FUNDAMENTO: A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica de origem multifatorial que ocorre em resposta à agressão endotelial. O fungo Monascus ruber apresenta atividade hipocolesterolêmica e polifenóis presentes no resíduo de café apresentam atividade antioxidante, podendo auxiliar na prevenção de doenças cardiovasculares. O resíduo de café possui quantidade significativa de açúcares fermentescíveis, constituindo-se em substrato apropriado para o cultivo de fungos. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos resíduos de café seco e fermentado por Monascus ruber no metabolismo lipídico de camundongos knockout Apo E. MÉTODOS: O ensaio biológico foi realizado com 30 camundongos knockout para o gene Apo E, divididos em cinco grupos e submetidos a diferentes tratamentos. Foi realizada a prospecção fitoquímica e quantificação de compostos fenólicos dos resíduos fermentado e sem fermentar. O soro dos animais foi analisado utilizando kits enzimáticos e o tecido aórtico incluso em parafina e corado com H/E para realização da análise histopatológica. RESULTADOS: O resíduo de café sem fermentar 2%, em relação ao grupo controle, diminuiu em 42% o nível sérico de triacilgliceróis e em aproximadamente 41% a fração VLDL-c. Os grupos dos animais alimentados com 10% de resíduo não fermentado e 2% de resíduo fermentado diminuíram a área de lesão 10,5% e 15,4%, respectivamente, quando comparados ao controle. O resíduo fermentado apresentou um teor de compostos fenólicos superior ao resíduo não fermentado. CONCLUSÃO: O presente estudo mostra que a fermentação do resíduo de café apresenta potencial efeito benéfico sobre as doenças cardiovasculares, especialmente a aterosclerose.
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG - Brasil
O Brasil consolida a posição de maior produtor e exportador mundial de café em grãos, sendo responsável por 30% do mercado mundial1. No entanto, os subprodutos dessa atividade agrícola, que em muitos casos não são devidamente tratados, gerando despesas e preocupação ambiental, são também uma fonte de compostos com propriedades funcionais2.
A casca e a polpa de café, resíduos do despolpamento, possuem uma quantidade significativa de açúcares fermentescíveis, consistindo substrato apropriado para o cultivo de fungos e leveduras3.
O
A aterosclerose é uma doença complexa e multifatorial, sendo afetada por múltiplos fatores genéticos e ambientais. Vários trabalhos mostram que a alta ingestão calórica e consumo de dietas ricas em ácidos graxos saturados acelera a sua aterogênese; no entanto, os efeitos dos componentes individuais dos alimentos ainda são pouco compreendidos6.
Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural, os compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos, por inibirem a peroxidação lipídica, a lipo-oxigenase e, sobretudo, por atuarem como antioxidantes ou pró-oxidantes em doenças associadas ao metabolismo lipídico, especialmente a aterosclerose7,8.
Nesse contexto, o propósito geral deste trabalho é o aproveitamento do resíduo do café, utilizando-o como meio de cultura para o crescimento do fungo
Café da variedade Catuaí (
O fungo
Noventa e cinco mililitros de solução contendo sulfato de magnésio 0,1%, fosfato de potássio diidrogenado 0,1% e cloreto de amônio 1% foram adicionados a 50 g de resíduo de café para enriquecimento do meio e elevação do teor de umidade. O resíduo foi inoculado com suspensão de esporos do fungo cultivado em meio PDA a 28 ºC durante 13 dias. Em seguida, o resíduo fermentado foi seco e triturado para ser utilizado nas dietas experimentais.
A identificação dos metabólitos secundários presentes no resíduo de café seco e fermentado foi realizada por cromatografia de camada delgada9. O teor de fenóis totais dos resíduos fermentado e não fermentado foi estimado utilizando-se o reagente de Folin-Ciocalteu10. Foi utilizada a solução de água/etanol (6:4) como solvente, por apresentar maior eficiência na extração de fenóis totais dos resíduos11. Os resultados foram expressos em Equivalentes de Ácido Gálico (GAE).
O ensaio biológico foi realizado com 30 camundongos
Ao final do experimento os animais foram pesados, após jejum de 12 horas, anestesiados, eutanasiados e coletado amostras de sangue para dosagem de triacilgliceróis, colesterol total e suas frações. O sangue foi retirado por exsanguinação por secção da aorta abdominal. O soro foi obtido por centrifugação a 5.000 rpm por 15 minutos em centrífuga de mesa (Marconi, modelo M.A. 860).
