abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil fbfgj3tcZpBXpyh95ZmgYBR S0066-782X2012000500011 S0066-782X(12)09800511 10.1590/S0066-782X2012005000038 Artigos Originais Efeito da penicilina G a cada três semanas sobre o surgimento de Streptococcus viridans resistentes à penicilina na microflora oral Aguiar André Andrade de Sampaio Roney Orismar Sampaio Jorge Luiz de Mello Spina Guilherme Sobreira Neves Ricardo Simões Moreira Luiz Felipe Pinho Grinberg Max São Paulo São Paulo Universidade de São Paulo Brazil São Paulo SP Instituto do Coração Departamento de Doença Valvular Brasil São Paulo SP Instituto do Coração Departmento de Cirurgia Torácica Brasil São Paulo SP Instituto do Coração Departmento de Odontologia Brasil São Paulo São Paulo Fleury Medicina e Saúde Brazil 05 2012 98 5 452 458 05 07 2011 01 12 2011 18 07 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: Penicilina G benzatina a cada 3 semanas é o protocolo padrão para a profilaxia secundária para febre reumática recorrente. OBJETIVO: Avaliar o efeito da penicilina G benzatina em Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis em pacientes com doença valvular cardíaca, devido à febre reumática com recebimento de profilaxia secundária. MÉTODOS: Estreptococos orais foram avaliados antes (momento basal) e após 7 dias (7º dia) iniciando-se com penicilina G benzatina em 100 pacientes que receberam profilaxia secundária da febre reumática. Amostras de saliva foram avaliadas para verificar a contagem de colônias e presença de S. sanguinis e S. oralis. Amostras de saliva estimulada pela mastigação foram serialmente diluídas e semeadas em placas sobre agar-sangue de ovelhas seletivo e não seletivo a 5% contendo penicilina G. A identificação da espécie foi realizada com testes bioquímicos convencionais. Concentrações inibitórias mínimas foram determinadas com o Etest. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças estatísticas da presença de S. sanguinis comparando-se o momento basal e o 7º dia (p = 0,62). No entanto, o número existente de culturas positivas de S. oralis no 7º dia após a Penicilina G benzatina apresentou um aumento significativo em relação ao valor basal (p = 0,04). Não houve diferença estatística existente entre o momento basal e o 7º dia sobre o número de S. sanguinis ou S. oralis UFC/mL e concentrações inibitórias medianas. CONCLUSÃO: O presente estudo mostrou que a Penicilina G benzatina a cada 3 semanas não alterou a colonização por S. sanguinis, mas aumentou a colonização de S. oralis no 7º dia de administração. Portanto, a susceptibilidade do Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis à penicilina G não foi modificada durante a rotina de profilaxia secundária da febre reumática utilizando a penicilina G. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)

 Penicilina G benzatina febre reumática doença das valvas cardíacas boca estreptococos veridans streptococcus oralis 19 04 2012

Efeito da penicilina G a cada três semanas sobre o surgimento de Streptococcus viridans resistentes à penicilina na microflora oral

André Andrade de AguiarI,II; Roney Orismar SampaioI,II; Jorge Luiz de Mello SampaioIII; Guilherme Sobreira SpinaI,II; Ricardo Simões NevesI,IV; Luiz Felipe Pinho MoreiraI,IV; Max GrinbergI,II

IUniversidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil

IIDepartamento de Doença Valvular – Instituto do Coração (InCor), São Paulo, SP – Brasil

IIIFleury Medicina Diagnóstica, São Paulo, SP – Brasil

IVDepartmento de Odontologia – Instituto do Coração (InCor), São Paulo, SP – Brasil

VDepartmento de Cirurgia Torácica – Instituto do Coração (InCor), São Paulo, SP – Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: Penicilina G benzatina a cada 3 semanas é o protocolo padrão para a profilaxia secundária para febre reumática recorrente.

OBJETIVO: Avaliar o efeito da penicilina G benzatina em Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis em pacientes com doença valvular cardíaca, devido à febre reumática com recebimento de profilaxia secundária.

MÉTODOS: Estreptococos orais foram avaliados antes (momento basal) e após 7 dias (7º dia) iniciando-se com penicilina G benzatina em 100 pacientes que receberam profilaxia secundária da febre reumática. Amostras de saliva foram avaliadas para verificar a contagem de colônias e presença de S. sanguinis e S. oralis. Amostras de saliva estimulada pela mastigação foram serialmente diluídas e semeadas em placas sobre agar-sangue de ovelhas seletivo e não seletivo a 5% contendo penicilina G. A identificação da espécie foi realizada com testes bioquímicos convencionais. Concentrações inibitórias mínimas foram determinadas com o Etest.

RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças estatísticas da presença de S. sanguinis comparando-se o momento basal e o 7º dia (p = 0,62). No entanto, o número existente de culturas positivas de S. oralis no 7º dia após a Penicilina G benzatina apresentou um aumento significativo em relação ao valor basal (p = 0,04). Não houve diferença estatística existente entre o momento basal e o 7º dia sobre o número de S. sanguinis ou S. oralis UFC/mL e concentrações inibitórias medianas.

CONCLUSÃO: O presente estudo mostrou que a Penicilina G benzatina a cada 3 semanas não alterou a colonização por S. sanguinis, mas aumentou a colonização de S. oralis no 7º dia de administração. Portanto, a susceptibilidade do Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis à penicilina G não foi modificada durante a rotina de profilaxia secundária da febre reumática utilizando a penicilina G. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)

Palavras-chave: Penicilina G benzatina/uso terapêutico, febre reumática; doença das valvas cardíacas, boca, estreptococos veridans, streptococcus oralis.

