FUNDAMENTO: O programa de biogênese mitocondrial no coração parece apresentar remodelação adaptativa após estresse biomecânico e oxidativo. Os mecanismos adaptativos que protegem o metabolismo do miocárdio durante a hipóxia são coordenados, em parte, pelo óxido nítrico (NO). OBJETIVO: Observar a biogênese mitocondrial e expressão do óxido nítrico sintase (NOS) em corações de cardiopatia congênita com cianose; discutir a resposta mitocondrial à hipóxia crônica do miocárdio. MÉTODOS: Foram investigados 20 pacientes com defeitos cardíacos cianóticos (n = 10) ou acianóticos (n = 10). Foram estudadas amostras do miocárdio na via de saída ventricular direita, tomadas durante a operação. A análise morfométrica de mitocôndrias foi realizada por microscopia eletrônica de transmissão. A relação mtDNA/nDNA foi determinada com PCR em tempo real. Os níveis de transcrição da subunidade I da citocromo c oxidase (COXI), coativador-1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α), o fator respiratório nuclear 1 (NRF1), e fator de transcrição mitocondrial A (Tfam) foram detectados por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) ativado por fluorescência em tempo real. Os níveis proteicos de COXI e nNOS, iNOS e eNOS foram medidos por técnica de Western Blot. RESULTADOS: A densidade volumétrica mitocondrial (Vv) e a densidade numérica (Nv) foram significativamente elevadas em pacientes com cianose, em comparação com a cardiopatia congênita acianótica. MtDNA elevada e suprarregulação dos níveis de COXI, PGC-1 α, NRF1 e Tfam mRNA foram observadas em pacientes cianóticos. Os níveis de proteína de COXI e eNOS foram significativamente maiores no miocárdio de pacientes cianóticos que nos de acianóticos. Os níveis de transcrição do PGC-1α se correlacionam com os níveis de eNOS. CONCLUSÃO: A biogênese mitocondrial é ativada no miocárdio da via de saída ventricular na cardiopatia congênita com cianose, que poderia ser a resposta adaptativa à hipóxia crônica e possivelmente envolve suprarregulação da eNOS. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)
eNOS se correlaciona com a biogênese mitocondrial em corações com cardiopatia congênita e cianose
Department of Cardiovascular Surgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, PR China
As mitocôndrias são o local de produção de energia oxidativa em células eucarióticas. Biogênese mitocondrial é definida como o controle do
O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa com uma vasta gama de atividades fisiológicas e também patológicas, incluindo a regulação do tônus do vaso e angiogênese em doenças cardiovasculares isquêmicas, cicatrização de feridas, inflamação e doenças malignas. O NO também tem um efeito complexo na mitocôndria, incluindo o aumento da biogênese dirigida pela maquinaria transcricional, mediante indução do PGC-1α dependente de (sGC) cGMP sensível a guanilato ciclase solúvel, e redução da fosforilação oxidativa mediante inibição competitiva da transferência de elétrons na cadeia respiratória4. Durante a hipóxia5, os cardiomiócitos apresentam um aumento da produção de NO e algumas respostas hipóxicas adaptativas são regulados pelo NO no coração6. A sintase endotelial de óxido nítrico (eNOS) mostrou ser induzida por hipoxia7, e ser ativada pelo fator de transcrição HIF8 induzido por hipoxia.
Uma vez que faltam dados sobre a resposta mitocondrial do miocárdio para hipoxemia crônica em razão da Doença Cardíaca Congênita (DCC), realizamos uma análise morfológica e molecular detalhada em corações de pacientes com doença coronariana cianótica, comparando perfis de expressão gênica de reguladores-chave da biogênese mitocondrial e proteínas eNOS com corações de pacientes com CPC sem cianose.
Após a aprovação pelo Comitê de Ética Humana do Hospital Xinqiao, 20 pacientes com idade entre 2 e 22 anos (média de 9,2 anos), submetidos a cirurgia cardíaca primária, foram incluídos neste estudo prospectivo. Dez pacientes tinham defeito cardíaco cianótico e dez, acianótico. Este estudo foi realizado entre pacientes diagnosticados com cardiopatia congênita com obstrução da via de saída ventricular direita e que foram submetidos a cirurgias cardíacas no Departamento de Cirurgia Cardiovascular do Hospital Xinqiao, entre janeiro de 2008 e dezembro de 2008. A
Os agentes administrados para pré-medicação e anestesia geral convencional consistiram em todos os casos de midazolam, fentanil sulfato e brometo de pancurônio. Após o início da Circulação Extracorpórea (CEC), a aorta foi pinçada e a parada cardíaca induzida pela injeção intraaórtica de solução cardioplégica esfriada a 4°C. Uma biópsia foi retirada da via de saída ventricular direita, imediatamente após o pinçamento aórtico. As amostras do miocárdio tomadas para avaliação ultraestrutural foram imediatamente picadas em pedaços de 1-2 mm, e colocadas em glutaraldeído 2,5% frio por 12 h. As amostras recolhidas para RT-PCR, RT e Western Blott foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70.
