudica a vasodilatação dependente endotélio, marca funcional que caracteriza a disfunção endotelial.7

No início da formação da placa ateromatosa, a disfunção endotelial pode ser caracterizada pelo aumento na expressão e liberação de moléculas de adesão, entre elas, a selectina endotelial (E-selectina), a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a molécula de adesão vascular 1 (VCAM-1). Essas moléculas são liberadas em resposta a estímulos de citocinas inflamatórias, de lipopolissacarídeos bacterianos ou de lipoproteínas de baixa densidade oxidadas (LDL-ox). Elas permitem a ligação célula-célula ou célula-matriz extracelular, levando à deposição de células espumosas no espaço subendotelial,8 e aumento da espessura da parede do vaso, com redução ou até mesmo completa obstrução do lúmen vascular.9

A determinação da função da endotelial consiste na análise de sua responsividade a estímulos vasodilatadores ou vasoconstritores, permitindo o avanço no entendimento do desenvolvimento e progressão da aterosclerose e possíveis alvos terapêuticos.2 Os métodos consistem em análises in vitro, como cultura de células endoteliais, e in vivo, como a dilatação mediada pelo fluxo (DMF), pletismografia por oclusão venosa (POV) ou dosagem de marcadores séricos. No entanto, nenhuma dessas técnicas atualmente é aplicada para diagnóstico clínico de disfunção endotelial, uma vez que elas são muito invasivas, caras ou difíceis de padronizar.1

A alteração da função endotelial precede as alterações ateroscleróticas morfológicas e pode contribuir para o desenvolvimento da lesão e das complicações clínicas finais. As doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causas de morte natural no mundo, inclusive no Brasil. Dados recentes do DATASUS de 2014 apontaram que aproximadamente 30% dos registros de mortalidade nacional foram decorrentes de doenças cardiovasculares. Dessa forma, a pesquisa clínica, por meio das técnicas mencionadas acima, possibilita o melhor entendimento desse problema e permite que novas oportunidades de prevenção e tratamento surjam, diminuindo a morbimortalidade e gastos públicos. O amplo conhecimento das ferramentas de avaliação da função endotelial pelos profissionais da área da saúde possibilita o aprimoramento das mesmas, tornando possível a translação da pesquisa clínica para efetiva aplicação na clínica médica.

A seguir, técnicas de avaliação da função endotelial serão descritas de acordo com últimos achados da literatura.

 Análises <italic>in vitro</italic> Cultura de células endoteliais

A cultura de células endoteliais é largamente descrita na literatura, principalmente em estudos que demonstram o efeito do estresse oxidativo e inflamação sobre os mecanismos de mobilização e proliferação dessas células in vitro.1 O desenvolvimento da cultura de células endoteliais a partir de sangue periférico representa um importante passo nas pesquisas sobre células angiogênicas circulantes, uma vez que essas células passaram a ser isoladas para estudo.

Contudo, a utilização da cultura celular para avaliação da função endotelial apresenta prós e contras. A possibilidade do estudo de diferentes vias de sinalização intracelular permite que diversos ensaios sejam feitos, com diferentes objetivos. Por exemplo, a descoberta de marcadores de superfície, anticorpos monoclonais e beads magnéticas de imunoensaio facilitaram o processo de isolamento, quantificação e caracterização de células endoteliais. No entanto, essa técnica apresenta limitações em relação a alterações fenotípicas que as células sofrem dependendo do tempo de cultura e do meio utilizado, além de não estar completamente estabelecido como um modelo fiel ao in vivo.10 Dessa forma, o protocolo para realização da cultura deve ser cuidadosamente estudado, uma vez que diferentes fatores de crescimento são conhecidos por estimular diferentes fenótipos nas células em proliferação.11

Devido à dificuldade em se estudar o endotélio in vivo, diversas técnicas in vitro foram desenvolvidas.12 Dentre essas técnicas, as HUVECs (células endoteliais de veia umbilical humana) têm sido largamente utilizadas como fonte de células endoteliais humanas, uma vez que são livres de patógenos e fisiologicamente mais relevantes que a demais linhagens disponíveis.13 Culturas primárias com essas células são capazes de manter características nativas das células do endotélio, incluindo a expressão de marcadores de superfície específicos, além de vias de sinalização de intracelulares.14

Uma vez no meio de cultura, essas células apresentam padrão disperso na placa e após dias de incubação, passam a apresentar padrão confluente, ocupando a maior parte do fundo da placa.15 Quando a placa se apresenta completamente coberta, as células se agrupam e formam tight junctions (junções de oclusão); as células adquirirem formato de paralelepípedo e se assemelham ao que ocorre in vivo.16 HUVECs são usualmente utilizadas em pesquisas de biologia molecular, permitindo avanços no estudo da fisiopatologia da formação da placa de ateroma e dos mecanismos responsáveis pelo controle da angiogênese e vascularização das áreas danificadas.12,17 Culturas de HUVECs possibilitam estudos de interação celular (resultando na análise de moléculas de adesão e citocinas), avaliação dos efeitos da taxa de cisalhamento e fluxo oscilatório na sinalização celular (de forma a reproduzir o fenômeno que ocorre no lúmen dos vasos), além de permitir a descoberta de receptores e fatores de transcrição que participam no desenvolvimento e progressão da disfunção endotelial.18-20 No entanto, os resultados devem ser interpretados com cuidado devido às já mencionadas limitações da metodologia.