Introdução

A febre reumática (FR) é a principal causa de doença cardíaca valvular nos países em desenvolvimento. A FR causa morbidade e mortalidade significativas, levando a 90% de cirurgias cardíacas em crianças e mais de 30% de cirurgias cardíacas em adultos. A profilaxia secundária com Penicilina G benzatina 1.200.000 U (PGB) a cada 3 semanas é o regime padrão para a prevenção da febre reumática recorrente em países em desenvolvimento. Sequelas valvares são as consequências mais terríveis da febre reumática aguda, e tais lesões cardíacas também podem predispor o paciente à endocardite infecciosa (EI), uma doença mórbida que agrava o prognóstico desses pacientes1-4.

Apesar da profilaxia secundária amplamente recomendada para a FR com PGB a cada 3 semanas2,5,6, poucos estudos avaliaram a susceptibilidade a antibióticos e a frequência de Viridans Streptococci na flora oral de pacientes que receberam profilaxia secundária após FR com PGB. Além disso, nenhum dos estudos avaliou esta questão relacionada a S. sanguinis e S. oralis, que são espécies predominantes recuperadas na EI7,8.

A profilaxia com a PGB protege os pacientes da doença cardíaca valvular de novas recorrências de FR. Contudo, nenhum estudo avaliou a flora oral com uma casuística expressiva e com especificidade suficiente para esses patógenos.

Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se existe uma associação entre a profilaxia com PGB e a colonização da cavidade oral com Viridans Streptococci resistente à penicilina.

Métodos

Coorte

Cem pacientes foram selecionados e avaliados em dois períodos:

Momento basal com PGB e 7º dia — Cem pacientes com FR sob regime de profilaxia secundária com penicilina G benzatina 1.200.000 UI por pelo menos seis meses antes da admissão no estudo. Pacientes com atividade reumática ou pacientes com diagnóstico de infecção foram excluídos.

Todos os pacientes foram avaliados clinicamente, tendo sido submetidos a inspeção da cavidade oral para evitar a admissão de pacientes com infecção sistêmica ou oral aguda.

O presente estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional e todos os pacientes do estudo deram seu consentimento informado.

Coleta de amostras, transporte e cultura

As amostras foram coletadas no início do estudo (100 amostras) e no 7º dia (100 amostras) após uma dose profilática de PGB. Amostras de saliva foram obtidas de pacientes que mascavam pastilhas de parafina9 e foram coletadas em um frasco de plástico descartável esterilizado. Aproximadamente 1 mL foi transferido para um frasco contendo 5,7 mL de meio de viabilidade Göteborg, anaerobicamente preparado e esterilizado (VMGA II S)10.As amostras contidas no meio de transporte foram mantidas de 2ºC a 8ºC antes do plaqueamento. Amostras de saliva foram serialmente diluídas dez vezes em solução tampão fosfato com pH 7,2 antes do plaqueamento em ácido nalidíxico numa base de agar de Columbia além de sangue de ovelha a 5% (CNASB), CNASB mais penicilina G (0,25 µg/mL)11, e anfotericina B (0,5 µg/mL)12-15.Os meios foram incubados a 35ºC a 5% de CO2 por 72 horas e depois analisados para contagem de colônias para cada morfotipo colonial.

Identificação das espécies

Cada morfotipo colonial foi subcultivado em agar de soja tríptica além de sangue de ovelha a 5% (SBA) e testado para catalase e coloração de Gram. Cocos Gram-positivos e negativos para catalase foram posteriormente avaliados para verificação das seguintes características/utilização de substratos: hemólise, arginina, ureia, L-pirrolidonil-β naftilamida e hidrólise da esculina, β-N-acetil-glicosidase, α-D-glicosidase, β-N-acetil-galactosidase, susceptibilidade optoquina, teste Voges-Proskauer e produção de ácido a partir da insulina , manitol, rafinose e melibiose como recomendado16.

Teste de susceptibilidade

A concentração inibitória mínima (CIM) para penicilina G foi determinada utilizando o Etest como recomendado pelo fabricante (AB Biodisk, Solna, Suécia). Os resultados foram interpretados como recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)11.

Análise estatística

O modelo de regressão logística foi utilizado para verificar associação do grupo com a ocorrência de S. sanguinis e S. oralis com correções de idade e sexo.

A análise qualitativa foi realizada com o uso do teste não paramétrico de Mc Nemar.

A análise quantitativa foi realizada com o uso do teste não paramétrico de Wilcoxon.

Aplicou-se uma significância estatística de 5% para todos os testes.

Resultados

O grupo estudado era composto por 100 pacientes, 38 homens, com idades entre 10 e 53 anos (26,5 ± 8 anos).

No grupo, 54 pacientes apresentavam insuficiência mitral, 27 apresentavam insuficiência aórtica, 25 tinham estenose mitral e 14 tinham estenose aórtica. Oito pacientes tinham prótese mitral biológica, 3 tinham prótese biológica aórtica, 2 tinham prótese mecânica mitral e 1 tinha prótese mecânica aórtica.

Não houve diferenças comparando-se o número de culturas positivas para S. sanguinis no momento basal e no 7º dia após a administração de PGB (p = 0,62, Tabela 1). No entanto, o número de culturas positivas para S. oralis no 7º dia após a administração de PGB apresentou um aumento significativo em relação ao valor basal (p = 0,04, Tabela 1).