As amostras em glutaraldeído foram posteriormente colocadas em tetróxido de ósmio; e então embebidas em resina epóxi. Secções ultrafinas foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo saturados. De cada amostra foram obtidas 10 micrografias eletrônicas de campos escolhidos aleatoriamente. A densidade volumétrica mitocondrial (VV), a densidade numérica (Nv) e a média do volume (V) foram determinadas com ampliação de ×89,00, de acordo com o método de Nouette-Gaulain e cols.9, como segue: Vv é a fração de volume relativa das mitocôndrias determinada como a fração relativa de superfície da unidade de área composta por todas as fatias de mitocôndria. Nv depende das seções das mitocôndrias (NA) contadas por superfície de medida padrão, da distribuição de tamanho (K), e, finalmente, do formato da mitocôndria, na relação Nv=K.NA3/2/β.Vv1/2. O coeficiente de forma b para estruturas elipsoidais é uma função dos diâmetros longitudinal e transversal. Com base em estudos anteriores, foi assumido como sendo β=2 no coração10. K é determinada pela distribuição do tamanho dos objetos. De acordo com estudos anteriores em coração com hipóxia crônica, foi assumido como sendo K=1,1 no presente estudo10. V é a média de volume por mitocôndria obtida pela divisão simples de Vv por Nv.
O DNA genômico total foi isolado a partir de amostras de miocárdio com o kit TIANamp Genomic DNA (Tiangen, China) de acordo com as instruções do fabricante. O conteúdo de MtDNA relativo ao DNA nuclear foi determinado utilizando um PCR quantitativo em tempo real realizado em um Sistema de Detecção de Sequencia ABI PRISM7900. Primers específicos foram utilizados para amplificar um fragmento de 86bp do citocromo-b mitocondrial ou um fragmento 207bp do gene L10A da proteína ribossômica genômica nuclear. As reações de PCR foram realizadas como se segue: 95°C por 60s; 45 ciclos a 95°C 15s, 60°C 15s, 72°C 45s. Os testes de PCR foram realizados em triplicado para cada amostra de DNA. A expressão do número de cópias do mtDNA em relação ao DNA nuclear (relação mtDNA/nDNA) foi determinada utilizando o método 2-ΔCt 11.
O RNA total foi extraído a partir de amostras de miocárdio, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando 2 μg de RNA. A síntese da primeira fita de cDNA foi realizada com o kit BioRT cDNA First Strand Synthesis (Bioer, China). A amplificação da PCR-RT em tempo real foi realizada em 20 μL de mistura de reação contendo 1 μl da amostra de cDNA, 10 μl de SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japão), e 0,25 μM de conjuntos de primers específicos mediante a utilização de um Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7900 (PE Applied Biosystems, EUA). A RT-PCR foi realizada começando com 60s a 95°C seguido por um passo de desnaturação a 95°C por 15s, um passo de hibridação a 60°C para 15s, e um passo de extensão a 72°C por 45s, por 45 ciclos. A análise da curva de dissociação foi realizada no final dos 45 ciclos para verificar a identidade do produto da PCR. Extraímos a curva padrão de cada gene entre uma concentração relativa e o ciclo limiar de uma série de diluições de 10 vezes do produto específico da PCR. Cada amostra foi medida por triplicados de modelos de cDNA e o nível de expressão foi calculado como a relação entre o valor médio da expressão relativa em triplicado de cada amostra, e a expressão relativa da proteína L10A ribossômica (RPL10A) como controle interno. Para a análise dos dados foi utilizado o software do Sistema de Detecção de Sequência Versão 1.3.1 (Applied Biosystems).