 Ensaios funcionais <italic>in vitro</italic>

Nas últimas décadas, ensaios funcionais in vitro vêm sendo utilizados para avaliação da função endotelial, como o banho de órgão e o registro miográfico, e se mostrado técnicas essenciais para a descoberta de fatores de relaxamento derivados do endotélio (EDRF), sendo o mais estudado entre eles, o óxido nítrico (NO).21 Tais ensaios são importantes uma vez que nos permitem medir o relaxamento dependente do endotélio de alguns segmentos, em resposta a agonistas reconhecidos - acetilcolina (ACh) e nitroprussiato de sódio.22

O banho de órgão isolado é uma técnica in vitro que avalia a reatividade vascular em resposta a agonistas, gerando uma curva dose resposta utilizada para investigar alterações fisiológicas e farmacológicas de preparações biológicas isoladas de várias espécies (coelho, rato, etc). Tecidos e órgãos utilizados incluem: anéis ou tiras de artérias e veias, átrio, ventrículo ou músculo papilar, diafragma, fundus de estômago, intestino (duodeno, jejuno e íleo), traqueia, útero, entre outros. Esta técnica tem por função reproduzir um ambiente fisiológico adequado de temperatura, aeração e nutrientes para análises dessas preparações. Ela é composta por uma aparelhagem que consiste de uma cuba de vidro de parede dupla que possui em seu interior uma câmara muscular, com capacidade variável entre 5 e 50 mL, conectada a uma serpentina helicoidal por onde desloca-se o líquido nutritivo. Esta serpentina helicoidal encontra-se banhada com água aquecida a 37ºC, a qual é impulsionada por uma bomba de circulação. O órgão ou tecido isolado é mantido dentro da câmara muscular. Uma de suas extremidades é fixada em uma haste de vidro conectada a uma bomba de ar que proporciona aeração da solução nutritiva, e a outra extremidade, fixada a uma alavanca, é conectada a um transdutor de força por uma linha de algodão.23,24

A partir daí os experimentos envolvem adição de drogas em doses cumulativas à câmara muscular ou estimulação elétrica (quando o órgão é fixado entre dois eletrodos de platina conectados a um estimulador elétrico), que resultam na contração ou relaxamento do músculo em estudo. As mudanças de tensão são registradas em miógrafos (quimógrafos, fisiógrafos ou sistemas de aquisição digital),1 os quais registram a intensidade e a cinética dos diferentes estágios da contração (velocidade, frequência ou decaimento). A partir dos resultados experimentais, curvas de resposta à dose ou ao estímulo são geradas.23 Quando a curva dose-resposta desloca-se para a direita, significa que há um comprometimento da liberação de EDRF/NO pelo endotélio.25

Essa técnica é importante, pois proporciona o controle total do ambiente de experimentação (solução nutritiva, temperatura controlada, etc) e é capaz de isolar elementos da função endotelial usando, por exemplo, inibidores da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), como L-NAME. Outras vantagens do método incluem o preparo relativamente simples, o que permite múltiplas preparações simultaneamente; a possibilidade do uso de estimulação elétrica; e quantificação precisa da resposta.23

Uma desvantagem desse método é que sua utilização é restrita à experimentação animal, devido a considerações éticas que limitam a disponibilidade e a quantidade de amostras humanas e à variabilidade das respostas relacionadas com eventos controlados nos pacientes. Outra desvantagem seria a necessidade de utilizar um tamanho relativamente grande do tecido (> 1 mm de diâmetro), o que inviabiliza a avaliação de vasos com diâmetro menores.23 Apesar de ser a metodologia mais amplamente utilizada para o estudo da função endotelial em modelos animais, ela apresenta a limitação de não distinguir os fenômenos biológicos que ocorrem no lúmen e no exterior do vaso sanguíneo.

 Análises <italic>in vivo</italic> Dilatação mediada pelo fluxo (DMF)

Importantes evidências sugerem que a detecção da disfunção endotelial na artéria braquial atua como um importante indicador de disfunção endotelial sistêmica.26 A função vascular pode ser medida de diversas formas, tanto com a utilização de técnicas invasivas como métodos não invasivos.27

As técnicas invasivas envolvem principalmente a administração intra-arterial de substâncias que promovem o aumento da liberação de NO que, por sua vez, induz a dilatação dos leitos vasculares investigados em indivíduos saudáveis. A observação de vasoconstrição nessas situações indica possível disfunção endotelial.28 Todavia, por sua natureza invasiva, apresentam como desvantagem a dificuldade de utilização generalizada na população. Dessa forma, o desenvolvimento e a utilização de métodos não invasivos tornam-se mais práticos e acessíveis para determinação da função vascular.27

