FUNDAMENTO: As alterações cardíacas na fase de transição do coração fetal para a vida extrauterina vêm sendo exploradas por inúmeras pesquisas em animais, e os mecanismos celulares responsáveis por essas modificações ainda não estão bem documentado em seres humanos. OBJETIVO: Avaliar o mecanismo de diferenciação celular em cardiomiócitos ocorridas nos primeiros dias de vida, por meio da análise imunoistoquímica de proteínas envolvidas com processos de proliferação e contração muscular, em amostras de miocárdio de recém-natos humanos. MÉTODO: Estudo transversal de amostras parafinadas de miocárdio provenientes de banco de necropsias de recémnascidos humanos, divididos em dois grupos amostrais: recém-nascidos a termo que foram a óbito com no máximo dois dias de vida (NEO1) com 10 casos, e recém- nascidos a termo que foram a óbito entre três e 10 dias de vida (NEO2) com 14 casos, a fim de seguir uma linha de tempo que contemplasse a fase de transição da circulação fetal a vida extrauterina. As amostras foram estudadas em tissue microarray e os anticorpos utilizados foram o Ki67, PCNA, PTEN, Bcl2 (proliferação) e HHF35 e actina sarcomérica (proteínas contráteis). RESULTADOS: Foi encontrada diferença com o Ki67 p = 0,02, HHF35 p < 0,01 e actina sarcomérica p = 0,02, e a expressão do Ki67 foi mais alta no grupo NEO1 e a expressão do HHF35 e da actina sarcomérica foi mais alta no grupo NEO2. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que os cardiomiócitos apresentam uma característica proliferativa (Ki67) nos NEO1 e que essa vai, seguindo uma linha temporal, sendo substituída por um caráter de diferenciação (HHF35 e actina sarcomérica) nos NEO2.
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IIUniversidade Federal do Paraná - UFPR, PR - Brasil
Durante o desenvolvimento cardíaco, nos estudos em animais, os cardiomiócitos sofrem numerosas mudanças fenotípicas, passando, segundo MacLellan e Schneider e Cortius e cols., de um fenótipo proliferativo intraútero (hiperplásico) para um de crescimento e diferenciação celular na vida extrauterina (hipertrófico)1,2.
Anversa e Nadal-Ginard relatam que a transição dos cardiomiócitos de fenótipo hiperplásico para hipertrófico proporcionaria um aumento importante da força de contração cardíaca3.
Na fase hipertrófica do desenvolvimento cardíaco, os cardiomiócitos ventriculares aumentam de tamanho por causa do aumento da síntese de proteínas contráteis e também diminuem a síntese de DNA com consequente diminuição da proliferação celular.
Os mecanismos celulares que são responsáveis pelo desencadeamento e regulação dessa transição não são totalmente conhecidos4.
Porrello e cols. realizaram ressecção parcial do coração do rato com um e sete dias de vida. Observaram que apenas no rato com um dia de vida ocorreu regeneração, demonstrando assim que, por um breve período após o nascimento, o coração do mamífero parece ter capacidade de regeneração5.
O delineamento desses mecanismos é particularmente importante para a compreensão dos processos de regeneração de cardiomiócitos, por meio de células primitivas indiferenciadas, após lesões miocárdicas em indivíduos adultos. O conhecimento da proliferação intrínseca e do potencial cardiomiogênico de recém-nascidos pode levar a uma melhor compreensão desses mesmos processos em indivíduos adultos, acarretando futuros benefícios clínicos em pacientes com lesões miocárdicas grave5.
A hipótese deste estudo se baseia no fato de que os cardiomiócitos podem sofrer uma transição gradativa do seu fenótipo hiperplásico para hipertrófico, seguindo a evolução temporal dos neonatos, envolvendo alterações na expressão imunoistoquímica de algumas proteínas atuantes no crescimento e diferenciação celular. Sendo assim, o objetivo deste estudo é avaliar, por meio de análise imunoistoquímica de algumas proteínas envolvidas com os processos de proliferação e contração muscular, o mecanismo de diferenciação celular dos cardiomiócitos em seres humanos que demonstrasse a fase de transição da circulação fetal a vida extrauterina.
Para a elaboração desta pesquisa foram incluídas amostras de miocárdio de ventrículo esquerdo fixadas em formol e emblocadas em parafina, provenientes de necropsias de recém-natos a termo (idade gestacional entre 38 e 42 semanas) que foram a óbito até 10 dias de vida pós-natal (n = 106 casos), da Unidade de Patologia Pediátrica e Perinatal do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (UFPR), entre os anos de 1985 e 2005.
