abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil qR9PtcbRLSDb4pcQCQS39Kb S0066-782X2012000500008 S0066-782X(12)09800508 10.1590/S0066-782X2012005000036 Artigos Originais Morfologia e contratilidade em cardiomiócitos de ratos com baixo desempenho para o exercício físico Quintão Júnior Judson Fonseca Natali Antônio José Carneiro Júnior Miguel Araújo Castro Cynthia Aparecida de Drummond Lucas Rios Lavorato Victor Neiva Felix Leonardo Bonato Cruz Jader dos Santos Prímola-Gomes Thales Nicolau Viçosa Minas Gerais Universidade Federal de Viçosa Brazil Vitório Espírito Santo Universidade Federal do Espírito Santo Brazil Belo Horizonte Minas Gerais Universidade Federal de Minas Gerais Brazil 05 2012 98 5 431 436 01 11 2011 24 01 2012 03 11 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A capacidade aeróbica é fundamental para o desempenho físico, e a baixa capacidade aeróbica está relacionada ao desencadeamento de diversas doenças cardiovasculares. OBJETIVO: Comparar a contratilidade e a morfologia de cardiomiócitos isolados de ratos com baixo desempenho e desempenho padrão para o exercício físico. MÉTODOS: Ratos Wistar, com 10 semanas de idade, foram submetidos a um protocolo de corrida em esteira até a fadiga, e foram divididos em dois grupos: Baixo Desempenho (BD) e Desempenho Padrão (DP). Em seguida, após eutanásia, o coração foi removido rapidamente e, por meio de dissociação enzimática, os cardiomiócitos do ventrículo esquerdo foram isolados. O comprimento celular e dos sarcômeros e a largura dos cardiomiócitos foram medidos usando-se um sistema de detecção de bordas. Os cardiomiócitos isolados foram estimulados eletricamente a 1 e 3 Hz e a contração celular foi medida registrando-se a alteração do seu comprimento. RESULTADOS: O comprimento celular foi menor no grupo BD (157,2 ± 1,3µm; p < 0,05) em relação ao DP (161,4 ± 1,3 µm), sendo o mesmo resultado observado para o volume dos cardiomiócitos (BD, 25,5 ± 0,4 vs. DP, 26,8 ± 0,4 pL; p < 0,05). Os tempos para o pico de contração (BD, 116 ± 1 vs. DP, 111 ± 2ms) e para o relaxamento total (BD, 143 ± 3 vs. DP, 232 ± 3 ms) foram maiores no grupo BD. CONCLUSÃO: Conclui-se que os miócitos do ventrículo esquerdo dos animais de baixo desempenho para o exercício físico apresentam menores dimensões que os dos animais de desempenho padrão, além de apresentarem perdas na capacidade contrátil.

 Miócitos cardíacos ratos exercício fadiga contração miocárdica condicionamento físico animal 12 04 2012

Morfologia e contratilidade em cardiomiócitos de ratos com baixo desempenho para o exercício físico

Judson Fonseca Quintão JúniorI; Antônio José NataliI; Miguel Araújo Carneiro JúniorIII; Cynthia Aparecida de CastroI; Lucas Rios DrummondI; Victor Neiva LavoratoI; Leonardo Bonato FelixI; Jader dos Santos CruzII; Thales Nicolau Prímola-GomesI

IUniversidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG

IIIUniversidade Federal do Espírito Santo, Vitório, ES, Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A capacidade aeróbica é fundamental para o desempenho físico, e a baixa capacidade aeróbica está relacionada ao desencadeamento de diversas doenças cardiovasculares.

OBJETIVO: Comparar a contratilidade e a morfologia de cardiomiócitos isolados de ratos com baixo desempenho e desempenho padrão para o exercício físico.

MÉTODOS: Ratos Wistar, com 10 semanas de idade, foram submetidos a um protocolo de corrida em esteira até a fadiga, e foram divididos em dois grupos: Baixo Desempenho (BD) e Desempenho Padrão (DP). Em seguida, após eutanásia, o coração foi removido rapidamente e, por meio de dissociação enzimática, os cardiomiócitos do ventrículo esquerdo foram isolados. O comprimento celular e dos sarcômeros e a largura dos cardiomiócitos foram medidos usando-se um sistema de detecção de bordas. Os cardiomiócitos isolados foram estimulados eletricamente a 1 e 3 Hz e a contração celular foi medida registrando-se a alteração do seu comprimento.

RESULTADOS: O comprimento celular foi menor no grupo BD (157,2 ± 1,3µm; p < 0,05) em relação ao DP (161,4 ± 1,3 µm), sendo o mesmo resultado observado para o volume dos cardiomiócitos (BD, 25,5 ± 0,4 vs. DP, 26,8 ± 0,4 pL; p < 0,05). Os tempos para o pico de contração (BD, 116 ± 1 vs. DP, 111 ± 2ms) e para o relaxamento total (BD, 143 ± 3 vs. DP, 232 ± 3 ms) foram maiores no grupo BD.

