ijcs International Journal of Cardiovascular Sciences Int. J. Cardiovasc. Sci. 2359-4802 2359-5647 Sociedade Brasileira de Cardiologia kTxsKzvfrqNV9RwJxJKyMmP S2359-56472017000200145 10.5935/2359-4802.20170033 Original Articles Rescue Therapy with Nifurtimox and Dipyridamole for Severe Acute Chagas Myocarditis with Congestive Heart Failure in NMRI Albino Mice Aparicio Daniela Yustiz 1 González-Hernández María 1 Hernández-Forero Greybis 1 Guédez-Ortiz María 1 Santeliz Sonia 1 Goncalves Loredana 2 Cabarcas Rafael Bonfante 1 Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" Faculty of Health Sciences Biochemistry Research Unit Barquisimeto Venezuela Biochemistry Research Unit, Faculty of Health Sciences, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA), Barquisimeto, Venezuela Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado Universidad de los Andes Mérida Venezuela Universidad de los Andes, Mérida - Venezuela Universidad de los Andes Mailing Address: Rafael Bonfante Cabarcas, Av. libertador con Av. Andrés Bello, Decanato de Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado". Postal Code: 3001, Barquisimeto - Venezuela. E-mail: rbonfantecabarcas@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Cabarcas RB. Acquisition of data: Aparicio DY, González-Hernández M, Hernández-Forero G, Guédez-Ortiz M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Analysis and interpretation of the data: Aparicio DY, González-Hernández M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Statistical analysis: Aparicio DY, González-Hernández M, Santeliz S, Cabarcas RB. Obtaining financing: Cabarcas RB. Writing of the manuscript: Aparicio DY, González-Hernández M, Hernández-Forero G, Guédez-Ortiz M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Aparicio DY, González-Hernández M, Hernández-Forero G, Guédez-Ortiz M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Supervision: Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Mar-Apr 2017 30 2 145 156 16 10 2016 10 11 2016 02 02 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Chagas disease is a global health problem; therefore, the development of new therapeutic protocols is necessary. Our group recently demonstrated that nifurtimox associated with dipyridamole has curative effects in mice with acute Chagas disease. In this study, we assess the effect of this therapeutic protocol in chagasic mice with heart failure.

 Objective:

To evaluate whether nifurtimox and dipyridamole are useful to rescue mice with severe acute chagasic myocarditis with heart failure.

 Methods:

42 mice with acute chagasic myocarditis and congestive heart failure were divided into three groups: control chagas (n = 11), Nif-Dip treated with nifurtimox and dipyridamole (n = 14) and Nif-Dip-heart failure treated with nifurtimox and dipyridamole associated with digoxin, furosemide, and captopril (n = 17). Nifurtimox and dipyridamole doses were 40 and 30 mg/kg/day, respectively, for 6 weeks. Mice underwent clinical, electrocardiographic, hemoparasitological and histopathological assessments.

 Results:

Lower mortality in Nif-Dip (28.57%; n = 4) compared to control chagas (54.54%; n = 6) and Nif-Dip-heart failure (52.9%; n = 9) was observed. Clinically, nifurtimox and dipyridamole-treated mice increased body weight and improved heart failure without splenomegaly. In these groups, parasitemia and tissue parasites were eradicated; fibrosis, myocytolysis, inflammatory cell infiltrate and mast cells decreased. Repolarization disorders, prolonged QRS and QT intervals, increase of S wave amplitude and atrioventricular dissociation were reversed by the treatment.

 Conclusion:

Nifurtimox with dipyridamole can rescue NMRI mice from severe acute chagas disease, as nifurtimox showed trypanocidal activity and dipyridamole potentiated its effect. Dipyridamole would be useful in chagasic heart failure.

 Keywords: Chagas Disease Chagas Cardiomyopathy Heart Failure Mice Nifurtimox Dipyridamole Fondo Nacional para la Ciencia y Tecnología 2007001425 This study was funded by Fondo Nacional para la Ciencia y Tecnología (FONACIT), number: 2007001425, Ministerio del Poder Popular para la Ciencia y Tecnología, Venezuela. Introduction

Chagas Disease (ChD) is a global public health problem due to a high residual 1.06% prevalence in endemic countries, where reemergence has been reported as oral transmission outbreaks and because of the disease globalization, as a product of the migration of people from endemic countries to developed countries; it has resulted in a 4.2% prevalence in immigrant populations in Europe.1-4

Symptomatic acute ChD cases have been associated with patent parasitemia and severe acute myocarditis, with high morbidity and mortality.5 Severe heart damage would reflect parasite pathogenic action; therefore, it would be mandatory to conduct aggressive trypanocidal therapeutic interventions, to decrease parasitic load, morbidity, and mortality.

Currently, the accepted treatment protocols for acute ChD are nifurtimox and benznidazole. The use of this protocol, even when the best results are obtained, shows these results are not fully satisfactory. In Venezuela, studies using nifurtimox and/or benznidazole have been disappointing, with more than 70% of the cases with proven presence of parasites in tissues, parasite genome or its antigens (positive serology) after using these drugs.5,6

Thus, it would be useful to create therapeutic schemes where these drugs will be combined with others, which could increase nifurtimox and benznidazole efficacy and decrease their side effects. Ideally, these drugs should have trypanocidal effect, promote cardiac functionality, and counteract pathophysiological phenomena resulting from infection, inflammation, and free-radical generation.

According with the microvascular theory, dipyridamole could be seen as the adjunctive drug, because it induces coronary vasodilation through nitric oxide (NO), improving blood flow; it has antiplatelet effect preventing thrombi formation; it increases extracellular levels of adenosine, improving cardiac function in patients with HF; it promotes an anti-inflammatory effect suppressing free radical formation and it improves the redox state of cells undergoing inflammatory phenomena7,8.

Recently, our group demonstrated that dipyridamole has a trypanocidal effect in vitro with an IC50 of 372 µM and potentiates the effect of subtherapeutic doses of nifurtimox, providing curative effects on NMRI mice with acute ChD.9 For this reason, in this study we consider whether a therapeutic rescue in acute chagasic myocarditis (AChM) animals with severe CHF can be performed with nifurtimox and dipyridamole, allowing a reduction in mortality and cardiac functional sequelae.

 Materials and methods Sample

The sample consisted of 48 male NMRI adult mice, weighing between 30-50 g, obtained from the animal research facilities at Center-West Lisandro Alvarado University (Barquisimeto, Venezuela), which were infected intraperitoneally with blood trypomastigotes suspended in 0.9% NaCl, at a dose of 100 trypomastigotes per gram of body weight. The strain of TcI lineage used has been registered in the WHO bank under the name MHOM/VEcepa792/2-92-YBM.9 The assayed parasites were obtained from blood of infected mice in the acute phase of ChD and maintained in vector/mouse cycles; vectors were Rhodnius prolixus stage III nymphs. At week 2 of inoculation, confirmation of parasitemia was performed, and only positive mice were included in the study.

Of the 48 infected mice, 6 (12.50%) died during the first six weeks of infection, the remaining 42 mice with AChM with clinical signs of CHF were electrocardiographically studied under anesthesia, then divided in three groups and received treatment during 6 weeks. The Control Chagas group (CC; n = 11) were treated with vehicle; the Nif-Dip group (n = 14) were treated with nifurtimox (40 mg/kg) associated with dipyridamole (30 mg/kg) and Nif-Dip-CHF group (n = 17) were treated with nifurtimox (40 mg/kg) and dipyridamole (30 mg/kg) associated with drugs for CHF treatment (captopril 5 mg/kg, digoxin 8 µg/kg and furosemide 2 mg/kg, the latter two administered for only for 1 week).

The mice were distributed in stainless steel cages, measuring 29x30x14 cm, with 5 to 8 animals per cage, with free access to water and food (Perrarina®, Protinal, Venezuela), with a 12-hour light/dark cycle and an average 27°C temperature.

At 6 weeks of treatment, the animals were clinically evaluated (weight, piloerection, and clinical signs of CHF, such as dyspnea and/or cyanosis at rest or under anesthesia), as well as submitted to parasitological (parasitemia) and electrocardiographic assessments. They were subsequently sacrificed by exsanguination via cardiac puncture under anesthesia, followed by autopsy, when organs were removed and weighed, and samples for histopathology were collected.

 Bioethics

All experimental procedures performed in this study were based on the principles established in the bioethics and biosafety manual of the National Fund for Science and Technology, Ministry of Popular Power for Science and Technology, Venezuela.

 Electrocardiography

Electrocardiographic studies were performed under anesthesia with sodium pentobarbital 25 mg/kg and ketamine 25 mg/kg of body weight ip, in bipolar configuration, using 3 needle-type electrodes (one positive, one negative and one neutral or reference), positioned in the subcutaneous tissue. We worked with 4 lead-ECG configurations: in DI, a positive electrode was placed together with the reference electrode on the left shoulder joint, while the negative electrode was positioned on the right shoulder joint; in DII, a positive electrode was positioned on the xiphoid process, while a negative one was placed on the right shoulder joint and the reference on the left shoulder joint; in DIII, both the negative electrode and the reference electrode were placed on the left shoulder joint and a positive electrode was maintained on the xiphoid process, and in AVF lead, a negative electrode was positioned on the cervical midline above the suprasternal fossa, while a positive electrode was placed on the xiphoid process and a reference one remained on the left shoulder joint.

Electrodes were connected to a BioAmp amplifier (AD Instruments, New Zealand), and analog signals were converted to digital signals through a Powerlab/8sp interphase system (AD Instruments, New Zealand), displayed, recorded, and analyzed on a personal computer using the Chart v4.2.1 software (AD Instruments New Zealand). The signal capture was performed at a 1000 events/sec frequency and filtered at 60 Hz.

 Histopathology

Right ventricular and cardiac apex samples were fixed with 4% paraformaldehyde solution in PBS, pH 7.4 for 2 hours. Fixed tissue samples were embedded successively in 10, 15, 20, 25 and 30% sucrose solutions until samples migrated to the container bottom in each solution; then samples were stored at -70°C until used. Samples were thawed and embedded in Optimal Cutting Temperature (OCT) compound, and again frozen with liquid nitrogen, cryostat-cut obtaining 5 µm-sections, put on microscope slides and stained with hematoxylin-eosin or toluidine blue stains. Additionally, another group of samples was fixed with 10% formalin in PBS pH 7.4, embedded in paraffin, cut with a microtome and stained with hematoxylin-eosin.

 Data analysis

Data is expressed as absolute values, percentages or mean ± SEM. Paired or unpaired Student's t test was used to analyze the significance of observed differences before and after treatment in a group or to compare two unrelated groups, respectively; while ANOVA followed by Tukey's post-test was used to analyze significance of observed differences between the three experimental groups. A value of p < 0.05 was considered significant. GraphPad Prism Software 5.0 was used for the statistical analysis.