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da UFPR com o número 1319.167/2006-11.
Os casos foram divididos em dois grupos: NEO1, recém-nascidos a termo que evoluíram para óbito com no máximo dois dias de vida; e NEO2, com óbito entre três e 10 dias de vida.
O estudo contava, inicialmente, com 56 casos de NEO1 e 50 casos de NEO2. Após serem aplicados os critérios de exclusão, foram selecionados 10 casos para o grupo NEO1 e 14 casos para o grupo NEO2.
Foram excluídos todos os fetos malformados, sindrômicos, portadores de eritoblastose fetal, alterações placentárias ou com histórico gestacional de hipertensão arterial crônica ou especifica da gestação, diabetes pré-gestacional ou gestacional, infecções maternas, crescimento intrauterino retardado, oligodrâmnio e polidrâmnio.
Todos os casos do estudo foram classificados quanto a sexo, idade gestacional, tempo de vida e causa da morte.
As amostras de miocárdio foram fixadas em formol e estavam conservadas em blocos de parafina, o que levou a adotar-se a técnica de imunoistoquímica como método de análise de expressão proteica.
A imunoistoquímica parece ser a técnica mais apropriada para materiais fixados em formol e emblocados em parafina. Tem sido descrita, ao longo dos anos, como uma importante ferramenta na expansão dos conhecimentos sobre a expressão proteica, além de ser uma técnica barata e de fácil execução.
O seu resultado, no entanto, é influenciado por alguns fatores, tais como o tempo de fixação e o processamento do material, a qualidade do fixador e dos anticorpos escolhidos, as reações propriamente ditas e a subjetividade da interpretação das lâminas. Mesmo assim, a imunoistoquímica tem sido amplamente utilizada em materiais fixados em formol e processados em parafina, pela sua capacidade de expressão mesmo diante de uma qualidade precária dos tecidos estudados6.
As amostras de miocárdio de cada um dos grupos foram então montadas em
Para a demonstração dos antígenos específicos em amostras de miocárdio fixados em formol e emblocados em parafina, utilizou-se a técnica da imunoistoquímica, e todos os anticorpos foram diluídos com diluente de anticorpos (Dakocytomation®). Como anticorpo secundário utilizou-se o EnVision®+Dual Link/Peroxidase (Dakocytomation®). Utilizou-se como cromógeno, para revelar as reações, o 3,3'-diaminobenzidina ou DAB; Sistema Substrato-Cromógeno (Dakocytomation®). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários e proporção de diluição: anti-PTEN (1:400; Novocastra®), anti-Ki67 (1:150; Dako ®); anti-PCNA (1:400; Dako ®) e anti-Bcl2 (1:200; Dako ®) para avaliar proliferação celular; e o HHF35 (1:400; Dako ®) e o anti-Actina Sarcomérica ( 1:400; Dako®) para avaliar proteínas contráteis.
As reações foram controladas com reações-controle positivas e negativas.
As reações dos anticorpos Ki67, PCNA, Bcl2 e PTEN para proliferação celular foram analisados pelo método quantitativo simples, mediante a contagem dos núcleos de cardiomiócitos positivos em toda a amostra, objetiva com aumento de 400 vezes.
As reações dos anticorpos HHF35 e actina sarcomérica para proteínas contráteis foram analisados pelo método quantitativo morfométrico, e esse método lê a intensidade da cor da região com reação imunoistoquímica positiva e a converte numa medida de área, tendo como unidade o micrômetro. Para isso foi utilizada a microscopia óptica, objetiva com aumento de 200 vezes, microscópio binocular (Olympus® BX50), acoplado a um computador onde se encontra instalado o software Image Pro Plus® para realização da análise.
Para a comparação dos grupos em relação a variáveis quantitativas foi considerado o modelo de análise de variância ANOVA com o nível de significância considerado de 0,05.
Um total de 24 corações de recém-nascidos foram analisados, apresentando, no que se refere a sexo, tempo médio de idade gestacional ou de vida e causa da morte, o seguinte perfil demonstrado na
Dentre os marcadores imunoistoquimicos que sugerem proliferação celular, o Ki67 com p = 0,02 apresentou diferença significativa entre o grupo NEO1 e NEO2.
Na
Os anticorpos HHF35 e actina sarcomérica que avaliam proteínas contráteis apresentaram diferença significativa entre os dois grupos, tendo valores maiores no grupo NEO2, e têm seus resultados apresentados na
O PCNA e o Ki67 vêm sendo utilizados para o estudo do ciclo celular como importantes marcadores proliferativos, sendo empregados em estudos sobre o crescimento celular dos cardiomiócitos1,2,8.
