abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil mrZLBLV7PQLGjZjZJKgrLmj S0066-782X2012000500002 S0066-782X(12)09800502 10.1590/S0066-782X2012005000037 Artigos Originais Polimorfismos beta1-adrenérgico associados com Fibrilação Atrial na Insuficiência Cardíaca Sistólica Nascimento Bruno Costa do Pereira Sabrina Bernardez Ribeiro Georgina Severo Mesquita Evandro Tinoco Niterói Rio de Janeiro Universidade Federal Fluminense Brazil 05 2012 98 5 384 389 30 04 2011 20 01 2012 03 05 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: O sistema nervoso simpático apresenta grande importância na patogênese da fibrilação atrial na insuficiência cardíaca sistólica. A identificação de polimorfismos no gene ADBR1 do receptor beta1-adrenérgico representa um importante passo no conhecimento dessa patogênese. OBJETIVO: Este estudo analisou a associação entre os dois polimorfismos funcionais do gene ADBR1 do receptor beta1-adrenérgico, Ser49Gly e Arg389Gly, e a presença da fibrilação atrial em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica. MÉTODOS: Estudo caso-controle com 144 pacientes portadores de insuficiência cardíaca sistólica, dos quais 24 com fibrilação atrial (casos) e 120 sem fibrilação atrial (controles). O DNA genômico foi extraído de leucócitos do sangue periférico e os genótipos dos polimorfismos Ser49Gly e Arg389Gly foram identificados em todos os indivíduos por PCR/RFLP (polymerase chain reaction / restriction fragment length polymorphism). RESULTADOS: A média etária foi 59 ± 13 anos, 70% dos pacientes eram do sexo masculino, 42% apresentavam causa isquêmica e 74% apresentavam hipertensão arterial sistêmica. Os genótipos Ser49Ser e Arg389Arg apresentaram associação significativa com fibrilação atrial (p = 0,005 e p = 0,01; respectivamente). Por meio de regressão logística, ambos ajustados para o tamanho do átrio esquerdo e idade, mantiveram associação significativa (Arg389Arg - odds ratios: 2,78; intervalo de confiança de 95% = 1,02 - 7,56 e Ser49Ser - odds ratios: 8,02; intervalo de confiança de 95% = 1,02 - 63,82). CONCLUSÃO: Ambos os genótipos associaram-se com fibrilação atrial nos pacientes estudados, porém apenas o polimorfismo Ser49Gly apresentava-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

 Fibrilação atrial insuficiência cardíaca polimorfismo genético genótipo 12 04 2012

Polimorfismos beta1-adrenérgico associados com Fibrilação Atrial na Insuficiência Cardíaca Sistólica

Bruno Costa do Nascimento; Sabrina Bernardez Pereira; Georgina Severo Ribeiro; Evandro Tinoco Mesquita

Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: O sistema nervoso simpático apresenta grande importância na patogênese da fibrilação atrial na insuficiência cardíaca sistólica. A identificação de polimorfismos no gene ADBR1 do receptor beta1-adrenérgico representa um importante passo no conhecimento dessa patogênese.

OBJETIVO: Este estudo analisou a associação entre os dois polimorfismos funcionais do gene ADBR1 do receptor beta1-adrenérgico, Ser49Gly e Arg389Gly, e a presença da fibrilação atrial em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica.

MÉTODOS: Estudo caso-controle com 144 pacientes portadores de insuficiência cardíaca sistólica, dos quais 24 com fibrilação atrial (casos) e 120 sem fibrilação atrial (controles). O DNA genômico foi extraído de leucócitos do sangue periférico e os genótipos dos polimorfismos Ser49Gly e Arg389Gly foram identificados em todos os indivíduos por PCR/RFLP (polymerase chain reaction / restriction fragment length polymorphism).

RESULTADOS: A média etária foi 59 ± 13 anos, 70% dos pacientes eram do sexo masculino, 42% apresentavam causa isquêmica e 74% apresentavam hipertensão arterial sistêmica. Os genótipos Ser49Ser e Arg389Arg apresentaram associação significativa com fibrilação atrial (p = 0,005 e p = 0,01; respectivamente). Por meio de regressão logística, ambos ajustados para o tamanho do átrio esquerdo e idade, mantiveram associação significativa (Arg389Arg – odds ratios: 2,78; intervalo de confiança de 95% = 1,02 – 7,56 e Ser49Ser – odds ratios: 8,02; intervalo de confiança de 95% = 1,02 – 63,82).