CONCLUSÃO: Conclui-se que os miócitos do ventrículo esquerdo dos animais de baixo desempenho para o exercício físico apresentam menores dimensões que os dos animais de desempenho padrão, além de apresentarem perdas na capacidade contrátil.

Palavras-chave: Miócitos cardíacos, ratos, exercício, fadiga, contração miocárdica, condicionamento físico animal.

Introdução

A capacidade aeróbica é fundamental não só para o desempenho físico, mas também está relacionada ao desencadeamento de diversas doenças. Uma baixa capacidade aeróbica está associada à incidência de doenças cardiovasculares e maior mortalidade1,2.

A capacidade aeróbica é uma variável complexa que está sob a influência de fatores genéticos e ambientais3. Os fatores genéticos podem representar de 70% a 90% nas variações observadas na capacidade aeróbica4. O termo capacidade aeróbica intrínseca tem sido utilizado para se referir ao conjunto de genes que determinarão as variações na capacidade aeróbica quando não houver treinamento físico prévio (estado não treinado)5-8. O principal fator determinante da capacidade aeróbica intrínseca é a capacidade do coração de manter um fluxo sanguíneo adequado aos tecidos corporais. Trabalhos prévios demonstraram que ratos com Alta Capacidade Aeróbica Intrínseca (ACAI) apresentaram ganhos na função cardíaca4, maior consumo máximo de oxigênio (VO2máx)3 e, em nível celular, apresentaram parâmetros morfológicos e contráteis maiores em relação a ratos com Baixa Capacidade Aeróbica Intrínseca (BCAI)9. Esses resultados evidenciaram a importância da atividade contrátil cardíaca na determinação da capacidade aeróbica intrínseca.

No nível celular, a capacidade contrátil do cardiomiócito está diretamente associada à homeostasia do Ca2+. O Ca2+ está envolvido no processo de acoplamento excitação-contração, tanto no momento da excitabilidade dos cardiomiócitos quanto na ativação final dos filamentos contrateis causando a contração10,11. Resultados anteriores de nosso grupo de estudo mostraram que cardiomiócitos isolados de ratos com alto desempenho para o exercício físico (AD) apresentaram ganhos na função contrátil (sistólica e diastólica), além de um maior transiente intracelular global de Ca2+ (transiente de [Ca2+]i) em relação a ratos com desempenho padrão (DP)12.

Estudos sobre a morfologia e a função contrátil de cardiomiócitos de animais com baixo desempenho e desempenho padrão são escassos. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi comparar parâmetros contráteis e morfológicos de cardiomiócitos isolados de ratos BD (baixo desempenho para o exercício físico) e DP (desempenho padrão para o exercício físico). De acordo com nossa hipótese, os cardiomiócitos dos animais BD apresentam perdas na morfologia e na capacidade contrátil.

Métodos

Animais

Para realização dos experimentos foram utilizados ratos Wistar machos (rattus novergicus), com 10 semanas de idade, pesando 224 ± 5 g no início do período experimental, provenientes do biotério central da Universidade Federal de Viçosa (MG). Os animais foram mantidos em caixas de polietileno, com no máximo 5 ratos por caixa, em uma sala a 23 ºC, com ração comercial e água ad libitum e um ciclo de 12-12 h claro/escuro (6h00 – 18h00). Foram seguidas as normas estabelecidas no Guide for the Careand Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996) e respeitados os princípios éticos na experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais – Cetea/UFMG (protocolo nº 015/08).

Protocolo de exercício

Os animais foram submetidos a um protocolo baseado no tempo total de exercício até a fadiga (TTF)12. Uma semana antes dos testes os animais passaram por um período de adaptação à esteira (Insight Instrumentos – Ribeirão Preto, SP, Brasil), durante cinco dias consecutivos (5 min/dia; 5% de inclinação) e com aumentos diários da velocidade da esteira (10, 10, 11, 13, 15 m/min). Após a semana de adaptação, cada animal realizou, em três dias alternados, três testes de exercício progressivo até a fadiga (velocidade inicial de 10 m/min; 5% de inclinação). Durante os testes, a velocidade da esteira foi aumentada em 1 m/min a cada 3 min. O teste foi interrompido quando o animal entrou em fadiga. O momento da fadiga foi definido quando o rato não conseguia manter a corrida de acordo com a velocidade da esteira12,13.

Estratégia de seleção

A estratégia de seleção utilizada no presente estudo foi baseada no TTF para cada rato12. Dados anteriores de nosso laboratório mostraram que por meio dessa estratégia de seleção três grupos podem ser determinados: Baixo Desempenho (BD), Desempenho Padrão (DP) e Alto Desempenho (AD). Baseados nesses dados os animais foram divididos em dois grupos: grupo BD (n = 10) e grupo DP (n = 10).