No embrião de mamíferos, a proliferação e a diferenciação dos cardiomiócitos acontecem concomitantemente durante o período embrionário e fetal e continuam a ocorrer até poucos dias após o nascimento2.
Estudos em ratos revelam que os cardiomiócitos normalmente param de se dividir com aproximadamente 17 dias de desenvolvimento pós-natal. A expressão do PCNA nessa fase revela que 6% dos cardiomiócitos estariam em atividade de síntese no momento do nascimento, mas apenas 1,5% dessas células estaria em síntese com 11 dias de vida, e apenas 0,5% dos cardiomiócitos adultos seria capaz de entrar em fase de síntese. Essa incapacidade dos cardiomiócitos adultos de se regenerarem mediante o aumento de divisões celulares já foi amplamente estudada e apresentada como um dos maiores problemas para o tratamento clínico das doenças cardíacas1,2,8.
Estudos recentes da expressão imunoistoquímica do Ki67, em corações humanos infartados, revelaram, entretanto, que 4% dos cardiomiócitos apresentavam positividade para essa proteína proliferativa nas regiões infartadas. Além disso, as mudanças fenotípicas encontradas na transição da circulação fetal para a vida extrauterina poderiam incluir uma diminuição gradativa da expressão do PCNA e Ki671,2,8-12.
Neste estudo, o Ki67 apresentou um decréscimo na expressão quando comparado os grupos de NEO1 e NEO2 (
Outro anticorpo que tem importante papel na regulação do ciclo celular é o PTEN, estando envolvido na progressão do ciclo celular, na migração e crescimento celular, bem como a apoptose13.
Nas amostras deste estudo observamos uma diferença de expressão do PTEN entre os dois grupos, porém não houve diferença estatisticamente significativa.
O PTEN, quando ativado, pode estar envolvido com o bloqueio da capacidade celular de passar da fase G1 para a fase S mediante a inibição das ciclinas, bloqueando, consequentemente, a capacidade proliferativa dos cardiomiócitos na via extrauterina13.
Observou-se um aumento de expressão do Bcl2, a qual seguiu a linha temporal dos grupos da amostra, todavia sem diferença significativa estatisticamente. Esse fato poderia estar evidenciando maior resistência à apoptose no grupo de recém-natos que foi a óbito com mais de dois dias e, consequentemente, uma maior tendência ao crescimento e diferenciação celular2,9.
Os anticorpos HHF35 e a actina sarcomérica, os quais são usados para o estudo de proteínas contráteis, apresentaram diferença estatisticamente relevante entre os dois grupos amostrais, e o grupo NEO2 apresentou maior expressão de ambas às proteínas (
Percebeu-se a diminuição da expressão do Ki67, em relação à evolução temporal das amostras, evidenciando redução do fenótipo proliferativo dos cardiomiócitos. Os anticorpos que marcaram as proteínas contráteis (HHF35 e antiactina sarcomérica) apresentaram um aumento de sua expressão seguindo a evolução temporal dos grupos amostrais. Esses dados estão de acordo com a substituição da característica proliferativa hiperplásica desse tecido na vida intrauterina por uma característica de diferenciação celular, na vida extrauterina.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de doutorado de Tarcísio Fulgêncio Alves da Silva pela Pontífica Universidade Católica do Paraná.
Mona Adalgisa Simões Itaiopolis, 254, apto 302, America CEP 89204-100, Joinville, SC - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 21/02/12; revisado em 21/02/12; aceito em 16/04/12.
BACKGROUND: The cardiac alterations during the fetal heart transition to extrauterine life have been explored by several animal studies and the cell mechanisms responsible for these modifications are not well documented in humans. OBJECTIVE: To evaluate the mechanism of cell differentiation into cardiomyocytes that occur in the first days of life, through immunohistochemical analysis of proteins involved in proliferation and muscle contraction processes, in samples of human neonate myocardium. METHODS: Cross-sectional study of paraffin-sample sections of myocardium from an autopsy database of human neonates, divided into two sample groups: full-term neonates who died after a maximum of two days of life (NEO1) with 10 cases, and full-term infants who died between 3 and 10 days of life (NEO2) with 14 cases, in order to follow a temporal line that would contemplate the transition from fetal circulation to extrauterine life. The samples were studied in tissue microarray and the antibodies used were Ki67, PCNA, PTEN, Bcl2 (proliferation), HHF35 and sarcomeric actin (contractile proteins). RESULTS: Difference was observed regarding Ki67, p = 0.02; HHF35, p <0.01 and sarcomeric actin, p = 0.02, with Ki67 expression being higher in NEO1 group, whereas HHF35 and sarcomeric actin expression was higher in the NEO2 group. CONCLUSION: The results suggest that cardiomyocytes have a proliferation characteristic (Ki67) in NEO1 which, following a temporal line, will be replaced by a differentiation characteristic (HHF35 and sarcomeric actin) in NEO2.