 Results

All mice became infected with an average parasitemia of 4.19 ± 0.74 x 106 parasites/mL on the 6th week post-infection before treatment protocol began. In all experimental treated groups, parasites were not detected at the 7th week, while in the CC group, parasitemia disappeared between the 8th and 9th week; all groups had 0 parasitemia at sacrifice.

During the post-anesthetic period (0-48 hours), the CC group had 45.45% (n = 5), Nif-Dip 21.42% (n = 3) and Nif-Dip-CHF 41.17% (n = 7) of mortality rate, respectively. During the following six weeks, 1 animal of each CC and Nif-Dip groups and 2 from Nif-Dip-CHF group died, resulting in a total mortality of 54.54% (n = 6), 28.57% (n = 4) and 52.9% (n = 9), respectively.

In Figure 1, clinical parameters observed at the end of the experimental protocol are shown. We can observe that treated groups significantly increased body weight; while spleen weight and CHF clinical signs decreased significantly in these groups as compared with the CC group.

Clinical parameters quantified in mice with AChD treated or not with nifurtimox and dipyridamole.

In A, body weight is shown; mice submitted to the treatment protocol increased weight. In B, normalized spleen weight based on body weight is shown; splenomegaly decreased in mice submitted to the treatment protocol. In C, a summative clinical analysis based on the presence (1) or absence (0) of the following clinical signs were performed in each mouse: dyspnea and cyanosis at rest or under anesthesia and piloerection; mice submitted to the treatment protocol had decreased signs of CHF or infection. * means p < 0.05 when comparing treated groups in relation to Control Chagas non-treated group, using ANOVA test followed by Tukey's post-test

Quantitative and qualitative electrocardiographic parameters are shown in Tables I and II, respectively, before and after starting the therapeutic protocol. Altered electrocardiographic signs found before treatment included decreased heart rate, cardiac conduction disturbances, characterized as an increase in QRS and QT intervals values; alterations in ventricular repolarization, characterized by disorders in amplitude, axis direction and T wave decay (see Table I and Figures 2 and 3). These signs were reversed by the therapeutic protocol; however, R and S wave amplitudes decreased (See Table I and Figures 2 and 3). Regarding qualitative data disorders, nifurtimox-dipyridamole-based therapeutic protocol tended to decrease atrioventricular dissociation and post-depolarization disorders; however, rhythm disorders (nodal and ventricular extrasystoles) tended to increase (see Table II).

Electrocardiographic quantitative parameters in mice with acute chagasic cardiomyopathy with heart failure before and after starting the therapeutic protocol
Parameter Experimental groups
Nif-Dip Nif-Dip- CHF
Pre-treatment Post-treatment Pre-Treatment Post-treatment
HR (bpm) 373.40 ± 22.08 431.40 ± 24.35 382.20 ± 39.34 416.10 ± 22.04
PR 57.37 ± 2.87 52.59 ± 3.72 54.70 ± 3.73 58.07 ± 3.94
QRS (ms) 13.83 ± 0.21 11.50 ± 0.74* 14.71 ± 0.69 11.13 ± 0.45*
QT (ms) 101.50 ± 11.54 68.31 ± 12.81* 105.50 ± 11.33 90.01 ± 6.20
QTc (ms) 244.90 ± 22.16 175.00 ± 29.03* 252.30 ± 21.94 230.80 ± 11.50
P (µV) 56.77 ± 10.65 65.57 ± 8.02 34.07 ± 12.74 65.96 ± 4.18*
R (µV) 680.30 ± 82.25 577.40 ± 83.88 755.10 ± 83.82 631.80 ± 82.50
S (µV) -363.90 ±62.56 -204.20 ± 40.44* -252.10 ± 45.81 -40.10 ± 40.48*
T (µV) 218.20 ± 46.28 270.00 ± 41.68 225.60 ± 49.06 255.50 ± 38.40
τ1 5.19 ± 0.71 7.82 ± 1.07 6.30 ± 0.78 8.41 ± 2.63
τ1 % 40.63 ± 8.19 79.25 ± 4.21* 47.72 ± 6.91 74.04 ± 6.25*
τ2 67.16 ± 11.69 104.50 ± 23.29 69.88 ± 6.57 67.94 ± 5.07
τ2 % 59.70 ± 9.28 23.32 ± 3.76 30.12 ± 6.57 32.06 ± 5.07
D5 73.78 ± 2.33 62.24 ± 4.39* 71.47 ± 3.51 59.78 ± 4.55*
D10 48.69 ± 4.98 30.98 ± 5.46 49.41 ± 4.78 38.56 ± 4.49
D20 39.06 ± 3.80 20.78 ± 3.01* 38.21 ± 3.97 24.22 ± 3.72*
D40 37.27 ± 2.85 17.26 ± 3.16* 33.84 ± 3.38 23.43 ± 3.50*
D60 20.33 ± 3.09 11.64 ± 2.44* 22.69 ± 2.88 14.46 ± 3.04*
QRS axis 43.80 ± 21.17 46.90 ± 15.85 70.28 ± 12.26 78.86 ± 6.47
P axis 53.17 ± 18.53 53.38 ± 9.87 15.40 ± 18.69 58.32 ± 12.45
T axis 68.00 ± 16.83 79.78 ± 5.31* 59.49 ± 17.08 74.61 ± 6.89

"HR"-heart rate; "bpm" - beats per minute; T wave decay was analyzed by an exponential decay equation for two components. obtaining values and time constants τ1 and τ2 with their respective percentage contribution to decay; additionally, T wave amplitude percentage decay at 5. 10. 20. 40 and 60 ms after T peak was quantified;

means p < 0.05 comparing values before and after treatment using a paired Student's t test.

 Electrocardiographic qualitative parameters recorded in mice with acute chagas cardiomyopathy with heart failure before and after starting the therapeutic protocol
Parameters Experimental groups
Nif-Dip Nif-Dip-CHF
Beforen (%) Aftern (%) Beforen (%) Aftern (%)
AV dissociation 5 (50) 2 (20) 0 (0) 2 (25)
Ventricular extrasystoles 0 (0) 3 (30) 1 (12.5) 1 (12.5)
Nodal extrasystoles 0 (0) 5 (50) 0 (0) 1 (12.5)
Atrial fibrillation 4 (40) 3 (30) 0 (0) 2 (25)

"AV"- atrioventricular

Electrocardiographic changes observed before and after nifurtimox and dipyridamole therapeutic protocol was applied, associated with drugs for heart failure. Lead-ECG DIII, electrocardiographic records of two individuals are shown, before starting treatment (left) or after treatment (right). In record A, ischemic disorders are shown, characterized by inversion of T wave and J point below the isoelectric line, which were reversed by the therapeutic protocol with restitution of T wave morphology and amplitude (record B); additionally, the treatment induced a recovery of P wave amplitude. In record C, a decrease in the QRS complex and T wave amplitudes can be observed; note that T wave has a prolonged plateau; after treatment (record D) recovery of the QRS complex and T wave amplitude can be observed, which almost recovered normal morphology. Vertical bars indicate 400 µV, horizontal ones indicate 100 ms.

Electrocardiographic abnormalities observed before and after the nifurtimox and dipyridamole therapeutic protocol was applied. Lead-ECG DIII electrocardiographic records of two animals are shown, before starting treatment (left) or after treatment (right). In record A, low amplitude of bimodal P wave, decreased R wave amplitude, deep S wave, prolonged QRS complex and T wave second extended component, which does not reach the isoelectric line are shown; after treatment (record B) P, R and S wave amplitudes are recovered and a T wave amplitude of the second component is decreased. In record C, it is clearly shown that the second component of T wave forms an upward deflection, compatible with post-depolarization phenomenon, which was totally reversed by the treatment protocol (record D).Vertical bars indicate 400 µV, horizontal ones indicate 100 ms..

Histopathological analysis (see Table III) of the right ventricular sections from the CC mice group displayed thickened epicardium, myocytolysis and diffuse mononuclear inflammatory infiltrate; while in the Nif-Dip mice group, only reduced focal inflammatory infiltrate was observed and epicardial thickness was diminished; fibrosis degree was similar in both groups. In the cardiac apex sections, fibrosis, myocytolysis, epicardium thickness and inflammatory infiltrate were lower in mice treated with nifurtimox-dipyridamole when compared to the CC group. In both sections, in 60% of untreated mice, intact and/or broken parasitic nests were present, while in sections of nifurtimox-dipyridamole treated mice amastigotes and/or parasite nests were not observed (see Figure 4). Additionally, in 60% (n = 3) of CC and in 50% (n = 2) of Nif-Dip group mice, mast cells were observed in cardiac apex sections; however, the number of mast cells per field was higher in the CC group (10.60 ± 7.53) than in the Nif-Dip group (1.00 ± 0.82); (see Figure 5 and Table III).

Histopathological analysis in right ventricle and cardiac apex sections from mice with acute chagas cardiomyopathy with heart failure treated or not with nifurtimox and dipyridamole
Parameter Experimental groups
Control Chagas Nif-Dip
RV Apex RV Apex
Parasitic nests 6.00 ± 2.47 3.00 ± 1.91 0* 0*
Fibrosis 1.40 ± 0.50 1.75 ± 0.47 1.40 ± 0.50 0.25 ± 0.25*
Myocytolysis 2.00 ± 0.44 1.50 ± 0.28 1.40 ± 0.24 0.25 ± 0.25*
Epicardium thickness 1.80 ± 0.20 1.75 ± 0.25 1.20 ± 0.20 0.75 ± 0.25*
Inflammatory infiltrate 2.80 ± 0.20 2.00 ± 0.57 1.80 ± 0.37* 0.50 ± 0.28
Mast cells -- 10.60 ± 7.53 -- 1 ± 0.82

"RV": right ventricle;

means p < 0.05 when comparing the values given for the same cardiac region with and without nifurtimox and dipyridamole treatment by an unpaired Student's t test.

Heart tissue histopathological characteristics of mice with acute Chagas disease treated or not with nifurtimox and dipyridamole. Tissue sections fixed with 4% paraformaldehyde, cryopreserved with 30% sucrose, embedded in OCT, and stained with hematoxylin-eosin are shown. In A, a representative Control Chagas heart section is displayed, where amastigotes nests (arrow), a mononuclear diffuse infiltrate and myocytolysis (1000X magnification) can be observed. In B, a representative heart section in mice treated with nifurtimox and dipyridamole is shown, disclosing muscle fiber integrity and a very discrete mononuclear cell infiltrate; fiber separation is a product of the cryopreservation technique (400X magnification).

