FUNDAMENTO: O estresse crônico está associado à remodelação cardíaca; entretanto, os mecanismos permanecem a ser descobertos. OBJETIVO: A proposta deste estudo foi testar a hipótese de que o estresse crônico promove disfunção cardíaca associada a depressão da atividade do canal-L para Ca2+. M MÉTODOS: Ratos Wistar machos com 30 dias de idade (70 - 100 g) foram distribuídos dentro de dois grupos: controle (C) e estresse crônico (St). O estresse consistiu na imobilização durante 15 semanas, cinco vezes por semana, 1 h por dia. A função cardíaca foi avaliada pela performance do ventrículo esquerdo por meio do ecocardiograma e pelo músculo papilar ventricular isolado. A função do músculo papilar foi avaliada em condição basal e com manobras inotrópicas, como: pós-pausa e elevação na concentração extracelular de Ca2+, na presença ou ausência de um bloqueador específico de canal-L para Ca2+. RESULTADOS: O estresse ficou caracterizado por hipertrofia das glândulas adrenais, aumento nos níveis de corticosterona circulante e por hipertensão arterial. Ainda, o estresse crônico gerou hipertrofia ventricular esquerda. O estresse crônico foi capaz de melhorar a resposta no músculo papilar para manobras inotrópicas positivas. A melhora de função não esteve associada com o canal-L para Ca2+. CONCLUSÃO: O estresse produziu hipertrofia cardíaca; entretanto, nos estudos de músculo papilar isolado, as manobras inotrópicas positivas potencializaram a função cardíaca em ratos estressados, sem o envolvimento do canal-L para Ca2+. Assim os mecanismos responsáveis permanecem incertos para alterações no influxo de Ca2+.
IDepartamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, SP
IIDepartamento de Farmacologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP
IIIDepartamento de Clinica Médica, Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, SP
IVDepartamento de Esportes, Centro de Educação Física e Esportes, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ES - Brasil
O estresse tem um papel essencial em nosso dia a dia, e muitas vezes está relacionado a problemas conjugais, de saúde, trabalho e baixa condição socioeconômica1. Selye2 definiu o estresse como um estado caracterizado por um padrão de resposta uniforme, independentemente do estressor particular, que pode levar a alterações patológicas de longo prazo, tais como: ansiedade crônica, depressão, obesidade, distúrbios imunológicos, inflamação, resistência a insulina e doença cardiovascular3,4.
Os transtornos cardiovasculares mais bem definidos, relacionados ao estresse crônico em seres humanos, são hipertensão arterial, variabilidade da frequência cardíaca, disfunção diastólica e sistólica ventricular esquerda e alterações vasculares5-8. Além disso, esse estresse variável durante 15 dias foi capaz de produzir hipertrofia cardíaca e mudanças estruturais cardíacas permanentes9. Zhao e cols.10 também mostraram que a submissão de ratos a estresse crônico de imobilização durante 21 dias resultou em disfunção cardíaca e lesão estrutural do coração.
Além disso, experimentos realizados em ratos submetidos a estresse emocional demonstraram aumento na contração e velocidade de relaxamento dos músculos papilares isolados11. Meerson e cols.12 observaram como a adaptação a estresses de curto prazo do músculo papilar e coração de ratos isolados aumentou a resistência do miocárdio aos efeitos arritmogênico e contrátil do excesso de Ca2+.
Além disso, ratos submetidos a estresse crônico de imobilização durante sete dias, duas horas por dia, mostraram aumento dos receptores inositol-1,4,5-trifosfato tipo 1 e 2 nos ventrículos esquerdos13. Em experimentos com ratos, com modelo de estresse de imobilização de 21 dias, Zhao e cols.14 determinaram que o estresse aumenta a expressão da subunidade α1c do canal de cálcio tipo L, e corrente de cálcio em miócitos ventriculares dos ratos.
O canal de cálcio tipo L desempenha um papel importante na manutenção da função cardíaca normal. O influxo de íons Ca2+ através do canal de cálcio tipo L é crucial para o acoplamento excitação-contração no coração15. As alterações na densidade ou papel do canal de cálcio tipo L têm sido implicadas numa variedade de doenças cardiovasculares16,17.
