abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil YvLysbx9tTyVSRQx5GpcMcB S0066-782X2012001400006 S0066-782X(12)09900506 10.1590/S0066-782X2012005000097 Artigos Originais Tratamento pós-menopausa reduz a atividade da catalase e atenua o risco cardiovascular Castanho Vera S. Nakamura Rui Tsutomu Pinto-Neto Aarão M. Faria Eliana Cotta De Campinas São Paulo Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Patologia Clínica Brazil Campinas São Paulo Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Tocoginecologia Brazil Campinas São Paulo Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Radiologia Brazil 11 2012 99 5 1008 1014 21 12 2011 06 07 2012 06 07 2012 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A menopausa pode levar a alterações na saúde feminina, com mudanças no estado oxidativo de mulheres pós-menopausadas, para as quais são limitadas as informações relativas à influência da hormonioterapia (HT) sobre as atividades das enzimas antioxidantes. OBJETIVO: Avaliar a influência da HT sobre a atividade da catalase, concentrações de lipídeos e lipoproteínas, proteína de transferência de colesteril éster, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, nitratos, proteína C-reativa ultrassensível e espessura da carótida em mulheres pós-menopausadas. MÉTODOS: Foram alocadas 94 mulheres para um de quatro grupos com ou sem HT. O último grupo foi subdividido em mulheres sendo tratadas com estrógeno e outras com estrógeno mais progestágeno. Foram realizadas medidas de parâmetros bioquímicos plasmáticos e da espessura da íntima-média da carótida. RESULTADOS: A HT antagonizou a redução na atividade da catalase após a menopausa, mas não teve efeito sobre os níveis da proteína de transferência de colesteril éster, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, peróxido lipídico, nitrato e proteína C reativa ultrassensível, nem sobre a espessura da íntima-média da carótida. A análise multivariada mostrou que a HT baseada em estrógeno atenuou a relação entre os fatores de risco cardiovasculares e a espessura da íntima-média da carótida comum. CONCLUSÃO: Este estudo mostra que a HT em mulheres pós-menopausadas produz efeitos antioxidantes e antiateroscleróticos benéficos por melhorar as concentrações séricas de lipídios e lipoproteínas, aumentar a atividade da catalase sérica e atenuar a associação entre os fatores de risco cardiovasculares e a aterosclerose precoce.

 Fatores de risco doenças cardiovasculares catalase pós-menopausa 30 10 2012

Tratamento pós-menopausa reduz a atividade da catalase e atenua o risco cardiovascular

Vera S. CastanhoI; Rui Tsutomu NakamuraII; Aarão M. Pinto-NetoIII; Eliana Cotta De FariaI

IDepartamento de Patologia Clínica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP - Brasil

IIDepartamento de Radiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP - Brasil

IIIDepartamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP - Brasil

Endereço para correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A menopausa pode levar a alterações na saúde feminina, com mudanças no estado oxidativo de mulheres pós-menopausadas, para as quais são limitadas as informações relativas à influência da hormonioterapia (HT) sobre as atividades das enzimas antioxidantes.

OBJETIVO: Avaliar a influência da HT sobre a atividade da catalase, concentrações de lipídeos e lipoproteínas, proteína de transferência de colesteril éster, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, nitratos, proteína C-reativa ultrassensível e espessura da carótida em mulheres pós-menopausadas.

MÉTODOS: Foram alocadas 94 mulheres para um de quatro grupos com ou sem HT. O último grupo foi subdividido em mulheres sendo tratadas com estrógeno e outras com estrógeno mais progestágeno. Foram realizadas medidas de parâmetros bioquímicos plasmáticos e da espessura da íntima-média da carótida.

RESULTADOS: A HT antagonizou a redução na atividade da catalase após a menopausa, mas não teve efeito sobre os níveis da proteína de transferência de colesteril éster, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, peróxido lipídico, nitrato e proteína C reativa ultrassensível, nem sobre a espessura da íntima-média da carótida. A análise multivariada mostrou que a HT baseada em estrógeno atenuou a relação entre os fatores de risco cardiovasculares e a espessura da íntima-média da carótida comum.

CONCLUSÃO: Este estudo mostra que a HT em mulheres pós-menopausadas produz efeitos antioxidantes e antiateroscleróticos benéficos por melhorar as concentrações séricas de lipídios e lipoproteínas, aumentar a atividade da catalase sérica e atenuar a associação entre os fatores de risco cardiovasculares e a aterosclerose precoce.

Palavras-chave: Fatores de risco; doenças cardiovasculares; catalase; pós-menopausa.