De acordo com o critério metodológico adotado, o grupo BD foi constituído pelos animais com TTF abaixo de 16,63 min, ou seja, um TTF que fosse menor que pelo menos um desvio padrão da média da população. Por sua vez, os animais com TTF entre 16,33 e 46,57 min foram incluídos no grupo DP, ou seja, que tivesse um TTF que não fosse maior e nem menor que um desvio padrão da média da população12.

Massa corporal, eutanásia, massa do coração e ventricular, isolamento dos cardiomiócitos

A massa corporal do animal foi medida imediatamente antes da eutanásia por meio de uma balança eletrônica (Marte – Brasil). O coração foi removido, lavado em solução contendo 750 µM de CaCl2 para retirar o excesso de sangue, e pesado em balança de precisão (Gehaka – Brasil). Após a pesagem do coração, a artéria aorta foi canulada e esse foi perfundido com uma solução de isolamento, contendo: [composição (mM): 130 Na+; 5,4 K+; 1,4 MgCl2; 140 Cl-; 0,75 Ca2+; 5,0 Hepes; 10 glicose; 20 taurina; e 10 creatina; pH = 7,3 em temperatura ambiente]14,15. Em seguida, trocou-se a perfusão para uma solução livre de Ca2+ contendo 0,1 mM de EGTA, durante 6 min, para destruição das bandas escalariformes entre os cardiomiócitos. Em seguida, o coração foi perfundido com uma solução contendo 1 mg.mL-1 de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) e 100 µM de CaCl2 durante 25 min, para a destruição das fibras colágenas extracelulares. Todas as soluções utilizadas no procedimento foram oxigenadas (O2 100% – White Martins, Brasil) e mantidas em temperatura de 37 ºC. Ao final da perfusão os ventrículos foram separados dos átrios e pesados14. Após, o ventrículo esquerdo foi separado em fragmentos que foram colocadas em frascos contendo 5 mL da solução enzimática (colagenase) suplementada com 1% de albumina bovina sérica. Os frascos foram agitados moderadamente durante 5 min, em "banho-maria", a 37 ºC. A seguir, o conteúdo dos frascos foi filtrado e centrifugado (3000 rpm) por 30 s. O sobrenadante foi removido e as células foram suspendidas na solução de 750 µM de CaCl2. As células foram armazenadas por um prazo de até 6 horas após o procedimento de isolamento14. Os índices de hipertrofia cardíaca e ventricular foram calculados pelas razões dos pesos do coração e do ventrículo, respectivamente, pelo peso corporal.

Contração celular

A contração celular foi medida por meio da técnica de alteração do comprimento do cardiomiócito, usando-se um sistema de detecção de bordas, montado em um microscópio invertido (Ionoptix, EUA), conforme descrito previamente14,15. Os cardiomiócitos foram acomodados em uma câmara experimental com a base de vidro e banhados por solução tampão com a seguinte composição (em mM): 136,9 NaCl; 5,4 KCl; 0,37 NaH2PO4; 0,57 MgCl2; 5 Hepes; 5,6 Glicose; 1,0 CaCl2 (pH = 7,4). Os cardiomiócitos foram visualizados em um monitor por meio de uma câmera (Myocam, Ionoptix, 240 Hz) acoplada ao microscópio utilizando-se um programa de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix). Os cardiomiócitos foram estimulados nas frequências de 1 e 3 Hz (10 V de 5 min) utilizando-se um par de eletrodos de aço e um estimulador elétrico de campo (Myopacer, Ionoptix). Os movimentos das bordas longitudinais dos cardiomiócitos foram capturados pelo sistema de detecção de bordas e armazenados para análise posterior. Foram utilizados para as medidas de contração somente os cardiomiócitos que estavam em boas condições, com as bordas e as estriações sarcoméricas bem definidas, relaxados em repouso e sem apresentar contrações voluntárias. As contrações foram analisadas por meio de um software caseiro desenvolvido na plataforma matLab.

Dimensões dos cardiomiócitos

O comprimento e a largura dos cardiomiócitos foram medidos usando-se um sistema de detecção de bordas. As imagens das células foram visualizadas e capturadas como descrito anteriormente14. O comprimento foi definido por meio da medição da imagem gerada no monitor, por meio de uma régua em µm, desde a borda direita até a borda esquerda das células. A largura foi definida pela medição da imagem gerada no monitor, por meio de uma régua em µm, desde a borda superior até a borda inferior, no ponto médio das células. O volume celular foi calculado usando-se a fórmula: [Volume (pL) = comprimento (mm) x largura (mm) x (7,59 x 10-3pL/mm2)]16. O comprimento do sarcômero foi medido usando-se um sistema de captação de imagens (Ionoptix, EUA). Esse sistema permite visualizar as estrias dos cardiomiócitos, e por meio do contraste da imagem gerada medir a distância entre eles.

Análise estatística

A análise final dos dados foi feita por meio de teste-t não pareado. Os dados são apresentados como média ± erro-padrão da média. O nível de significância adotado foi de 5%.