As dosagens sorológicas foram efetuadas no equipamento de dosagens multiparamétrico de Bioquímica (Alizé®), utilizando-se
A região inicial da aorta foi removida e perfundida em tampão salino fosfato (PBS), transferida para uma solução de etanol 70% e conservada até a realização da análise histopatológica. Fragmentos aórticos foram processados em micrótomo rotativo manual (marca American Optical®) conforme rotina para inclusão em parafina, de forma orientada, obtendo-se cortes histológicos consecutivos, com 5 µm de espessura, a partir da superfície de inclusão. Foram preparadas duas lâminas contendo em média 10 cortes por animal. As preparações foram coradas com hematoxilina e eosina (H/E), codificadas e submetidas à análise microscópica.
A região inicial da aorta foi utilizada para as análises histológicas dos constituintes arteriais. Todos os cortes histológicos obtidos foram examinados com o objetivo de localizar as estruturas anatômicas referenciais da válvula aórtica e da raiz da aorta. De acordo com a presença dessas estruturas referenciais, o corte histológico no nível anatômico da válvula aórtica foi selecionado para as medidas. Os cortes foram obtidos em intervalos de 5 µm, sendo a extensão média explorada de 20-30 µm. Para análise morfométrica foram capturadas imagens dos cortes histológicos dos cinco grupos, e para padronização do número amostral dos grupos foram sorteadas, aleatoriamente, oito imagens para realização das medidas.
As imagens foram obtidas em microscópio Olympus® Bx50 acoplado a uma câmera digital Q-Color 3 Olympus®, sendo as imagens capturadas utilizando o programa Q-Capture Pró, versão 6.0.0.412. As áreas das lesões foram dimensionadas utilizando o programa Image Pró Plus versão 4.5.0.29.
O software SigmaStat (versão 2.03) foi utilizado para análise descritiva dos resultados e testes de comparação das médias dos grupos independentes. A avaliação da distribuição das variáveis foi realizada pelo teste de Kolmogorov-Sminorv. Considerando o número amostral por grupo de animais e que algumas variáveis não apresentaram distribuição normal, testes não paramétricos foram realizados para a comparação de cada dois grupos independentes, utilizando o teste de Mann Whitney. As variáveis com distribuição normal foram submetidas à análise paramétrica, seguida do teste t. As médias foram significativas a
Os principais grupos de metabólitos secundários identificados nos resíduos de café fermentado e não fermentado por
Os resultados para detecção de saponinas, triterpenos/esteroides, cumarinas, taninos, flavonoides e alcaloides foram positivos para ambos resíduos. No entanto, houve diferença entre os perfis cromatográficos dos extratos quanto aos grupos metabólitos secundários (
Os resultados mostram que o resíduo fermentado apresentou um teor de fenóis totais estatisticamente superiores ao resíduo não fermentado.
A
Os resultados mostram que houve uma diminuição significativa nos níveis séricos de triacilgliceróis e da fração VLDL-c.
A
Os resultados mostram que houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de tratamento (Grupos 2, 3 e 4) e o grupo controle (Grupo 1).
A
As lesões aórticas são classificadas como um xantoma em estágio progressivo e ainda não são encontrados deposição evidente de cristais de colesterol, de acordo com a classificação de Virmani e cols.13.
A
Os resultados encontrados sugerem que o efeito do resíduo fermentado está inversamente relacionado com sua concentração na dieta. O grupo que recebeu 2% de resíduo fermentado apresentou uma diminuição de 15% na área da lesão.
O presente estudo avalia, pela primeira vez, o efeito do resíduo de café não fermentado e fermentado pelo fungo
Produtos fermentados por fungos do gênero
O processo de fermentação pode sintetizar ou degradar compostos que apresentam atividade biológica. Neste trabalho foi verificada a presença das mesmas classes de compostos bioativos nos resíduos de café fermentado e não fermentado. No entanto, mediante distintos fatores de retenção, foi possível observar diferentes compostos fitoquímicos nas mesmas classes de metabólitos secundários entre o resíduo fermentado e não fermentado. Essa diferença de compostos pode estar relacionada com o teor superior de polifenóis no resíduo que foi submetido à fermentação.
Os resultados encontrados mostraram que houve diferença no perfil lipídico dos camundongos que receberam resíduo sem fermentar quando comparados com o grupo que ingeriu apenas dieta aterogênica (Grupo 1). O resíduo de café sem fermentar 2% (Grupo 2) diminuiu em 42% o nível sérico de triacilgliceróis ao mesmo tempo em que reduziu a fração VLDL-c em aproximadamente 41% em relação ao grupo controle (Grupo 1), sendo as diferenças estatisticamente significativas.