Introdução

O papel do estresse oxidativo na aterosclerose recebe atenção considerável, sendo a aterogênese desencadeada por inflamação focal e proliferação celular1. As enzimas antioxidantes como a catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase protegem as células aeróbicas contra a lesão oxidativa causada por espécies reativas de oxigênio (ERO) geradas durante o metabolismo celular normal1. O estresse oxidativo resultante do excesso de produção de ERO ou uma deficiência nos sistemas antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos podem levar a uma série de situações patológicas e contribuir para o envelhecimento1. A menopausa pode causar mudanças na saúde da mulher, com excesso de formação de ERO e alterações no status oxidativo de mulheres pós-menopausadas2-5. Entretanto, poucos estudos examinaram a influência da hormonioterapia (HT) na atividade das enzimas antioxidantes em mulheres pós-menopausadas e têm se concentrado no uso em curto prazo da HT.

Os efeitos cardiovasculares da HT são objeto de muito debate desde que os primeiros achados do Women's Health Initiative (WHI - Iniciativa sobre a Saúde da Mulher) foram divulgados. No entanto, análises posteriores dos resultados da WHI sugeriram que a associação entre o uso de HT e o risco cardiovascular é influenciada por vários fatores, entre os quais a idade e tempo desde a menopausa. Estudos observacionais e randomizados sugerem que a introdução da terapia de reposição hormonal (TH) logo no início da pós-menopausa pode ser benéfica sob o ponto de vista cardiovascular. Contrariamente, o envelhecimento, o tempo desde a menopausa e a presença de fatores de risco cardiovasculares ou de doença cardiovascular podem reduzir sua eficácia e aumentar o risco de eventos cardiovasculares6.

Nos últimos dez anos, a TH para o tratamento dos sintomas da menopausa é uma opção real que levou à publicação recente de estudos sobre os efeitos antioxidantes do estrógeno. Além de seus efeitos sobre os sintomas pós-menopausa, a estrogenioterapia vem sendo empregada para tratar a osteoporose7, e muitas mulheres pós-menopausadas a utilizam.

A espessura da íntima-média da artéria carótida comum (EIM da carótida), que é um desfecho intermediário adequado para se investigar os efeitos clinicamente relevantes sobre a aterogênese, pode ser utilizada para avaliar os estágios iniciais da aterosclerose, uma vez que esse parâmetro se correlaciona com fatores de risco que incluem a idade, dislipidemias e o estresse oxidativo8. Há poucas informações sobre a influência da HT sobre a aterosclerose de carótida; enquanto estudos experimentais e epidemiológicos relatam que a HT tem um efeito benéfico sobre a progressão da EIM da carótida em mulheres pós-menopausadas9, outros não observaram nenhum efeito significativo10. Em contraposição, relata-se que, embora a HT possa prevenir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas em mulheres pós-menopausadas9, não há nenhuma diferença na EIM da carótida entre mulheres que receberam ou não HT11. O metabolismo dos lipídios e lipoproteínas altera-se acentuadamente após a menopausa12-14 com uma redução natural nos níveis de estrógeno.

No presente estudo, investigamos a atividade da catalase sérica, as concentrações séricas de lipídios, das lipoproteínas, da proteína de transferência de colesteril éster, de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), do nitrato e os níveis plasmáticos de proteína C reativa ultrassensível (PCR-us) em mulheres pós-menopausadas recebendo ou não HT para determinar se este tratamento pós-menopausa influencia os níveis de estresse oxidativo (um marcador pró-inflamatório). A espessura da EIM da carótida comum foi usada como marcador precoce de aterosclerose.

Métodos

Participantes

Selecionamos 94 mulheres pós-menopausadas (MPM) com idade média de 59 anos, que foram distribuídas em um dos dois grupos seguintes: as sem HT (SHT, n = 63) e as com HT (CHT, n = 31). O grupo CHT foi subdividido entre as que usavam estrogenioterapia (ET, estrógeno equino conjugado, 0,625 mg/dia; n = 20) e as que usavam estrógeno mais progestágeno (EPT, acetato de medroxiprogesterona, 2,5-5 mg/dia; n = 11). As participantes foram recrutadas sequencialmente na clínica da universidade por um período de um ano, de acordo com os critérios apresentados a seguir.

As MPM foram avaliadas clinicamente no Ambulatório de Dislipidemia e Menopausa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. A presença de menopausa foi definida em mulheres ≥ 40 anos em menopausa natural há pelo menos um ano ou submetidas cirurgicamente a ooforectomia bilateral, de acordo com os critérios da Sociedade Norte-Americana de Menopausa14. Os critérios de exclusão para participação no estudo foram: dislipidemia grave (colesterol HDL ≤ 40 mg/L, colesterol LDL ≥ 190 mg/L e triglicérides ≥ 400 mg/L), tabagismo, etilismo, doença sistêmica grave incluindo nefropatias, endocrinopatias, hepatopatias e pneumopatias.

O critério para índice de massa corpórea (IMC) ≤ 27 kg/ m2 13 foi atingido por metade das mulheres estudadas.