As amostras do miocárdio foram dissolvidas numa solução tampão contendo Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 mM de vanadato de sódio, Triton X-100 1%, 0,5% de Nonidet P-40, e 1μg/mL de leupeptina e aprotinina. O homogenato foi centrifugado durante 5 min, e o sobrenadante foi congelado e armazenado a 80°C. Um ensaio de proteína BCA (Sangon, China) foi usado para determinar o conteúdo de proteína. O tecido dissolvido (100-200 μg) foi submetido a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, e na sequência a proteína foi transferida para uma membrana de PVDF (Whatman Westran, RU). A membrana foi pré-incubada numa solução tampão contendo Tris 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, e Tween 0,1% suplementado com 5% de leite desnatado durante 1 h à temperatura ambiente. Após a pré-incubação, a membrana foi incubada na solução tampão de Tris-NaCl-Tween suplementada com 5% de albumina sérica bovina e anticorpo por 1-2h à temperatura ambiente. Os anticorpos utilizados foram um anticorpo monoclonal de camundongo contra a citocromo c oxidase I, um anticorpo policlonal de coelho contra a nNOS, um anticorpo policlonal de coelho contra a iNOS, um anticorpo policlonal de coelho contra a eNOS (todos eles 1:1000, Santa Cruz, EUA) e um anticorpo policlonal de coelho contra a β-actina (1:1,000; Biosynthesis Biotechnology, Beijing, China). Após a incubação, a membrana foi lavada com solução tampão durante 1 h, e re-sondada com o anticorpo secundário adequado conjugado com peroxidase de rábano silvestre (1:1.000; Biotechnology Biossíntese, Beijing, China) em solução tampão de Tris-NaCl-Tween suplementado com 5% de leite desnatado por 1 h à temperatura ambiente. Após a incubação, a membrana foi lavada três vezes com solução tampão de Tris-NaCl-Tween e as bandas foram visualizadas com kit de detecção ECL (ShineGene, Shanghai, China). Os filmes foram digitalizados com um densitômetro laser, utilizando o programa Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Canadá). Níveis relativos de proteína foram padronizados usando actina-β como controle interno.
Os resultados são expressos como valor médio ± DP. Foram realizados testes de normalidade. O teste T para amostras independentes foi utilizado para analisar diferenças entre os pacientes com defeitos cardíacos cianóticos ou acianóticos. A correlação de parâmetros independentes foi avaliada pelo teste de correlação de Spearman. Os valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Os dados foram analisados com o Pacote Estatístico para Ciências Sociais (SPSS) versão 10.0.
A
Amostras do miocárdio foram encontradas como sendo histologicamente normais na maioria dos pacientes acianóticos. Essas amostras apresentaram um arranjo ordenado de miofibrilas e sarcômeros, mitocôndria bem distribuída e bandas-Z normais. Em pacientes cianóticos observou-se desorganização miofibrilar, encurtamento de sarcômeros, acúmulo focal da mitocôndria com desigualdade de tamanho e forma, depósitos anormais intramitocondriais e bandas-Z e discos intercalares (
A relação mtDNA/nDNA em pacientes cianóticos foi maior que em pacientes acianóticos (1,56 ± 0,18 vs. 0,97 ± 0,17, p < 0,05). Após a normalização com o gene Rpl10a, os níveis de expressão de mRNA em cada amostra foram estimados como um nível de expressão relativa em comparação com a amostra de referência. O nível de ARNm da COXI foi significativamente incrementado, enquanto os níveis de transcrição de vários reguladores essenciais da biogênese mitocondrial (PGC-1v, NRF1 e Tfam) apresentaram uma suprarregulação coordenada em pacientes cianóticas comparado com os pacientes acianóticos (p < 0,01,
A análise de Western Blot revelou que os níveis da COXI foram significativamente maiores no miocárdio do ventrículo direito de pacientes com cianose do que naqueles com defeitos cardíacos acianóticos (p < 0,05). Uma quantidade muito baixa de proteína nNOS foi detectada em todas as amostras do miocárdio e não foi observada diferença entre os dois grupos. Não houve diferença entre os níveis de proteína iNOS de pacientes cianóticos e acianóticos. Os níveis de eNOS foram aumentados em pacientes cianóticos, comparado com pacientes acianóticas (p < 0,05,