Perante essa informação, o objetivo foi testar a hipótese de que o estresse crônico promove a disfunção cardíaca associada com a diminuição da atividade do canal Ca2+ tipo L. Uma das características novas do presente estudo é o tempo em que os ratos foram submetidos a estresse, 15 semanas, considerando-se que há uma falta de estudos que avaliam o estresse crônico por períodos prolongados, com parâmetros que englobam estrutura cardíaca e atividade. Este estudo contribuirá para a compreensão das alterações cardíacas provocadas pelo estresse crônico.
Ratos Wistar machos de 30 dias de idade (70 - 100 g), provenientes do Centro de Animais da Faculdade de Medicina de Botucatu (Botucatu, São Paulo, Brasil) foram alojados em gaiolas individuais. O ambiente foi controlado em termos de luz (ciclo de 12 h luz/escuridão começando às 6 h da manhã), ar limpo a temperatura ambiente (23 ± 3ºC) e umidade relativa (60 ± 5%). Após sete dias de aclimatação, os ratos foram distribuídos em dois grupos: controle (C, n = 8) e estresse crônico (St, n = 8). Os animais foram pesados semanalmente. Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para Uso e Cuidado de Animais de Laboratório publicado pelo Conselho Nacional de Pesquisa e foram aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto de Biociências da Unesp-Botucatu (Protocolo nº 95/08-CEEA).
Após 30 dias, os membros do grupo St foram imobilizados individualmente em cápsulas de metal à temperatura ambiente de 25ºC, uma hora por dia, cinco dias por semana, durante 15 semanas. Durante a sessão de estresse, o grupo C permaneceu na sua gaiola respectiva à temperatura ambiente de 25ºC, sem receber comida nem água. No final da sessão, o grupo St foi reintroduzido na gaiola original.
A Ingestão semanal de Calorias (IC) foi calculada pelo consumo médio semanal de alimentos
Levando em conta que o estresse crônico pode desenvolver algumas comorbidades, como hipertensão arterial e hipercorticosteronemia, as seguintes avaliações foram realizadas em todos os grupos. Os animais foram sacrificados e a hipertrofia das glândulas adrenais foi avaliada. As glândulas foram removidas, dissecadas e pesadas.
A PAS foi avaliada de três em três semanas durante as 15 semanas. A avaliação foi pelo método não invasivo de manguito de cauda, com Eletroesfigmomanômetro Narco® BioSystems (International Biomedical, Austin, TX, EUA). Para cada animal, foi registrada a média de duas leituras de pressão.
No final do período experimental, os animais foram submetidos a 12-15 horas de jejum, anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg ip), e sacrificados por decapitação. As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados, e o soro foi separado por centrifugação a 3000 × g durante 15 minutos a 4ºC e armazenado a -80ºC até a análise posterior. Os níveis de corticosterona foram determinados por radioimunoensaio usando o kit específico (Coat-A-Count Rat Corticosterone - Diagnostic Products Corporation).
Os ratos foram pesados e anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilazina (1 mg/kg), administrados por via intramuscular.
Os animais foram colocados em posição de decúbito lateral esquerdo para a ecocardiografia, a qual foi realizada com máquina de ultrassom HDI 5000 Phillips, equipado com transdutor eletrônico de 12 MHz. Para medir as estruturas do coração, foram obtidas imagens em modo monodimensional (modo M), com imagens em modo bidimensional orientando o feixe de ultrassom, e o transdutor colocado numa posição paraesternal no eixo curto. A imagem do Ventrículo Esquerdo (VE) foi obtida posicionando o cursor em modo M logo abaixo do plano da valva mitral no nível dos músculos papilares. As imagens da aorta e do átrio esquerdo foram obtidas com o cursor em modo-M posicionado no nível da valva aórtica. As imagens foram registradas em impressora Sony Co. UP-890. Posteriormente, as estruturas cardíacas foram medidas manualmente, com um paquímetro de precisão.
Quando o diâmetro da cavidade ventricular era máximo, foram medidos: o Diâmetro Diastólico do VE (DDVE), a Espessura Diastólica da Parede Posterior do VE (EDPPVE) e a Espessura Diastólica do Septo Interventricular (EDSIV). Quando o diâmetro da cavidade era mínimo, foram medidos: o Diâmetro Sistólico do VE (DSVE), a Espessura Sistólica da Parede Posterior do VE (ESPPVE) e a Espessura Sistólica do Septo Interventricular (ESSIV). O Átrio Esquerdo (AE) foi medido em seu diâmetro máximo. A Massa de VE (MVE) foi calculada usando a seguinte fórmula: MVE = [(DDVE + EDPPVE + EDSIV)3 - (DDVE)3] x 1,04. As seguintes variáveis foram derivadas das dimensões descritas: A espessura relativa do VE (EDPPVE/DDVE), DDVE/PC, AE/MC e o Índice de MVE (IMVE, MVE/MC).