Mast cell expression in heart tissue of mice with acute Chagas disease, treated or not with nifurtimox and dipyridamole. Tissue sections that were fixed with 4% paraformaldehyde, cryopreserved with 30% sucrose, embedded in OCT, and stained with toluidine blue are shown. In A, a representative Control Chagas heart section is shown, where two mast cells with degranulation in process can be seen (see arrow, 1000x magnification). In B, a representative heart section from a mouse treated with nifurtimox and dipyridamole is shown, where mast cells are not present (400Xmagnification). In the upper right corner, a bar graph is shown with the average number of mast cells in 10 fields and SEM values obtained in heart sections of the Chagas Control (white bar) and Nif-Dip (black bar) groups.

Discussion

In this study, we demonstrate that the combination of nifurtimox with dipyridamole was therapeutically useful in mice with AChM with CHF, since, compared with untreated control mice, it reduced mortality, decreased or eradicated infection and, furthermore clinical, and histopathological signs of severe AChM were reversed. To our knowledge, this is the first study carried out in animal models to evaluate nifurtimox-dipyridamole-based therapeutic rescue in mice with severe AChM.

The trypanocidal effect of nifurtimox treatment was tested in the present study by demonstrating absence of parasitemia after the first week of treatment and the absence of amastigotes or parasite nests in cardiac right ventricular and apex histopathology sections. These results concur with those reported by Santeliz et al.9 who demonstrated that the nifurtimox (40 mg/kg) and dipyridamole (30 mg/kg) combination eradicates tissue and hematic parasites in mice with acute ChD without CHF. The trypanocidal effect shown in the present work could depend solely on the effect of nifurtimox at a 40 mg/kg dose, as this dose has been reported to be curative (16); however, several studies in murine models about the use of nifurtimox in ChD treatment have been controversial (see below).

Studies on nifurtimox effect in experimental animals have used high doses of the drug, obtaining conflicting results; while Bustamante et al.10 working with C57BL/6 (Ly5.2 +) mice obtained a 95-100% cure rate with doses of 100 mg/kg, during 40 days of continuous or 13 days of intermittent treatment, Wong-Baeza et al.11 working with NIH albino mice, obtained a slight parasitemia decrease, with similar doses using a 50-day therapeutic protocol. This discordance observed between the aforementioned studies and our work can be explained by mouse strains used; however, response to nifurtimox treatment may depend also on the tested T. cruzi strain, as demonstrated in the study by Andrade et al.12, who found that Type I strain (high and early parasitemia, macrophage tropism) showed high sensitivity (56 ± 16% cure), type II strains (high and late parasitemia, heart muscle tropism) showed medium to high sensitivity (52 ± 11% cure) and type III strains (low parasitemia and skeletal muscle tropism) showed low sensitivity (0.45±0.45% cure) to therapeutic regimens based on nifurtimox 200 mg/kg for 4 days, followed by 50 mg/kg for 5 days a week, up to a total of 90 days. Additionally, Faúndez et al.13 found parasitemia decreases using doses of 2.5 and 10 mg/kg, with 25 and 100% of survival, respectively.

The trypanocidal effect of dipyridamole should also be considered, as this effect has been reported on epimastigotes in axenic culture with an IC50 of 372 µM; this effect was partially reproduced while working with NMRI mice, where this drug decreased, but not cleared parasitemia.9 However, we propose that dipyridamole most beneficial effect is functional and it is related to its action mechanism.

The microvascular theory suggests that Chagas myocardiopathy development reflects endothelium damage in the microcirculation, with the formation of platelet and blood thrombi, causing diffuse ischemia in cardiac tissue, which then causes necrosis, cardiac remodeling, and fibrosis, leading to the development of dilated cardiomyopathy with CHF.14 Because dipyridamole is an antiplatelet agent, it prevents platelet thrombus formation and, consequently, hematic ones; also by increasing cGMP and adenosine levels, it induces coronary vasodilation mediated by NO production, improving ischemic phenomena in the chagasic myocardium. Similarly, by increasing levels of adenosine acting on A1- and A3-receptors, it has a cardioprotective effect that allows better management of the failing heart's energy demands and avoids early apoptotic phenomena, respectively.15

Likewise, it has been reported that endogenous adenosine acting on A1-receptors generate a chronotropic and dromotropic negative effect, reducing the incidence of ventricular arrhythmias caused by ischemia-reperfusion in isolated beating rat hearts,16 and when acting on A2-receptors it has an antiarrhythmic effect in acute myocardial ischemia, thus reducing the frequency of ventricular fibrillation;17 therefore it could prevent lethal arrhythmias observed in Chagas cardiomyopathy. Also in this line of thought, it has been reported that long-term oral administration of dipyridamole improves physical and cardiac status of patients with mild to moderate CHF, resulting in echocardiographic improvements of ejection fraction, left ventricular systolic diameter, and plasma B-type natriuretic peptide level.18

Recently, Ramakers et al.19 reported that dipyridamole treatment increases the levels of IL-10, which is considered an anti-inflammatory cytokine that can induce TNF-α and IL-6 decrease. Increased levels of TNF-α and IL-6 have been associated with ChD advanced stages and negatively correlated with cardiac function;20,21 while high levels of IL-10 have been associated with cardiac function recovery, ejection fraction improvement and a reduction in left ventricular diastolic diameters, therefore being a cardioprotective factor. In the indeterminate phase of ChD, elevated levels of IL-10 have been reported, whereas in patients who develop CChM these levels are decreased.22

Evidence suggests that during T. cruzi infection, the myocardium is exposed to lesions caused by continuous oxidative stress through the production of reactive oxygen species, which are released continuously as a result of mitochondrial injuries during Chagas cardiomyopathy progression.23 The molecular structure of dipyridamole allows it to accept electrons, thus functioning as a free radical scavenger, with a greater capacity than α-tocopherol and ascorbic acid, suggesting that dipyridamole beneficial effect observed in the present study is associated with its antioxidant capacity.7

In this study, the early mortality observed in all experimental groups can be explained by cardiac functional impairment caused by AChM, which was aggravated by subjecting the mice to general anesthesia. In vigil state, mice usually have a heart rate of around 580 bpm, while under anesthesia with pentobarbital-ketamine, as reported in the present study, it ranges ​​between 373 and 382 bpm. Anesthesia-induced bradycardia decreases cardiac output and aggravates HF, thereby increasing death risk, which was evidenced in the CC group mortality. In contrast, mice treated with nifurtimox and dipyridamole had the lowest mortality, which could be related to those previously described dipyridamole effects (see above). Unexpectedly, the Nif-Dip-CHF group had a higher mortality than the Nif-Dip group; this can be explained considering that the administration of drugs such as digoxin to a vulnerable host, the risk of cardiac arrhythmias and sudden death is increased, as it has been shown in humans by Madelaire et al.,24 who reported that digoxin use was associated with increased risk of death in patients with chronic heart failure.

Experimental results obtained in the present study confirmed that all NMRI mice with acute ChD showed repolarization abnormalities, which were improved by the therapeutic scheme. Alvarado et al.25 stated that repolarization disorders are characteristic signs of AChM in humans and NMRI mice, which gives them a diagnostic value for acute ChD, clearly demonstrated in the present work. Ventricular repolarization disorders have been associated with ischemia and ventricular overload.26

As nifurtimox has a trypanocidal effect potentiated by dipyridamole, it would quickly eradicate the infection, which would reverse the inflammatory phenomena related to parasitism, thus improving cardiac function; however, the adjuvant effect of dipyridamole must be crucial, because it reverses the functional ischemic phenomena, causing coronary vasodilation and improving the energy balance of cardiomyocytes, allowing the transmembrane ionic equilibrium to be restored and thus normalizing the repolarizing electrical phenomena.

Coincident with repolarization disorders, an increase in the S wave amplitude was observed in the present study, which was reversed with the therapeutic scheme. Few studies have defined the S wave electrogenic substrate; however, in humans, the S wave reflects a late depolarization of the diaphragmatic surface or Purkinje cell depolarization.27 Nonetheless, in mice, given the high density of early repolarizing currents, it is proposed that S wave also reflects an early repolarizing component,28 and thus, as repolarization disorders improves, the S wave amplitude decreases, as shown in the present study.

On the other hand, slowed intraventricular conduction reflected in QRS and QT values improved significantly after the therapeutic scheme was applied; however, atrioventricular (AV) conduction values reflected by PR length did not show improvement. Improvement of intraventricular conduction may reflect an inflammation and blood flow restoration in a reversible morphofunctional substrate, while irreversible AV conduction disorders, including arrhythmias such as atrial fibrillation, which seems to be a reflection of an irreversible damage, product of intense inflammation, remodeling and fibrosis of the atria, usually observed in ChD.29

Likewise, the R wave amplitude was unchanged, which might be due to irreversible damage to the myocardial structure or it could reflect a net pharmacological effect due to dipyridamole-induced negative inotropic effect mediated by adenosine acting on A1 receptors.9

Mast cell density in heart tissue histological sections was higher in the CC group when compared to the Nif-Dip group. Mast cells are inflammatory cells that increase and trigger a series of responses to inflammatory and infectious stimuli involved in myocarditis and dilated cardiomyopathy pathogenesis; a correlation between the degree of fibrosis and mast cell density in hearts of patients with dilated cardiomyopathy with CHF has been reported.30 In this regard, Rork et al.31 (2008) reported that mast cell degranulation contributes to myocardial injury observed in ischemia-reperfusion protocols and adenosine receptors (A2A) activation reduced the infarct area.

 Conclusion

In conclusion, this study showed that treatment with nifurtimox (40 mg/kg) and dipyridamole (30 mg/kg) has a beneficial effect on NMRI albino mice with acute ChD and CHF. The effect of nifurtimox is related to their trypanocidal activity, while the effect of dipyridamole can be related to its ability to potentiate nifurtimox trypanocidal effect and to its capacity to reverse the pathophysiological phenomena related to AChM, such as microvascular ischemia, free radical generation, immunomodulation of inflammation and cardiac overload. Dipyridamole safety, experience based on its use and wide therapeutic window constitute a valuable advantage for its inclusion in future ChD therapeutic protocols in humans.