A aorta dos animais do grupo que recebeu a dieta aterogênica suplementada com resíduo de café sem fermentar a 2% (Grupo 2) apresentou maior área de lesão quando comparado ao grupo controle (Grupo 1), ao contrário de esperado, uma vez que esse grupo apresentou níveis de triacilgliceróis e VLDL-c inferior ao grupo controle. Os grupos dos animais que foram alimentados com 10% de resíduo não fermentado (Grupo 3) e 2% de resíduo fermentado (Grupo 4) diminuíram a área de lesão 10,5% e 15,4% respectivamente, quando comparado ao grupo controle, sendo esta diminuição estatisticamente significativa.
Comparando os grupos alimentados com os diferentes resíduos na mesma concentração, Grupo 2 e Grupo 4, observa-se que os animais que consumiram 2% do resíduo fermentado apresentaram diminuição de 26,4% na área de lesão quando comparado ao Grupo 2, mostrando que a fermentação teve efeito benéfico, reduzindo a formação da placa de ateroma. Na concentração de 10%, somente o resíduo que não foi submetido à fermentação mostrou efeito benéfico, reduzindo a lesão em 14,1% quando comparado ao grupo de animais alimentados com 10% do resíduo fermentado (Grupo 5).
Quando comparados os resíduos iguais, porém em diferentes concentrações, verificou-se que as concentrações influenciam na formação das lesões ateroscleróticas, mostrando que a maior concentração de resíduo não fermentado (Grupo 3) foi eficaz na redução da lesão. Em contrapartida, a menor concentração do resíduo fermentado (Grupo 4) apresentou melhor efeito protetor.
A relação entre o consumo da bebida café e o desenvolvimento de doenças cardiovasculares tem sido demonstrada na literatura, principalmente envolvendo humanos. Se, por um lado, diversos estudos demonstram o efeito maléfico do café sobre as doenças18,19, por outro, existem evidências de efeitos benéficos dele20,21. Contudo, não foram encontrados relatos na literatura abordando o efeito dos produtos fermentados por fungos do gênero
O efeito antioxidante é obtido quando os compostos bioativos são utilizados em baixas concentrações, funcionando como mediadores de sinalização em mecanismos de ajuste, proliferação, defesa e morte celular. O aumento na concentração desses compostos pode causar injúrias celulares relacionadas ao surgimento de condições patológicas no organismo22-24. Uma possível explicação para os resultados observados é que a fermentação leva à formação de compostos bioativos específicos que em altas concentrações (10%) tornam-se maléficos e que a 2% essa concentração foi adequada para diminuir essas lesões aórticas. Já no resíduo sem fermentar é possível que a concentração de fenóis no resíduo a 2% seja insuficiente para apresentar efeito protetor no organismo, e que na suplementação de 10% essa concentração seja adequada para tais efeitos.
O estudo apresenta limitações que devem ser mencionadas. O pouco volume sanguíneo obtidos nesse tipo de modelo animal dificulta a realização de diferentes análises.
Os resultados encontrados no presente estudo mostraram que o resíduo de café reduz os níveis séricos de triacilgliceróis e VLDLc.
A fermentação elevou o teor de fenóis totais.
Os animais que receberam o resíduo fermentado a 2% apresentaram o melhor efeito na diminuição da área da lesão aórtica. Já os animais que consumiram o resíduo fermentado a 10% não apresentou efeito sob as lesões, evidenciando um efeito dose dependente.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo teve o apoio técnico e financeiro da Fapemig e do CNPq.
Este artigo é parte de dissertação de Larissa Froede Brito pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.
Larissa Froede Brito Marly de Azevedo, 40/402 Centro. CEP 36570-000, Viçosa, MG - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 24/01/12
Revisado em 31/01/12
Aceito em 23/03/12
BACKGROUND: Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of multifactorial origin, which occurs in response to endothelial injury. The fungus Monascus ruber has hypocholesterolemic activity, and the polyphenols present in coffee residue have an antioxidant activity and can help prevent cardiovascular diseases. Coffee residue has a significant amount of fermentable sugars, being an adequate substrate for growing fungi. OBJECTIVE: The objective of this study was to assess the effect of dry coffee residue fermented with Monascus ruber on the lipid metabolism of ApoE knockout mice. METHODS: The biological assay was performed with 30 ApoE knockout mice, divided into five groups and undergoing different treatments. The phytochemical prospection and quantification of phenolic compounds of the fermented and non-fermented coffee residues were performed. The sera of the animals were analyzed by using enzyme kits, and the aortic tissue was embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin to undergo histopathological analysis. RESULTS: Comparing with the control group, the group receiving 2% non-fermented coffee residue showed a reduction of 42% in the serum levels of triacylglycerols and of approximately 41% in VLDL-c. The groups receiving 10% non-fermented coffee residue and 2% fermented coffee residue showed reductions in the lesion areas of 10.5% and 15.4%, respectively, as compared with the control group. The fermented coffee residue showed a higher content of phenolic compounds as compared with the non-fermented coffee residue. CONCLUSION: The present study showed that coffee residue fermentation has a potentially beneficial effect on cardiovascular diseases, especially atherosclerosis.