A função sistólica do VE foi avaliada pelos seguintes índices: porcentagem de encurtamento mesocárdico (% Enc. Meso.): [(DDVE + ½ EDPPVE + ½ EDSIV) - (DSVE + ½ ESPPVE + ½ ESSIV)] / (DDVE + ½ EDPPVE + ½ EDSIV), porcentagem de encurtamento endocárdico (% Enc. Endo.): [(DDVE - DSVE) / DDVE]; velocidade de encurtamento da parede posterior (VEPP). A função diastólica foi avaliada pela razão entre o pico da velocidade de influxo inicial (onda E) e a contração atrial (onda A) do fluxo transmitral (E/A), o tempo de desaceleração da onda E (TDE) e o tempo de relaxamento isovolumétrico (TRI). Após a eutanásia, os átrios (A), o ventrículo direito (VD) e o VE foram pesados em valores absolutos e corrigidos pelo PC.
O papel do miocárdio foi avaliado mediante o estudo de músculos papilares isolados do VE. Essa preparação nos permite medir a capacidade do músculo cardíaco para encurtar-se e exercer força, independentemente de influências que possam modificar o desempenho mecânico
Os músculos foram contraídos isotonicamente com cargas leves por 60 min, e em seguida carregados (50 g) para contrair isometricamente e esticar até ao máximo das curvas comprimento-tensão. Após um período de 5 min, durante o qual as preparações foram submetidas a contrações isotônicas, os músculos foram novamente colocadas sob condições isométricas, e o pico da curva de comprimento-tensão (
Os músculos papilares foram avaliados em condição basal de 2,5 mM Ca2+ e depois de manobras inotrópicas e lusitrópicas: aumentos na concentração de Ca2+ extracelular e contração pós-repouso (CPR). As respostas inotrópicas foram registradas 5 min após a adição de cada concentração de Ca2+ extracelular na solução do banho. A CPR foi estudada em uma concentração de Ca2+ extracelular de 0,5 mM, onde o estímulo foi interrompido por 10, 30, e 60 s antes de reiniciar a estimulação. Durante o repouso no miocárdio do rato, o RS acumula Ca2+ acima e além do acumulado durante a estimulação regular, e a primeira batida após o intervalo de repouso (B1) é mais forte que a batida antes do intervalo de repouso (B0).
A avaliação da atividade do canal de Ca2+ tipo L foi realizada utilizando um inibidor específico, o cloridrato de diltiazem (10-4 M), em presença de concentrações acumulativas Ca2+. Vinte minutos após a adição de diltiazem na solução, cada concentração de Ca2+ foi separadamente adicionada à solução do banho durante 10 min, e a atividade do músculo foi avaliada.
No final do estudo, os parâmetros utilizados para caracterizar o músculo papilar foram comprimento (mm), peso (mg), e área de secção transversal área de secção transversal AST (mm2). A AST foi calculada a partir do comprimento e do peso do músculo papilar, assumindo uniformidade e gravidade específica de 1.0. O comprimento do músculo em L
Os dados foram relatados como média ± desvio padrão. As comparações entre os grupos foram realizadas utilizando o teste
Peso corporal, alimentação e ingestão de calorias em relação aos níveis de corticosterona e pressão arterial
O estresse crônico não alterou o peso corporal (C = 438 ± 49
No estudo
A
A
Depois de manobras inotrópicas e lusitrópicas, a aplicação de estresse induziu várias diferenças. Na CPR, os animais que foram expostos a estresse evidenciaram aumentos de DT, dT/dt e -dT/dt em relação ao grupo controle (
O bloqueio do canal de Ca2+ tipo L pelo diltiazem, no entanto, não conduziu a quaisquer alterações, como o aumento nas manobras aumentou, conforme previsto, a concentração de Ca2+ extracelular em todos os parâmetros analisados (
A resposta ao estresse é subordinada à intensidade, duração e tipo de estressor18. No presente estudo, o modelo de estresse crônico não produz alterações significativas no peso corporal, ingestão calórica e eficiência alimentar. Esses resultados desafiam outras investigações que tentam corroborar a noção de que o estresse induz anorexia e perda de peso corporal por meio de modelos de ratos19,20. A literatura mostra que uma minoria de 30% dos seres humanos perde peso durante ou após o estresse, enquanto a maioria das pessoas ganha peso por causa do aumento na ingestão alimentar21,22.