Sources of Funding

This study was funded by Fondo Nacional para la Ciencia y Tecnología (FONACIT), number: 2007001425, Ministerio del Poder Popular para la Ciencia y Tecnología, Venezuela.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 References 1 World Health Organization. (WHO). Chagas disease in Latin America: An epidemiological update based on 2010 estimates. Wkly Epidemiol Rec. 2015;90(6):33-43. World Health Organization. (WHO) Chagas disease in Latin America: An epidemiological update based on 2010 estimates Wkly Epidemiol Rec 2015 90 6 33 43 2 Requena A, Aldasoro E, de Lazzari E, Sicuri E, Brown M, Moore D, et al. Prevalence of Chagas disease in Latin-American migrants living in Europe: a systematic review and meta-analysis. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9(2):1-15. Requena A Aldasoro E de Lazzari E Sicuri E Brown M Moore D Prevalence of Chagas disease in Latin-American migrants living in Europe: a systematic review and meta-analysis PLoS Negl Trop Dis 2015 9 2 1 15 3 Forsyth C, Hernandez S, Olmedo W, Abuhamidah A, raina M, Sanchez D, et al. Safety Profile of Nifurtimox for Treatment of Chagas Disease in the United States. Clin Infect Dis. 2016;63(8):1056-62. Forsyth C Hernandez S Olmedo W Abuhamidah A raina M Sanchez D Safety Profile of Nifurtimox for Treatment of Chagas Disease in the United States Clin Infect Dis 2016 63 8 1056 1062 4 Toso A, Vial F, Galanti N. Oral transmission of Chagas' disease. Rev Méd Chile. 2011;139(2):258-66. Toso A Vial F Galanti N Oral transmission of Chagas' disease Rev Méd Chile 2011 139 2 258 266 5 Noya B, Díaz Z, Colmenares C, Ruiz R, Mauriello L, Muñoz A, Noya O. Update on oral Chagas disease outbreaks in Venezuela: epidemiological, clinical and diagnostic approaches. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015;110(3):377-86. Noya B Díaz Z Colmenares C Ruiz R Mauriello L Muñoz A Noya O Update on oral Chagas disease outbreaks in Venezuela: epidemiological, clinical and diagnostic approaches Mem Inst Oswaldo Cruz 2015 110 3 377 386 6 Inglessis I, Carrasco H, Añez N, Fuenmayor C, Parada H, Pacheco J, et al. Clinical, parasitological and histopathologic follow-up studies of acute Chagas patients treanted with benznidazole. Arch Inst Cardiol Mex. 1998;68(5):405-10. Inglessis I Carrasco H Añez N Fuenmayor C Parada H Pacheco J Clinical, parasitological and histopathologic follow-up studies of acute Chagas patients treanted with benznidazole Arch Inst Cardiol Mex 1998 68 5 405 410 7 Kim H, Liao J. Translational therapeutics of dipyridamole. Arterioscler Thromb Vascular Biol. 2008;28(3):e39-e42. Kim H Liao J Translational therapeutics of dipyridamole Arterioscler Thromb Vascular Biol 2008 28 3 e39 e42 8 Schaper W. Dipyridamole, an underestimated vascular protective drug. Cardiovasc Drugs Ther. 2005;19(5):357-63. Schaper W Dipyridamole, an underestimated vascular protective drug Cardiovasc Drugs Ther 2005 19 5 357 363 9 Santeliz S, Caicedo P, Giraldo E, Alvarez C, Yustiz MD, Rodriguez-Bonfante C, et al. Dipyridamole potentiated trypanocidal effect of nifurtimox and improved cardiac function in NMRI mice with acute chagasic myocarditis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2016 [In Press]. Santeliz S Caicedo P Giraldo E Alvarez C Yustiz MD Rodriguez-Bonfante C Dipyridamole potentiated trypanocidal effect of nifurtimox and improved cardiac function in NMRI mice with acute chagasic myocarditis Mem Inst Oswaldo Cruz 2016 In Press 10 Bustamante JM, Craft JM, Crowe BD, Ketchie SA, Tarleton RL. New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice. J Infect Dis. 2014;209(1):150-62. Bustamante JM Craft JM Crowe BD Ketchie SA Tarleton RL New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice J Infect Dis 2014 209 1 150 162 11 Wong-Baeza C, Nogueda-Torres B, Serna M, Meza-Toledo S, Baeza I, Wong C. Trypanocidal effect of the benzyl ester of N-propyl oxamate: a bi-potential prodrug for the treatment of experimental Chagas disease. BMC Pharmacol Toxicol. 2015;16:10. Wong-Baeza C Nogueda-Torres B Serna M Meza-Toledo S Baeza I Wong C Trypanocidal effect of the benzyl ester of N-propyl oxamate: a bi-potential prodrug for the treatment of experimental Chagas disease BMC Pharmacol Toxicol 2015 16 10 10 12 Andrade SG, Magalhães JB, Pontes A. Evaluation of chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma cruzi strains of different types. Bull World Health Organ.1985;63(4):721-6. Andrade SG Magalhães JB Pontes A Evaluation of chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma cruzi strains of different types Bull World Health Organ 1985 63 4 721 726 13 Faúndez M, López-Muñoz R, Torres G, Morello A, Ferreira J, Kemmerling U, et al. Buthionine sulfoximine has anti-Trypanosoma cruzi activity in a murine model of acute Chagas' disease and enhances the efficacy of nifurtimox. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(5):1837-9. Faúndez M López-Muñoz R Torres G Morello A Ferreira J Kemmerling U Buthionine sulfoximine has anti-Trypanosoma cruzi activity in a murine model of acute Chagas' disease and enhances the efficacy of nifurtimox Antimicrob Agents Chemother 2008 52 5 1837 1839 14 Rossi M, Tanowitz H, Malvestio L, Celes M, Campos E, Blefari V, et al. Coronary microvascular disease in chronic Chagas cardiomyopathy including an overview on history, pathology, and other proposed pathogenic mechanisms. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4(8):e674. Rossi M Tanowitz H Malvestio L Celes M Campos E Blefari V Coronary microvascular disease in chronic Chagas cardiomyopathy including an overview on history, pathology, and other proposed pathogenic mechanisms PLoS Negl Trop Dis 2010 4 8 e674 15 Hussain A, Gharanei A, Nagra A, Maddock H. Caspase inhibition via A3 adenosine receptors: a new cardioprotective mechanism against myocardial infarction. Cardiovasc Drugs Ther. 2014;28(1):19-32. Hussain A Gharanei A Nagra A Maddock H Caspase inhibition via A3 adenosine receptors: a new cardioprotective mechanism against myocardial infarction Cardiovasc Drugs Ther 2014 28 1 19 32 16 Lee Y, Chern J, Yen M. Antiarrhythmic effects of BN-063, a newly synthesized adenosine A1 agonist, on myocardial ischaemia in rats. Br J Pharmacol. 1994;112(4):1031-6. Lee Y Chern J Yen M Antiarrhythmic effects of BN-063, a newly synthesized adenosine A1 agonist, on myocardial ischaemia in rats Br J Pharmacol 1994 112 4 1031 1036 17 Schreieck J, Richardt G. Endogenous adenosine reduces the occurrence of ischemia-induced ventricular fibrillation in rat heart. J Mol Cell Cardiol. 1999;31(1):123-34. Schreieck J Richardt G Endogenous adenosine reduces the occurrence of ischemia-induced ventricular fibrillation in rat heart J Mol Cell Cardiol 1999 31 1 123 134 18 Sanada S, Asanuma H, Koretsune Y, Watanabe K, Nanto S, Awata N, et al., Long-term oral administration of dipyridamole improves both cardiac and physical status in patients with mild to moderate chronic heart failure: a prospective open-randomized study. Hypertens Res. 2007;30(10):913-9. Sanada S Asanuma H Koretsune Y Watanabe K Nanto S Awata N Long-term oral administration of dipyridamole improves both cardiac and physical status in patients with mild to moderate chronic heart failure: a prospective open-randomized study Hypertens Res 2007 30 10 913 919 19 Ramakers B, Riksen N, Stal T, Heemskerk S, van den Broek P, Peters W, et al. Dipyridamole augments the antiinflammatory response during human endotoxemia. Critical Care. 2011;15(6):R289. Ramakers B Riksen N Stal T Heemskerk S van den Broek P Peters W Dipyridamole augments the antiinflammatory response during human endotoxemia Critical Care 2011 15 6 R289 R289 20 López L, Arai K, Giménez E, Jiménez M, Pascuzo C, Rodríguez- Bonfante C, C-reactive protein and interleukin-6 serum levels increase as Chagas disease progresses towards cardiac failure. Rev Española Cardiol. 2006;59(1):50-6. López L Arai K Giménez E Jiménez M Pascuzo C Rodríguez- Bonfante C C-reactive protein and interleukin-6 serum levels increase as Chagas disease progresses towards cardiac failure Rev Española Cardiol 2006 59 1 50 56 21 D'Angelo Mendoza E, Rodríguez Bonfante C, Camacho I, Martínez J, Perdomo T, Cabrera A, et al. [Patients suffering dilated chagasic cardiopathy or non chagasic cardiopathy show an increased levels of tumor necrosis factor alpha]. Invest Clin. 2005;46(3):229-40. D'Angelo Mendoza E Rodríguez Bonfante C Camacho I Martínez J Perdomo T Cabrera A Patients suffering dilated chagasic cardiopathy or non chagasic cardiopathy show an increased levels of tumor necrosis factor alpha Invest Clin 2005 46 3 229 240 22 Sousa GR, Gomes JA, Fares RC, Damásio MP, Chaves AT, Ferreira KS, et al. Plasma cytokine expression is associated with cardiac morbidity in Chagas disease. PLoS One.2014;9(3):e87082. Sousa GR Gomes JA Fares RC Damásio MP Chaves AT Ferreira KS Plasma cytokine expression is associated with cardiac morbidity in Chagas disease PLoS One 2014 9 3 e87082 23 Vyatkina G, Bhatia V, Gerstner A, Papaconstantinou J, Garg N. Impaired mitochondrial respiratory chain and bioenergetics during chagasic cardiomyopathy development. Biochim Biophys Acta. 2004;1689(2):162-73. Vyatkina G Bhatia V Gerstner A Papaconstantinou J Garg N Impaired mitochondrial respiratory chain and bioenergetics during chagasic cardiomyopathy development Biochim Biophys Acta 2004 1689 2 162 173 24 Madelaire C, Schou M, Nelveg-Kristensen K, Schmiegelow M, Torp-Pedersen C, Gustafsson F, et al. Use of digoxin and risk of death or readmission for heart failure and sinus rhythm: a nationwide propensity score matched study. Int J Cardiol. 2016;221:944-50. Madelaire C Schou M Nelveg-Kristensen K Schmiegelow M Torp-Pedersen C Gustafsson F Use of digoxin and risk of death or readmission for heart failure and sinus rhythm: a nationwide propensity score matched study Int J Cardiol 2016 221 944 950 25 Alvarado-Tapias E, Miranda-Pacheco M, Rodríguez-Bonfante C, Velásquez G, Loyo J, Gil-Oviedo M, et al. Electrocardiography repolarization abnormalities are characteristic signs of acute chagasic cardiomyopathy. Invest Clin. 2012;53(4):378-94. Alvarado-Tapias E Miranda-Pacheco M Rodríguez-Bonfante C Velásquez G Loyo J Gil-Oviedo M Electrocardiography repolarization abnormalities are characteristic signs of acute chagasic cardiomyopathy Invest Clin 2012 53 4 378 394 26 De Micheli A, Medrano G. On the electrophysiopathological concept and ECG manifestations of ischemia, injury and necrosis. Arch Cardiol Mex. 2009;79(1):2-4. De Micheli A Medrano G On the electrophysiopathological concept and ECG manifestations of ischemia, injury and necrosis Arch Cardiol Mex 2009 79 1 2 4 27 Ashley E, Niebauer J. Cardiology explained. London: Remedica; 2004. Chap. 4. [Cited in 2016 Feb 10]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2204/ Ashley E Niebauer J Cardiology explained London Remedica 2004 Chap. 4 2016 Feb 10 Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2204/ 28 Boukens B, Rivaud M, Rentschler S, Coronel R. Misinterpretation of the mouse ECG: ''musing the waves of Mus musculus''. J Physiol. 2014;592(21):4613-26. Boukens B Rivaud M Rentschler S Coronel R Misinterpretation of the mouse ECG: ''musing the waves of Mus musculus'' J Physiol 2014 592 21 4613 4626 29 Novaes R, Penitente A, Gonçalves R, Talvani A, Peluzio M, Neves C, et al. Trypanosoma cruzi infection induces morphological reorganization of the myocardium parenchyma and stroma, and modifies the mechanical properties of atrial and ventricular cardiomyocytes in rats. Cardiovasc Pathol. 2013;22(4):270-9. Novaes R Penitente A Gonçalves R Talvani A Peluzio M Neves C Trypanosoma cruzi infection induces morphological reorganization of the myocardium parenchyma and stroma, and modifies the mechanical properties of atrial and ventricular cardiomyocytes in rats Cardiovasc Pathol 2013 22 4 270 279 30 Batlle M, Pérez-Villa F, Lázaro A, Garcia-Pras E, Ramirez J, Ortiz J, et al. Correlation between mast cell density and myocardial fibrosis in congestive heart failure patients. Transplant Proc. 2007;39(7):2347-9. Batlle M Pérez-Villa F Lázaro A Garcia-Pras E Ramirez J Ortiz J Correlation between mast cell density and myocardial fibrosis in congestive heart failure patients Transplant Proc 2007 39 7 2347 2349 31 Rork T, Wallace K, Kennedy D, Marshall M, Lankford A, Linden J. Adenosine A2A receptor activation reduces infarct size in the isolated, perfused mouse heart by inhibiting resident cardiac mast cell degranulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008;295(5):H1825-33. Rork T Wallace K Kennedy D Marshall M Lankford A Linden J Adenosine A2A receptor activation reduces infarct size in the isolated, perfused mouse heart by inhibiting resident cardiac mast cell degranulation Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008 295 5 H1825 H1833 Artigos Originais Terapia de Resgate com Nifurtimox e Dipiridamol na Miocardite Chagásica Aguda Grave com Insuficiência Cardíaca em Camundongos NMRI Aparicio Daniela Yustiz 1 González-Hernández María 1 Hernández-Forero Greybis 1 Guédez-Ortiz María 1 Santeliz Sonia 1 Goncalves Loredana 2 Cabarcas Rafael Bonfante 1 Unidade de Bioquímica, Escola de Ciências da Saúde, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA), Barquisimeto, Venezuela Universidad de los Andes, Mérida - Venezuela Correspondência: Rafael Bonfante Cabarcas, Av. libertador con Av. Andrés Bello, Decanato de Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado". CEP: 3001, Barquisimeto - Venezuela. E-mail: rbonfantecabarcas@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Cabarcas RB. Obtenção de dados: Aparicio DY, González-Hernández M, Hernández-Forero G, Guédez-Ortiz M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Análise e interpretação dos dados: Aparicio DY, González-Hernández M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Análise estatística: Obtenção de financiamento: Cabarcas RB. Redação do manuscrito: Aparicio DY, González-Hernández M, Santeliz S, Cabarcas RB. Obtenção de financiamento: Cabarcas RB. Redação do manuscrito: Aparicio DY, González-Hernández M, Hernández-Forero G, Guédez-Ortiz M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Aparicio DY, González-Hernández M, Hernández-Forero G, Guédez-Ortiz M, Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB. Supervisão: Santeliz S, Goncalves L, Cabarcas RB.