As avaliações do número de UFC/mL na saliva dos pacientes no momento basal e no 7º dia após a administração de PGB foram subdivididas em S. sanguinis e S. oralis.

Os valores de UFC/mL referentes ao S. sanguinis e S. oralis na saliva não apresentaram diferenças entre o momento basal e o 7º dia após a administração de PGB (p = 0,68 e p = 0,80, respectivamente; Figura 1).

As concentrações inibitórias mínimas para penicilina G foram subdivididas em S. sanguinis e S. oralis. Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre o momento basal e o 7º dia após a administração de PGB sobre a CIM de S. sanguinis e S. oralis (p = NS; Figura 2).

A Tabela 2 mostra dados como CIM50 e CIM90, que representa as concentrações inibitórias mínimas para penicilina G para inibir 50% e 90%, respectivamente, do Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis suscetíveis à penicilina G.

Discussão

Este grupo de pacientes com doença cardíaca valvular está predisposto a endocardite infecciosa. Os resultados de endocardite infecciosa a partir da bacteremia muitas vezes estiveram relacionados com focos orais infecciosos. Viridans streptococci constituem o grupo predominante recuperados na EI, particularmente Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis. O efeito da PGB crônica ainda não foi estudado com a especificidade relacionada a esses patógenos.

O estudo de coorte apresentou prevalência do sexo feminino (62/100), possivelmente devido à maior ocorrência geral de FR em mulheres17. Apesar da heterogeneidade de gênero, isto não representa um viés, pois não se observou diferença estatística (p = NS) entre a ocorrência de S. sanguinis e S. oralis em relação à idade e ao sexo dos pacientes quando foi aplicado o modelo de regressão logística. Além disso, não houve diferença estatística entre a taxa de cáries dentárias, perda de dentes, ou dentes com restaurações entre os sexos na população do estudo18. Todos os pacientes tiveram suas cavidades orais inspecionadas de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde19 para excluir a presença de infecções orais, que poderiam afetar a microbiota oral16,20-22.

S. sanguinis e S. oralis são comensais comuns da cavidade oral presentes na formação inicial de placa bacteriana dentária, o que representa quase 80% de Streptococcus nesta fase20-23. A dose de PGB de 1.200.000 UI IM atua como um bactericida sobre o Streptococcus, sensível na fase de multiplicação ativa, o que, hipoteticamente, poderia causar uma diminuição desses microrganismos na cavidade bucal neste grupo de pacientes.

O S. sanguinis também foi observado em ambos os períodos, em um número limitado de pacientes, de forma semelhante ao observado por Bilavsky e cols.7. Não houve diferença (p = 0,62) de sua presença nos grupos estudados. Isso mostrou que a PGB não interferiu no crescimento das espécies. No entanto, outros estudos relataram um maior número de amostras de S. sanguinis20,21, talvez devido ao uso da metodologia clássica para a identificação de Streptococcus (com o uso de kits de identificação disponíveis comercialmente em conjunto com testes de triagem padrão para o gênero). No entanto, no presente estudo, a metodologia descrita por Ruoff e cols.16 foi adotada, realizando-se testes bioquímicos com a adição de três substratos fluorogênicos, aumentando assim a especificidade na identificação das espécies. Embora tenhamos utilizado a melhor metodologia disponível para a identificação dessas espécies, sabe-se que existem algumas limitações, uma vez que o sequenciamento genético certamente seria o melhor método a ser aplicado. No entanto, isto seria financeiramente inviável devido ao tamanho da amostra, provavelmente levando a nenhuma diferença no resultado do estudo.

No que diz respeito à obtenção das amostras através da saliva estimulada e não da placa dentária, isso se justifica por um conhecimento geral de que a saliva estimulada é um método melhor de coleta devido à sua homogeneidade e logística em comparação com a coleta de amostras a partir da placa dentária24.

Quanto ao S. oralis, observamos um número significativamente maior desses micro-organismos no 7º dia de administração de PGB vs. momento basal (P = 0,04, Tabela 1). A amostra de saliva coletada no 7º dia de administração de PGB ocorreu durante o período de maior quantidade de concentração sérica de fármacos de acordo com Decourt e cols.25. Esta é uma evidência da falta de influência da PGB sobre o microrganismo mais prevalente na placa bacteriana e um dos principais agentes etiológicos da endocardite infecciosa20,21,26.

No presente estudo, não encontramos diferença estatística em relação aos valores de UFC/mL de saliva (Figura 1, P=NS) e CIMs (CIM50 e CIM90) de S. sanguinis e S. oralis (Tabela 2).

O uso crônico de penicilina G benzatina no grupo de estudo não alterou significativamente a susceptibilidade do S. sanguinis e S. oralis à penicilina G, como visto anteriormente7. É interessante notar a ocorrência de um aumento na resistência, ou nos valores de CIM, no Viridans Streptococcus e, portanto, um aumento no número de cepas resistentes a antibióticos isoladas em hemoculturas positivas para EI. No entanto, estes pacientes estavam recebendo terapia com antibióticos por via oral, e os intervalos de CIM diferem daqueles padronizados pelo CLSI para penicilina G7,27,28.

Nossos resultados sobre a identificação de espécies corroboram os resultados de Bilavsky e cols.7. No entanto, discordamos em relação ao aumento da resistência à penicilina G do Viridans Streptococcus.