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG - Brazil
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Brazil has consolidated its position as the world's greatest producer and exporter of coffee beans, accounting for 30% of the world market1. However, the by-products of that agricultural activity, which are often not properly treated, generate costs and environmental concern, are also a source of compounds with functional properties2.
Coffee hull and pulp, residues of de-pulping, have a significant amount of fermentable sugars, being a proper substrate for fungal and yeast growth3.
Atherosclerosis is a complex and multifactorial disease, affected by multiple genetic and environmental factors. Several studies have shown that a high-calorie ingestion and consumption of diets rich in saturated fatty acids accelerate atherogenesis; however, the effects of the dietary individual components are still little understood6.
Of the several classes of antioxidant substances of natural occurrence, phenolic compounds have received a lot of attention in past years, because they inhibit lipid peroxidation and lipoxygenase, acting mainly as antioxidants or pro-oxidants in diseases associated with the lipid metabolism, specially atherosclerosis7,8.
In that setting, the general purpose of this study was to assess the use of coffee residues as a culture medium for growing
Catuai coffee variety (
Ninety-five milliliters of a solution containing 0.1% magnesium sulfate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, and 1% ammonium chloride were added to 50g of the coffee residue to enrich the medium and increase humidity. The residue was then inoculated with a suspension of spores of the fungus cultivated in the PDA medium at 28 ºC for 13 days. Then, the fermented coffee residue was dried and ground to be used in experimental diets.
The secondary metabolites present in the dried and fermented coffee residue were identified by use of thin-layer chromatography9. The total phenol content of the fermented and non-fermented coffee residues was estimated by using the Folin-Ciocalteu reagent10. The water/ethanol solution (6:4) was used as a solvent, because it showed greater efficiency in extracting total phenols from residues11. The results were expressed as gallic acid equivalents (GAE).
The biological assay was performed with 30 Apo E knockout mice of both sexes (mean weight of 22 g). The animals received a Purina® standard food preparation and water "
At the end of the experiment, the animals were weighed, after a 12-hour fasting, anesthetized, and euthanized, blood samples being collected for measuring triacylglycerols, total cholesterol and fractions. Blood was withdrawn by use of exsanguination via abdominal aorta section. Serum was obtained through centrifugation at 5,000 rpm for 15 minutes in a table centrifuge (Marconi, M.A. 860 model).
Serum measurements were performed in the multiparametric measuring apparatus (Bioquímica, Alizé®), using BioMérieux® enzyme kits.
The initial region of the aorta was removed and perfused in phosphate buffered saline (PBS), transferred to a 70% ethanol solution and conserved until histopathological analysis. Aortic fragments were processed in a manual rotary microtome (American Optical®) after routine paraffin inclusion, and 5-µm thick consecutive histological sections were obtained. Two histological slides containing, on average, ten sections per animal were obtained. The slides were stained with hematoxylin and eosin (H/E), encoded and submitted to microscopy.
The initial region of the aorta was used for histological analyses of the arterial constituents. All histological sections obtained were examined aiming at locating the referential anatomical structures of the aortic valve and root. According to the presence of those referential structures, the histological section at the aortic valve anatomic level was selected for the measurements. The sections were obtained at 5-µm intervals, the mean explored extension being 20-30 µm. For morphometric analysis, images of the histologic sections of the five groups were captured, and, for standardizing the group samplings, eight images were randomly selected for measurement.
Images were obtained with the Olympus® Bx50 microscope coupled with a Q-Color 3 Olympus® digital camera, the images being captured by using the Q-Capture Pro software, version 6.0.0.412. The aortic lesion areas were measured by using the Image Pro Plus software, version 4.5.0.29.