Potencial Conflito de Interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A doença de Chagas é um problema de saúde global, sendo necessário o desenvolvimento de novos protocolos terapêuticos. Nosso grupo demonstrou recentemente que o nifurtimox associado ao dipiridamol tem efeitos curativos em camundongos com doença de Chagas aguda. Neste estudo, avaliamos o efeito deste protocolo terapêutico em camundongos chagásicos com insuficiência cardíaca.

 Objetivo:

Avaliar se o nifurtimox e o dipiridamol são úteis no tratamento de resgate em camundongos com miocardite chagásica aguda com insuficiência cardíaca.

 Métodos:

Foram divididos em três grupos 42 camundongos com miocardite chagásica aguda e insuficiência cardíaca congestiva: Controle Chagas (n = 11); Nif-Dip, tratados com nifurtimox e dipiridamol (n = 14); e Nif-Dip-Insuficiência Cardíaca, tratados com nifurtimox e dipiridamol, associados com digoxina, furosemida e captopril (n = 17). As doses de nifurtimox e dipiridamol foram de 40 e 30 mg/kg/dia, respectivamente, durante 6 semanas. Os camundongos foram submetidos a avaliações clínicas, eletrocardiográficas, hemoparasitológicas e histopatológicas.

 Resultados:

Observou-se menor mortalidade no Grupo Nif-Dip (n = 4; 28,57%) em relação ao Controle Chagas (n = 6; 54,54%) e ao Nif-Dip-Insuficiência Cardíaca (n = 9; 52,9%). Clinicamente, os camundongos tratados com nifurtimox e dipiridamol aumentaram o peso corporal e melhoraram a insuficiência cardíaca, sem mostrar esplenomegalia. Nestes grupos, foram erradicadas as parasitemias e os parasitas teciduais; a fibrose, a miocitólise, o infiltrado de células inflamatórias e os mastócitos diminuíram. Os distúrbios de repolarização, os intervalos QRS e o QT prolongados, o aumento da amplitude da onda S e a dissociação atrioventricular foram revertidos pelo tratamento.

 Conclusão:

O tratamento com nifurtimox e dipiridamol pode ser usado no resgate em camundongos com doença chagásica aguda grave, já que o nifurtimox teve atividade tripanocida, e o dipiridamole potenciou seu efeito. O dipiridamol seria útil na insuficiência cardíaca chagásica.

 Palavras-chave: Doença de Chagas Cardiomiopatia Chagásica Insuficiência Cardíaca Camundongos, Nifurtimox Dipiridamol Fondo Nacional para la Ciencia y Tecnología 2007001425 O presente estudo foi financiado por Fondo Nacional para la Ciencia y Tecnología (FONACIT), número: 2007001425, Ministerio del Poder Popular para la Ciencia y Tecnología, Venezuela. Introdução

A Doença de Chagas (DC) é um problema de saúde pública global, devido à alta prevalência residual de 1,06% em países endêmicos, onde o ressurgimento da doença tem sido relatado sob a forma de surtos por transmissão oral e também pela globalização da doença, consequência da migração de indivíduos oriundos de países endêmicos para países desenvolvidos, resultando em uma prevalência de 4,2% na população imigrante na Europa.1-4

Os casos agudos de DC sintomática têm sido associados à parasitemia patente e à miocardite aguda grave, com alta morbidade e mortalidade.5 A lesão cardíaca grave seria um reflexo da ação patogênica do parasita; assim, seria obrigatório realizar intervenções terapêuticas tripanossomicidas agressivas para diminuir a carga parasitária, a morbidade e a mortalidade.

Atualmente, os protocolos de tratamento aceitos para a DC aguda são o nifurtimox e o benznidazole. O uso deste protocolo, mesmo quando os melhores resultados são obtidos, não é totalmente satisfatório. Na Venezuela, estudos com nifurtimox e/ou benznidazole têm sido decepcionantes, com mais de 70% dos casos com presença comprovada de parasitas teciduais, genoma parasitário ou seus antígenos (sorologia positiva) após o uso destes fármacos.5,6

Assim, pode ser útil criar esquemas terapêuticos nos quais estes fármacos sejam combinados com outros, o que poderia aumentar a eficácia do nifurtimox e do benznidazole, e diminuir seus efeitos secundários. Idealmente, estas drogas precisam ter um efeito tripanocida, promover a funcionalidade cardíaca e neutralizar os fenômenos fisiopatológicos resultantes da infecção, inflamação e geração de radicais livres.

De acordo com a teoria microvascular, o dipiridamol pode ser considerado medicamento adjuvante, porque induz a vasodilatação coronariana por meio do Óxido Nítrico (NO), a melhorando o fluxo sanguíneo. Ele tem efeito antiplaquetário, que impede a formação de trombos; aumenta os níveis extracelulares de adenosina, melhorando a função cardíaca em pacientes com insuficiência cardíaca; promove um efeito anti-inflamatório, suprimindo a formação de radicais livres, e melhora o estado redox das células submetidas a fenômenos inflamatórios.7,8

Recentemente, nosso grupo demonstrou que o dipiridamol tem um efeito tripanocida in vitro com uma CI50 de 372 µM e que potencializa o efeito de doses subterapêuticas de nifurtimox, proporcionando efeitos curativos em camundongos NMRI com DC9 aguda. Por este motivo, neste estudo, avaliamos se um resgate terapêutico em indivíduos com Miocardite Chagásica Aguda (MCA) e Insuficiência Cardíaca Congestiva (ICC) grave pode ser realizado com nifurtimox e dipiridamol, permitindo redução da mortalidade e sequelas cardíacas funcionais.

 Métodos Amostra

A amostra incluiu 48 camundongos NMRI machos, adultos, com peso entre 30 e 50 g, obtidos nas instalações do biotério da Universidade Centro-Oeste Lisandro Alvarado (Barquisimeto, Venezuela), que foram infectados intraperitonealmente com tripomastigotas sanguíneas suspensas em soro fisiológico 0,9%, com dosagem de 100 tripomastigotas por grama de peso corporal. A cepa da linhagem de TcI utilizada está registada no banco da Organização Mundial da Saúde (OMS) sob a denominação MHOM/VEcepa792/2-92-YBM.9 Os parasitas analisados foram obtidos a partir do sangue de camundongos infectados na fase aguda da DC e mantidos em ciclos de vetor/camundongo. Os vetores foram ninfas de Rhodnius prolixus de terceiro estágio. Na segunda semana após a inoculação, foi confirmada a parasitemia, e apenas os camundongos positivos foram incluídos no estudo.