A capacidade para modular o número de mitocôndrias e a densidade de complexos de cadeia de transferência de elétrons por unidade mitocondrial tem sido demonstrada em níveis de regulação ultraestruturais, bioquímicos e moleculares. No coração, paralelamente às mudanças de desenvolvimento na tensão de oxigênio, carga hemodinâmica, preferência do substrato, a biogênese mitocondrial é acelerada no período perinatal, com um pico na idade adulta jovem, com um subsequente declínio durante a senescência12. A plasticidade adaptativa tem sido demonstrada pela massa mitocondrial cardíaca aumentada com uma indução paralela na capacidade geradora de energia após hipóxia hipobárica13. Neste estudo, demonstramos que a densidade volumétrica mitocondrial (Vv) e a densidade numérica (Nv) foram elevadas em pacientes com cianose em comparação com a cardiopatia congênita acianótica, sugerindo que havia mais mitocôndrias no miocárdio de pacientes com cardiopatia congênita cianótica. Essa resposta foi acompanhada por aumento significativo no número de cópias do mtDNA e na suprarregulação da mRNA na COXI e expressão proteica, que foi codificada pelo mtDNA. A indução de genes envolvidos na biogênese mitocondrial foi também observada no grupo cianótico. O aumento da massa mitocondrial, mtDNA, mRNA e proteína demonstrou que o programa de biogénese mitocondrial é suprarregulado em corações de pacientes cianóticos. Além disso, o mRNA de PGC-1 α, o regulador-chave do programa de biogênese mitocondrial, se correlaciona inversamente com a SaO2, sugerindo que a hipóxia é um gatilho importante para a biogênese mitocondrial em pacientes com cardiopatia congênita cianótica.
No músculo esquelético, a proliferação mitocondrial demonstra compensar parcialmente a disfunção respiratória, mantendo a produção de global de ATP14; a distintivo histopatológico desse fenômeno é a presença de um aumento do número de mitocôndrias, especialmente na região subsarcolemal. No entanto, no músculo cardíaco, a indução da biogênese mitocondrial tem sido proposta como uma resposta inadequada em cardiomiopatias mitocondriais15. De fato, a indução cardíaca específica do PGC-1 α em camundongos resulta em disfunção cardíaca com características morfológicas de proliferação mitocondrial dos miócitos e desorganização e perda miofibrilar. Curiosamente, tanto a proliferação mitocondrial quanto a cardiomiopatia são reversíveis após a cessação da expressão transgênica16. Nossos achados de que a biogênese mitocondrial foi suprarregulada nos corações dos pacientes cianóticos pode ser um mecanismo compensatório da mitocôndria no miocárdio. A proliferação mitocondrial pode melhorar a difusão e utilização de oxigênio limitado com o alargamento da superfície. No entanto, a proliferação mitocondrial também pode afetar espécies reativas de oxigênio (ROS) derivadas de vias mitocondriais e de apoptose. Então, se essa adaptação é benéfica para a função cardíaca permanece inexplicada, e trabalhos adicionais são necessários para resolver esse problema.
No presente estudo, descobrimos que os níveis de intramiocárdicos de eNOS foram significativamente elevados em pacientes com cardiopatia congênita cianótica, e se correlacionaram negativamente com a SaO2. Embora em um estudo anterior os níveis de eNOS-mRNA tenham sido reduzidos e os níveis de iNOS-mRNA tenham aumentado no tecido atrial direito de crianças com cianose em comparação com aquelas com cardiopatia congênita acianótica17, vários estudos já confirmaram que a hipóxia pode ativar a eNOS e aumentar a expressão da eNOS no coração18. Recentemente, um elemento de resposta à hipóxia foi identificado no promotor de eNOS humano8, ligando assim a expressão da eNOS ao HIF, o principal responsável na mediação de respostas adaptativas à hipóxia.
Outro resultado interessante do estudo é a observação de uma associação entre os níveis de transcrição de PGC-1 α, que estavam presentes no nível de biogênese mitocondrial e níveis miocárdicos de eNOS em pacientes com doença cardíaca congênita. A proteção induzida por hipóxia crónica do miocárdio contra a lesão de reperfusão isquêmica foi confirmada por vários grupos19. Consistente com a capacidade bioenergética aumentada como consequência da biogênese mitocondrial, as mitocôndrias extraídas de corações hipóxicos mostram aumento das taxas de síntese de ATP20. Além disso, a cardioproteção induzida por hipóxia é associada à suprarregulação da óxido nítrico sintase (NOS) e é eliminada pela inibição da NOS21. Uma vez que a capacidade do NO para ativar a maquinaria transcricional que dirige a biogênese mitocondrial tem sido estabelecida, nossa observação da associação entre os níveis de transcrição de PGC-1 α e os níveis miocárdicos da eNOS pode implicar que a eNOS e a biogênese mitocondrial desempenham papéis importantes na proteção do miocárdio induzida por hipóxia crônica contra lesão de reperfusão isquêmica22.