Este estudo contribuiu para despertar questionamentos sobre o tratamento clínico desses pacientes. Embora a American Heart Association (AHA) não recomende mais a profilaxia com antibióticos antes de procedimentos que causem bacteremia nesses pacientes, acreditamos que estudos adicionais sejam necessários no âmbito da população brasileira a fim de conhecer a nossa realidade, e então adaptá-la às mudanças sugeridas pela AHA. Enquanto aguardamos esses dados, seria prudente da continuidade à implementação das diretrizes da AHA de 1997, em que a profilaxia para endocardite infecciosa é recomendada para pacientes com doença reumática do coração antes dos procedimentos que causam bacteremia no trato geniturinário, trato respiratório e sistema estomatognático.

Nosso estudo também contribui para a interface entre medicina e odontologia, porque mostra que sob a ação prolongada da PGB não há diminuição dos principais microrganismos envolvidos na etiologia da endocardite infecciosa e, portanto, a profilaxia com antibióticos antes de procedimentos que causam bacteremia pode ser necessária.

Assim, estudos adicionais são necessários para verificar a necessidade de se estabelecer uma rotina especial para que esses pacientes possam passar por procedimentos odontológicos que poderiam causar bacteremia no 7º dia após a administração de PGB.

Este estudo mostrou que a administração de PGB a cada 3 semanas não alterou a colonização por S. sanguinis; mas a PGB aumentou a colonização de S. oralis no 7º dia seguinte ao da sua administração e, finalmente, a susceptibilidade do Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis à penicilina G não foi alterada durante o ciclo da penicilina G.

Agradecimentos

O grupo gostaria de agradecer o Dr. Luiz Antônio Machado César por sua contribuição em relação à coleta de dados. O grupo também deseja agradecer ao Dr. Walter Niccoli Filho pela sua ajuda na preparação deste manuscrito.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESP e CNPq e parcialmente financiado pelo Instituto Fleury.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de André Andrade de Aguiar pela Faculdade de Medicina da USP.

Correspondência:

André Andrade de Aguiar

Rua Botucatu, 572 - conjunto 31 - Vila Clementino

04023-061 - São Paulo, SP – Brasil

E-mail:

drandreaguiar@yahoo.com.br

Artigo recebido em 05/07/11

revisado recebido em 18/07/11

aceito em 01/12/11

1. Ayoub EM, Kotb M, Cunningham MW. Rheumatic fever pathogenesis. In: Stevens DL, Kaplan EL. (eds.). Streptococcal infections: clinical aspects, microbiology and molecular pathogenesis. New York: Oxford Universe Press; 2000. p. 102-31. Streptococcal infections: clinical aspects, microbiology and molecular pathogenesis 2000 102 31 Ayoub EM Kotb M Cunningham MW Stevens DL Kaplan EL 2. Dajani AS, Bisno AL, Chung KJ, Durack DT, Gerber MA, Kaplan EL, et al. Prevention of rheumatic fever: a statement for health professionals by the Committee on Rheumatic Fever, Endocarditis and Kawasaki Disease of the Council on Cardiovascular Disease in the young, the American Heart Association. Pediatr Infect Dis J. 1989;8(5):263-6. Prevention of rheumatic fever: a statement for health professionals by the Committee on Rheumatic Fever, Endocarditis and Kawasaki Disease of the Council on Cardiovascular Disease in the young, the American Heart Association Pediatr Infect Dis J 1989 263 6 5 8 Dajani AS Bisno AL Chung KJ Durack DT Gerber MA Kaplan EL 3. Sampaio RO, Fae KC, Demarchi LM, Pomerantzeff PM, Aiello VD, Spina GS, et al. Rheumatic heart disease: 15 years of clinical and immunological follow-up. Vasc Health Risk Manag. 2007;3(6):1007-17. Rheumatic heart disease: 15 years of clinical and immunological follow-up Vasc Health Risk Manag 2007 1007 17 6 3 Sampaio RO Fae KC Demarchi LM Pomerantzeff PM Aiello VD Spina GS 4. Snitcowsky R. Rheumatic fever prevention in industrializing countries: problems and approaches. Pediatrics. 1996;97(6 Pt 2):996-8. Rheumatic fever prevention in industrializing countries: problems and approaches Pediatrics 1996 996 8 6 Pt 2 97 Snitcowsky R 5. Currie BJ. Are the currently recommended doses of benzathine penicillin G adequate for secondary prophylaxis of rheumatic fever? Pediatrics. 1996;97(6 Pt 2):989-91. Are the currently recommended doses of benzathine penicillin G adequate for secondary prophylaxis of rheumatic fever Pediatrics 1996 989 91 6 Pt 2 97 Currie BJ 6. Kassem AS, Zaher SR, Abou Shleib H, el-Kholy AG, Madkour AA, Kaplan EL. Rheumatic fever prophylaxis using benzathine penicillin G (BPG): two- week versus four-week regimens: comparison of two brands of BPG. Pediatrics. 1996;97(6 Pt 2):992-5. Rheumatic fever prophylaxis using benzathine penicillin G (BPG): two- week versus four-week regimens: comparison of two brands of BPG Pediatrics 1996 992 5 6 Pt 2 97 Kassem AS Zaher SR Abou Shleib H el-Kholy AG Madkour AA Kaplan EL 7. Bilavsky E, Eliahou R, Keller N, Yarden-Bilavsky H, Harel L, Amir J. Effect of benzathine penicillin treatment on antibiotic susceptibility of viridans streptococci in oral flora of patients receiving secondary prophylaxis after rheumatic fever. J Infect. 2008;56(4):244-8. Effect of benzathine penicillin treatment on antibiotic susceptibility of viridans streptococci in oral flora of patients receiving secondary prophylaxis after rheumatic fever J Infect 2008 244 8 4 56 Bilavsky E Eliahou R Keller N Yarden-Bilavsky H Harel L Amir J 8. Darhous MS, Dahab OM, el Atar E, el Ghafary E. Dental, oral and bacteriological aspects in patients at risk of subacute bacterial endocarditis. Egypt Dent J. 1993;39(4):533-9. Dental, oral and bacteriological aspects in patients at risk of subacute bacterial endocarditis Egypt Dent J 1993 533 9 4 39 Darhous MS Dahab OM el Atar E el Ghafary E 9. Jensen JL, Karatsaidis A, Brodin P. Salivary secretion: stimulatory effects of chewing-gum versus paraffin tablets. Eur J Oral Sci. 1998;106(4):892-6. Salivary secretion: stimulatory effects of chewing-gum versus paraffin tablets Eur J Oral Sci 1998 892 6 4 106 Jensen JL Karatsaidis A Brodin P 10. Dahlen G, Pipattanagovit P, Rosling B, Moller AJ. A comparison of two transport media for saliva and subgingival samples. Oral Microbiol Immunol. 1993;8(6):375-82. A comparison of two transport media for saliva and subgingival samples Oral Microbiol Immunol 1993 375 82 6 8 Dahlen G Pipattanagovit P Rosling B Moller AJ 11. Wayne PA. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement. M100-S18. Clinical and Laboratory Standards Institute. MO2-A10. 2009;29(1):1-53. CLSI: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement. M100-S18. Clinical and Laboratory Standards Institute MO2-A10 2009 1 53 1 29 Wayne PA 12. Gold OG, Jordan HV, Van Houte J. A selective medium for Streptococcus mutans. Arch Oral Biol. 1973;18(11):1357-64. A selective medium for Streptococcus mutans Arch Oral Biol 1973 1357 64 11 18 Gold OG Jordan HV Van Houte J 13. Murray PR. Manual of clinical microbiology. Washington (DC):ASM Press; 2003. Manual of clinical microbiology 2003 Murray PR 14. Pezzlo M. Aerobic bacteriology. In: Isenberg HD. (ed.). Clinical microbiology procedures handbook. Washington, (DC): American Society for Microbiology Press; 1992. p. 1.20.5-1.20.6. Clinical microbiology procedures handbook 1992 1.20.5 1.20.6 Pezzlo M. Isenberg HD 15. Sanchez-Perez L, Acosta-Gio AE. Caries risk assessment from dental plaque and salivary Streptococcus mutans counts on two culture media. Arch Oral Biol. 2001;46(1):49-55. Caries risk assessment from dental plaque and salivary Streptococcus mutans counts on two culture media Arch Oral Biol 2001 49 55 1 46 Sanchez-Perez L Acosta-Gio AE 16. Ruoff KL, Whiley RA, Beighton D. Streptococcus. In: Murray PR. (ed.). Manual of clinical microbiology. Washington (DC): ASM Press; 2003. p. 405-21. Manual of clinical microbiology 2003 405 21 Ruoff KL Whiley RA Beighton D Murray PR 17. Neves RS, Neves IL, Giorgi DM, Grupi CJ, César LA, Hueb WA, et al. Efeitos do uso da adrenalina na anestesia local odontológica em portador de coronariopatia. Arq Bras Cardiol. 2007;88(5):545-51. Efeitos do uso da adrenalina na anestesia local odontológica em portador de coronariopatia Arq Bras Cardiol 2007 545 51 5 88 Neves RS Neves IL Giorgi DM Grupi CJ César LA Hueb WA 18. Ministério da Saúde. Datasus. Levantamento epidemiológico em saúde bucal: Brasilia;1996. Datasus 1996 19. WHO. Oral health surveys. Basic methods. Geneva, 1977. Basic methods 1977 20. de Almeida PF, Franca MP, Santos SP, Moreira RS, Tunes UR. Microbiota estreptocócica associada com a formação inicial da placa dental. R Ci Med Biol. 2002;1(1):33-41. Microbiota estreptocócica associada com a formação inicial da placa dental R Ci Med Biol 2002 33 41 1 1 de Almeida PF Franca MP Santos SP Moreira RS Tunes UR 21. Frandsen EV, Pedrazzoli V, Kilian M. Ecology of viridans streptococci in the oral cavity and pharynx. Oral Microbiol Immunol. 1991;6(3):129-33. Ecology of viridans streptococci in the oral cavity and pharynx Oral Microbiol Immunol 1991 129 33 3 6 Frandsen EV Pedrazzoli V Kilian M 22. Herzberg MC. Oral Streptococci in health and disease. In: Stevens DL, Kaplan EL. (eds.). Streptococcal infections: clinical aspects, microbiology and molecular pathogenesis. New York: Oxford Universe Press; 2000. p. 333-70. Streptococcal infections: clinical aspects, microbiology and molecular pathogenesis 2000 333 70 Herzberg MC Stevens DL Kaplan EL 23. Ito HO. Infective endocarditis and dental procedures: evidence, pathogenesis, and prevention. J Med Invest. 2006;53(3-4):189-98. Infective endocarditis and dental procedures: evidence, pathogenesis, and prevention J Med Invest 2006 189 98 3-4 53 Ito HO 24. Motisuki C, Lima LM, Spolidorio DM, Santos-Pinto L. Influence of sample type and collection method on Streptococcus mutans and Lactobacillus spp. counts in the oral cavity. Arch Oral Biol. 2005;50(3):341-5. Influence of sample type and collection method on Streptococcus mutans and Lactobacillus spp: counts in the oral cavity Arch Oral Biol 2005 341 5 3 50 Motisuki C Lima LM Spolidorio DM Santos-Pinto L 25. Decourt LV, Santos SR, Snitcowsky R, Pileggi F, Tsuzuki H, de Araujo Abreu AM, et al. [Serum levels of benzathine penicillin G after intramuscular administration]. Arq Bras Cardiol. 1983;40(1):3-8. Arq Bras Cardiol 1983 3 8 1 40 Decourt LV Santos SR Snitcowsky R Pileggi F Tsuzuki H 26. Jeon EH, Han JH, Ahn TY. Comparison of bacterial composition between human saliva and dental unit water system. J Microbiol. 2007;45(1):1-5. Comparison of bacterial composition between human saliva and dental unit water system J Microbiol 2007 1 5 1 45 Jeon EH Han JH Ahn TY 27. Erickson PR, Herzberg MC. Emergence of antibiotic resistant Streptococcus sanguis in dental plaque of children after frequent antibiotic therapy. Pediatr Dent. 1999;21(3):181-5. Emergence of antibiotic resistant Streptococcus sanguis in dental plaque of children after frequent antibiotic therapy Pediatr Dent 1999 181 5 3 21 Erickson PR Herzberg MC 28. Hall GE, Baddour LM. Apparent failure of endocarditis prophylaxis caused by penicillin-resistant Streptococcus mitis. Am J Med Sci. 2002;324(1):51-3. Apparent failure of endocarditis prophylaxis caused by penicillin-resistant Streptococcus mitis Am J Med Sci 2002 51 3 1 324 Hall GE Baddour LM Original Articles Effect of penicillin G every three weeks on oral microflora by penicillin resistant Viridans Streptococci