The SigmaStat software (version 2.03) was used for the descriptive analysis of the results and the comparison tests of the means of the independent groups. The Kolmogorov-Sminorv test was used to assess the distribution of the variables. Considering the sampling per group of animals and that some variables do not have a normal distribution, non-parametric tests were performed for comparing each two independent groups, using the Mann-Whitney test. Variables with normal distribution underwent parametric analysis, followed by the
The major groups of secondary metabolites identified in the non-fermented coffee residues and in the coffee residues fermented by
Saponins, triterpenes/steroids, coumarins, tannins, flavonoids and alkaloids were detected in both coffee residues. However, there was a difference between the chromatographic profiles of the extracts regarding the secondary metabolite groups.
The fermented coffee residue showed a statistically higher content of total phenols than the non-fermented coffee residue.
The results show a significant reduction in the serum levels of triacylglycerols and VLDL-c.
The results show statistically significant differences between the treatment groups (Groups 2, 3 and 4) and the control group (Group 1).
The aortic lesion was identified as a xanthoma in a progressive stage with no evident deposition of cholesterol crystals, according to the classification by Virmani et al.13.
The results suggest that the effect of the fermented coffee residue is inversely related to its dietary concentration. The group receiving 2% of fermented residue showed a 15% reduction in the lesion area.
The present study assesses, for the first time, the effect of coffee residues fermented and non-fermented with
Products fermented with fungi of the
The fermentation process can synthetize or break down compounds that have biological activity. This study evidenced the presence of the same classes of bioactive compounds in fermented and non-fermented coffee residues. However, by use of distinct retention factors, the fermented and non-fermented coffee residues showed different phytochemical compounds in the same classes of secondary metabolites. That difference in compounds might relate to the higher content of polyphenols in the fermented coffee residue.
A difference was observed in the lipid profile of mice receiving non-fermented coffee residue as compared with that of mice receiving only an atherogenic diet (Group 1). Group 2 had a 42% reduction in the serum level of triacylglycerols simultaneously with an approximately 41% reduction in VLDL-c as compared with Group 1, and the differences were statistically significant.
The aorta of the Group 2 animals showed the greatest lesion area as compared with that of Group 1, contrary to that which was expected, because Group 2 had lower levels of triacylglycerols and VLDL-c than those of the control group. Group 3 and Group 4 decreased their lesion areas by 10.5% and 15.4%, respectively, as compared with the control group, and the reductions were statistically significant.
Comparing the groups fed the different residues at the same concentration (Groups 2 and 4), that receiving 2% fermented coffee residue (Group 4) showed a 26.4% decrease in the lesion area as compared with Group 2, showing that fermentation had a beneficial effect, reducing the formation of the atheroma plaque. At the 10% concentration, only the non-fermented residue showed a beneficial effect, reducing the lesion by 14.1% as compared with animals fed a 10% fermented coffee residue (Group 5).
When comparing equal residues, but at different concentrations, the concentrations influenced the formation of atherosclerotic lesions, evidencing that the higher concentration of the non-fermented residue (Group 3) was efficient in reducing the lesion. On the other hand, the lower concentration of the fermented residue (Group 4) had a better protective effect.
The relationship between the consumption of coffee beverages and the development of cardiovascular diseases has been reported in the literature, mainly involving human beings. If, on the one hand, several studies have shown the noxious effect of coffee on diseases18,19, on the other, there is evidence of its beneficial effects20,21. However, no reports have been found about the effect of products fermented with fungi of the
The antioxidant effect is obtained when the bioactive compounds are used at low concentrations, acting as signaling mediators in mechanisms of cell adjustment, proliferation, defense and death. The concentration increase of those compounds can cause cell injuries related to pathological conditions22-24. One possible explanation for our results is that fermentation leads to the formation of specific bioactive compounds, which, at high concentrations (10%), become noxious, but at a 2% concentration decrease those aortic lesions. Regarding the non-fermented residue, the concentration of phenols in the 2% coffee residue might be insufficient to provide a protective effect, but, at the 10% supplementation, the protective effect might be achieved.
The study had limitations, one of them was the small blood volume obtained in this type of animal model, hindering the performance of different analyses.
The results of this study showed that coffee residues reduce the serum levels of triacylglycerols and VLDLc.
Fermentation increased the content of total phenols.
The animals receiving the 2% fermented coffee residue showed the greatest reduction in the aortic lesion area. Those receiving the 10% fermented residue showed no effect on the lesions, evidencing a dose-dependent effect.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study had the technical and financial support of Fapemig and CNPq.
This article is part of the master's thesis of Larissa Froede Brito at the Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.