Sintomas vasomotores (ondas de calor e sudorese noturna) foram as principais indicações para o uso de HT sistêmica14. Todas as MPM recebiam HT com estrógeno oral contínuo (0,625 mg/dia) ou estrógeno contínuo (0,625 mg/dia) mais acetato de medroxiprogesterona (2,5 ou 5 mg/dia) por pelo menos um ano (média de cinco anos). Todas as participantes assinaram o termo de consentimento antes de serem admitidas no estudo.

Esta investigação foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição (protocolo nº 314/2004).

Amostras

As amostras de sangue foram coletadas das pacientes por punção venosa em ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), após 12 horas de jejum. O plasma foi obtido por centrifugação a 1.000 g por 10 minutos a 4 °C.

Métodos Analíticos Gerais

Determinou-se o nível de colesterol total e de triglicérides por método colorimétrico-enzimático (Hitachi 917, Roche, Mannheim, Alemanha). O colesterol de LDL e HDL plasmáticos foram analisados no sobrenadante da amostra por meio de método colorimétrico-enzimático direto homogêneo após precipitação das lipoproteínas contendo apo-B 100. As apolipoproteínas (AI e B 100) foram medidas por nefelometria.

O nitrato, metabólito estável do óxido nítrico, foi medido com reagente Greiss em kit comercial de ensaio nitrato/nitrito (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, Michigan, EUA)15. Os ensaios em plasma da atividade da catalase e concentrações de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e lipoperoxidases (LPO), foram realizados pelos métodos de Elisa e colorimétrico (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, Michigan, EUA)16,17. A concentração de PCR ultrassensível foi medida por ensaio de PCR aumentada por látex da Behring e por sistema de analisador nefelométrico da Behring (Dade Behring, Tóquio, Japão).

A espessura da íntima-média da artéria carótida comum foi medida por sistema de ultrassom HDI 1500 (Ultrassom ATL, Botheli, WA, EUA) dotado de sonda Doppler colorido de 7-12 MHz. A EIM da carótida foi calculada como a média de cinco medidas tomadas na parede distal das artérias carótidas comuns direita e esquerda, de acordo com método padronizado9. Os resultados individuais (expressos em mm) foram a média da EIM das carótidas direita e esquerda.

Análise estatística

Os resultados estão expressos como médias ± desvio-padrão (DP). As análises estatísticas foram feitas por meio de Ancova com transformação de rank ajustada para idade e IMC ou do teste de Mann-Whitney. O teste de Spearman foi usado para analisar a correlação entre as variáveis nos grupos. Foi usada análise de regressão linear múltipla com critério passo a passo para a seleção de variáveis para avaliar a influência da concentração sérica de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteína de transferência de colesterol esterificado (CETP), catalase, nitrato, TBARS, LPO e PCR-us na EIM da carótida. Os resultados foram expressos como coeficientes de determinação (R2) que representaram a porcentagem de variação na variável dependente explicada por variáveis independentes. Valores de p < 0,05 (teste bicaudal) foram considerados significativos. Todas as análises estatísticas e de dados foram realizadas com o pacote estatístico SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC, EUA).

Resultados

As características clínicas e bioquímicas das participantes estão resumidas na Tabela 1. Não houve diferença na média de idade ou pressão arterial dos grupos SHT e CHT, mas observou-se diferença significativa no IMC (29 kg/m2 e 26 kg/ m2, respectivamente; p = 0,021) e circunferência da cintura (89 cm e 83 cm, respectivamente; p = 0,007) dos dois grupos. A EIM média da carótida variou de 0,83 mm a 0,91 mm, sem diferença entre os dois grupos pós-menopausa.

A concentração sérica média de colesterol total no MPM excedeu o valor máximo recomendado de 200 mg/dL (Tabela 2). Foram observados níveis mais altos de colesterol LDL e colesterol NHDL (colesterol não HDL) nas mulheres pós-menopausadas SHT em relação às CHT (p = 0,013 e 0,048 para colesterol LDL e NHDL, respectivamente - Tabela 2), ao passo que a lipoproteína (a) permaneceu inalterada. Foram observados níveis aumentados de colesterol HDL nas mulheres pós-menopausadas recebendo estrogenioterapia em comparação com aquelas tratadas com estrógeno mais progestágeno (p = 0,041). Os níveis de insulina foram idênticos em todos os grupos (não mostrados). O índice de Castelli II (colesterol LDL/colesterol HDL) diminuiu na HT com estrógeno. A atividade da CETP foi semelhante em todos os grupos.

A Tabela 3 mostra que, à exceção da catalase, que aumentou em aproximadamente 42% nos grupos CHT e EPT, não houve diferenças significativas entre os grupos quanto aos níveis dos outros biomarcadores de estresse oxidativo e inflamação.

Foram observadas correlações fortes entre três fatores de risco para aterosclerose (idade, PCR-us e circunferência da cintura) e a EIM da carótida no grupo SHT que, no entanto, foram abolidas pela TH no grupo EPT (Tabela 4). Entretanto, o grupo EPT ainda manteve correlações importantes entre a EIM da carótida e colesterol LDL e pressão arterial sistólica, dois bem conhecidos marcadores de aterosclerose.