Neste trabalho, o estresse aumentou os níveis de corticosterona sistêmicos. Os autores ressaltaram que o estresse é capaz de aumentar os níveis desse hormônio, de acordo com a função putativa do hormônio do estresse corticosterona, envolvendo o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e o sistema simpático-adrenomedular. O hormônio liberador de corticotropina (HLC) liberado pelo hipotálamo estimula a secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) da pituitária anterior. O ACTH circulante atua na zona fasciculada do córtex adrenal onde estimula a libertação de cortisol em seres humanos e corticosterona em ratos18,23.
Esse aumento de corticosterona está associado com a hipertrofia das glândulas adrenais. Vários pesquisadores têm utilizado o peso fresco da glândula adrenal, um órgão que responde ao estresse, como indicativo de condições estressogênicas8. O peso da glândula adrenal pode ser reduzido ou pode permanecer inalterado após a exposição ao estresse agudo, mas é frequentemente aumentado pelo estresse crônico24,25.
No presente estudo, os animais submetidos a estresse apresentaram hipertensão arterial. A pressão arterial é controlada por meio de vários sistemas, entre eles o sistema nervoso simpático, sistema renina-angiotensina-aldosterona, e estresse oxidativo, que causa vasoconstrição periférica26-28. Essa hipertensão observada em ratos submetidos a estresse provavelmente está relacionada aos sistemas mencionados acima; no entanto, esses mecanismos não foram avaliados neste estudo em particular. Esse resultado corrobora os achados caracterizados na literatura, que observou esse tipo de alterações em humanos estressados5. Esses resultados apoiam fortemente modelo de estresse utilizado na presente pesquisa é um bom modelo para estudar o estresse crônico, uma vez que vários distúrbios vinculados ao estresse, incluindo hipercorticosteronemia, hipertrofia das glândulas adrenais e hipertensão arterial, podem ser investigadas com esse modelo. Esse estresse também gerou hipertrofia do ventrículo esquerdo cardíaco, avaliado pela ecocardiografia e estudos
O estudo ecocardiográfico não revelou alterações significativas na função ventricular sistólica e diastólica esquerda. No entanto, o papel do miocárdio avaliado em condições basais também não apresentou nenhuma alteração; o músculo papilar estressado apresentou melhora da resposta inotrópica para a contração pós-repouso, e um aumento da concentração de cálcio extracelular. Atualmente, várias investigações têm utilizado essas manobras para identificar alterações nas fases de contração e relaxamento, que podem eventualmente não ser observadas em condições basais; além disso, elas ajudam na compreensão dos possíveis mecanismos responsáveis por alterações na atividade cardíaca30.
O mecanismo responsável por essa melhora da função miocárdica ainda não está claro; portanto, só podemos especular sobre o mecanismo intrínseco responsável por esses resultados. A melhor resposta dos ratos estressados pode ser devida ao aumento na sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio31,32 e ao aumento na absorção33,34 do cálcio no retículo sarcoplasmático induzido pelo estresse crônico. Esses postulados são extrapolados de uma estudo35 anterior que observou melhor resposta inotrópica ao cálcio em ratos submetidos a exercício físico. Exercício e estresse são semelhantes em relação a várias características neuroendócrinas, tais como aumento do nível de vasopressina, ACTH, aldosterona, corticosterona e catecolaminas36. A hipertrofia da glândula adrenal observada neste estudo está em concordância com o pressuposto de que o sistema simpático-adrenomedular poderia participar na melhor resposta do coração ao cálcio.