Dentre as inúmeras técnicas não invasivas de determinação da função vascular, uma que desponta como a mais utilizada e mais importante, combina o imageamento de artérias (principalmente da artéria braquial) em resposta a uma hiperemia reativa, induzindo aumento de fluxo local e esperada dilatação dependente de endotélio.22,27 Nesta técnica, com auxílio de manguito pneumático ou torniquete, vasos distais da mão ou do antebraço são ocluídos por determinado tempo, seguido da liberação dos aparatos de oclusão. Essa liberação resultará em hiperemia reativa nos leitos vasculares distais e proximais, consequência de uma dilatação local, mediada pela liberação de alguns fatores, como o NO.29 O aumento do fluxo nas artérias proximais, como a braquial, é resultado do aumento do estresse de cisalhamento e da dilatação induzida pelo NO.22 A esta resposta, dá-se o nome de dilatação mediada pelo fluxo (DMF). Classicamente, a técnica envolve o imageamento de artérias com auxílio de um ultrassom durante duas condições: durante o repouso (medidas basais) e durante a hiperemia reativa (após um período de 5 minutos de oclusão arterial).27,30

A DMF na artéria braquial é uma medida indireta de liberação do NO pelo endotélio a partir de um estímulo transiente de fluxo sanguíneo.31 A dependência da DMF pelo NO foi mostrada por meio da infusão intra-arterial de um inibidor específico da eNOS , a Ng-mono-metil-L-arginina (L-NMMA), que reduziu em aproximadamente 66% a dilatação arterial em resposta ao estresse de cisalhamento.32

Tem sido proposta uma relação proporcional entre a magnitude da dilatação mediada com a função endotelial.22 Uma DMF prejudicada é considerada uma das primeiras manifestações potencialmente reversíveis de doença vascular, e pode resultar em uma importante medida do impacto de danos ao endotélio.33 Além disso, a disfunção endotelial detectada pela DMF tem potencial em predizer um fator de risco mesmo na ausência de diagnóstico para doenças coronarianas.26,34 Nesse sentido, a determinação da DMF tem sido proposta como uma técnica com potencial aplicabilidade clínica na identificação de fatores de risco para eventos cardiovasculares, mesmo em pacientes assintomáticos.35

A determinação da DMF tem capacidade de estratificar os indivíduos em baixo, moderado ou alto risco para futuros eventos cardiometabólicos.31 Para Gokce et al.,36 uma prejudicada DMF tem valor prognóstico a longo prazo e sugerem que a técnica pode ser utilizada na tomada de decisões terapêuticas sobre determinado paciente. Baseado nisso, estudos mostraram uma associação entre uma deficiente DMF com o aumento de fatores de riscos de eventos cardiovasculares.34-36

Sob perspectivas metodológicas, alguns cuidados devem ser levados em consideração durante a determinação da DMF. Por causa de variações na magnitude de dilatação entre períodos pós-prandiais, principalmente após refeições ricas em lipídeos e momentos de jejum ou, ainda, durante o ciclo menstrual, é recomendado que os estudos que investiguem a DMF sejam conduzidos com pacientes em jejum e mulheres na fase folicular do ciclo menstrual.33

Contudo, assim como outras técnicas, a avaliação da DMF apresenta algumas limitações que devem ser levadas em consideração. Primeiramente, a falta de padronização e variações no posicionamento dos manguitos nos punhos/braços e nos diâmetros dos vasos dificultam a comparação dos resultados com outros achados. Além disso, em determinadas condições de doenças, o grau de hiperemia reativa pode sofrer variação mesmo sob estímulos similares. Ainda, alterações nas estruturas dos vasos sanguíneos e uma dilatação prejudicada podem atuar como fatores limitantes durante a técnica de DMF.1 Vale ressaltar que se trata de uma técnica altamente avaliador-dependente, o que pode levar a diferentes valores de DMF.

 Fluxometria por laser Doppler (FLD)

A fluxometria por laser Doppler (FLD) é uma excelente técnica para mensuração da microcirculação cutânea.37,38 É baseada na medição do efeito doppler causado pela refração de uma luz emitida em frequência conhecida sobre as células vermelhas do sangue em movimentação.22 A FLD é amplamente utilizada por se tratar de uma técnica não invasiva, simples de ser aplicada e por permitir medições contínuas.37 FLD não determina diretamente o fluxo sanguíneo local, mas fornece um índice de perfusão cutânea.

Esta técnica é baseada na difusão e refração de um feixe de luz monocromática. O feixe de luz sofre mudanças em seu comprimento de onda (efeito doppler) quando se choca com células vermelhas sanguíneas que estão em constante movimentação.38 A frequência e a magnitude da mudança do comprimento de onda do feixe de luz têm associação com a velocidade dos glóbulos vermelhos e com a quantidade dessas células. A maioria dos equipamentos utiliza um comprimento de onda de 780 nanômetros, suficientes para penetrar na pele de qualquer indivíduo, independentemente de cor ou saturação de oxigênio.38,39