BACKGROUND: Benzathine penicillin G every 3 weeks is the standard protocol for secondary prophylaxis for recurrent rheumatic fever. OBJECTIVE: Assess the effect of Benzathine penicillin G on Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis in patients with cardiac valvular disease due to rheumatic fever receiving secondary prophylaxis. METHODS: Oral streptococci were evaluated before (baseline) and after 7 days (day 7) with Benzathine penicillin G in 100 patients receiving routine secondary rheumatic fever prophylaxis. Saliva samples were evaluated for colony count and presence of S. sanguinis and S. oralis. Chewing-stimulated saliva samples were serially diluted and plated onto both nonselective and selective 5% sheep blood agar containing penicillin G. The species were identified using conventional biochemical tests. Minimal inhibitory concentrations were determined with the Etest. RESULTS: No statistical differences were found in the presence of S. sanguinis comparing baseline and day 7 (p = 0.62). However, the existing number of positive cultures of S. oralis on day 7 after Benzathine penicillin G presented a significant increase compared to baseline (p = 0.04). No statistical difference was found between baseline and day 7 concerning the number of S. sanguinis or S. oralis CFU/mL and median minimal inhibitory concentrations. CONCLUSION: This study showed that Benzathine penicillin G every 3 weeks did not change the colonization by S. sanguinis, but increased colonization of S. oralis on day 7 of administration. Therefore, susceptibility of Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis to penicillin G was not modified during the penicillin G routine secondary rheumatic fever prophylaxis. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)

 Penicilin G benzathine rheumatic fever heart valve diseases mouth verdidans streptococci streptococcus oralis

Effect of penicillin G every three weeks on oral microflora by penicillin resistant Viridans Streptococci

André Andrade de AguiarI,II; Roney Orismar SampaioI,II; Jorge Luiz de Mello SampaioIII; Guilherme Sobreira SpinaI,II; Ricardo Simões NevesI,IV; Luiz Felipe Pinho MoreiraI,V; Max GrinbergI,II

IUniversidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil

IIDepartamento de Doença Valvular – Instituto do Coração (InCor), São Paulo, SP – Brazil

IIIFleury Medicina Diagnóstica, São Paulo, SP – Brazil

IVDepartmento de Odontologia – Instituto do Coração (InCor), São Paulo, SP – Brazil

VDepartmento de Cirurgia Torácica – Instituto do Coração (InCor), São Paulo, SP – Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Benzathine penicillin G every 3 weeks is the standard protocol for secondary prophylaxis for recurrent rheumatic fever.

OBJECTIVE: Assess the effect of Benzathine penicillin G on Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis in patients with cardiac valvular disease due to rheumatic fever receiving secondary prophylaxis.

METHODS: Oral streptococci were evaluated before (baseline) and after 7 days (day 7) with Benzathine penicillin G in 100 patients receiving routine secondary rheumatic fever prophylaxis. Saliva samples were evaluated for colony count and presence of S. sanguinis and S. oralis. Chewing-stimulated saliva samples were serially diluted and plated onto both nonselective and selective 5% sheep blood agar containing penicillin G. The species were identified using conventional biochemical tests. Minimal inhibitory concentrations were determined with the Etest.

RESULTS: No statistical differences were found in the presence of S. sanguinis comparing baseline and day 7 (p = 0.62). However, the existing number of positive cultures of S. oralis on day 7 after Benzathine penicillin G presented a significant increase compared to baseline (p = 0.04). No statistical difference was found between baseline and day 7 concerning the number of S. sanguinis or S. oralis CFU/mL and median minimal inhibitory concentrations.