A análise de regressão mostrou que, nas mulheres SHT, a EIM da carótida correlacionou-se positivamente com a idade e os níveis de nitrato e de PCR-us, mas negativamente com os níveis de Lp (a) (Tabela 5). Nas mulheres CHT, a EIM da carótida correlacionou-se positivamente com a idade e a circunferência da cintura, enquanto, nas mulheres ET, a EIM da carótida correlacionou-se negativamente com a idade e os níveis de lipoproteínas. O último achado sugere ação protetora do estrógeno.

Discussão

O estresse oxidativo tem um papel central na peroxidação lipídica e na inflamação associada à aterosclerose, sendo a inflamação particularmente importante na mediação de todos os estágios dessa doença18. Entretanto, a utilidade das medidas antioxidantes no tratamento de pacientes portadores de aterosclerose não foi conclusivamente provada.

A HT possui ações cardioprotetoras que podem estar associadas a alterações nos níveis de lipoproteínas circulantes19. Como mostrado aqui, mulheres em HT apresentaram níveis plasmáticos significativamente menores de colesterol LDL (p = 0,013) e colesterol NHDL (p = 0,048), e relação colesterol LDL/colesterol HDL mais baixa (p = 0,001), embora as mulheres ET apresentassem colesterol HDL mais alto que as EPT (p = 0,041).

As alterações no perfil das lipoproteínas plasmáticas, mediadas pela transferência de lipídios neutros tais como o colesteril éster e triglicéride, são a função mais bem conhecida do CETP20. Estudos experimentais e epidemiológicos indicam que o CETP pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento da aterosclerose20-21, embora os efeitos precisos da CETP na aterogênese ainda sejam controversos. Em humanos, associa-se o aumento na incidência de coronariopatias com a deficiência22 ou aumento23 de CETP. Embora a CETP seja um alvo terapêutico em potencial24, a utilidade das intervenções envolvendo essa proteína dependerá da elucidação de seu papel na aterogênese. Conforme mostramos, a CETP não se alterou com a HT, em concordância com um estudo anterior em mulheres pós-menopausadas5.

A peroxidação lipídica induzida por radicais livres é proposta como fator etiológico no envelhecimento após a menopausa e em várias doenças relacionadas à idade, incluindo a aterosclerose. No presente estudo, não houve diferenças nos níveis séricos de LPO e TBARS (indicadores, respectivamente, de peroxidação lipídica e produção de radicais livres) entre os grupos SHT e CHT. Esses dados diferem de achados anteriores25 e dos níveis significativamente mais altos de TBARS em mulheres pós-menopausadas recebendo HT26. A discrepância entre nosso estudo e o mencionado anteriormente pode estar relacionada a diferenças na idade média dos grupos estudados, ou seja, de 59 e 56 anos nas mulheres SHT e CHT de nosso estudo, respectivamente, em comparação a 47 e 52 anos para mulheres SHT e CHT, respectivamente no estudo de Kesim e cols.26.

A óxido nítrico sintetase (NOS) expressa na parede vascular é um alvo da ação estrogênica e produz uma série de efeitos benéficos na biologia vascular. Conforme a mulher envelhece, a NOS aumenta e passa a produzir superóxido, uma perigosa espécie reativa de oxigênio. É o ambiente bioquímico em torno da NOS que determinará se o estrógeno vai gerar um produto benéfico óxido nítrico ou deletério (superóxido), e que pode ser responsabilizado por essa natureza dupla e oposta da farmacologia do estrogênio27.

A ausência de diferença nos níveis séricos de nitrato/nitrito nas mulheres SHT e CHT foi concordante com os dados relatados por Kesim e cols.26, mas diferente dos de Bednarek-Tupikowska e cols.25 e Salhotra e cols.28, que encontraram níveis significativamente mais altos de nitrito em mulheres pós-menopausadas recebendo HT.

A deficiência, dependente da idade, de estradiol e do antioxidante glutationa no sangue de mulheres pós-menopausadas, causa uma atividade compensatória da catalase, o que nem sempre é suficiente para contrabalançar o estresse oxidativo.

Vários relatos têm sugerido uma conexão entre a exposição ao estrógeno e a atividade da catalase, que é um componente de defesa antioxidante primário que catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em água29,30. A HT antagonizou a redução na atividade da catalase normalmente associada à menopausa (atividade da catalase: 22% em mulheres SHT, em comparação com 37% nas mulheres ET; p = 0,029).

Esses dados diferiram de outros estudos que não mostraram diferença na atividade da catalase em mulheres SHT e CHT27 ou níveis mais elevados em mulheres pós-menopausadas31-36.

Demonstrou-se que o tratamento de células epiteliais normais da mama humana em cultura com estradiol reduz a atividade da catalase celular37. Ademais, o tratamento de linhagens de células cancerígenas de mama com estradiol resultou na redução da atividade da catalase em linhagens celulares com receptor de estrógeno (RE) positivo, mas não nas de linhagem RE negativo37.