CONCLUSÃO: Ambos os genótipos associaram-se com fibrilação atrial nos pacientes estudados, porém apenas o polimorfismo Ser49Gly apresentava-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Palavras-chave: Fibrilação atrial / genética, insuficiência cardíaca / complicações, polimorfismo genético, genótipo.

Introdução

A Fibrilação Atrial (FA) e a Insuficiência Cardíaca Sistólica (ICS) frequentemente coexistem, em razão dos fatores de risco em comum e do processo patogênico semelhante1,2. A elevada incidência de FA nos pacientes com ICS pode ser influenciada por inúmeros fatores, dentre eles: (i) efeitos hemodinâmicos, sobretudo a dilatação atrial e a disfunção diastólica; (ii) ativação neuro-humoral; e (iii) inflamação e estresse oxidativo. A FA pode causar ICS (taquicardiomiopatia) ou ser responsável por sua deteriorização. A coexistência de FA e ICS está associada com prognóstico adverso, como: progressão da doença, maior número de hospitalizações, acidente vascular cerebral e óbito3-6.

A relação entre FA e ICS tem sido intensamente estudada. No entanto, o conhecimento fisiopatológico ainda permanece incompleto, e necessita de novas descobertas sobre alguns aspectos ainda obscuros. Atualmente, a genética propõe que para um considerável número de doenças cardiovasculares, a suscetibilidade está relacionada, em parte, aos polimorfismos genéticos, particularmente àqueles relacionados aos receptores de neurotransmissores. Tendo em vista as alterações que as variações genéticas do receptor beta1-adrenérgico podem causar na função do sistema adrenérgico e seu impacto na predisposição às enfermidades, esses polimorfismos têm sido relacionados a propensão, evolução e desfecho de diversas doenças cardíacas, entre elas a IC7. O papel central do sistema nervoso simpático e de seus receptores na IC torna o estudo dos polimorfismos genéticos desses receptores (Arg389Gly e Ser49Gly) um importante passo rumo ao melhor entendimento dessa patogênese8,9.

Alguns estudos associam o genótipo Arg389Arg à maior resposta adrenérgica em estados fisiológicos e em estágios agudos de doença cardiovascular. Além disso, está associado à maior incidência de taquicardia ventricular10-15. O genótipo Ser49Ser está associado a menor down-regulation dos receptores beta1-adrenérgico e, com isso, demonstra altos níveis de expressão agonista em doenças com elevação crônica da atividade adrenérgica, como a IC. Além disso, esse genótipo está associado a resultados adversos em pacientes com IC15-19.

Em nosso estudo avaliamos a associação entre os polimorfismos do gene ADBR1 e a presença de FA em pacientes com ICS.

Métodos

Realizamos um estudo observacional, do tipo caso-controle, em pacientes com IC sistólica, provenientes da clínica de IC da Universidade Federal Fluminense. O grupo dos casos foi constituído por 24 pacientes portadores de fibrilação atrial e o grupo dos controles, por 120 sem a arritmia. O objetivo do estudo foi avaliar a associação entre os genótipos Arg389Arg e Ser49Ser e a FA nos pacientes com IC sistólica.

Os pacientes foram incluídos no estudo no momento em que foram admitidos no ambulatório de IC. O estudo envolveu as seguintes etapas: (i) registro dos dados clínicos e demográficos dos casos e dos controles; (ii) coleta de sangue para a análise genética dos receptores beta-adrenérgicos; e (iii) análise das variáveis demográficas, clínicas, laboratoriais, ecocardiográficas e dos genótipos em relação aos grupos dos casos e dos controles. Os critérios de inclusão foram: idade > 18 anos; pacientes com história e exame físico compatíveis com IC e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) < 50% pelo método ecocardiográfico de Simpson. Os critérios de exclusão foram: pacientes com indicação ou submetidos a ressincronização cardíaca; miocardite ativa; episódio de morte súbita abortada ou presença de desfibrilador; e indicação de angioplastia ou cirurgia de revascularização miocárdica.