O presente estudo sugere que a biogênese mitocondrial é ativada no miocárdio da via de saída ventricular na cardiopatia congênita com cianose, que poderia ser a resposta adaptativa à hipóxia crônica e possivelmente envolve suprarregulação da eNOS.
Este trabalho foi financiado pela National Natural Science Foundation Program (30972957).
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado por National Natural Science Foundation Program (30972957).
Este artigo é parte de tese de doutorado de Juan Xiao pela Third Military Medical University, Chongqing, PR China.
Yingbin Xiao Department of Cardiovascular Surgery, Xinqiao Hospital Third Military Medical University, 183 Xinqiao Street Chongqing, 400037, PR China E-mail:
Artigo recebido em 10/12/11; revisado em 22/12/11; aceito em 16/04/12.
BACKGROUND: Mitochondrial biogenesis program in heart appears to exhibit adaptive remodeling following biomechanical and oxidative stress. The adaptive mechanisms that protect myocardium metabolism during hypoxia are coordinated in part by nitric oxide (NO). OBJECTIVE: To observe mitochondrial biogenesis and nitric oxide synthase (NOS) expression in hearts of congenital heart disease with cyanosis, discuss mitochondrial response to chronic hypoxia in myocardium. METHODS: 20 patients with cyanotic (n=10) or acyanotic cardiac defects (n=10) were investigated. Samples from the right ventricular outflow tract myocardium taken during operation were studied. Morphometric analysis of mitochondria was performed with transmission electron microscope. Relative mtDNA/nDNA ratio was determined with real-time PCR. Cytochrome c oxidase subunit I (COXI), peroxisome-proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α), nuclear respiratory factor 1 (NRF1), and mitochondrial transcription factor A (Tfam) transcript levels were detected by real-time fluorescent RT-PCR. COXI and nNOS, iNOS and eNOS protein levels were measured with western blot. RESULTS: Mitochondrial volume density (Vv) and numerical density (Nv) were significantly elevated in patients with cyanotic compared to acyanotic congenital heart disease. Elevated mtDNA and up-regulated COXI, PGC-1α, NRF1 and Tfam mRNA levels were observed in cyanotic patients. Protein levels of COXI and eNOS were significantly higher in the myocardium of cyanotic than of acyanotic patients. PGC-1α transcript levels correlated with the levels of eNOS. Conclusion: Mitochondrial biogenesis is activated in right ventricular outflow tract myocardium in congenital heart disease with cyanosis, which could be the adaptive response to chronic hypoxia and possibly involves eNOS up-regulation. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)
eNOS correlates with mitochondrial biogenesis in hearts of congenital heart disease with cyanosis
Department of Cardiovascular Surgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, PR China
Conclusion: Mitochondrial biogenesis is activated in right ventricular outflow tract myocardium in congenital heart disease with cyanosis, which could be the adaptive response to chronic hypoxia and possibly involves eNOS
up-regulation. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)
Mitochondria are the site of oxidative energy production in eukaryotic cells. Mitochondrial biogenesis is defined as the control of mitochondrial turnover, content, and number required to maintain diverse homeostatic demands across tissue types1. Mitochondrial biogenesis involves the coordinated action of both nuclear and mitochondrial encoded genomes. Peroxisome profilerator activated receptor gamma coactivator alpha (PGC-1α), an inducible transcriptional coactivator, has been implicated as a major regulator of the mitochondrial biogenic program. PGC-1α interacts with nuclear respiratory factor 1 (NRF1), stimulating transcription of many mitochondrial genes as well as mitochondrial transcription factor A (Tfam), a direct regulator of mitochondrial DNA replication and transcription2. In the heart, mitochondria are highly abundant, constitute approximately 40% of total cardiomyocyte volume, and produce more than 90% of the cell's energy3. Mitochondrial biogenesis program in heart appears to exhibit adaptive remodeling following biomechanical and oxidative stress, for instance, following hypoxia, and is supposed to be an explicit target for cardiac therapeutic interventions1.
Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule with a wide range of physiological and pathological activities, including the regulation of vessel tone and angiogenesis in ischemic cardiovascular diseases, wound healing, inflammation, and malignant diseases. NO also has complex effect on mitochondrion, including upregulating the transcriptional machinery driving biogenesis via soluble guanylate cyclase-sensitive (sGC) cGMP dependent induction of PGC-1α and reducing oxidative phosphorylation flux via competitive inhibition of respiratory chain electron transfer4. Cardiomyocytes show increased NO production during hypoxia5, and some of the adaptive hypoxic responses are regulated by NO in the heart6. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) has been shown to be induced by hypoxia7 and to be activated by hypoxia-induced transcription factor HIF8.
Since data are lacking about the myocardial mitochondrial response to chronic hypoxemia due to congenital cardiac disease (CHD), we performed a detailed morphologic and molecular analysis on hearts from patients with cyanotic CHD, comparing gene expression profiles of key regulators of mitochondrial biogenesis and eNOS protein expression to hearts of CHD patients without cyanosis.
After approval by the Human Ethical Committee of the Xinqiao Hospital, 20 patients aged 2 to 22 years (mean 9.2 years) undergoing primary cardiac surgery were enrolled in this prospective study. Ten patients had a cyanotic and ten had an acyanotic cardiac defect. This study was carried out among patients who were diagnosed with congenital heart disease with right ventricular outflow tract obstruction and had cardiac operations in Department of cardiovascular surgery of Xinqiao Hospital between 2008.01 and 2008.12.
Drugs given for premedication and conventional general anesthesia consisted in all cases of midazolam, fentanyl sulfate and pancuronium bromide. After institution of cardiopulmonary bypass (CPB), the aorta was cross-clamped and cardiac arrest instituted by intra-aortal injection of a 4°C cold cardioplegic solution. A biopsy was taken from the right ventricular outflow tract immediately after aortic clamping. Myocardial Samples taken for ultra-structural evaluation were immediately minced into 1-2 mm size pieces, fixed for 12 h in cold 2.5% glutaraldehyde. Samples taken for RT-PCR, PCR and Western blotting were immediately snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -70°C until analysis.
The glutaraldehyde fixed samples were post-fixed in osmium tetroxide; they were then embedded in epoxy resin. Ultrathin sections were stained with saturated uranyl acetate and lead citrate. Ten electron micrographs of randomly chosen fields were obtained from each sample. Mitochondrial volume density (Vv), numerical density (Nv) and mean volume (V) were determined at ×89.00 magnification according to the method of Nouette-Gaulain et al.9 as follows. Vv is the relative volume fraction of the mitochondria determined as the relative surface fraction of the unit area comprised by all mitochondrion slices. Nv depends on mitochondria sections (NA) counted per standard measuring surface, on the size distribution (K) and, finally on the shape of the mitochondria, writing Nv=K.NA3/2/β.Vv1/2. The form coefficient b for ellipsoidal structures is a function of the longitudinal and transverse diameter. On the basis of previous studies it was assumed to be β=2 in the heart10. K is determined by the size distribution of the objects. According to previous studies in chronic hypoxic heart, it was assumed to be K=1.1 in the present study10. V is the mean volume per mitochondria obtained by simple division of Vv by Nv.
Total genomic DNA was isolated from Myocardial Samples with the TIANamp Genomic DNA kit (Tiangen, China) according to the instructions of the manufacturer. MtDNA content relative to nuclear DNA was determined utilizing a quantitative real-time PCR performed in an ABI PRISM7900 Sequence Detection System. Specific primers were used to amplify an 86bp fragment of mitochondrial cytochrome-b or a 207bp fragment of nuclear genomic Ribosomal protein L10A gene. PCR reactions were performed as following: 95°C for 60s; 45 cycles at 95°C 15s, 60°C 15s, 72°C 45s. PCR assays were performed in triplicate for each DNA sample. The expression of mtDNA copy number relative to nuclear DNA (relative mtDNA/nDNA ratio) was determined using the 2-ΔCt method11.