Quando combinada a outras técnicas, como a infusão de substâncias vasoativas com efeito local, a iontoforese de pequenas moléculas carregadas ou técnicas que induzam hiperemia reativa, a FLD tem sido utilizada para determinação de mudanças na microcirculação da pele em tempo real.22 Por exemplo, a administração intradérmica de ACh por iontoforese induz dilatação dependente de endotélio que combinada com a FLD permite quantificar o fluxo sanguíneo da região.40

A FLD apresenta boa precisão para quantificar rápidas alterações no fluxo sanguíneo cutâneo. Todavia, a heterogeneidade característica desse tecido, devido a diferenças em sua anatomia, promove uma variabilidade espacial, que contribui para uma relativa baixa qualidade na reprodutibilidade da técnica. Por outro lado, o uso de probes integrados auxilia na diminuição da variabilidade espacial, permitindo aumentos na reprodutibilidade.38 Outra vantagem desta técnica é seu caráter não invasivo; mesmo quando acoplada à infusão intradérmica, a técnica é relativamente segura, dada a pequena quantidade de droga infundida. Esta técnica apresenta menor complexidade do que a DMF, porém com um bom potencial de relevância clínica para testar a saúde vascular.22

Pletismografia por oclusão venosa (POV)

A pletismografia por oclusão venosa (POV) começou a ser estudada há mais de 90 anos e o seu objetivo inicial era avaliar o fluxo sanguíneo em órgãos.41 Atualmente, a POV vem sendo amplamente utilizada em estudos que investigam a função endotelial, avaliando a ação do sistema nervoso autônomo na regulação do fluxo sanguíneo, assim como a resposta vasodilatadora frente a estímulos diversos como, por exemplo, o exercício e o estresse mental.41,42 Por ser um método de fácil aplicabilidade, a POV é muito utilizada no estudo da fisiologia vascular em humanos in vivo, tanto em indivíduos saudáveis quanto em diversas situações patológicas.43

O procedimento não invasivo de POV consiste na colocação de um manguito pneumático na porção superior do braço do indivíduo, e inflado a uma pressão inferior a pressão diastólica. Geralmente utiliza-se uma pressão em torno 40 mmHg, sendo o manguito inflado intermitentemente durante aproximadamente 10 segundos e desinflado por 5 segundos. Esse procedimento dura em torno de 2 a 3 minutos.44,45

A pressão gerada por essa manobra é suficiente para manter o fluxo arterial em direção ao antebraço, porém impossibilita o retorno venoso, o que acarreta no aumento do volume do membro. Tal aumento é linear e captado por meio de um sensor silástico (strain gauge) que é posicionado no ponto de maior volume do antebraço. Esse sensor é preenchido com mercúrio e é capaz de medir qualquer alteração no volume tecidual.43

O indivíduo em situação de repouso apresenta o fluxo sanguíneo no antebraço que se divide em, aproximadamente, 70% no músculo estriado esquelético e 30% na pele. A mão possui inúmeras comunicações arteriovenosas relacionadas à irrigação da pele. Para que isso não influencie na medida de fluxo no antebraço, é posicionado um manguito inferior em torno do punho é inflado a uma pressão supra sistólica momentos antes da medida.42,43,46,47

A variação no volume do membro proveniente da manobra é utilizada para avaliar a responsividade do vaso. Esse estímulo pode ser mecânico, promovendo hiperemia reativa, ou por via química e invasiva, pela administração de substâncias vasoativas. A resposta prejudicada ou diminuída pode ser um indício de disfunção endotelial.48 A disfunção endotelial é considerada um fator crítico no desenvolvimento, progressão e complicações para a doença arterial coronariana.49 A função endotelial, quando preservada, funciona como um importante regulador de inflamação vascular e remodelamento.43,47,48,50

A vasodilatação endotélio-dependente pode ser mensurada por meio da hiperemia reativa que é estimulada por meio de um manguito posicionado no braço e inflado uma pressão supra sistólica conforme descrito acima. Esse estímulo induz a produção de vasodilatadores, principalmente NO, a partir da microvasculatura, aumentando a velocidade do fluxo. O estresse de cisalhamento provocado pelo atrito do sangue com a parede do vaso promove vasodilatação. Posteriormente, o manguito é liberado rapidamente e as variações nos vasos são medidas.50 Outra forma de se medir essa resposta é por meio da infusão de ACh, que atua como agonista de receptores muscarínicos localizados no endotélio, e usada para avaliar vasodilatação dependente do endotélio. Geralmente são infundidas doses crescentes durante 5 minutos e a medida de fluxo sanguíneo no antebraço, dada por mL.100mL-1.min-1 tecidual, é verificada nos dois últimos minutos da infusão.43,47

Já a vasodilatação endotélio-independente é avaliada pela infusão de substâncias vasoativas precursoras de NO, como o nitroprussiato de sódio. Os strain gauges vão identificar a variação vascular confirmar se houve uma resposta adequada ou não. Quando a resposta condiz com o estímulo, podemos afirmar que a função endotelial está preservada.43

A POV, quando realizada de forma invasiva utilizando a infusão intra-arterial de substâncias vasoativas, é considerada como ferramenta padrão-ouro para a análise do comportamento vascular. Porém, isso inviabiliza a sua realização em grande escala na prática clínica.