Resultados

Baseado no critério de seleção adotado (12), os grupos BD e DP foram constituídos por animais com TTF de 13,67 ± 2,11 min e 37,26 ± 6,61 min, respectivamente (p < 0,05).

Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos BD e DP na massa corporal, na massa do coração, no peso relativo do coração e na massa do ventrículo (tab. 1).

Os resultados da morfologia dos cardiomiócitos dos animais BD e DP são mostrados na tabela 2. O comprimento dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo foi significativamente menor no grupo BD em relação ao DP. Todavia, a largura celular não foi estatisticamente diferente entre os grupos. O volume celular foi menor nos animais BD em relação aos DP (p < 0,05). Não houve diferenças significativas entre o comprimento dos sarcômeros dos grupos BD e DP.

A tabela 3 apresenta os resultados das variáveis contráteis entre os grupos BD e DP, nas frequências de 1 e 3 Hz. A 1 Hz não foram encontradas diferenças significativas para as variáveis observadas. Quando os cardiomiócitos foram estimulados a 3 Hz, os resultados demonstraram que houve diferença para os parâmetros tempo até o pico de contração (Tpico) e tempo do pico de contração até o relaxamento total (Trelax), sendo medidos valores maiores nos cardiomiócitos do grupo BD em relação ao DP (p < 0,05). Não foram observadas diferenças significativas na amplitude de contração e no tempo do pico de contração até 50% do relaxamento total (T50%).

Discussão

O presente estudo teve como objetivo comparar as variáveis morfológicas e contráteis de cardiomiócitos isolados de ratos com baixo desempenho e desempenho padrão para o exercício físico. Confirmando nossa hipótese, foi demonstrado que a seleção de ratos com baixa capacidade aeróbica intrínseca associou-se a perdas na morfologia e na capacidade contrátil. Foi observado também que os cardiomiócitos dos ratos de baixo desempenho apresentaram menor comprimento e volume celular, além de apresentarem um maior tempo para o pico de contração e para o relaxamento celular.

Para a seleção dos grupos nesse estudo, os animais BD foram selecionados de acordo com o TTF e então comparados com os ratos DP. Estudos anteriores com animais BCAI/ACAI mostraram que na 11ª geração as duas linhagens divergiram em 347% na distância percorrida até a fadiga, o que correspondeu a um TTF de 14,3 e 41,6 min, respectivamente9,17. No presente estudo, os animais BD e DP obtiveram valores de TTF de 13,67 min e 37,26 min, respectivamente. Esses valores aproximam-se dos obtidos nos estudos prévios. As principais diferenças para a seleção dos animais no atual estudo, para o modelo original, foram a utilização de ratos com desempenho padrão, em vez de ratos com alto desempenho, a não utilização de nenhum tipo de cruzamento direcionado para selecionar os animais e a utilização de uma linhagem de ratos que não é modelo de doença.

Os dados do presente trabalho mostraram que os cardiomiócitos dos animais BD apresentaram perdas na morfologia e na capacidade contrátil. Os animais do grupo BD apresentaram menor comprimento celular associado a um menor volume. Tais diferenças podem refletir numa menor cavidade ventricular e, consequentemente, em menor débito cardíaco e volume de ejeção4,18. Além disso, ganhos na morfologia podem refletir em alterações no tamanho do músculo e no volume das câmaras ventriculares. A hipertrofia fisiológica do músculo cardíaco é uma resposta do cardiomiócito a estímulos mecânicos e neuro-hormonais, permitindo uma melhora da função da bomba cardíaca19. A hipertrofia fisiológica ocorre por meio do aumento da massa muscular cardíaca causada primariamente pelo aumento das dimensões dos cardiomiócitos20,21. Além disso, o aumento da dimensão interna das câmaras ventriculares está vinculado especialmente ao aumento da distensibilidade do tecido muscular cardíaco e ao aumento do comprimento dos cardiomiócitos22,23.

Em estudos com animais BCAI/ACAI, os animais BCAI apresentaram menor capacidade aeróbica, debito cardíaco e volume de ejeção4 quando comparados aos ACAI. Estudos prévios também analisaram a morfologia dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo desses animais. Foi observado que os animais BCAI apresentam menor comprimento e volume celular em relação aos ACAI9,24. Similar aos estudos anteriores, nossos resultados mostram que os cardiomiócitos dos animais BD apresentam menor comprimento e volume celular em relação aos animais DP.