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During cardiac development, in animal studies, cardiomyocytes undergo numerous phenotypic alterations, going from an intrauterine proliferative phenotype (hyperplastic) to a cell growth and differentiation pattern in extrauterine life (hypertrophic), according to MacLellan and Schneider and Cortius et al.1,2.
Anversa and Nadal-Ginard reported that the transition of cardiomyocytes from a hyperplastic to a hypertrophic phenotype would provide a significant increase in cardiac contractile force3.
At the hypertrophic stage of heart development, ventricular cardiomyocytes increase in size due to increased synthesis of contractile proteins and also to decrease in DNA synthesis with a consequent decrease in cell proliferation.
The cell mechanisms that are responsible for triggering and regulating this transition are not fully understood4.
Porrello et al. performed partial resection of the heart in rats aged one and seven days of life. They observed regeneration only in one-day-old rats, thus demonstrating that, for a brief period after birth, the mammalian heart seems to have capacity for regeneration5.
The design of these mechanisms is particularly important to understand cardiomyocyte regeneration processes, through undifferentiated primitive cells, after myocardial lesions in adults. The knowledge of intrinsic proliferation and cardiomyogenic potential of newborns can lead to a better understanding of these processes in adults, resulting in future clinical benefits in patients with severe myocardial lesions5.
The hypothesis of the present study is based on the fact that cardiomyocytes can undergo a gradual transition from the hyperplastic to the hypertrophic phenotype, following the temporal evolution of neonates, involving alterations in the immunohistochemical expression of some proteins that act on cell growth and differentiation. Therefore, the objective of this study is to evaluate, by immunohistochemical analysis of some proteins involved in the processes of muscle proliferation and contraction, the mechanism of cell differentiation of cardiomyocytes in humans that can demonstrate the transition from fetal circulation to extrauterine life.
This study analyzed samples of left ventricular myocardium fixed in formalin and embedded in paraffin, from autopsies of full-term newborns (gestational age between 38 and 42 weeks), who died within 10 days of post-natal life (n = 106 cases) at the Pediatric and Perinatal Pathology Unit, Department of Pathology, Hospital de Clinicas, Universidade Federal do Parana (UFPR), between the years 1985 and 2005. This study was approved by the UFPR Ethics Committee under protocol # 1319.167/2006-11.
The cases were divided into two groups: NEO1, full-term newborns that died no more than two days after birth, and NEO2, who died between three and 10 days of post-natal life.
The study consisted initially of 56 cases in NEO1 and 50 cases in NEO2. After exclusion criteria were applied, 10 cases were selected for the NEO1 group and 14 cases for the NEO2 group.
The exclusion criteria included all cases of malformed, syndromic fetuses, fetal erythroblastosis cases, placental alterations or those with a gestational history of chronic arterial or specific gestational hypertension, pre-pregnancy or gestational diabetes, maternal infections, intrauterine growth retardation, oligohydramnios and polyhydramnios.
All cases were classified according to sex, gestational age, age and cause of death. Samples of myocardium were fixed in formalin and preserved in paraffin blocks, which led us to adopt the immunohistochemistry technique as the method of analysis of protein expression.
Immunohistochemistry seems to be the most appropriate technique for materials fixed in formalin and embedded in paraffin. It has been described over the years, as an important tool in the study of protein expression, in addition to being an inexpensive and easy-to-perform technique.
The results, however, are influenced by factors such as fixation time and processing of the material, the quality of the fixation agent and the chosen antibodies, the reactions themselves and the subjectivity when interpreting the slides. Nevertheless, immunohistochemistry has been widely used in material fixed in formalin and processed in paraffin due to its expression capacity even when using poor-quality tissues6.
Myocardium samples from each group were then mounted in tissue microarrays (TMA), using three fragments of LV myocardium per case, and each fragment measured 3 mm in diameter.