Os estudos dos nossos grupos também avaliaram a participação do canal de Ca2+ tipo L usando o bloqueador de cálcio, diltiazem; a inclusão desse agente diminuiu o fornecimento de Ca2+ ao tecido17. O resultado com o diltiazem não alterou a função do músculo papilar entre os grupos, sugerindo que a atividade do canal de Ca2+ tipo L foi semelhante em ambos os grupos. A literatura tem ainda para mostrar a utilização de uma metodologia semelhante. Zhao e cols.14 observaram um aumento na densidade do canal de Ca2+ tipo L e na corrente de cálcio, em ratos submetidos a estresse de imobilização durante 21 dias consecutivos, em miócitos ventriculares. Contrastando esse resultado, nossas investigações resultaram em densidade de canal Ca2+ tipo L e corrente de cálcio, proporcionais entre os grupos. Essa diferença pode ser devida ao período extenso de exposição ao estresse, indicando uma resposta adaptativa das células cardíacas.
Em conclusão, os dados produzidos neste estudo estão em conflito com nossas hipóteses iniciais. O estresse crônico não deprime a função cardíaca em condições basais e melhora a resposta do miocárdio à estimulação inotrópica. Os resultados demonstram que o canal de Ca2+ tipo L não está envolvido na melhora da função do miocárdio ao estímulo do estresse. Mais estudos são necessários para entender melhor o efeito do estresse sobre o desempenho cardíaco. Esses resultados sugerem que alterações cardíacas de indivíduos estressados são observadas apenas após exposição a estímulos extrínsecos, e essa resposta pode ser uma resposta adaptativa a condições de estresse, com o objetivo de proteger o indivíduo de doença cardiovascular. O presente trabalho contribui para o conjunto de conhecimentos sobre as alterações cardíacas associadas ao estresse e, consequentemente, poderia ajudar os médicos a oferecerem conselhos úteis para os pacientes, pois o estresse é uma das principais causas de doenças cardiovasculares.
Pesquisa financiada pela Fapesp (2009/03771-2).
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado por FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo).
Este artigo é parte da tese de mestrado de Thiago Bruder Nascimento pela Universidade de São Paulo.
Thiago Bruder do Nascimento Departamento de Farmacologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP) Ribeirão Preto, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 27/02/12; revisado em 01/03/12; aceito em 16/04/12.
BACKGROUND: Chronic stress is associated with cardiac remodeling; however the mechanisms have yet to be clarified. OBJECTIVE: The purpose of this study was test the hypothesis that chronic stress promotes cardiac dysfunction associated to L-type calcium Ca2+ channel activity depression. METHODS: Thirty-day-old male Wistar rats (70 - 100 g) were distributed into two groups: control (C) and chronic stress (St). The stress was consistently maintained at immobilization during 15 weeks, 5 times per week, 1h per day. The cardiac function was evaluated by left ventricular performance through echocardiography and by ventricular isolated papillary muscle. The myocardial papillary muscle activity was assessed at baseline conditions and with inotropic maneuvers such as: post-rest contraction and increases in extracellular Ca2+ concentration, in presence or absence of specific blockers L-type calcium channels. RESULTS: The stress was characterized for adrenal glands hypertrophy, increase of systemic corticosterone level and arterial hypertension. The chronic stress provided left ventricular hypertrophy. The left ventricular and baseline myocardial function did not change with chronic stress. However, it improved the response of the papillary muscle in relation to positive inotropic stimulation. This function improvement was not associated with the L-type Ca2+ channel. CONCLUSION: Chronic stress produced cardiac hypertrophy; however, in the study of papillary muscle, the positive inotropic maneuvers potentiated cardiac function in stressed rats, without involvement of L-type Ca2+ channel. Thus, the responsible mechanisms remain unclear with respect to Ca2+ influx alterations.
IDepartment de Pharmacology, Institute of Bioscience, São Paulo State University (UNESP), Botucatu, SP
IIDepartment de Pharmacology, Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP
IIIDepartment of Medicine Clinical, Botucatu School of Medicine, São Paulo State University (UNESP), Botucatu, SP
IVDepartment of Sports, Center of Physical Education and Sports, UFES - Federal University of Espirito Santo, Vitória, ES - Brazil
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Stresses play in integral role in our daily lives and are often related to issues with marital issues, health, work, and low socioeconomic status1. Selye2 defined stress as a state characterized by a uniform response pattern, regardless of the particular stressor, that could lead to long-term pathological changes such as: chronic anxiety, depression, obesity, immunologic disorders, inflammation, insulin resistance and cardiovascular disease3,4.