Total RNA was extracted from Myocardial Samples using Trizol reagent (Invitrogen, USA) following the manufacturer's instructions. Reverse transcription was performed using 2 μg of RNA. First-strand cDNA synthesis was accomplished with BioRT cDNA First Strand Synthesis Kit (Bioer, China). Real-time RT-PCR amplification was performed in 20 μl of reaction mixture containing 1μl of cDNA sample, 10μl of SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japan), and 0.25μM of specific primer sets by the use of an ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, USA). Real-time RT-PCR was carried out starting with 60s at 95°C followed by a denaturation step at 95°C for 15 s, an annealing step at 60°C for 15 s, and an extension step at 72°C for 45s for 45 cycles. Dissociation curve analysis was performed at the end of 45 cycles to verify PCR product identity. We drew the standard curve of each gene between a relative concentration and the threshold cycle of a 10-fold dilution series of specific PCR product. Each sample was measured by triplicates of cDNA templates and the expression level was calculated as the ratio of the mean value of the triplicate relative expression of each sample to the relative expression of Ribosomal protein L10A (RPL10A) as an internal control. Sequence Detector Systems Version 1.3.1 software (Applied Biosystems) was used for data analysis.
Myocardial Samples were lysed in a buffer containing 10mM Tris (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50mM NaF, 0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1mM sodium vanadate, 1% Triton X-100, 0.5% nonidet P-40, and 1μg/mL of leupeptin and aprotinin. The homogenate was centrifuged for 5min, and the supernatant was frozen and stored at 80°C. A BCA protein assay (Sangon, China) was used to determine protein content. Tissue lysate (100-200μg) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and protein was subsequently transferred to a PVDF membrane (Whatman Westran, UK). The membrane was pre-incubated in a buffer containing 10mM Tris (pH 7.4), 150mM NaCl, and 0.1% Tween supplemented with 5% skim milk for 1h at room temperature. Following pre-incubation, the membrane was incubated in the Tris-NaCl-Tween buffer supplemented with 5% bovine serum albumin and antibody for 1-2h at room temperature. Antibodies employed were a mouse monoclonal antibody against cytochrome c oxidase I, a rabbit polyclonal antibody against nNOS, a rabbit polyclonal antibody against iNOS, a rabbit polyclonal antibody against eNOS(all of them 1:1000, Santa Cruz, USA) and a rabbit polyclonal antibody against β-actin(1:1,000; Biosynthesis Biotechnology, Beijing, China). Following incubation, the membrane was washed with buffer for 1h, and re-probed with the appropriate secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (1:1,000; Biosynthesis Biotechnology, Beijing, China) in Tris-NaCl-Tween buffer supplemented with 5% skim milk for 1h at room temperature. Following incubation, the membrane was washed three times with the Tris-NaCl-Tween buffer and bands visualized by an ECL detection kit (ShineGene, Shanghai, China). Films were scanned with a laser densitometer utilizing the program Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Canada). Relative levels of protein were standardized using β-actin as the internal control.
Results are expressed as the mean value ± SD. Normality tests were performed. The independent samples T test was used to analyze differences between patients with cyanotic or acyanotic cardiac defects. Correlation of independent parameters was assessed by the Spearmen correlation test. P-values<0.05 were considered significant. Data were analyzed with the Statistical Package for Social Sciences version 10.0.
Myocardial specimens were found to be histologically normal in most acyanotic patients. These specimens exhibited an orderly arrangement of myofibril and sarcomeres, well-distributed mitochondrion and normal Z-bands. In cyanotic patients, myofibrillar disorganization, shortening of sarcomeres, focal accumulation of mitochondrion with inequality of size and shape, intramitochondrial deposits and abnormal Z-bands and intercalated discs were observed (
The relative mtDNA/nDNA ratio of cyanotic patients was higher than the ratio of asyanotic patients (1.56±0.18 vs. 0.97±0.17, p<0.05). After normalization with the Rpl10a gene, mRNA expression levels in each sample were estimated as a relative expression level in comparison with the reference sample. The mRNA level of COXI was significantly increased, while the transcript levels of several key regulators of mitochondrial biogenesis (PGC-1α, NRF1 and Tfam) were coordinately up-regulated in cyanotic patients comparing with asyanotic patients(p<0.01,
Western blot analysis revealed that COXI levels were significantly higher in the right ventricular myocardium of patients with cyanotic than in those with acyanotic cardiac defects (p<0.05). Very low amount of nNOS protein was detected in all myocardial samples and no difference was observed between two groups. There was no difference between the iNOS protein levels of cyanotic and acyanotic patients. Levels of eNOS were increased in cyanotic patients comparing with acyanotic patients (p<0.05,
The capacity to modulate mitochondrial number and the density of electron transfer chain complexes per unit mitochondria has been demonstrated at ultrastructural, biochemical, and molecular regulatory levels. In the heart, in parallel with developmental changes in oxygen tension, hemodynamic load, and substrate preference, mitochondrial biogenesis is accelerated in the prenatal period with a peak in young adulthood with a subsequent decline during senescence12. Adaptive plasticity has been demonstrated by increased cardiac mitochondrial mass with a parallel induction in energy-generating capability following hypobaric hypoxia13. In this study, we demonstrated that mitochondrial volume density (Vv) and numerical density (Nv) were elevated in patients with cyanotic compared to acyanotic congenital heart disease, suggesting there were more mitochondria in myocardium of patients with cyanotic congenital heart disease. This response was accompanied by significantly increased mtDNA copy number and up-regulated COXI mRNA and protein expression, which was encode by mtDNA. Induction of genes involved in mitochondrial biogenesis was also observed in cyanotic group. The increase in mitochondrial mass, mtDNA, mRNA and protein demonstrated that the mitochondrial biogenesis program is up-regulated in cyanotic patients' hearts. Furthermore, mRNA of PGC-1α, the key regulator of the mitochondrial biogenic program, correlated inversely with SaO2, suggesting that hypoxemia is an important trigger for mitochondrial biogenesis in patients with cyanotic congenital heart disease.