A discrepância entre nosso estudo e outros relatos pode estar relacionada ao pequeno número de pacientes em cada grupo estudado. A magnitude da redução na atividade de catalase pode depender de outros fatores como raça, alimentação, e da expressão individual das formas do polimorfismo da catalase, embora nosso estudo não tenha permitido análises de subgrupos detalhadas em relação a essas características38. Escalante Gómez e Quesada Mora39 estudaram o efeito sobre a oxidação do DNA como possível explicação para o processo de envelhecimento e as consequências que a HT tem sobre eles. Nesse estudo, eles não encontraram diferença estatística entre os grupos para oxidação proteica e atividade da catalase, concluindo que a HT reduz o dano oxidativo tanto no DNA quanto nos lipídios em mulheres pós-menopausadas, à semelhança de nosso estudo39.

Além disso, estavam disponíveis informações abrangentes sobre fatores confundidores em potencial. As informações sobre o uso de HT foram coletadas por meio de questionário detalhado, o que, embora sujeito a viés de recordação, referia-se a comportamento pregresso.

A HT não alterou a EIM da carótida em mulheres CHT, nem nos subgrupos ET e EPT. Entretanto, a média da EIM da carótida correlacionou-se positivamente com a idade, circunferência da cintura e níveis de PCR-us; essa correlação desapareceu com a HT. Além disso, a análise de regressão múltipla mostrou relações negativas para idade e LPO após HT com estrógeno, indicando efeito protetor do tratamento hormonal. Este pequeno estudo mostra a necessidade de pesquisas mais abrangentes para investigar os papéis diferenciais da HT e, se após a menopausa, ela pode influenciar os níveis de estresse oxidativo.

Conclusões

Este estudo mostra que a HT em mulheres pós-menopausadas produz efeitos antioxidantes e antiateroscleróticos benéficos por meio da melhora dos perfis plasmáticos de lipídios e lipoproteínas, do aumento da atividade da catalase plasmática e da atenuação da associação entre fatores de risco cardiovascular e aterosclerose precoce.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de doutorado de Vera Sylvia Castanho pela UNICAMP.

Endereço para correspondência:

Eliana C de Faria

Departamento de Patologia Clínica, FCM

Universidade de Campinas

Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Barão Geraldo

CEP 13084-971, Campinas, SP - Brasil

E-mail:

cotta@fcm.unicamp.br,

cottadefaria@gmail.com

Artigo recebido em 21/12/11

Revisado em 03/01/12

Aceito em 06/07/12

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BACKGROUND: Menopause can lead to alterations in women's health, with changes in the oxidative status of postmenopausal women in whom information regarding the influence of hormone therapy (HT) on antioxidant enzyme activities is limited. OBJECTIVE: To evaluate the influence of HT on catalase activity; concentrations of lipids and lipoprotein, cholesteryl ester transfer protein, thiobarbituric acid-reactive substances, nitrates, high-sensitivity C-reactive protein and carotid thickness in postmenopausal women. METHODS: Ninety-four consecutive women were allocated to one of four groups, without HT and with HT. The latter group was subdivided into women using estrogen and those using estrogen plus progestogen therapy. Plasma biochemical parameters and common carotid intima-media thickness measurements were performed. RESULTS: HT antagonized the decrease in catalase activity after menopause, but had no effect on the levels of cholesteryl ester transfer protein, thiobarbituric acid-reactive substances, lipid peroxide, nitrate, high-sensitivity C-reactive protein, or on the common carotid intima-media thickness. Multivariate analysis showed that estrogen-based HT attenuated the relationship between cardiovascular risk factors and the intima-media thickness of the common carotid. CONCLUSION: This study indicates that HT in postmenopausal women produces beneficial antioxidant and anti-atherosclerotic effects by ameliorating the plasma lipid and lipoprotein profiles, increasing plasma catalase activity and attenuating the association between cardiovascular risk factors and early atherosclerosis.

 Risk factors cardiovascular diseases catalase postmenopause

Postmenopausal therapy reduces catalase activity and attenuates cardiovascular risk

Vera S. CastanhoI; Rui Tsutomu NakamuraII; Aarão M. Pinto-NetoIII; Eliana Cotta De FariaI

IDepartment of Clinical Pathology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP - Brazil

IIDepartment of Radiology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP - Brazil

IIIDepartment of Tocogynecology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP - Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Menopause can lead to alterations in women's health, with changes in the oxidative status of postmenopausal women in whom information regarding the influence of hormone therapy (HT) on antioxidant enzyme activities is limited.

OBJECTIVE: To evaluate the influence of HT on catalase activity; concentrations of lipids and lipoprotein, cholesteryl ester transfer protein, thiobarbituric acid-reactive substances, nitrates, high-sensitivity C-reactive protein and carotid thickness in postmenopausal women.