The most well-defined cardiovascular disorders related to chronic stress in humans are arterial hypertension, heart rate variability, left ventricular systolic and diastolic dysfunction and vascular alterations5-8. In addition, this variable stress for 15 days was able to produce hypertrophic cardiac and permanent cardiac structural changes9. Zhao et al.10 also showed that rats subjected to the chronic stress of restraint for 21 days resulted in cardiac dysfunction and to structural injury of the heart.
In addition, experiments performed in rats subjected to emotional-pain stress demonstrated increased contraction and relaxation velocity of isolated papillary muscles11. Meerson et al.12 observed how rat-isolated heart and papillary muscle adaptation to short-term stresses increased myocardial resistance to arrhythmogenic and contractile effects of excessive Ca2+.
Furthermore, the rats that underwent chronic stress of immobilization for 7 days, 2 hours per day, showed an increase of type 1 and 2 inositol-1,4,5-trisphosphate receptors in their left ventricles13. In experiments with a 21-day restraint stress rat model, Zhao et al.14 determined that stress increases the expression of α1c subunit of the L-type calcium channel and calcium current in ventricular myocytes of rats.
The L-type calcium channel plays a major role in maintenance of normal cardiac function. The influx of Ca2+ ions through the L-type calcium channel is crucial for excitation-contraction coupling in the heart15. Alterations in density or role of the L-type calcium channel have been implicated in a variety of cardiovascular diseases16,17.
Given this information, the objective was to test the hypothesis that chronic stress promotes cardiac dysfunction associated to L-type calcium Ca2+ channel activity depression. One of the novel features of this study is the time in which the rats were subjected to stress, 15 weeks, considering there is a lack of studies evaluating chronic stress for prolonged periods of time with parameters encompassing cardiac structure and activity. This study will contribute to the understanding of cardiac alterations caused by chronic stress.
Thirty-day-old male
After 30 days, the members of the St group were immobilized individually in metal capsules at room temperature 25ºC, 1 hour per day, 5 days a week for 15 weeks. During the session stress, C group remained in their respective cage at room temperature 25ºC, without receiving food and water. At the end of the session, St group members were reintroduced to their original cage.
Weekly calorie intake (CI) was calculated by average weekly food consumption
Noting that chronic stress may develop some comorbidities, such as hypertension and hypercorticosteronemia, the following evaluations were performed in all groups. The animals were killed and the hypertrophy of adrenals glands were assessed. The glands were removed, dissected and weighed.
The evaluation of SBP was assessed every three weeks during the 15 weeks. The assessment was by the non-invasive tail-cuff method with a Narco BioSystems® Electro-Sphygmomanometer (International Biomedical, Austin, TX, USA). The average of two pressure readings were recorded for each animal.
At the end of the experimental period, animals were subjected to 12-15 h of fasting, anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg i.p.), and euthanized by decapitation. Blood samples were collected in heparinized tubes, and the serum was separated by centrifugation at 3000 × g for 15 minutes at 4ºC and stored at -80ºC until further analysis. Corticosterone levels were measured by radioimmunoassay using specific kit (Coat-A-Count Rat Corticosterone - Diagnostic Products Corporation).
The rats were weighed, and anesthetized with ketamine hydrochloride (50 mg/kg) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg), administered intramuscularly.
The animals were positioned in the left lateral position for the echocardiography, which was performed with a HDI 5000 Phillips ultrasound machine, equipped with a 12 MHz electronic transducer. For the measurement of heart structures, monodimensional mode (M-mode) images were obtained, with two-dimensional mode images guiding the ultrasound beam, and the transducer placed in a parasternal location in the short axis. The image of the left ventricle (LV) was obtained by positioning the M-mode cursor just below the mitral valve plane at the level of the papillary muscles. The images of the aorta and the left atrium were obtained with the M-mode cursor positioned at the level of the aortic valve. The images were recorded in a Sony Co. UP-890 printer model. Subsequently, heart structures were manually measured, with a precision caliper.