 Velocidade de onda de pulso (VOP)

Ao fim da ejeção ventricular, é gerada uma onda de pressão que se propaga do coração para a periferia em determinada velocidade. A medida dessa velocidade é denominada velocidade de onda de pulso (VOP).51 Alguns autores definem a VOP como a distância percorrida pelo fluxo sanguíneo dividida pelo tempo necessário para percorrer tal distância, dada em metros/segundos.52

A VOP tem sido adotada como um importante marcador de risco cardiovascular.53 Assim, quanto menor a VOP, mais elástico e saudável se encontra o vaso. Porém, quando o vaso apresenta um alto nível de rigidez, ocorre um aumento na propagação das ondas de pulso na artéria aorta e grandes vasos, além de causar um retorno precoce das ondas de pulso refletidas da periferia.54 A onda de pulso é normalmente refletida em qualquer ponto de descontinuidade da árvore arterial, causando uma onda retrógrada na aorta ascendente. Esse retorno antecipado, ainda no final da sístole, promove uma sobrecarga no trabalho cardíaco.51

A associação entre a rigidez arterial e fatores de risco como doença arterial coronariana, diabetes mellitus, hipertensão arterial, disfunção diastólica e idade já está bem estabelecida.51 Um indivíduo jovem saudável apresenta valores reduzidos de VOP, porém, com o avançar da idade as propriedades elásticas dos vasos reduzem, aumentando os valores de VOP.55 Ainda existem controvérsias quanto aos valores de VOP e risco cardiovascular, porém, valores maiores que 12 m/s são tidos como "ponto de corte".51

Existem diferentes técnicas para mensuração da VOP, porém a forma estabelecida na literatura como padrão ouro é a relação carótida-femoral por expressar valores diretamente relacionados a artéria aorta e por ser um método não invasivo.56-58 Essa técnica é realizada com o indivíduo em posição supina, e dois transdutores são posicionados, um na artéria carótida comum direita e outro na artéria femoral direita. A diferença de tempo entre o início da onda de pulso carotídeo e o início da onda de pulso femoral, e a medida da distância entre os transdutores são utilizados para calcular a VOP.51,57,58

Outro método amplamente recomendado para a análise das ondas de pulso é a tonometria de aplanação. Essa técnica é utilizada para estimar a onda de pressão aórtica a partir da onda de pressão na artéria carótida comum ou radial. O uso da tonometria da artéria radial é mais recomendado devido ao suporte da estrutura óssea no local, o que facilita a medida. Para a sua realização, é utilizado um transdutor posicionado na pele no local mais proeminente do vaso. Os sinais da onda pressão são captados pelo aparelho e posteriormente é aplicada uma função de transferência para calcular a onda de pressão da aorta.57

A rigidez arterial representa um forte indício de doença cardiovascular, o que justifica o uso da análise de onda de pulso na prática clínica, identificando alterações nos vasos que possam estar diretamente relacionados à saúde vascular mesmo antes do aparecimento de sinais ou sintomas.58

Possíveis limitações da técnica estão relacionadas à existência de comorbidades associadas como síndrome metabólica, obesidade e diabetes, o que pode prejudicar o registro da onda de pressão femoral. Além disso, homens com obesidade abdominal e mulheres com grande volume do busto podem ocasionar erro na determinação da distância entre os pontos de medida.57

Marcadores séricos de disfunção endotelial

Biomarcadores são ferramentas analíticas usadas para avaliar parâmetros biológicos. Em 2001, um grupo de trabalho do National Institutes of Health (NIH) padronizou a definição de biomarcador, ou marcadores biológicos, como "uma característica que é objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica". Atualmente, são utilizados como ferramenta para: 1) identificação de indivíduos sob alto risco; 2) diagnóstico rápido e preciso em condições de doença; 3) prognóstico e tratamento eficazes. Independentemente de sua finalidade, um biomarcador apresenta relevância clínica quando apresenta as seguintes características: precisão; padronização e reprodutibilidade; adequação ao paciente; fácil interpretação por clínicos; e alta sensibilidade e/ou especificidade pelo parâmetro que se propõe a identificar.59

O uso de biomarcadores séricos para avaliação da função endotelial apresenta vantagens devido à relativa simplicidade dos procedimentos e ao fato de que amostras de sangue venoso são amplamente utilizadas na rotina laboratorial. A utilização desses marcadores biológicos para avaliação do prognóstico e/ou diagnóstico de doenças vasculares ainda está em um estágio inicial de desenvolvimento, mas essa área de atuação apresenta um grande potencial.1

Moléculas de adesão celular (ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina)

As células endoteliais desempenham um papel chave no transporte de células e substratos metabólicos entre o sangue e o espaço intersticial, incluindo um complexo sistema de sinalização que regula respostas imunes inatas do leito vascular. Quando essas células são ativadas por estímulos pró-inflamatórios, tais como endotoxinas bacterianas, interleucina 1B (IL-1B), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), proteína C reativa (PCR), LDL-ox ou por forças hemodinâmicas relacionadas ao fluxo sanguíneo, a expressão de moléculas de adesão é aumentada e, portanto, são consideradas marcadores precoces de ativação endotelial e inflamação sistêmica.60