Associado às diferenças na morfologia, foi observado que os cardiomiócitos dos animais BD apresentaram alterações na capacidade contrátil. O Tpico e o Trelax foram maiores nos cardiomiócitos do grupo BD. Nos cardiomiócitos a velocidade de contração está relacionada diretamente a dois fatores. Primeiro, à liberação do Ca2+ armazenado no Retículo Sarcoplasmático (RS) para o citoplasma mediante os receptores de rianodina (RyR2), gerando um transiente de [Ca2+]i11. Segundo, à capacidade da miosina ATPase hidrolisar ATP (10). Dados anteriores de nosso grupo de pesquisa mostraram que o transiente de [Ca2+]i está diretamente relacionado ao desempenho físico nesse modelo de seleção12. Os mesmos resultados foram observados também em animais BCAI quando comparados aos ACAI25. Além disso, foi encontrado também uma relação entre a capacidade aeróbica intrínseca e a expressão dos RyR212.

Além de perdas na velocidade de contração, foi observada também uma velocidade de relaxamento mais lenta nos cardiomiócitos do grupo BD. A capacidade de relaxamento das células cardíacas está relacionada com a remoção de Ca2+ do citosol11. Em cardiomiócitos de ratos, a remoção de Ca2+ do citosol ocorre por quatro processos que envolvem a Ca2+-ATPase do RS (SERCA2a) e do sarcolema, o trocador sódio-cálcio NCX e a recaptação mitocondrial10. A atividade da SERCA2a é o principal desses mecanismos26, correspondendo por aproximadamente 92% da recaptação total de Ca2+ em cardiomiócitos de ratos27. O relaxamento mais rápido pode ter um impacto positivo na contração celular, pois acelera a recaptação de Ca2+ para o RS11. Nesse sentido, uma expressão aumentada de SERCA2a em ratos de alta capacidade para o exercício aeróbico pode refletir em uma melhora na função contrátil12.

O presente estudo teve como objetivo comparar as variáveis morfológicas e contráteis de cardiomiócitos isolados de ratos com baixo desempenho e desempenho padrão para o exercício físico. Confirmando nossa hipótese, foi demonstrado que a seleção de ratos com baixa capacidade aeróbica intrínseca associou-se a perdas na morfologia e na capacidade contrátil. Foi observado também que os cardiomiócitos dos ratos de baixo desempenho apresentaram menor comprimento e volume celular, além de apresentarem um maior tempo para o pico de contração e para o relaxamento celular.

Conclusão

Os cardiomiócitos dos animais de baixo desempenho apresentaram diminuições no comprimento e no volume celular. Além disso, foi observado também nos cardiomiócitos desses animais aumento do tempo até o pico de contração e do tempo do pico de contração até o relaxamento total.

Agradecimentos

Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq e parcialmente pela FAPEMIG.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Thales Nicolau Prímola Gomes pela Universidade Federal de Minas Gerais.

Thales Nicolau Prímola-Gomes

Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Educação Física - Av. Ph. Rolfs, s/n – Campus Universitário

36570-000 – Viçosa, MG - Brasil

E-mail:

thales.gomes@ufv.br

Artigo recebido em 01/11/11; revisado recebido em 03/11/11; aceito em 24/01/12.

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BACKGROUND: Aerobic capacity is essential to physical performance, and low aerobic capacity is related to the triggering of various cardiovascular diseases. OBJECTIVE: To compare the morphology and contractility of isolated rat cardiomyocytes with low performance and standard performance for exercise. METHODS: Wistar rats with 10 weeks of age underwent a protocol of treadmill running to fatigue, and were divided into two groups: Low Performance (LP) and Standard Performance (SP). Then, the animals were sacrificed, the heart was quickly removed and, by means of enzymatic dissociation, left ventricular cardiomyocytes were isolated. The cell and sarcomeres length and width of cardiomyocytes were measured using an edge detection system. The isolated cardiomyocytes were electrically stimulated at 1 and 3 Hz and cell contraction was measured by registering the change of their length. RESULTS: The cell length was shorter in the LP group (157.2 1.3µm; p < 0.05) compared to SP (161.4 1.3µm), and the same result was observed for the volume of cardiomyocytes (LP, 25.5 0.4. vs. SP, 26.8 ± 0.4 pL; p < 0.05). The time to peak contraction (LP, 116 1 vs. SP 111 2ms) and total relaxation (LP, 143 3 vs. SP 232 3ms) were higher in the LP group. CONCLUSION: We conclude that left ventricular myocytes of animals with low performance for exercise are smaller than animals with standard performance. In addition to that, they present losses in contractile capacity.

 Myocytes cardiac rats exercise fatigue myocardial contraction physical conditioning animal

Morphology and contractility in cardiomyocytes of rats with low exercise performance

Judson Fonseca Quintão JúniorI; Antônio José NataliI; Miguel Araújo Carneiro JúniorIII; Cynthia Aparecida de CastroI; Lucas Rios DrummondI; Victor Neiva LavoratoI; Leonardo Bonato FelixI; Jader dos Santos CruzII; Thales Nicolau Prímola-GomesI

IUniversidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG

IIIUniversidade Federal do Espírito Santo, Vitório, ES, Brasil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Aerobic capacity is essential to physical performance, and low aerobic capacity is related to the triggering of various cardiovascular diseases.