Dos 48 camundongos infectados, seis (12,50%) morreram durante as primeiras 6 semanas de infecção, e os 42 camundongos restantes com MCA e sinais clínicos de ICC foram eletrocardiograficamente estudados sob anestesia, depois divididos em três grupos e tratados durante 6 semanas. O Grupo Controle Chagas (CC n = 11) foi tratado com veículo, o Grupo Nif-Dip (n = 14) foi tratado com nifurtimox (40 mg/kg) associado ao dipiridamol (30 mg/kg), e o Grupo Nif-Dip-ICC (n = 17) foi tratado com nifurtimox (40 mg/kg) e dipiridamol (30 mg/kg) associados a fármacos para o tratamento da ICC (captopril 5 mg/kg, digoxina 8 µg/kg e furosemida 2 mg/kg, os dois últimos administrados apenas por 1 semana).

Os camundongos foram distribuídos em gaiolas de aço inoxidável medindo 29 x 30 x 14 cm, com cinco a oito animais por gaiola, com acesso livre à água e aos alimentos (Perrarina®, Protinal, Venezuela), com ciclos de 12 horas de luz/escuridão e média de 27°C de temperatura.

Após 6 semanas de tratamento, os animais foram avaliados clinicamente (peso, piloereção e sinais clínicos de ICC, como dispneia e/ou cianose em repouso ou sob anestesia), bem como submetidos a avaliações parasitológicas (parasitemia) e eletrocardiográficas. Eles foram posteriormente sacrificados por exsanguinação via punção cardíaca sob anestesia, seguido de autópsia, quando os órgãos foram removidos e pesados, e as amostras para histopatologia foram coletadas.

 Bioética

Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram baseados nos princípios estabelecidos no manual de bioética e biossegurança do Fundo Nacional de Ciência e Tecnologia do Ministério do Poder Popular para Ciência e Tecnologia da Venezuela.

 Eletrocardiografia

Foram realizados estudos eletrocardiográficos sob anestesia com pentobarbital sódico 25 mg/kg e cetamina 25 mg/kg de peso corporal via intraperitoneal, em configuração bipolar utilizando três eletrodos tipo agulha (um positivo, um negativo e um neutro ou de referência), posicionados no tecido subcutâneo. Trabalhamos com um Eletrocardiograma (ECG) de quatro derivações nas seguintes configurações: em DI, um eletrodo positivo foi colocado junto do eletrodo de referência na articulação do ombro esquerdo, enquanto o eletrodo negativo foi posicionado na articulação do ombro direito; em DII, um eletrodo positivo foi posicionado no processo xifoide, enquanto um negativo foi colocado na articulação do ombro direito e o de referência na articulação do ombro esquerdo; em DIII, tanto o eletrodo negativo quanto o de referência foram colocados na articulação do ombro esquerdo, e um eletrodo positivo foi mantido no processo xifoide; e na derivação AVF, um eletrodo negativo foi posicionado na linha mediana cervical acima da fossa supraesternal, enquanto o eletrodo positivo foi colocado sobre o processo xifoide, e o de referência permaneceu na articulação do ombro esquerdo.

Os eletrodos foram ligados a um amplificador BioAmp (AD Instruments, Nova Zelândia), e os sinais analógicos foram convertidos para sinais digitais por um sistema de interfase Powerlab/8sp (AD Instruments, Nova Zelândia), exibidos, gravados e analisados em um computador pessoal utilizando o software Chart v4.2.1 (AD Instruments Nova Zelândia). A captura de sinal foi realizada a uma frequência de 1.000 eventos/segundo e filtrada a 60 Hz.

 Histopatologia

As amostras do ventrículo direito e do ápice cardíaco foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% em PBS, pH 7,4 durante 2 horas. Amostras fixadas de tecido foram imersas sucessivamente em soluções de sacarose a 10, 15, 20, 25 e 30%, até que as amostras migrassem para o fundo do recipiente em cada solução; então as amostras foram armazenadas a -70°C até serem utilizadas. As amostras foram descongeladas e imersas em composto OCT (Temperatura Ótima de Corte, sigla do inglês Optimal Cutting Temperature) e novamente congeladas em nitrogênio líquido, cortadas em um criostato, obtendo amostras de 5 µm, colocadas em lâminas de microscópio e coradas com técnicas de hematoxilina e eosina ou azul de toluidina. Adicionalmente, outro grupo de amostras foi fixado com formalina a 10% em PBS pH 7,4, imerso em parafina, cortado com micrótomo e corado com hematoxilina e eosina.

 Análise de dados

Os dados foram expressos como valores absolutos, porcentagens ou média ± Erro Padrão da Média (EPM). O teste t de Student pareado ou não pareado foi utilizado para analisar a significância das diferenças observadas antes e após o tratamento em um grupo, ou para comparar dois grupos não relacionados, respectivamente; enquanto a Análise de Variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey, foi utilizada para analisar o significado das diferenças observadas entre os três grupos experimentais. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. O software GraphPad Prism 5.0 foi utilizado na análise estatística.

 Resultados

Todos os camundongos foram infectados com uma parasitemia média de 4,19 ± 0,74 x 106 parasitas/mL na sexta semana pós-infecção antes do início do protocolo de tratamento. Em todos os grupos tratados experimentalmente, parasitas sanguíneos não foram detectados na sétima semana, enquanto no Grupo Controle Chagas, a parasitemia desapareceu entre a oitava e a nona semanas. Todos os grupos apresentavam parasitemia 0 ao sacrifício.

Durante o período pós-anestésico (0 a 48 horas), o Grupo Controle Chagas apresentou taxa de mortalidade de 45,45% (n = 5), o Grupo Nif-Dip de 21,42% (n = 3) e o Grupo Nif-Dip-ICC de 41,17% (n = 7), respectivamente. Durante as 6 semanas seguintes, um animal do Grupo CC, um animal do Grupo Nif-Dip e dois do Grupo Nif-Dip-ICC morreram, resultando em uma mortalidade total de 54,54% (n = 6), 28,57% (n = 4) e 52,9% (n = 9), respectivamente.

Na figura 1, são apresentados os parâmetros clínicos observados no final do protocolo experimental. Os grupos tratados aumentaram significativamente o peso corporal; enquanto o peso do baço e os sinais clínicos de ICC diminuíram significativamente nestes grupos, em comparação com o Grupo Controle Chagas.

Parâmetros clínicos quantificados em camundongos com doença de Chagas aguda, tratados ou não com nifurtimox e dipiridamol.

Em (A), é mostrado o peso corporal: camundongos submetidos ao protocolo de tratamento aumentaram de peso. Em (B), é mostrado o peso do baço normalizado com base no peso corporal; a esplenomegalia diminuiu em camundongos submetidos ao protocolo de tratamento. Em (C), foi realizada uma análise clínica sumativa baseada na presença (1) ou ausência (0) dos seguintes sinais clínicos em cada camundongo: dispneia e cianose em repouso ou sob anestesia e piloereção; os camundongos submetidos ao protocolo de tratamento tinham sinais reduzidos de insuficiência cardíaca congestiva ou infecção. * p < 0,05 quando comparados os grupos tratados em relação ao grupo Controle Chagas não tratado, utilizando Análise de Variância seguida do pós-teste de Tukey.

A tabelas 1 e 2 mostram os parâmetros eletrocardiográficos quantitativos e qualitativos, respectivamente, antes e depois do início do protocolo terapêutico. Os sinais eletrocardiográficos alterados encontrados antes do tratamento incluíram diminuição da frequência cardíaca; distúrbios da condução cardíaca, caracterizados como um aumento nos valores dos intervalos QRS e QT; alterações na repolarização ventricular caracterizadas por distúrbios na amplitude; direção do eixo e decaimento da onda T (Tabela 1 e Figuras 2 e 3). Estes sinais foram revertidos pelo protocolo terapêutico; no entanto, as amplitudes das ondas R e S diminuíram (Tabela 1 e Figuras 2 e 3). Em relação aos distúrbios dos dados qualitativos, o protocolo terapêutico baseado em nifurtimox-dipiridamol tendeu a diminuir a dissociação atrioventricular e os distúrbios pós-despolarização; no entanto, os distúrbios do ritmo (extrassístoles nodais e ventriculares) tenderam a aumentar (Tabela 2).

Parâmetros quantitativos eletrocardiográficos em camundongos com cardiomiopatia chagástica aguda e insuficiência cardíaca, antes e após o início do protocolo terapêutico
Parâmetro Grupos experimentais
Nif-Dip Nif-Dip-ICC
Pré-tratamento Pós-tratamento Pré-tratamento Pós-tratamento
FC (bpm) 373,40 ± 22,08 431,40 ± 24,35 382,20 ± 39,34 416,10 ± 22,04
PR 57,37 ± 2,87 52,59 ± 3,72 54,70 ± 3,73 58,07 ± 3,94
QRS (ms) 13,83 ± 0,21 11,50 ± 0,74* 14,71 ± 0,69 11,13 ± 0,45*
QT (ms) 101,50 ± 11,54 68,31 ± 12,81* 105,50 ± 11,33 90,01 ± 6,20
QTc (ms) 244,90 ± 22,16 175,00 ± 29,03* 252,30 ± 21,94 230,80 ± 11,50
P (µV) 56,77 ± 10,65 65,57 ± 8,02 34,07 ± 12,74 65,96 ± 4,18*
R (µV) 680,30 ± 82,25 577,40 ± 83,88 755,10 ± 83,82 631,80 ± 82,50
S (µV) -363,90 ±62,56 -204,20 ± 40,44* -252,10 ± 45,81 -40,10 ± 40,48*
T (µV) 218,20 ± 46,28 270,00 ± 41,68 225,60 ± 49,06 255,50 ± 38,40
τ1 5,19 ± 0,71 7,82 ± 1,07 6,30 ± 0,78 8,41 ± 2,63
τ1% 40,63 ± 8,19 79,25 ± 4,21* 47,72 ± 6,91 74,04 ± 6,25*
τ2 67,16 ± 11,69 104,50 ± 23,29 69,88 ± 6,57 67,94 ± 5,07
τ2% 59,70 ± 9,28 23,32 ± 3,76 30,12 ± 6,57 32,06 ± 5,07
D5 73,78 ± 2,33 62,24 ± 4,39* 71,47 ± 3,51 59,78 ± 4,55*
D10 48,69 ± 4,98 30,98 ± 5,46 49,41 ± 4,78 38,56 ± 4,49
D20 39,06 ± 3,80 20,78 ± 3,01* 38,21 ± 3,97 24,22 ± 3,72*
D40 37,27 ± 2,85 17,26 ± 3,16* 33,84 ± 3,38 23,43 ± 3,50*
D60 20,33 ± 3,09 11,64 ± 2,44* 22,69 ± 2,88 14,46 ± 3,04*
Eixo QRS 43,80 ± 21,17 46,90 ± 15,85 70,28 ± 12,26 78,86 ± 6,47
Eixo P 53,17 ± 18,53 53,38 ± 9,87 15,40 ± 18,69 58,32 ± 12,45
Eixo T 68,00 ± 16,83 79,78 ± 5,31* 59,49 ± 17,08 74,61 ± 6,89