METHODS: Ninety-four consecutive women were allocated to one of four groups, without HT and with HT. The latter group was subdivided into women using estrogen and those using estrogen plus progestogen therapy. Plasma biochemical parameters and common carotid intima-media thickness measurements were performed.

RESULTS: HT antagonized the decrease in catalase activity after menopause, but had no effect on the levels of cholesteryl ester transfer protein, thiobarbituric acid-reactive substances, lipid peroxide, nitrate, high-sensitivity C-reactive protein, or on the common carotid intima-media thickness. Multivariate analysis showed that estrogen-based HT attenuated the relationship between cardiovascular risk factors and the intima-media thickness of the common carotid.

CONCLUSION: This study indicates that HT in postmenopausal women produces beneficial antioxidant and anti-atherosclerotic effects by ameliorating the plasma lipid and lipoprotein profiles, increasing plasma catalase activity and attenuating the association between cardiovascular risk factors and early atherosclerosis.

Keywords: Risk factors; cardiovascular diseases; catalase; postmenopause.

Introduction

The role of oxidative stress in atherosclerosis has received considerable attention, with atherogenesis being triggered by focal inflammation and cellular proliferation1. Antioxidant enzymes such as catalase, superoxide dismutase e glutathione peroxidase, protect aerobic cells against oxidative injury caused by reactive oxygen species (ROS) generated during normal cellular metabolism1. Oxidative stress resulting from the overproduction of ROS or a deficiency in the enzymatic and non-enzymatic antioxidant systems can lead to a number of pathological conditions and contribute to aging1. Menopause can lead to alterations in women´s health, with excessive ROS formation and changes in the oxidative status of postmenopausal women2-5. However, few studies have examined the influence of hormone therapy (HT) on antioxidant enzyme activity in postmenopausal women and have focused on short-term use of HT.

The cardiovascular effects of HT have been the subject of much debate since the initial findings from the Women's Health Initiative (WHI study) were reported. However, re-analyses of WHI results have suggested that the association between HT use and cardiovascular risk is influenced by several factors, among these, age and time since menopause. Observational and randomized studies have suggested that initiation of hormone replacement therapy (HT) in early postmenopause could be beneficial from a cardiovascular point of view. Conversely, aging, time since menopause and presence of cardiovascular risk factors or cardiovascular disease may decrease its efficacy and increase the risk of cardiovascular events6.

In the last ten years, HT for the treatment of menopausal symptoms is a real option that led to recently launched studies on the antioxidant effects of estrogen. In addition to its effects on the post-menopausal symptoms estrogen therapy has been used to treat osteoporosis7 and many postmenopausal women have been using it.

The intima-media thickness of the common carotid artery (carotid IMT), an appropriate intermediate endpoint for investigating clinically relevant effects on atherogenesis, can be used to assess the early stages of atherosclerosis, since this parameter correlates with risk factors, including age, dyslipidemias and oxidative stress8. Information regarding the influence of HT on carotid atherosclerosis is limited; whereas experimental and epidemiological studies have reported that HT has a beneficial effect on the progression of carotid IMT in postmenopausal women9, others have observed no significant effect10. In contrast, it has been reported that while HT may prevent the development of atherosclerotic plaques in postmenopausal women9, there is no difference in the carotid IMT between women who had and had not used HT11. Lipid and lipoprotein metabolism is markedly altered after menopause12-14 with a natural reduction in estrogen levels.

In this study, we investigated the serum catalase activity; serum concentrations of lipids and lipoprotein, cholesteryl ester transfer protein, thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), nitrate and hs-CRP plasma levels in postmenopausal women with or without HT, in order to determine whether postmenopausal HT influences the levels of oxidative stress (a proinflammatory marker). The thickness of the common carotid intima-media was used as an early marker of atherosclerosis.

Methods

Subjects

Ninety four postmenopausal women (POMW) mean age: 59 years, were assigned to one of two groups: those without HT (WTHT, n = 63) and those with HT (WHT, n = 31); the women in the latter group were further subdivided into those using estrogen therapy (ET, conjugated equine estrogen, 0.625 mg/d; n = 20) and those using estrogen plus progestogen therapy (EPT, methoxyprogesterone acetate, 2.5-5 mg/d; n = 11). They were sequentially recruited at the University Clinic during a one-year period, according to the criteria presented below.

The POMW were clinically evaluated at the Dyslipidemia and Menopause Outpatient Clinics of the School of Medical Sciences of UNICAMP. The presence of menopause was defined among women ≥ 40 years old with at least one year of natural menopause or surgical bilateral oophorectomy, in accordance with the criteria of the North American Menopause Society14. The exclusion criteria for participation in the study were: severe dyslipidemia (HDL cholesterol ≤ 40 mg/L, LDL cholesterol ≥ 190 mg/L and triglycerides ≥ 400 mg/L), smoking, alcoholism, severe systemic disease including nephropathy, endocrinopathy and pneumopathy.