When the diameter of the ventricular cavity was maximal, the LV diastolic diameter (LVDD), the LV posterior wall diastolic thickness (LVPWDT) and the interventricular septum diastolic thickness (IVSDT) were measured. When the diameter of the cavity was minimalized, the LV systolic diameter (LVSD), the LV posterior wall systolic thickness (LVPWST) and the interventricular septum systolic thickness (IVSST) were measured. The left atrium (LA) was measured at its maximal diameter. The LV mass (LVM) was calculated using the following formula: LVM = [(LVDD + LVPWDT + IVSDT)3- (LVDD)3] x 1.04. The following variables were derived from the dimensions described above: LV relative thickness (LVPWDT/LVDD), LVDD/BW, LA/BW and LVM index (LVMI, LVM/BW).
The LV systolic function was assessed by the following indexes: Percentage of mesocardial shortening (% Meso. Short.): [(LVDD + ½ LVPWDT + ½ IVSDT) - (LVSD + ½ LVPWST + ½ IVSST)] / (LVDD + ½ LVPWDT + ½ IVSDT); percentage of endocardial shortening (% Endo. Short.): [(LVDD - LVSD) / LVDD]; posterior wall shortening velocity (PWSV). The diastolic function was assessed by the ratio index between the peak of initial inflow velocity (E wave) and the atrial contraction (A wave) of the transmitral flow (E/A), the deceleration time of the E wave (DTE) and the isovolumetric relaxation time (IVRT). After the euthanasia, the atria (A), the right ventricle (RV) and the LV were weighed in absolute values and corrected by BW.
Myocardial role was evaluated by studying isolated papillary muscles from the LV. This preparation allows us to measure the capacity of the cardiac muscle to shorten and develop force independently of influences that can modify
The muscles were contracted isotonically with light loads for 60 min and then loaded (50 g) to contract isometrically and stretched to the maximum of their length-tension curves. After a 5-min period during which preparations underwent isotonic contractions, muscles were again placed under isometric conditions, and the peak of the length-tension curve (
The papillary muscles were evaluated under the baseline condition of 2.5 mM Ca2+ and after inotropic and lusitropic maneuvers: increases in extracellular Ca2+concentration and post-rest contraction (PRC). Inotropic responses were recorded 5 min after the addition of each concentration of extracellular Ca2+ to the bathing solution. PRC was studied at an extracellular Ca2+ concentration of 0.5 mM, where the stimulus was paused for 10, 30, and 60 s before restarting the stimulation. During rest in the rat myocardium, the SR accumulates Ca2+ above and beyond that accumulated during regular stimulation, and the first beat after the rest interval (B1) is stronger than the beat before the rest interval (B0).
The evaluation of L-type Ca2+ channel activity was performed using a specific inhibitor,
At the end of the study, the parameters used to characterize the papillary muscle were length (mm), weight (mg), and CSA (mm2). The CSA was calculated from the length and weight of papillary muscle, assuming uniformity and a specific gravity of 1.0. The muscle length at L
Data were reported as means ± standard deviation. Comparisons between groups were performed using Student's t-test for independent samples. The body weight and blood pressure between groups were compared by analysis of variance (ANOVA) for repeated measures. When significant differences were found (p
Body weight, food and calorie intake in relation to corticosterone levels and blood pressure
The chronic stress did not change the BW (C = 438 ± 49 vs. St = 421 ± 33, p > 0,05), while CI (C = 68,7 ± 5,1 vs. St = 69,2 ± 8,6, p > 0.05) and FE (C = 2.24 ± 0.25 vs. St = 2.25 ± 0.32, p > 0.05) increased the corticosterone level [C = 59.32 ± 19.2 vs. St = 98.02 ± 23.0, p
In the
The
After inotropic and lusitropic maneuvers, the application of stress induced several differences. In the PRC, animals that were exposed to stress evinced increases of DT, +dT/dt and -dT/dt in relation to control group (
However, the blockade of L-type Ca2+ channel by diltiazem did not lead to any changes as the increase in maneuvers expectedly increased extracellular Ca2+concentration in all parameters analyzed (
The stress response is contingent upon intensity, duration and type of stressor18. In this study, the model of chronic stress did not produce significant changes on body weight, caloric intake and feeding efficiency. These results challenge other investigations which attempt to corroborate the notion that stress induces anorexia and body weight loss via rat models19,20. The literature illustrates that a 30% minority of humans, lose weight during or after stress, while most individuals gain body weight due to increases in their food intake21,22.