A migração transendotelial de leucócitos é regulada por moléculas de adesão celular solúveis, tais como ICAM-1, VCAM-1 e E-selectinas. A ICAM-1 é membro da superfamília de imunoglobulinas e ligante para integrinas β2 de moléculas presentes em leucócitos61 e é altamente expressa em células endoteliais e macrófagos subendoteliais.62 A ICAM-1 participa da mediação de uma série de interações célula-célula, incluindo a adesão e transmigração de leucócitos na parede do endotélio vascular. Dados da literatura suportam a hipótese de que a expressão de ICAM-1 leva à ativação células endoteliais e a inflamação que, por sua vez, são passos importantes na iniciação e progressão da aterosclerose.63

A VCAM-1 também pertence à superfamília de imunoglobulinas e é um ligante do antígeno-4 muito tardio, uma β-integrina encontrada apenas na superfície de células mononucleares.64 Sua expressão é predominantemente restrita a células endoteliais e células fusiformes ocasionais. De forma contrária a ICAM-1, que é produzida em baixos níveis, a VCAM-1 não é expressa no endotélio saudável.62 Supõe-se que a expressão de VCAM-1 pode resultar da ativação endotelial, uma vez que aumenta o recrutamento local de monócitos e melhora a interação monócito-endotélio durante a iniciação da formação de lesões ateroscleróticas.65

A E-selectina, molécula pertence à família das lectinas do tipo C, é provavelmente a mais específica dentre os marcadores de ativação endotelial.66,67 Sua expressão é restrita ao endotélio vascular e induzida por citocinas inflamatórias. Essa molécula de adesão desempenha um papel importante no recrutamento de leucócitos para o local da inflamação e, medeia a rolagem de leucócitos em vasos sanguíneos inflamados.67

Marcadores inflamatórios

Ao longo dos últimos anos, evidências têm demonstrado que a inflamação está intimamente relacionada com a patogênese da aterosclerose e suas complicações. PCR, ligante de CD40 (CD40L), IL-18, proteína quimiotática de monócitos (MCP-1), entre outros, são marcadores inflamatórios que resultam na ativação endotelial.68 Fortes evidências científicas indicam que a ativação inflamatória é uma importante via no desenvolvimento e progressão de aterosclerose. A cascata inflamatória está envolvida durante todo o processo de formação da placa aterosclerótica, desde as fases iniciais de disfunção endotelial até o desenvolvimento de síndromes coronárias agudas.69

Interleucina-18 (IL-18)

A interleucina- 18 (IL-18), membro da família de citocinas IL-1, é altamente expressa em placas ateroscleróticas e se localiza principalmente em macrófagos residentes nessas áreas. O aumento da expressão de IL-18 está associado diretamente ao desenvolvimento da disfunção endotelial, uma vez que essa interleucina promove aumento na expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular.68

Proteína-C Reativa (PCR)

A PCR é pentraxina circulante composta de cinco subunidades idênticas dispostas na forma de um pentâmero cíclico, que desempenha um papel importante na resposta imune inata humana.70 Pesquisas nos últimos 20 anos sugerem que a PCR pode apresentar capacidade pró-aterogênica e afetar diretamente a expressão de moléculas de adesão e a fibrinólise, atuando, assim no processo inflamatório em células endoteliais no desenvolvimento da disfunção endotelial.71-73

Esses estudos demonstram que a PCR promove ativação endotelial por meio da expressão de ICAM-1, VCAM-1, E-selectinas e MCP-1 e, ainda, ativa macrófagos que expressam citocinas e fatores teciduais, promovendo um aumento da absorção de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) por outras lipoproteínas.73 Verificou-se também que a PCR modula negativamente a produção de fatores vasoativos derivados do endotélio, principalmente o NO, principal controlador da homeostase vascular. Esse processo pode facilitar a ocorrência de apoptose nas células endoteliais e atenuar mecanismos compensatórios importantes para a angiogênese.71

Paralelamente, a PCR tem capacidade de acentuar a produção da endotelina-1 (ET-1), um potente vasoconstritor dependente do endotélio, e da IL-6, uma citocina pró-inflamatória chave.72 Todos esses dados corroboram com a ideia de que a PCR é preditora de aterosclerose e morte vascular. Sua concentração sérica pode refletir a saúde endotelial, uma vez que essa proteína tem capacidade de alterar o fenótipo de células endoteliais e, assim, contribuir para a formação da lesão, ruptura da placa e trombose coronária. Portanto, além de atuar como um biomarcador inflamatório, a PCR também é considerada um mediador de doença vascular.60

Ligante de CD40 (CD40L)

O ligante CD40 (CD40L), que pode se apresentar na forma livre ou solúvel, é uma proteína transmembrana de tipo II que pertence à superfamília do TNF e compõe uma via fisiopatológica intimamente envolvida na inflamação e na aterogênese.74 O CD40L origina-se principalmente de plaquetas que, apesar de serem essenciais para a hemostasia, também têm potencial para iniciar uma resposta inflamatória na parede vascular.75 Uma vez ativadas, plaquetas prontamente expressam CD40L e o aparecimento dessa molécula em sua superfície induz as células endoteliais a secretar quimiocinas e expressar moléculas de adesão, promovendo, assim, o recrutamento e extravasamento de leucócitos no local da lesão.76