The immunohistochemical technique was used to demonstrate the specific antigens in myocardial samples fixed in formalin and embedded in paraffin and all antibodies were diluted with antibody diluent (Dakocytomation ®). The EnVision ® + Dual Link / Peroxidase (Dakocytomation ®) was used as the secondary antibody. As chromogen, used to reveal the reaction, 3,3'-diaminobenzidine or DAB, chromogen-substrate system (Dakocytomation ®) was used. The following primary antibodies and dilution ratios were used: anti-PTEN (1:400; ® Novocastra), anti-Ki67 (1:150, Dako ®), anti-PCNA (1:400, Dako ®) and anti-Bcl2 (1:200, Dako ®) to assess cell proliferation, and HHF35 (1:400, Dako ®) and sarcomeric anti-actin (1:400, Dako ®) to assess contractile proteins. The reactions were controlled reactions with positive and negative controls.
The reactions of antibodies Ki67, PCNA, Bcl2 and PTEN for cell proliferation were analyzed by simple quantitative method by counting the nuclei of positive cardiomyocytes in the entire sample, under 400 X magnification.
The reactions of HHF35 and sarcomeric actin antibodies for contractile proteins were analyzed by the morphometric quantitative method, and this method reads the color intensity of the region with positive immunohistochemistry reaction and converts it into an area measurement, using the micrometer as unit. For that purpose an optical microscope was used with a 200 X magnification, in a binocular microscope (Olympus BX50 ®) coupled to a computer in which the Image Pro Plus ® software had been installed to perform the analysis. To compare the groups in terms of quantitative variables, the ANOVA model was considered, with a significance level of 0.05.
A total of 24 newborn hearts were analyzed, showing, regarding gender, mean gestational age or days of life and cause of death, the following profile shown in
PCNA and Ki67 have been used to study the cell cycle as important markers of proliferation and have been used in studies on cardiomyocyte cell growth1,2,8.
In the mammalian embryo, proliferation and differentiation of cardiomyocytes occur concomitantly during embryonic and fetal periods and continue to occur until a few days after birth2.
Studies in rats have shown that cardiomyocytes often stop dividing at approximately 17 days of post-natal development. The expression of PCNA in this phase shows that 6% of cardiomyocytes were in synthesis activity at birth, but only 1.5% of these cells would be in synthesis activity at 11 days of life, and only 0.5% of adult cardiomyocytes could enter the synthesis phase. This inability of adult cardiomyocytes to regenerate through the increase of cell divisions has been broadly studied and is as one of the major problems for the clinical treatment of heart disease1,2,8.
Recent studies of the immunohistochemical expression of Ki67 in infarcted human hearts have shown, however, that 4% of the cardiomyocytes showed positivity for this proliferative protein in infarcted regions. Furthermore, the phenotypic alterations found in the transition from fetal circulation to extrauterine life could include a gradual decrease in PCNA and Ki67 expression1,2,8-12.
In the present study, Ki67 showed a decrease in expression when groups NEO1 and NEO2 were compared (p = 0.02). This is in agreement with the idea of a decrease in the proliferative characteristics of cardiomyocytes in this period.
Another antibody that has an important role in cell cycle regulation is PTEN, which is involved in cell cycle progression, cell migration and growth, as well as apoptosis13. Samples in this study showed a difference in PTEN expression between the two groups; however, the differences were not statistically significant. PTEN, when activated, could be involved in blocking the cell capacity to move from G1 to S phase through cyclin inhibition, consequently blocking the proliferative capacity of cardiomyocytes in the extrauterine pathway13.
Increased expression of Bcl2 was observed, which followed the temporal evolution of the sample groups, although with no statistically significant difference. This fact might indicate greater resistance to apoptosis in the group of newborns who died after two days of life and therefore, a greater tendency to cell growth and differentiation2,9.
The HHF35 antibodies and sarcomeric actin, which are used for the study of contractile proteins, showed statistically significant difference between the two sample groups, and the Neo2 group showed higher expression of both proteins (p < 0.01 and p = 0.02, respectively). This fact possibly demonstrates that the differentiation of cardiomyocytes occurs by increasing the volume of cardiac cells, through changes in the expression of sarcomeric proteins, which would result in changes in the functional properties of cardiomyocytes with an increase in capacity of power generation by the heart muscles during the postnatal development14.
We observed a decrease in Ki67 expression in relation to sample temporal evolution, showing a reduction in cardiomyocyte proliferative phenotype. The antibodies that marked contractile proteins (sarcomeric anti-actin and HHF35) showed increased expression following the temporal evolution of the sample groups. These data are consistent with the substitution of the hyperplasic proliferative characteristic of this tissue during intrauterine life by a cell differentiation characteristic in extrauterine life.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Tarcísio Fulgêncio Alves da Silva, from Pontífica Universidade Católica do Paraná.