In this work, the stress increased systemic corticosterone levels. Authors underscored that stress is able to enhance levels of this hormone, consistent with the putative function of the corticosterone stress hormone, involving the hypothalamus pituitary adrenal (HPA) axis and the sympathetic-adrenomedullary system. Corticotrophin-releasing hormone (CRH) released by the hypothalamus, stimulates the secretion of Adrenocorticotropic Hormone (ACTH) from the anterior pituitary. Circulating ACTH acts on the fasciculate zone of the adrenal cortex where it stimulates the release of cortisol in humans and corticosterone in rats18,23.
This increase of corticosterone is associated with adrenal glands hypertrophy. Various investigators have used the fresh weight of the adrenal gland, an organ that responds to stress, as indicative of stressogenic conditions8. The weight of the adrenal gland may be reduced or may remain unchanged after exposure to acute stress, but is often increased by chronic stress24,25.
In the present study, animals undergoing stress had arterial hypertension. Blood pressure is controlled via several systems, among them the sympathetic nervous system, renin-angiotensin aldosterone system, and oxidative stress, which causes peripheral vasoconstriction26-28. This hypertension observed in rats subjected to stress is probably related to systems mentioned above; however, these mechanisms were not assessed in this particular study. This result corroborates findings characterized in the literature, which observed these type of alterations in stressed humans5. These results strongly support the chronic stress model as an exceptional model to study chronic stress, as several disorders linked to stress including hypercorticosteronemia, adrenal glands hypertrophy and arterial hypertension may be investigated via this model. This stress also generated left ventricular cardiac hypertrophy assessed by echocardiography and
The echocardiography study did not show any significant alterations in diastolic and systolic left ventricular function. However, the myocardial role assessed in baseline conditions also did not show any change; the stressed papillary muscle presented improvement of inotropic response to post rest-contraction and an increase of extracellular calcium concentration. Currently, several investigations have used these maneuvers to identify changes in phases of contraction and relaxation, which may eventually not be observed under basal conditions; in addition, they assist in the understanding of possible mechanisms responsible for alterations in cardiac activity30.
The mechanism responsible for this improvement of myocardial function remains unclear; therefore, we can only speculate about the intrinsic mechanism responsible for these results. The better response of the stressed rats may be due to increase in myofilament calcium-sensitivity31,32 and increased sarcoplasmic reticulum calcium uptake33,34 induced by chronic stress. These postulations are extrapolated from a previous study35 that observed better inotropic response to calcium in rats subjected to exercise training. The exercise and stress are similar in respect to several neuroendocrine characteristics, such as increased level of vasopressin, ACTH, corticosterone, aldosterone and catecholamines36. The adrenal gland hypertrophy observed in this investigation is in concordance with the underlying assumption that the sympathetic-adrenomedullary system could participate in the heart's enhanced response to calcium.
Our group's studies also assessed the involvement of L-type Ca2+ channel using the calcium blocker, diltiazem; the inclusion of this drug decreased supply of Ca2+ to the tissue17. The result with diltiazem did not change the papillary muscle's function between groups, suggesting that the activity of L-type Ca2+channel was similar in both groups. The literature has yet to showcase the use of a similar methodology. Zhao et al. 14 observed increase of L-type Ca2+ channel density and calcium current in rats subjected to restraint stress for 21 consecutive days in ventricular myocyte. Contrasting this result, our investigations resulted in commensurate L-type Ca2+ channel density and calcium current between groups. This dissimilarity may be due to the extensive period of stress exposure indicating an adaptive response by cardiac cells.
In conclusion, the data produced in this study conflict with our initial hypotheses. The chronic stress did not depress the cardiac function under basal conditions and improved myocardial response to inotropic stimulation. The results demonstrate that the L-type Ca2+ channel is not involved in improved myocardial function to stress stimulus. Further studies are necessary to better understand the effect of stress on cardiac performance. These results suggest that cardiac alterations of stressed individuals are observed only after exposure to extrinsic stimuli and this response may be an adaptive response to stress conditions with the aim of protecting the individual from cardiovascular disease. This study contributes to the body of knowledge concerning cardiac alterations associated to stress and, consequently, could help physicians proffer useful advice to patients since stress is one of the major cause of cardiovascular diseases.
Research supported by FAPESP (2009/03771-2).
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was partially funded by FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo).
This article is part of the thesis of master submitted by Thiago Bruder Nascimento, from Universidade de São Paulo.