In skeletal muscle, mitochondrial proliferation has been shown to partly compensate for the respiratory dysfunction by maintaining overall ATP production14; the histopathologic hallmark of this phenomenon is the presence of an increased number of mitochondria, mostly in the subsarcolemmal region. However, in cardiac muscle, induction of mitochondrial biogenesis has been proposed as a maladaptive response in mitochondrial cardiomyopathies15. In fact, cardiac-specific induction of PGC-1α in mice results in cardiac dysfunction with morphologic features of myocyte mitochondrial proliferation and myofibrillar disorganization and loss. Intriguingly, both mitochondrial proliferation and cardiomyopathy are reversible upon cessation of transgene expression16. Our findings that mitochondrial biogenesis was up-regulated in cyanotic patients' hearts may be a compensatory mechanism of mitochondria in myocardium. Proliferated mitochondria may improve diffusion and utilization of limited oxygen with enlarged surface area. However, proliferated mitochondria may also affect reactive oxygen species (ROS) derived from mitochondria and apoptosis pathways. Therefore, whether this adaptation is beneficial to cardiac function remains unexplained and additional work is required to fully address this issue.
In the present study, we found that intramyocardial levels of eNOS were significantly elevated in patients with cyanotic congenital heart disease and correlated inversely with SaO2. Although in a previous study eNOS-mRNA levels were reduced and iNOS-mRNA levels were increased in right atrial tissue from children with cyanotic compared to those with acyanotic congenital heart disease17, several studies have now confirmed that hypoxia can activate eNOS and increase eNOS expression in the heart18. Recently, a hypoxia-responsive element has been identified in the human eNOS promoter8 thus linking eNOS expression to HIF, the major effect of mediating hypoxic adaptive responses.
Another interesting result of the present study is the observation of an association between PGC-1α transcript levels, which present the mitochondrial biogenesis level, and myocardial levels of eNOS in patients with congenital heart disease. Chronic hypoxia-induced myocardial protection against ischemia reperfusion injury has been confirmed by several groups19. Consistent with augmented bioenergetic capacity as a consequence of mitochondrial biogenesis, mitochondria extracted from hypoxic hearts show increased rates of ATP synthesis20. Moreover, hypoxia-induced cardioprotection is associated with the upregulation of nitric oxide synthase (NOS) and is abolished by NOS inhibition21. Since the capacity of NO to activate the transcriptional machinery driving mitochondrial biogenesis has been established, our observation of the association between PGC-1α transcript levels and myocardial levels of eNOS may imply that eNOS and mitochondrial biogenesis play important roles in chronic hypoxia-induced myocardial protection against ischemia reperfusion injury22.
The present results suggest that mitochondrial biogenesis is activated in right ventricular outflow tract myocardium in congenital heart disease with cyanosis, which could be the adaptive response to chronic hypoxia and possibly involves eNOS up-regulation.
This work was supported by National Natural Science Foundation Program (30972957).
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by National Natural Science Foundation Program (30972957).
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Juan Xiao , from Third Military Medical University, Chongqing, PR China.
Yingbin Xiao Department of Cardiovascular Surgery, Xinqiao Hospital Third Military Medical University, 183 Xinqiao Street Chongqing, 400037, PR China E-mail:
Manuscript received December 10, 2011; manuscript revised December 22, 2011; accepted April 16, 2012.