The criterium for body mass index (BMI) ≤ 27 kg/m2 13 was reached in half of the women studied.

Vasomotor symptoms (hot flashes and night sweats) were the main indication for the use of systemic HT14. All POMW had been on HT with continuous oral estrogen (0.625 mg/d) or continuous estrogen (0.625 mg/d) and methoxyprogesterone acetate (2.5 or 5 mg/d) for at least one year (mean of five years). All of the subjects gave written informed consent to participate in the study.

This investigation was approved by the institutional Research Ethics Committee (protocol no. 314/2004).

Samples

Blood samples were collected from patients by venipuncture into ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) after a 12 h fast. Plasma was obtained by centrifugation at 1000 g for 10 min at 4°C.

General Analytical Methods

Total cholesterol and triglycerides were determined by an enzymatic-colorimetric method (Hitachi 917, Roche, Mannheim, Germany). Plasma LDL and HDL cholesterol were analyzed in sample supernatants by a homogeneous direct enzymatic-colorimetric method after precipitation of apoB 100-containing lipoproteins. Apolipoproteins (AI and B 100) were determined by nephelometry.

Nitrate, the stable metabolite of nitric oxide, was measured with Greiss reagent in a commercial nitrate/nitrite assay kit (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, Michigan, USA)15. Catalase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and lipoperoxidases (LPO) concentrations were assayed in plasma by ELISA and colorimetric methods (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, Michigan, USA)16,17. The concentration of high-sensitive CRP was determined with a Behring latex-enhanced CRP assay and a Behring nephelometer analyzer system (Dade Behring, Tokyo, Japan).

The intima-media thickness of the common carotid artery was measured with an HDI 1500 ultrasound system (ATL Ultrasound, Botheli, WA, USA) fitted with a 7-12 MHz color Doppler probe. The carotid IMT was calculated as the mean of five measurements in the far wall of the left and right common carotid arteries, according to a standardized method9. Individual results (expressed in mm) were the average of the left and right carotid IMT.

Statistical Analysis

Results are expressed as means ± SD. Statistical analyses were carried out using ANCOVA with rank transformation, adjusted for age and BMI, or the Mann-Whitney test. Spearman's test was used to examine the correlation between variables in the groups. Multiple linear regression analysis with stepwise criteria for the selection of variables was used to assess the influence of lipoproteins, apolipoproteins, cholesteryl ester transfer protein (CETP), catalase, nitrate, TBARS, LPO and hs-CRP serum concentrations on carotid IMT. The results were expressed as coefficients of determination (R2) that represented the percentage of variation in the dependent variable that was explained by the independent variables. A value of p < 0.05 (two-tailed test) indicated significance. All data and statistical analyses were performed with the SAS statistical package (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).

Results

Table 1 summarizes the clinical and biochemical characteristics of the subjects. There was no difference in the mean age or blood pressure of the WTHT and WHT groups, but a significant difference was observed in the BMI (29 kg/m2 and 26 kg/m2, respectively; p = 0.021) and waist circumference (89 cm and 83 cm, respectively; p = 0.007) of the two groups. The mean carotid IMT ranged from 0.83 mm to 0.91 mm, with no difference between the two postmenopausal groups.

The mean serum total cholesterol concentration in POMW exceeded the maximum recommended value of 200 mg/dL (Table 2). Higher LDLchol and NHDLchol (non HDL cholesterol) levels were observed in WTHT versus WHT postmenopausal women (p = 0.013 and 0.048 for LDL and NHDLchol, respectively) (Table 2), whereas lipoprotein (a) remained unchanged. Increased HDLchol was observed in postmenopausal women with estrogen therapy, compared to those with estrogen plus progestogen therapy (p = 0.041). Insulin levels were identical in all groups (not shown). The Castelli II index (LDLchol/HDLchol) decreased in HT with estrogen. CETP activity was similar in all groups.

Table 3 shows that, with the exception of catalase, which increased by approximately 42% in the WHT and EPT groups, there were no significant differences in the levels of the other biomarkers of oxidative stress and inflammation between the groups.

Strong correlations were observed between three risk factors for atherosclerosis (age, hs-CRP and waist circumference) and carotid IMT in the WTHT group, but these were abolished by HT in the EPT group (Table 4). However, the EPT group still retained important correlations between carotid IMT and LDLchol and systolic blood pressure, two well-known markers for atherosclerosis.

Regression analysis showed that, in WTHT women, carotid IMT was positively correlated with age and nitrate and hs-CRP levels, but negatively correlated with Lp (a) levels (Table 5). In WHT women, carotid IMT was positively correlated with age and waist circumference, whereas in ET women, the carotid IMT was negatively correlated with age and lipoprotein levels. The latter finding suggests a protective action of estrogen.