OBJECTIVE: To compare the morphology and contractility of isolated rat cardiomyocytes with low performance and standard performance for exercise.

METHODS: Wistar rats with 10 weeks of age underwent a protocol of treadmill running to fatigue, and were divided into two groups: Low Performance (LP) and Standard Performance (SP). Then, the animals were sacrificed, the heart was quickly removed and, by means of enzymatic dissociation, left ventricular cardiomyocytes were isolated. The cell and sarcomeres length and width of cardiomyocytes were measured using an edge detection system. The isolated cardiomyocytes were electrically stimulated at 1 and 3 Hz and cell contraction was measured by registering the change of their length.

RESULTS: The cell length was shorter in the LP group (157.2 1.3µm; p < 0.05) compared to SP (161.4 1.3µm), and the same result was observed for the volume of cardiomyocytes (LP, 25.5 0.4. vs. SP, 26.8 ± 0.4 pL; p < 0.05). The time to peak contraction (LP, 116 1 vs. SP 111 2ms) and total relaxation (LP, 143 3 vs. SP 232 3ms) were higher in the LP group.

CONCLUSION: We conclude that left ventricular myocytes of animals with low performance for exercise are smaller than animals with standard performance. In addition to that, they present losses in contractile capacity.

Keywords: Myocytes, cardiac; rats; exercise; fatigue; myocardial contraction; physical conditioning animal.

Introduction

Aerobic capacity is essential not only for physical performance, but it is also related to the outbreak of various diseases. A low aerobic capacity is associated with the incidence of cardiovascular diseases and greater mortality1,2.

Aerobic capacity is a complex variable that is under the influence of genetic and environmental factors3. Genetic factors may represent 70% to 90% in the variations observed in the aerobic capacity4. The term intrinsic aerobic capacity has been used to refer to the set of genes that determine changes in aerobic capacity when there is no prior physical training (untrained state)5-8. The main determinant of intrinsic aerobic capacity is the capacity of the heart to maintain adequate blood flow to body tissues. Previous studies demonstrated that rats with High Intrinsic Aerobic Capacity (HIAC) showed gains in cardiac function4, higher maximum oxygen consumption (VO2max)3 and, at the cellular level, higher morphological and contractile parameters compared to rats with Low Intrinsic Aerobic Capacity (LIAC)9. These results show the importance of cardiac contractile activity in the determination of intrinsic aerobic capacity.

At the cellular level, the contractile capacity of cardiomyocytes is directly related to the Ca2+ homeostasis. The Ca2+ is involved in the process of excitation-contraction coupling, both at the time of excitability of cardiomyocytes and in the final activation of contractile filaments causing contraction10,11. Previous results of our study group showed that cardiomyocytes isolated from rats with high-performance for exercise (HP) showed gains in contractile function (both systolic and diastolic), and a larger global intracellular transient of Ca2+ ([Ca2+]i transient) compared to standard performing rats (SP)12.

Studies on the morphology and contractile function of cardiomyocytes of animals with low performance and standard performance are scarce. Hence, the objective of this study was to compare morphological and contractile parameters of isolated rat cardiomyocytes with LP (low performance for exercise) and SD (standard performance for exercise). According to our hypothesis, cardiomyocytes of LP animals showed significant reductions in the morphology and contractile capacity.

Methods

Animals

For these experiments, we used male Wistar rats (Rattus norvegicus), with 10 weeks of age, weighing 224 ± 5 g at the beginning of the trial, from the animal colony of the Universidade Federal de Viçosa (state of Minas Gerais). The animals were kept in polyethylene boxes with a maximum of five rats per box in a room at 23°C with commercial chow and water ad libitum and a cycle of 12-12 h light/dark (6:00 a.m. - 06:00 p.m.). This study followed the standards established in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996) and respected the Ethical Principles in Animal Experiments of the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). The study was approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation of Universidade Federal de Minas Gerais - Cetea/UFMG (protocol nº 015/08).

Exercise protocol

The animals were subjected to a protocol based on the total exercise time to fatigue (TET)12. One week before the test, the animals went through an adjustment period on the treadmill (Insight Instrumentos - Ribeirão Preto, Brazil) for five consecutive days (5 min/day; 5% slope) and daily increases of the treadmill speed (10, 10, 11, 13, 15 m/min). After one week of adaptation, each animal performed, on three alternate days, three progressive exercise tests until fatigue (initial speed of 10 m/min, 5% slope). During testing, the treadmill speed was increased by 1 m/min to 3 min each. The test was stopped when the animal entered in fatigue. The moment of fatigue was defined when the rat could not keep running at the treadmill speed12,13.

Selection strategy

The selection strategy used in this study was based on the TET for each rat12. Previous data from our laboratory have shown that by using this selection strategy, three groups can be determined: Low Performance (LP), Standard Performance (SP) and High Performance (HP). Based on these data, the animals were divided into two groups: LP (n = 10) and SP (n = 10).