CONCLUSION: This study showed that Benzathine penicillin G every 3 weeks did not change the colonization by S. sanguinis, but increased colonization of S. oralis on day 7 of administration. Therefore, susceptibility of Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis to penicillin G was not modified during the penicillin G routine secondary rheumatic fever prophylaxis. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)

Keywords: Penicilin G benzathine/therapeutic use; rheumatic fever; heart valve diseases; mouth; verdidans streptococci; streptococcus oralis.

Introduction

Rheumatic fever (RF) is the leading cause of valvular heart disease in developing countries. RF causes significant morbidity and mortality, causing 90% of cardiac surgeries in children and over 30% of cardiac surgeries in adults. Secondary prophylaxis of 1,200,000 U benzathine penicillin G (BPG) every 3 weeks is the standard regimen for the prevention of recurrent rheumatic fever in developing countries. Valvular sequelae is the most dreadful consequence of acute rheumatic fever, and such cardiac lesions can also predispose a patient to infective endocarditis (IE), a morbid disease that worsens the prognosis of these patients1-4.

In spite of the widely recommended secondary prophylaxis of RF with BPG every 3 weeks2,5,6, very few studies have assessed the antibiotic susceptibility and frequency of Viridans Streptococci in the oral flora of patients receiving secondary prophylaxis after RF with BPG. Also, none of the studies have assessed this issue related to S. sanguinis and S. oralis, which are predominant species recovered in IE7,8.

BPG prophylaxis protects valvular heart disease patients of new RF recurrences. However, no study has evaluated the oral flora with an expressive casuistic and specificity for these pathogens.

Therefore, the aim of this study is to evaluate if there is an association between BPG prophylaxis and the colonization of oral cavity by penicillin resistant Viridans Streptococci.

Methods

Cohort

A hundred patients were selected and evaluated in 2 periods:

BPG baseline and day 7 – One hundred RF patients previously receiving a secondary prophylaxis regimen with benzathine penicillin G 1,200,000 IU for at least 6 months before study admission. Patients with rheumatic activity or patients with diagnosis of infection were excluded.

All patients were assessed clinically, and they underwent oral cavity inspection to avoid admission of patients with acute systemic or oral infection.

This study was approved by the institutional ethics committee, and all study patients gave informed consent.

Sample collection, transport, and culture

Samples were collected at baseline (100 samples) and day 7 (100 samples) after BPG prophylactic dosage. Saliva samples were obtained from patients who chewed paraffin tablets9 and were collected into a sterile disposable plastic vial. Approximately 1 mL was transferred to a vial containing 5.7 mL of Göteborg viability medium, anaerobically prepared and sterilized (VMGA II S)10. Samples in transport medium were maintained at 2ºC to 8ºC before plating. Saliva samples were serially diluted tenfold in phosphate-buffered solution pH 7.2 before plating onto Columbia nalidixic agar plus 5% sheep blood (CNASB), CNASB plus penicillin G (0.25 µg/mL)11, and amphotericin B (0.5 µg/mL)12-15. Media were incubated at 35ºC in 5% CO2 for 72 h and then analyzed for colony count for each colonial morphotypes.

Species identification

Each colony morphotype was subcultivated onto tryptic soy agar plus 5% sheep blood (SBA) and tested for catalase and Gram stain. Catalase negative Gram-positive cocci were subsequently evaluated for the following characteristics/substrate utilization: hemolysis, arginine, urea, L-pyrrolidonyl-β-naphthylamide and esculin hydrolysis, β-N-acetyl glycosidase, α-D-glycosidase, β-N-acetyl galactosidase, optochin susceptibility, Voges-Proskauer test, and acid production from inulin, mannitol, raffinose, and melibiose, as recommended16.

Susceptibility testing

Minimal inhibitory concentration (MIC) for penicillin G was determined using the Etest as recommended by the manufacturer (AB Biodisk, Solna, Sweden). Results were interpreted as recommended by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)11.

Statistical analysis

The Logistic Regression model was used to check the group’s association with the occurrence of S. sanguinis and S. oralis with age and sex corrections.

The qualitative analysis was performed using the Mc Nemar nonparametric test.

Quantitative analysis was performed with the use do the Wilcoxon nonparametric test.

Statistical significance of 5% was applied for all tests.

Results

The group studied was composed of 100 patients, 38 males, aged 10 to 53 years old (26.5 ± 8 years).

In the group, 54 patients had mitral regurgitation, 27 had aortic regurgitation, 25 had mitral stenosis, and 14 had aortic stenosis. Eight patients had biological mitral prosthesis, 3 had biological aortic prosthesis, 2 had mechanical mitral prosthesis, and 1 had mechanical aortic prosthesis.

There were no differences comparing the number of positive cultures existed for S. sanguinis at baseline and day 7 after BPG (p = 0.62, Table 1). However, the existing number of positive cultures for S. oralis at day 7 after BPG presented a significant increase compared to baseline (p = 0.04, Table 1).

The assessments of the CFU/mL number in saliva of the patients at baseline and day 7 after BPG were subdivided into S. sanguinis and S. oralis.

The CFU/mL values in saliva for S. sanguinis and S. oralis did not differ between baseline and day 7 after BPG (p = 0.68 and p = 0.80 respectively; Figure 1).