CD40L pode rapidamente desprender-se da membrana plaquetária, apresentando-se na forma solúvel. Ambas as formas têm atividade pró-trombótica e pró-inflamatória, aumentando a ativação e agregação plaquetária e a conjugação de plaquetas-leucócitos e leucócito-endotélio. Ainda, aumentam a libertação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio a partir de plaquetas estimuladas.77 Resumindo, esse sistema de ativação de CD40L promove um estado inflamatório crônico na parede vascular e isso contribui para o desenvolvimento da disfunção endotelial, aterogênese e suas respectivas complicações.74

Proteína quimiotática de monócitos (MCP-1)

Uma vez aderidos à parede vascular devido à ação das moléculas de adesão celular, os monócitos migram do endotélio para a camada íntima, a mais interna da parede vascular. Essa migração de monócitos é mediada por um gradiente de concentração de MCP-1, a partir da interação dessa molécula com os receptores CCR2 de monócitos. Uma vez no interior da camada íntima, os monócitos desenvolvem-se em macrófagos e começam a expressar receptores antioxidantes, tais como SR-A, CD36 e LOX-1, que internalizam lipoproteínas modificadas. Essa internalização dá origem a macrófagos ou células espumosas que transportam lipídios, os quais caracterizam as lesões ateroscleróticas precoces.78

Estudos mostram que a MCP-1 induz o recrutamento de monócitos após lesão endotelial, e esse dano parece ser necessário para o aparecimento local dessa molécula e sua expressão sobre plaquetas aderentes. Portanto, a expressão de MCP-1 após a lesão vascular é um mecanismo altamente especializado, que desempenha um papel decisivo no remodelamento vascular em situações de injúria. A dosagem do seu nível plasmático pode refletir o grau de disfunção e comprometimento do endotélio vascular.78

Células endoteliais circulantes (CEC) e micropartículas endoteliais (MPE)

A função endotelial reflete o balanço entre lesão e reparação do endotélio vascular. Essa relação levou ao desenvolvimento de ensaios para quantificar o descolamento das células endoteliais maduras e de micropartículas derivadas para representar o grau de dano. Células endoteliais circulantes (CEC), que se desprendem quando há ativação ou perda de integridade do endotélio vascular, podem ser medidas na circulação por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Uma vez iniciado o processo de apoptose endotelial, ocorre aumento abrupto da liberação de cálcio pelo retículo endoplasmático, fazendo com que a membrana celular saia do estado repouso.54 Dados da literatura sugerem que há uma relação direta entre o aumento o número CEC na circulação periférica e a extensão da lesão endotelial em pacientes com doença aterosclerótica e inflamação vascular.78

Micropartículas endoteliais (MPE) são pequenas vesículas formadas e liberadas pela membrana celular de CEC ativadas ou danificadas em resposta a ativação e/ou apoptose.78 Ao se desprender de suas células de origem, as MPE carregam em sua superfície moléculas de adesão, enzimas e receptores, além de expressarem uma variedade de antígenos constitutivos,53 e portanto, sua composição pode ser utilizada para caracterizar o estado da célula endotelial progenitora. Em condições normais, a ativação endotelial - quando o endotélio sai de seu estado basal e passa a expressar citocinas e moléculas de adesão, desencadeando mecanismos inflamatórios - mantém-se local, discreta e reversível, de forma que MPE circulantes são dificilmente encontradas. Já níveis elevados de MPE foram observados em uma variedade de condições associadas com a ativação endotelial ou à apoptose,66 indicando que MPE estão diretamente relacionadas com a trombogênese e formação da placa de ateroma,55 participando ainda nos processos de inflamação, dano vascular e angiogênese.54

Mieloperoxidase (MPO) e espécies reativas de oxigênio (EROs)

A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima membro da superfamília heme peroxidases, liberada por neutrófilos ativados, monócitos e macrófagos teciduais, que catalisam a formação de espécies reativas de oxigênio (EROS).60 Além de sua importância no combate a doenças infecciosas, a MPO é cada vez mais reconhecida pelo seu papel no início e progressão da aterosclerose.7,79 A MPO liga-se a glicosaminoglicanas nas paredes vasculares e, nessa circunstância, prejudica a liberação de NO derivada do endotélio e função endotelial local.7

Produtos da atividade das MPO, como ácido hipocloroso, radical tirosil e dióxido de nitrogênio, reagem com peróxido de hidrogênio e podem contribuir para a ocorrência de danos oxidativos em lipídeos e proteínas do organismo. Portanto, os dados da literatura corroboram a ideia de que níveis de MPO podem predizer o desenvolvimento da disfunção endotelial e doença arterial coronariana, enquanto baixos níveis plasmáticos e determinados polimorfismos específicos de MPO foram descritos como cardioprotetores.60,79