Discussion

Oxidative stress has a central role in lipid peroxidation and inflammation associated with atherosclerosis, with inflammation being particularly important in mediating all stages of this disease18. However, the usefulness of antioxidant measures to treat patients with atherosclerosis has not been conclusively proven.

HT has cardioprotective actions that may be associated with changes in circulating lipoprotein levels19. As shown here, women with HT had significantly lower plasma levels of LDLchol (p = 0.013) and NHDLchol (p = 0.048), and a lower LDLchol/HDLchol ratio (p = 0.001), although ET women had higher HDLchol than EPT women (p = 0.041).

Changes in the plasma lipoprotein profile, mediated by the transfer of neutral lipids, such as cholesteryl ester and triglyceride, are the best known function of CETP20. Experimental and epidemiological studies indicate that CETP may play an important role in the development of atherosclerosis20-21, although the precise effects of CETP on atherogenesis are still controversial. In humans, an increased incidence of coronary heart disease has been associated with a deficiency22 or increase23 in CETP. Although CETP is a potential therapeutic target24, the usefulness of interventions involving this protein will depend on clarification of its role in atherogenesis. As shown here, CETP was unaffected by HT, in agreement with a previous study in postmenopausal women5.

Free radical-induced lipid peroxidation has been proposed as an etiological factor in ageing after menopause and in various age-related diseases, including atherosclerosis. In the present study, there were no differences in the serum LPO and TBARS levels (indicators of lipid peroxidation and free-radical production, respectively) between the WTHT and WHT groups. These data differ from previous findings25 and from the significantly higher TBARS levels in postmenopausal women under HT26. The discrepancy between our study and the already-mentioned report may be related to differences in the mean ages of the groups that were studied, namely, 59 and 56 years in our WTHT and WHT women, respectively, compared to 47 and 52 years for WTHT and WHT women, respectively, in Kesim et al's study26.

The nitric oxide synthase expressed within the vascular wall is a target of estrogen action and produces a number of beneficial effects on vascular biology. As a woman ages, NOS becomes increasingly higher and starts to produce superoxide, a dangerous reactive oxygen species. It is the biochemical environment around NOS that will determine whether estrogen produces a beneficial nitric oxide or deleterious (superoxide) product, and can account for this dual and opposite nature of estrogen pharmacology27.

The lack of difference in the serum nitrate/nitrite levels of WTHT and WHT women agreed with data reported by kesim et al.26, but differed from those of Bednarek-Tupikowska et al.25 and Salhotra et al.28, who reported significantly higher nitrite levels in postmenopausal women under HT.

Age-dependent deficiency of estradiol and antioxidant glutathione in blood of postmenopausal women causes compensatory activity of catalase, which is not always enough to counteract oxidative stress.

Several reports have suggested a connection between estrogen exposure and catalase activity. Catalase is a primary antioxidant defense component that catalyzes the decomposition of hydrogen peroxide to water29-30. HT antagonized the decrease in catalase activity normally associated with menopause (catalase activity: 22% in WTHT women, compared to 37% in ET women; p = 0.029).

These findings differed from those of other studies that reported no difference in catalase activities of WTHT and WHT women27 or higher levels in postmenopausal women31-36.

Treatment of normal human breast epithelial cells in culture with estradiol was shown to decrease cellular catalase activity37. Further, treatment of breast cancer cell lines with estradiol resulted in decreased catalase activity in the estrogen receptor (ER) - positive but not the ER-negative cell lines37.

The discrepancy between our study and other reports may be related to the small number of patients in each group studied. The magnitude of the decrease in catalase activity may depend on other factors such as race, diet and the individual expressing forms of the catalase polymorphism, although our study did not permit detailed subgroup analysis by diet status, race or catalase polymorphism38. Escalante Gómez and Quesada Mora39 studied the effect on DNA oxidation as a possible explanation for the aging process itself and the effects that HT has on them, and found no statistical difference for protein oxidation and catalase activity among the groups. They concluded that HT decreases oxidative damage to both DNA and lipids in postmenopausal women, in corroboration to our findings39.

In addition, comprehensive information regarding potential confounding factors were available, and the HT-use information was collected using a detailed questionnaire, which, although subject to recall bias, referred to behavior in the past.

HT did not alter the carotid IMT in WHT women, or in the subgroups ET and EPT. However, mean carotid IMT was positively correlated with age, waist circumference and hs-CRP levels; this correlation disappeared with HT. In addition, multiple regression analysis showed negative relationships for age and LPO after estrogen HT, indicating a protective effect of hormonal treatment. This small study indicates the need for more extensive studies to investigate the differential roles of whether postmenopausal HT influences the levels of oxidative stress.

Conclusions

This study indicates that HT in postmenopausal women produces beneficial antioxidant and anti-atherosclerotic effects by ameliorating the plasma lipid and lipoprotein profiles, increasing plasma catalase activity and attenuating the association between cardiovascular risk factors and early atherosclerosis.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Vera Sylvia Castanho , from UNICAMP.

References