p < 0,05 comparando os valores antes e depois do tratamento por meio do teste t de Student pareado. O decaimento da onda T foi analisado por uma equação de decaimento exponencial para dois componentes, obtendo-se valores e constantes de tempo τ1 e τ2 com suas respectivas contribuições porcentuais ao decaimento; adicionalmente, a porcentagem da amplitude da onda T decaiu a 5, 10, 20, 40 e 60 ms após a quantificação do pico T. Nif-Dip: grupo tratado com nifurtimox (40 mg/kg) associado ao dipiridamol (30 mg/kg); Nif-Dip-ICC: grupo tratado com nifurtimox (40 mg/kg) e dipiridamol (30 mg/kg) associados a fármacos para o tratamento da insuficiência cardíaca congestiva (captopril 5 mg/kg, digoxina 8 µg/kg e furosemida 2 mg/kg, os dois últimos administrados apenas por 1 semana); FC: frequência cardíaca; PR: intervalo de tempo entre a onda P e da onda R.

 Parâmetros qualitativos eletrocardiográficos registrados em camundongos com cardiomiopatia chagástica aguda e insuficiência cardíaca antes e após o início do protocolo terapêutico
Parâmetros Grupos experimentais
Nif-Dip Nif-Dip-ICC
Antesn (%) Depoisn (%) Antesn (%) Depoisn (%)
Dissociação atrioventricular 5 (50) 2 (20) 0 (0) 2 (25)
Extrassístoles ventriculares 0 (0) 3 (30) 1 (12,5) 1 (12,5)
Extrassístoles nodais 0 (0) 5 (50) 0 (0) 1 (12,5)
Fibrilação atrial 4 (40) 3 (30) 0 (0) 2 (25)

Nif-Dip: grupo tratado com nifurtimox (40 mg/kg) associado ao dipiridamol (30 mg/kg); Nif Dip-ICC: grupo tratado com nifurtimox (40 mg/kg) e dipiridamol (30 mg/kg) associados a fármacos para o tratamento da insuficiência cardíaca congestiva (captopril 5 mg/kg, digoxina 8 µg/kg e furosemida 2 mg/kg, os dois últimos administrados apenas por 1 semana).

Alterações eletrocardiográficas observadas antes e após a aplicação do protocolo terapêutico com nifurtimox e dipiridamol associado a medicamentos para insuficiência cardíaca. São apresentados os registros eletrocardiográficos na derivação DIII de dois animais, antes do início do tratamento (à esquerda) ou após o tratamento (à direita). No registro (A), mostramos distúrbios isquêmicos, caracterizados pela inversão da onda T e ponto J abaixo da linha isoelétrica, os quais foram revertidos pelo protocolo terapêutico com restituição da morfologia e amplitude da onda T (B); adicionalmente, o tratamento induziu uma recuperação da amplitude da onda P. Em (C), pode-se observar uma diminuição das amplitudes do complexo QRS e da onda T, notando-se que a onda T tem um platô prolongado; após o tratamento (D) pode ser observada a recuperação da amplitude do complexo QRS e da onda T, que praticamente recuperou a morfologia normal. As barras verticais indicam 400 µV; as horizontais indicam 100 ms.

Anormalidades eletrocardiográficas observadas antes e após a aplicação do protocolo terapêutico com nifurtimox e dipiridamol. São mostrados os registros eletrocardiográficos em DIII de dois animais antes do início do tratamento (à esquerda) ou após o tratamento (à direita). No registro (A), são mostrados: baixa amplitude da onda P bimodal, amplitude da onda R diminuída, onda S profunda, complexo QRS prolongado e um segundo componente da onda T estendido, que não atinge a linha isoelétrica; após o tratamento (B), a amplitude das ondas P, R e S é recuperada e a amplitude da onda T do segundo componente diminui. Em (C), mostra-se claramente que o segundo componente da onda T forma uma deflexão ascendente, compatível com o fenômeno pós-despolarização, que foi totalmente revertido pelo protocolo de tratamento (D). As barras verticais indicam 400 µV; as horizontais indicam 100 ms.

A análise histopatológica (Tabela 3) em amostras do ventrículo direito dos camundongos do Grupo Controle Chagas mostrou espessura do epicárdio aumentada, miocitólise e infiltrado inflamatório mononuclear difuso; enquanto no Grupo Nif-Dip, foram observados apenas infiltrado inflamatório focal reduzido e a espessura do epicárdio diminuída; o grau de fibrose foi semelhante em ambos os grupos. Nas amostras do ápice cardíaco, a fibrose, a miocitólise, a espessura do epicárdio e o infiltrado inflamatório foram menores nos camundongos tratados com nifurtimox-dipiridamol quando comparados ao Grupo Controle Chagas. Em ambas as amostras, em 60% dos camundongos não tratados, estiveram presentes ninhos parasitários intactos e/ou quebrados, enquanto em amostras obtidas de camundongos tratados com nifurtimox-dipiridamol não foram observados amastigotas e/ou ninhos parasitários (Figura 4). Além disto, em 60% (n = 3) do Grupo Controle Chagas e em 50% (n = 2) dos camundongos do Grupo Nif-Dip, foram observados mastócitos em amostras do ápice cardíaco; no entanto, o número de mastócitos por campo foi maior no Grupo Controle Chagas (10,60 ± 7,53) do que no Grupo Nif-Dip (1,00 ± 0,82) (Figura 5 e Tabela 3).

Análise histopatológica em amostras do ventrículo direito e do ápice cardíaco de camundongos com cardiomiopatia chagástica aguda e insuficiência cardíaca tratados ou não com nifurtimox e dipiridamol
Parâmetro Grupos experimentais
Controle Chagas Nif-Dip
VD Ápice VD Ápice
Ninhos de parasitas 6,00 ± 2,47 3,00 ± 1,91 0* 0*
Fibrose 1,40 ± 0,50 1,75 ± 0,47 1,40 ± 0,50 0,25 ± 0,25*
Miocitólise 2,00 ± 0,44 1,50 ± 0,28 1,40 ± 0,24 0,25 ± 0,25*
Espessura do epicárdio 1,80 ± 0,20 1,75 ± 0,25 1,20 ± 0,20 0,75 ± 0,25*
Infiltrado inflamatório 2,80 ± 0,20 2,00 ± 0,57 1,80 ± 0,37* 0,50 ± 0,28
Mastócitos -- 10,60 ± 7,53 -- 1 ± 0,82

p < 0,05 quando comparados os valores para a mesma região cardíaca, com e sem tratamento com nifurtimox e dipiridamol, por meio do teste t de Student não emparelhado. Nif Dip: grupo tratado com nifurtimox (40 mg/kg) associado ao dipiridamol (30 mg/kg); VD: ventrículo direito.

Características histopatológicas do tecido cardíaco de camundongos com doença de Chagas aguda, tratados ou não com nifurtimox e dipiridamol. Trata-se de amostras de tecidos fixadas com paraformaldeído a 4%, criopreservadas com sacarose a 30%, imersas em solução especial (OCT) para temperatura ótima de corte e coradas com hematoxilina e eosina. Em (A), amostra do coração de um indivíduo do grupo Controle Chagas, na qual se observam um ninho de amastigotas (seta), infiltrado difuso mononuclear e miocitólise (aumento de 1.000X). Em (B), amostra do coração de camundongos tratados com nifurtimox e dipiridamol, podendo ser observados a integridade das fibras musculares e um infiltrado de células mononucleares muito discretas; a separação das fibras é produto da técnica de criopreservação (ampliação 400X).

Expressão de mastócitos no tecido cardíaco de camundongos com doença de Chagas aguda, tratados ou não com nifurtimox e dipiridamol. São apresentadas amostras de tecidos fixadas com paraformaldeído a 4%, criopreservadas com sacarose a 30%, imersas em solução especial (OCT) para temperatura ótima de corte e coradas com azul de toluidina. Em (A), amostra do coração de camundongo do grupo Controle Chagas, na qual podem ser vistos dois mastócitos em processo de degranulação (ver seta, ampliação de 1.000x). Em (B), amostra do coração de um camundongo tratado com nifurtimox e dipiridamol, na qual não estão presentes mastócitos (aumento de 400X). No canto superior direito mostramos um gráfico de barras com o número médio de mastócitos em dez campos e os valores do erro padrão da média obtidos em amostras cardíacas do grupo Controle Chagas (barra branca) e do grupo tratado com nifurtimox (40 mg/kg) associado ao dipiridamol (30 mg/kg) (barra preta).

Discussão

Neste estudo, demonstramos que a combinação de nifurtimox com dipiridamol foi terapeuticamente útil em camundongos com MCA e ICC, uma vez que, em comparação com os camundongos de controle não tratados, reduziu a mortalidade, diminuiu ou erradicou a infecção, e, além disto, os sinais clínicos e histopatológicos de MCA grave foram revertidos. Que seja de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo realizado em modelos animais para avaliar o tratamento de resgate terapêutico baseado em nifurtimox-dipiridamol em camundongos com MCA grave.