Por sua vez, o estresse oxidativo pode promover a disfunção endotelial por uma série de mecanismos, mas a via predominante envolve a redução da biodisponibilidade de NO. Em determinadas circunstâncias, a produção crônica de EROs pode exceder a capacidade antioxidante enzimática e não enzimática e, consequentemente, ocorrer um aumento dos níveis de biomoléculas oxidadas e os possíveis danos teciduais associados. Evidências sugerem que o estresse oxidativo tem um papel central na aterogênese e que poderia desempenhar esse papel por meio do desenvolvimento e progressão da disfunção endotelial.66

Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)

O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), também conhecido por fator de permeabilidade vascular, é amplamente conhecido por seu papel na angiogênese, estimulando a proliferação e migração de células endoteliais, além de aumentar a permeabilidade vascular. Esse fator é secretado por vários tipos celulares diferentes, incluindo as células endoteliais. VEGF liga-se principalmente a receptores tirosina-quinase de superfície celular denominados VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3.80 Dentre esses receptores, o VEGFR-2 destaca-se no que diz respeito à avaliação da função endotelial, pois sua expressão é restrita às células do endotélio vascular. Esse receptor desempenha um papel significativo na migração celular, vasodilatação dependente do endotélio e angiogênese.

A ativação de VEGFR-2 ocorre a partir da ligação com VEGF ou por aumento da taxa de cisalhamento do fluxo sanguíneo, que desencadeia uma cascata de sinalização e ativação das vias MEK-MAPK (proliferação e migração), PI3K-Akt (sobrevivência) e de Src eNOS (permeabilidade). Em adultos, VEGFR2 é fisiologicamente detectável em quantidades baixas na vasculatura e, em situações adversas (como crescimento tumoral, reparação de feridas e em doenças inflamatórias) participa do processo de revascularização local.80

Outros

LDL-oxs são moléculas pró-inflamatórias e imunogênicas que podem afetar uma grande variedade de processos ateroscleróticos a partir de eventos precoces, tais como a expressão da molécula de adesão e ativação do sistema imunitário, até eventos posteriores, tais como a agregação plaquetária e desestabilização da placa aterosclerótica.7 A LDL-ox é formada por processos oxidativos durante a migração das partículas de LDL na parede dos vasos sanguíneos e, recentemente, tem sido proposta como marcador de disfunção endotelial e aterogênese.68

Outro marcador da saúde endotelial são os ácidos graxos livres (AGLs). AGLs podem elevar os níveis de EROS a partir da produção de citocinas em células mononucleares. Além disso, podem induzir a ativação de vias pró-inflamatórias de NF-kB em células endoteliais humanas. Graças a essas características, os AGLs são considerados um biomarcador precoce para lesão endotelial e aterosclerose, apresentando implicações importantes para a prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares.60

As consequências pró-coagulantes da ativação endotelial podem ser mensuradas por alterações no equilíbrio entre o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e do seu inibidor endógeno, o inibidor da ativação do plasminogênio-1 (PAI-1). Além disso, o fator de von Willebrand, uma glicoproteína amplamente liberada pelo endotélio ativo, apresenta um papel adicional na ativação celular, na promoção da coagulação e na ativação de plaquetas. Além desses fatores, o fibrinogênio também pode ser considerado um biomarcador de função endotelial. Essa glicoproteína é sintetizada principalmente nas células hepáticas e em megacariócitos, e pode se ligar a proteínas da superfície da glicoproteína (GP) IIb / IIIa, criando pontes entre as plaquetas. O fibrinogênio estimula a migração de células de músculo liso, promove a agregação de plaquetas e aumenta a viscosidade no sangue e, portanto, é associado com o desenvolvimento inicial da aterosclerose.66

Conclusão

Evidências mostram a importância da disfunção endotelial para o desenvolvimento e progressão das doenças cardiovasculares. Inúmeros são os métodos para investigação da função da endotelial, sendo estes in vivo ou in vitro, invasivos ou não invasivos. Vale ressaltar que essas técnicas são amplamente utilizadas no âmbito da pesquisa clínica, porém os mesmos ainda não são utilizados em diagnósticos, por serem muito invasivas, muito caras ou difíceis de serem padronizadas. Ressaltamos, assim, a importância de mais estudos e investimentos na área a fim de torná-las aplicáveis na pratica clínica e, com isso, minimizar problemas de saúde pública relacionados a doenças cardiovasculares, por meio do diagnóstico precoce de disfunção endotelial.

Limitações

O presente artigo trata-se de uma revisão de literatura narrativa e, portanto, não apresenta uma metodologia de confecção estabelecida e reprodutível, ficando a cargo dos autores a identificação e seleção de estudos, sua análise e interpretação. Porém, ressalta-se que o objetivo dessa revisão é fornecer uma atualização sobre os métodos atualmente utilizados para avaliar função endotelial, e apontar novas perspectivas nessa área do conhecimento.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado por CAPES, FAPERJ, CNPq.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

 Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório de Ciências do Exercício (LACE) da Universidade Federal Fluminense (UFF) por todo suporte dado durante a elaboração do presente estudo.