According to the testing methodology adopted, the LP group consisted of animals with TET below 16.63 min, i.e., a TET that is smaller than at least one standard deviation of the population. In turn, the animals with TET between 16.33 and 46.57 min were included in the SP group, i.e., those which had a TET not higher or smaller than a standard deviation of the population12.

Body mass, euthanasia, heart and ventricular mass, cardiomyocyte isolation

The animals' body weight was measured immediately prior to euthanasia by means of an electronic scale (Mars - Brazil). The heart was removed, washed in a solution containing 750 M CaCl2 to remove excess blood, and weighed on a precision scale (Gehaka - Brazil). After weighing the heart, the aorta was cannulated and the heart was perfused with a solution of isolation, containing: [composition (mM): 130 Na+; 5.4 K+; 1.4 MgCl2; 140 Cl-; 0.75 Ca2+; 5.0 Hepes; 10 glucose; 20 taurine; and 10 creatine; pH 7.3 at room temperature]14,15. Then, perfusion was switched to a Ca2+-free solution containing 0.1 mM EGTA for 6 min for the destruction of cardiomyocytes scalariform bands. Then, the heart was perfused with a solution containing a 1mg.mL-1 collagenase type 2 (Worthington, USA) and 100 M CaCl2 for 25 min, for the destruction of extracellular collagen fibers. All solutions used in the procedure were oxygenated (O2 100% - White Martins, Brazil) and maintained at a temperature of 37°C. At the end of the infusion, the ventricles were separated from the atria and weighed14. Thereafter, the left ventricle was separated into fragments that were placed in vials containing 5 mL of enzyme solution (collagenase) supplemented with 1% bovine serum albumin. The vials were shaken moderately for 5 min in "bain marie" at 37°C. Next, the contents of the vials were filtered and centrifuged (3000 rpm) for 30 s. The supernatant was removed and the cells were suspended in 750 M solution of CaCl2. The cells were stored for a period of up to 6 hours after the procedure of isolation14. The indices of ventricular and cardiac hypertrophy were calculated for ratios of heart and ventricle weight, respectively, to body weight.

Cell contraction

The cell contraction was measured by the technique of changing the length of cardiomyocytes using an edge detection system mounted on an inverted microscope (Ionoptix, USA) as described previously14,15. The cardiomyocytes were placed in an experimental chamber with glass base and bathed in buffer containing the following composition (in mM): 136.9 NaCl; 5.4 KCl; NaH2PO4 0.37; 0.57 MgCl2; 5 Hepes; 5.6 Glucose; 1.0 CaCl2 (pH 7.4). The cardiomyocytes were viewed on a monitor via a camera (Myocam, Ionoptix, frequency of 240 Hz) attached to the microscope using an image detection program (Ionwizard, Ionoptix). The cardiomyocytes were stimulated at a frequency of 1 and 3.0 Hz (10 Volts, lasting 5 min) using a pair of steel electrodes and an electric field stimulator (Myopacer, Ionoptix). The movements of the longitudinal edges of the cardiomyocytes were captured by the edge detection system and stored for later analysis. Contraction measurements employed only those cardiomyocytes that were in good condition, with the edges and well-defined sarcomeric striations, at rest, with no voluntary contractions. Contractions were measured using a home software application developed on the Matlab platform.

Dimensions of cardiomyocytes

The cell and sarcomeres length and width of cardiomyocytes were measured using an edge detection system. The images of the cells were viewed and captured as described previously14. The length is defined by measuring the image generated on the monitor through a µm rule, from the right edge to left edge of the cells. The width was determined by measuring the image generated on the monitor, through a µm rule, from the top edge to bottom edge at the midpoint of the cells. The cell volume was calculated using the formula: [Volume (pl) = length (mm) x width (mm) x (7.59 x 10-3pL/mm2)]16. The sarcomere length was measured using an image capture system (Ionoptix, USA). This system lets you see the streaks of cardiomyocytes, and through the contrast of the image generated, it measures the distance between them.

Statistical analysis

The final data analysis was done using unpaired t-test. Data are presented as mean ± standard deviation. The level of significance adopted was 5%.

Results

Based on the selection criteria adopted (12), the LP and SP groups were composed of animals with TET of 13.67 ± 2.11 min and 37.26 ± 6.61 min, respectively (p < 0.05).

There were no significant differences between the LP and SP groups in body mass, heart mass, relative weight of the heart and ventricular mass (Table 1).

The results of cardiomyocyte morphology of LP and SP animal are shown in Table 2. The length of left ventricular cardiomyocytes was significantly lower in the LP group compared to the SP group. However, the cell width was not statistically different between groups. The cell volume was lower in LP animals compared to SP animals (p < 0.05). There were no significant differences between the sarcomere length of LP and SP groups.