The minimal inhibitory concentrations for penicillin G values were subdivided into S. sanguinis and S. oralis. No statistical difference was found between baseline and day 7 after BPG concerning the MIC of S. sanguinis and S. oralis (p = NS; Figure 2).

Table 2 shows data as MIC50 and MIC90, which represents the minimal inhibitory concentrations for penicillin G to inhibit 50% and 90%, respectively, of the susceptible Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis to penicillin G.

Discussion

This group of patients with valvular heart disease is predisposed to infective endocarditis. Infective endocarditis results from bacteremia, often related to oral infectious focuses. Viridans streptococci are the predominant group recovered in IE, particularly Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis. The effect of chronic BPG has not been studied with specificity to these pathogens yet.22,23

The study cohort had a prevalence of females (62/100), possibly due to the higher general occurrence of RF in women17. Despite the gender heterogeneity, it did not represent a bias because no statistical difference existed (p = NS) between the occurrence of S. sanguinis an S.oralis in relation to the patients age and sex when we applied the logistic regression model. Furthermore, no statistical difference existed among the rate of tooth cavities, loss of teeth, or teeth with fillings between sexes in the study population18. All patients had their oral cavities inspected according to the criteria of the World Health Organization19 to exclude the presence of oral infections, which could affect the oral microbiota16,20-22.

S. sanguinis and S. oralis are common commensals of the oral cavity present in the initial formation of dental bacterial plaque, representing nearly 80% Streptococcus in this phase20-23. The BPG 1,200,000 IU IM dose exercises as a bactericide effect on the Streptococcus, sensitive in the active multiplication phase, which, hypothetically, would cause a decrease in these microorganisms in the oral cavity in this group of patients.

S. sanguinis was also observed in both periods in a limited number of patients, similarly to that observed by Bilavsky et al7. No difference (P=0.62) of its presence was noticed in the study groups. This showed that BPG did not interfere with the species growth. However, other studies reported a greater number of samples of S. sanguinis20,21, perhaps due to the use of classic methodology for Streptococcus identification (with the use of commercially available identification kits in conjunction with standard screening tests for the genre). Nevertheless, in this study the methodology described by Ruoff et al16 was adopted, performing biochemical tests with the addition of 3 fluorogenic substrates, increasing the specificity in the identification of the species. Although we have used the best methodology available for the identification of these species, it is known that there are some limitations, since genetic sequencing would certainly be the best method to be applied. However, this would be financially impractical due to the sample size, probably leading to no difference in the result of the study.

In regard to obtaining the samples through stimulated saliva and not from the dental plaque, this was due to an overall knowledge that stimulated saliva is a better collection method for its homogeneity and logistics compared to the collection of dental plaque samples24.

As for the S. oralis, we noticed a significantly higher number of these microorganisms in the BPG-day 7 vs. baseline (p = 0.04, Table 1). The saliva sample collected from BPG- day 7 occurred during the time of the greatest amount of serum drug concentration according to Decourt et al25. This is evidence of the lack of BPG influence on the most prevalent microorganism in the bacterial plaque and one of the main Infectious Endocarditis etiological agents20,21,26.

In this study, we found no statistical difference concerning saliva UFC/mL numbers (Figure 1, p = NS) and MICs (MIC50 and MIC90) of S. sanguinis and S. oralis (Table 2).

The chronic use of benzathine penicillin G in the study group did not significantly alter S. sanguinis and S. oralis susceptibility to penicillin G, as seen previously7. It is interesting to note the occurrence of an increase in the resistance, or MIC values, in Viridans Streptococcus and, therefore, an increase in the number of strains resistant to antibiotics isolated into positive hemocultures for IE. However, these patients were receiving oral antibiotic therapy, and MIC intervals differ from those standardized by CLSI for penicillin G7,27,28.

Our findings regarding the identification of species corroborate the results of Bilavsky et al7. However, we disagree with the increased resistance to penicillin G of Viridans Streptococcus.

This study contributed to awake a inquiry regarding the clinical treatment of these patients. Although the American Heart Association (AHA) no longer recommends antibiotic prophylaxis prior to procedures that cause bacteremia in these patients, we believe that further studies are required aimed at the Brazilian population to know our reality, and then adapt it to changes suggested by the AHA. While we are awaiting these data, it would be prudent to continue to implement the recommendations of the 1997 AHA guidelines, in which prophylaxis for infective endocarditis is recommended for patients with rheumatic heart disease prior to procedures that cause bacteremia in the genitourinary tract, respiratory tract and the stomatognathic system.

Our study also contributes to the interface between medicine and dentistry, because it shows that under the prolonged action of PGB, there is no decrease of the main microorganisms involved in the etiology of infective endocarditis and, therefore, antibiotic prophylaxis prior to procedures that cause bacteremia may be necessary.

Hence, additional studies are necessary to verify the need to establish a special routine so that these patients can undergo dental procedures that could cause bacteremia on the 7th day following the administration of BPG.

This study showed that BPG every 3 weeks did not change the colonization by S. sanguinis; but BPG increased S. oralis colonization on day 7 following its administration and, finally, susceptibility of Streptococcus sanguinis and Streptococcus oralis to penicillin G was not altered during the penicillin G cycle.

Acknowledgments

The group wishes to thank Dr. Luiz Antônio Machado César for his contribution regarding data collection. The group also wishes to thank Dr. Walter Niccoli Filho for his assistance in the preparation of this manuscript.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESO and CNPq and partially funded by Instituto Fleury.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by André Andrade de Aguiar, from Faculdade de Medicina da USP.

References