O efeito tripanocida do nifurtimox foi testado no presente estudo, demonstrando ausência da parasitemia após a primeira semana de tratamento e ausência de amastigotas ou ninho de parasitas nas amostras cardíacas do ventrículo direito e nas amostras histopatológicas do ápice. Estes resultados coincidem com os relatados por Santeliz et al.,9 que demonstraram que a combinação de nifurtimox (40 mg/kg) e dipiridamol (30 mg/kg) erradicava os parasitas teciduais e sanguíneos em camundongos com DC aguda sem ICC. O efeito tripanocida, mostrado no presente estudo, poderia depender unicamente do efeito do nifurtimox na dose de 40 mg/kg, já que tal dose foi relatada curativa mas vários estudos em modelos murinos sobre o uso de nifurtimox no tratamento de DC têm sido controversos

Estudos sobre o efeito do nifurtimox em animais experimentais utilizaram doses elevadas da droga, obtendo resultados conflitantes. Bustamante et al.,10 porém, trabalhando com camundongos C57BL/6 (Ly5.2 +), obtiveram taxa de cura de 95 a 100% com doses de 100 mg/kg em esquemas de 40 dias contínuos ou intermitentes de 13 dias; Wong-Baeza et al.,11 trabalhando com camundongos albinos NIH, obtiveram ligeira diminuição da parasitemia com doses semelhantes em um protocolo terapêutico de 50 dias. Esta discordância observada entre os trabalhos citados e o nosso pode ser explicada pela linhagens de camundongos utilizadas; entretanto, a resposta ao tratamento com nifurtimox pode depender também da cepa de T. cruzi testada, como demonstrado no trabalho de Andrade et al.,12 que encontrou que a cepa tipo I (parasitemia alta e precoce, tropismo de macrófagos) apresentava alta sensibilidade (56 ± 16% de cura); cepas tipo II (parasitemia alta e tardia, tropismo do músculo cardíaco) tinha sensibilidade média a alta (52 ± 11% de cura), e a tipo III (baixa parasitemia e tropismo muscular esquelético) baixa sensibilidade (0,45 ± 0,45% de cura) aos regimes terapêuticos baseados em nifurtimox 200 mg/kg durante 4 dias, seguidos de 50 mg/kg durante 5 dias por semana, totalizando 90 dias. Adicionalmente, Faúndez et al.13 encontraram diminuição da parasitemia utilizando doses de 2,5 e 10 mg/kg, com 25 e 100% de sobrevivência, respectivamente.

O efeito tripanocida do dipiridamol também deve ser considerado. Ele foi relatado em epimastigotas em cultura axênica com CI50 de 372 µM. Este efeito foi reproduzido parcialmente em camundongos NMRI, e este fármaco diminuiu, mas não eliminou a parasitemia.9 No entanto, propomos que o efeito mais benéfico do dipiridamol é funcional e está relacionado com seu mecanismo de ação.

A teoria microvascular sugere que o desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica reflete um dano endotelial na microcirculação, com formação de trombos plaquetários e sanguíneos, o que acarreta isquemia difusa no tecido cardíaco, causando necrose, remodelamento cardíaco e fibrose, e levando ao desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada com ICC.14 Como o dipiridamol é um agente antiplaquetário, ele evita a formação de trombos plaquetários e, consequentemente, trombos sanguíneos; também devido ao aumento dos níveis de cGMP e adenosina, induz a vasodilatação coronariana mediada pela produção de NO, melhorando os fenômenos isquêmicos no miocárdio chagásico. Do mesmo modo, ao aumentar os níveis de adenosina atuando sobre os receptores A1 e A3, ele tem um efeito cardioprotetor, que permite um melhor manejo das necessidades energéticas do coração em falência e evita fenômenos apoptóticos precoces, respectivamente.15

Igualmente, foi relatado que a adenosina endógena, atuando sobre os receptores A1, gera um efeito cronotrópico e dromotrópico negativo, reduzindo a incidência de arritmias ventriculares causadas por isquemia-reperfusão em corações isolados de camundongos com batimentos16 e, quando atuando sobre os receptores A2, tem um efeito antiarrítmico na isquemia miocárdica aguda, reduzindo, assim, a frequência de fibrilação ventricular.17 Desta forma, seria possível evitar arritmias letais observadas na cardiomiopatia chagásica. Também nesta linha de pensamento, foi relatado que a administração oral prolongada de dipiridamol melhora o estado físico e cardíaco de pacientes com ICC leve a moderada, resultando em melhorias ecocardiográficas da fração de ejeção, diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo e do nível de peptídeo natriurético tipo B.18

Recentemente, Ramakers et al.,19 relataram que o tratamento com dipiridamol aumenta os níveis de Interleucina (IL) 10, que é considerada uma citocina anti-inflamatória capaz de induzir uma diminuição de Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α) e IL-6. Níveis aumentados de TNF-α e IL-6 têm sido associados com estágios avançados de DC e negativamente correlacionados com a função cardíaca,20,21 enquanto altos níveis de IL-10 têm sido associados à recuperação da função cardíaca, melhorando a fração de ejeção e reduzindo os diâmetros diastólicos do ventrículo esquerdo, sendo, portanto, um fator cardioprotetor. Na fase indeterminada da DC foram relatados níveis elevados de IL-10, enquanto que, em pacientes que desenvolvem miocardite chagásica crônica, estes níveis estão reduzidos.22

Evidências sugerem que, durante o curso da infecção por T. cruzi, o miocárdio é exposto à lesões causadas por estresse oxidativo contínuo por meio da produção de espécies reativas de oxigênio, que são liberadas continuamente como resultado de lesões mitocondriais durante a progressão da cardiomiopatia chagásica.23 A estrutura molecular do dipiridamol permite que ele aceite elétrons, funcionando, desta forma, como um eliminador de radicais livres, com uma maior capacidade do que alfa-tocoferol e ácido ascórbico, sugerindo que o efeito benéfico do dipiridamol observado no presente estudo está relacionado com sua capacidade antioxidante.7

Neste trabalho, a mortalidade precoce observada em todos os grupos experimentais pode ser explicada pela deficiência funcional cardíaca, causada pela MCA, agravada pela administração de anestesia geral aos camundongos. Em camundongos no estado de vigília, tem-se geralmente uma frequência cardíaca em torno de 580 bpm, enquanto sob anestesia com pentobarbital-cetamina, como relatado no presente estudo, obtém-se um valor entre 373 e 382 bpm. A bradicardia induzida pela anestesia diminui o débito cardíaco e agravou a insuficiência cardíaca, aumentando o risco de morte, o que foi evidenciado na mortalidade do Grupo Controle Chagas. Em contraste, os camundongos tratados com nifurtimox e dipiridamol apresentaram mortalidade mais baixa, o que pode estar relacionado com os efeitos do dipiridamol descritos anteriormente. Inesperadamente, o Grupo Nif-Dip-ICC apresentou maior mortalidade do que o Grupo Nif-Dip; isto pode ser explicado considerando que a administração de fármacos como a digoxina, em um hospedeiro vulnerável, aumenta o risco de arritmias cardíacas e morte súbita, como demonstrado em seres humanos por Madelaire et al.,24 que relataram que o uso de digoxina estava associado ao aumento do risco de morte em pacientes com insuficiência cardíaca crônica.

Resultados experimentais obtidos no presente estudo confirmaram que todos os camundongos NMRI com DC aguda apresentavam anormalidades de repolarização, que foram melhoradas pelo esquema terapêutico. Alvarado et al.,25 verificaram que os distúrbios de repolarização são sinais característicos de MCA em humanos e camundongos NMRI, o que lhes confere um valor diagnóstico para a DC aguda, fato que foi claramente demonstrado no presente estudo. Distúrbios de repolarização ventricular têm sido associados à isquemia e à sobrecarga ventricular.26

Como nifurtimox tem efeito tripanocida potencializado pelo dipiridamol, isto eliminaria rapidamente a infecção, o que reverteria os fenômenos inflamatórios relacionados ao parasitismo, melhorando a funcionalidade cardíaca. Entretanto, o efeito adjuvante do dipiridamol deve ser crucial, pois reverte fenômenos isquêmicos funcionais, causando vasodilatação coronariana e melhorando o balanço energético dos cardiomiócitos, além de permitir o restabelecimento do equilíbrio iônico transmembrana e normalizar os fenômenos elétricos repolarizantes.

Coincidente com os transtornos de repolarização, no presente estudo, observou-se um aumento na amplitude da onda S, que foi revertido com o esquema terapêutico. Poucos estudos definiram o substrato eletrogênico da onda S, mas, em seres humanos, a onda S reflete uma despolarização tardia da superfície diafragmática ou depolarização das células de Purkinje.27 No entanto, em camundongos, dada a alta densidade das correntes de repolarização precoce, é sugerido que a onda S também caracterize um componente de repolarização precoce,28 e, assim, à medida que os distúrbios de repolarização melhoram, a amplitude da onda S diminui, como foi aqui demonstrado.

Por outro lado, a condução intraventricular retardada, como demonstrado nos valores dos intervalos QRS e QT, melhorou significativamente após o uso do esquema terapêutico. Porém, os valores de condução atrioventricular, caracterizados pelo comprimento do intervalo PR, não apresentaram melhora. A melhora da condução intraventricular pode refletir inflamação e restauração do fluxo sanguíneo em um substrato morfofuncional reversível, enquanto que a irreversibilidade dos distúrbios da condução atrioventricular, incluindo arritmias como a fibrilação atrial, parece ser um reflexo de um dano irreversível de intensa inflamação, remodelamento e fibrose atrial, que é geralmente observado na DC.29

Do mesmo modo, a amplitude da onda R permaneceu inalterada, o que pode ser por conta de danos irreversíveis à estrutura miocárdica ou ser reflexo de um efeito farmacológico líquido, resultado do efeito inotrópico negativo induzido pelo dipiridamol, mediado pela adenosina, agindo sobre os receptores A1.9

Nas amostras histológicas do tecido cardíaco, a densidade de mastócitos foi maior no Grupo Controle Chagas quando comparado ao Grupo Nif-Dip. Os mastócitos são células inflamatórias que aumentam e desencadeiam uma série de respostas aos estímulos inflamatórios e infecciosos envolvidos na miocardite e patogênese da cardiomiopatia dilatada; foi relatada uma correlação entre o grau de fibrose e a densidade de mastócitos nos corações de pacientes com cardiomiopatia dilatada e ICC.30 A este respeito, Rork et al.,31 relataram que a degranulação de mastócitos contribui para a lesão miocárdica observada em protocolos de isquemia-reperfusão, e que a ativação de receptores de adenosina (A2A) reduziu a área de infarto.

 Conclusão

Este estudo mostrou que o tratamento com nifurtimox (40 mg/kg) e dipiridamol (30 mg/kg) tem efeito benéfico sobre os camundongos albinos NMRI com doença de Chagas aguda e insuficiência cardíaca congestiva. O efeito do nifurtimox está relacionado à sua atividade tripanocida, enquanto o do dipiridamol pode estar relacionado à sua capacidade de potencializar o efeito tripanocida do nifurtimox e à sua capacidade de reverter os fenômenos fisiopatológicos relacionados à miocardite chagásica aguda, como isquemia microvascular, geração de radicais livres, imunomodulação de inflamação e sobrecarga cardíaca. A segurança, experiência baseada no uso e ampla janela terapêutica do dipiridamol constituem valiosas vantagens para sua inclusão em futuros protocolos terapêuticos de doença de Chagas em seres humanos.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado por Fondo Nacional para la Ciencia y Tecnología (FONACIT), número: 2007001425, Ministerio del Poder Popular para la Ciencia y Tecnología, Venezuela.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.