Table 3 presents the results of contractile variable among LP and SP groups at the frequencies of 1 Hz and 3 Hz. At 1 Hz no significant differences were found for the variables observed. When cardiomyocytes were stimulated at 3 Hz, the results showed that there were differences for the parameters time to peak contraction (Tpeak) and time of peak contraction to total relaxation (Trelax). Higher values were found in the cardiomyocytes of the LP group compared to the SP group (p < 0.05). There were no significant differences in contraction amplitude and time to peak contraction to 50% of total relaxation (T50%).

Discussion

This study aimed to compare the morphological and contractile properties of isolated rat cardiomyocytes with low performance and standard performance for exercise. Confirming our hypothesis, we demonstrated that the selection of rats with low intrinsic aerobic capacity was associated with a loss in morphology and contractile capacity. It was also observed that the cardiomyocytes of low performance rats had lower length and cell volume, and a higher time to peak contraction and cell relaxation.

For the selection of groups in this study, the LP animals were selected according to the TET and then compared to SP rats. Previous studies with LIAC/HIAC animals showed that in the 11th generation, the two lineages diverged 347% in the distance walked to fatigue, which corresponded to a TET of 14.3 and 41.6 min, respectively9,17. In this study, the LP and SP animals obtained TET values of 13.67 min and 37.26 min, respectively. These values are similar to those obtained in previous studies. The main differences for the selection of animals in this study, the original model, were the use of rats with standard performance instead of rats with high performance, the non-use of any crossover to select the animals and the use of a lineage of rats that is not a disease model.

Data from this study showed that the cardiomyocytes of LP animals presented loss in morphology and contractile capacity. LP animals had lower cell length associated with a smaller volume. Such differences may reflect a smaller ventricular cavity and hence a smaller cardiac output and ejection volume4,18. Moreover, gains in morphology may reflect changes in muscle size and ventricular chamber volume. The physiologic hypertrophy of the heart muscle is a response of cardiomyocytes to mechanical and neurohormonal stimuli, allowing an improvement of cardiac pump function19. The physiological hypertrophy occurs through cardiac muscle mass increase caused primarily by increased cardiomyocite dimensions20,21. Furthermore, increased internal dimension of ventricular chambers is especially linked to increased elasticity of the cardiac muscle tissue and increased length of cardiomyocytes22,23.

In studies with LIAC/HIAC animals, LIAC animals had lower aerobic capacity, cardiac output and ejection volume4 compared to HIAC animals. Previous studies also analyzed the morphology of left ventricular cardiomyocytes of these animals. It was observed that LIAC animals have a smaller cell length and volume compared to HIAC animals9,24. Similar to previous studies, our results show that the cardiomyocytes of LP animals have shorter cell length and volume compared to SP animals.

Associated with differences in morphology, we found that cardiomyocytes of LP animals presented changes in contractile capacity. Tpeak and Trelax were higher in the cardiomyocytes of the LP group. In cardiomyocytes, contraction speed is directly related to two factors. Firstly, the release of Ca2+ stored in the sarcoplasmic reticulum (SR) into the cytoplasm upon ryanodine receptors (RyR2), generating a transient of [Ca2+]i.11 Secondly, the ability of myosin ATPase to hydrolyze ATP (10). Previous data from our research group showed that the transient [Ca2+]i is directly related to physical performance in this selection model12. The same results were also observed in LIAC animals compared to HIAC animals25. Furthermore, a relation between intrinsic aerobic capacity and RyR212 expression was also found.

In addition to losses in speed of contraction, a slower relaxation speed of LP cardiomyocytes was also observed. The ability of relaxation of the cardiac cells is related to the removal of Ca2+ from the citosol11. In rat cardiomyocytes, removal of Ca2+ from the cytosol is by four processes involving Ca2+-ATPase from the SR (SERCA2a) and sarcolemma, the sodium-calcium exchanger NCX and mitocondrial reuptake10. The activity of SERCA2a is the leading mechanism26, accounting for approximately 92% of the total Ca2+ reuptake in the cardiomyocytes of rats27. The faster relaxation may have a positive impact on cell contraction, because it accelerates the reuptake of Ca2+ to the SR11. Accordingly, an increased expression of SERCA2a in rats with high capacity for aerobic exercise may reflect an improvement in the contractile function12.

This study aimed to compare the morphological and contractile properties of isolated rat cardiomyocytes with low performance and standard performance for exercise. Confirming our hypothesis, we demonstrated that the selection of rats with low intrinsic aerobic capacity was associated with a loss in morphology and contractile capacity. It was also observed that the cardiomyocytes of low performance rats had lower length and cell volume, and a higher time to peak contraction and cell relaxation.

Conclusion

The cardiomyocytes of low performance animals had decreases in cell length and volume. Furthermore, increased time to peak contraction and peak contraction to total relaxation were also observed in the cardiomyocytes of these animals.

Acknowledgments

We thank the Foundation for Research Support of Minas Gerais (FAPEMIG) and the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq)

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq and partially funded by FAPEMIG.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Thales Nicolau Prímola Gomes, from Universidade Federal de Minas Gerais.

References