Amostra de sangue periférico foi extraída para isolamento de DNA e genotipagem. Os dados demográficos registrados foram: sexo, idade e etnia autodeclarada. Os dados clínicos avaliados foram: presença de Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS), diabete melito, Doença Arterial Coronariana (DAC) e uso de medicações cardiovasculares. Pacientes com história de infarto agudo do miocárdio, angioplastia coronariana, cirurgia de revascularização miocárdica, coronariopatia confirmada por coronariografia e testes provocativos positivos para isquemia miocárdica foram considerados portadores de DAC. Todos os pacientes foram avaliados funcionalmente de acordo com a classificação da New York Heart Association (NYHA). Exame ecocardiográfico foi realizado na admissão do estudo por dois ecocardiografistas experientes, de acordo com o guidelines da European Society of Cardiology20. As análises realizadas foram: (i) diâmetro sistólico e diastólico finais do ventrículo esquerdo; (ii) dimensão do átrio esquerdo (AE); e (iii) FEVE pelo método de Simpson. (Vivid 3, GE Medical Systems Ultrasound, Wisconsin USA). O ritmo cardíaco foi registrado por meio de eletrocardiograma padrão de 12 derivações na admissão dos pacientes para diagnosticar FA.

As amostras eram submetidas a lise celular com 1000µL de Tris-1 (Tris-HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 2mM pH 8,0) contendo Triton X-100 a 2,5%. Após centrifugação a 5.000 rpm por 5 minutos em centrífuga Beckman®, os núcleos celulares eram lisados com 200µL de Tris-2 contendo SDS a 1%. As proteínas eram removidas por precipitação salina com 100µL de NaCl 5M. O DNA presente no sobrenadante era isolado por precipitação etanólica e, finalmente, ressuspenso em 100µL de TE (Tris-HCl 10mM e 1mM EDTA, pH 8,0) e mantidos a -20°C o momento do uso. Após a extração, a integridades das amostras de DNA eram analisadas por sistema de eletroforese (BIO RAD eletroforese) em gel de agarose a 0,8% em tampão de TBE 1X (Tris-HCl 90mM, ácido bórico 90mM e EDTA 2mM), corados com brometo etídio. Os polimorfismos do gene ADBR1 (Arg389Gly e Ser49Gly) do receptor beta1-adrenérgico eram analisados por PCR/RFLP (polymerase chain reaction/ restriction fragment length polymorphism)21,22. A reação de PCR foi realizada em um volume total de 25 µL, sendo utilizado: 50 – 100 ng de DNA genômico, após ajuste da concentração, 1U de Taq DNA polimerase Fermentas, tampão de reação (KCl 50mM, MgCl2 1,5mM, Tris-HCl 10mM), 200 M de cada desoxinucleotídeo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e 15 pmol de cada oligonucleotídeo. As condições de amplificação e digestão para identificação dos polimorfismos estão detalhadas na tabela 1. O alelo selvagem foi definido de acordo com frequência do alelo da população em estudo.

A análise estatística foi processada pelo software estatístico SPSS, versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Os dados contínuos foram expressos em média ± o desvio padrão (DP) e as variáveis categóricas em números absolutos e percentagem. O teste do qui-quadrado foi realizado para análise do desvio de Hardy-Weinberg em relação à distribuição dos genótipos dos polimorfismos dos receptores beta-1-adrenérgico e para verificar se existe associação desses com a presença de FA. A Lei de Hardy-Weinberg descreve o princípio do equilíbrio genético em uma população. Esse equilíbrio se dará se, em uma dada população no decorrer das gerações, tanto as frequências alélicas como as frequências genotípicas permanecerem na mesma proporção. Para que isso ocorra não deve haver forças que possam favorecer a formação de outro gameta, tais como: migração, mutação ou seleção natural. Com o objetivo de verificar se existe relação significativa entre as variáveis clínicas, laboratoriais, ecocardiográficas e dos polimorfismos (Arg389Arg e Ser49Ser) com a FA foram aplicados os seguintes métodos: (i) para comparações de dados categóricos foi aplicado o teste do qui-quadrado (χ2) ou o teste exato de Fisher; e (ii) para comparação de dados numéricos foi utilizado o teste t de Student para amostras independentes ou pelo teste de Mann-Whitney (não paramétrico). A homogeneidade da variância foi testada pelo teste de Levene. A análise de regressão logística foi realizada para identificar as variáveis independentes significativas que se associam com FA. O critério de determinação de significância adotado foi o nível de 5%;

Este estudo foi realizado em conformidade com os princípios da declaração de Helsinki. O protocolo foi aprovado por um comitê de ética em pesquisa e todos os pacientes assinaram um consentimento livre e esclarecido antes de participarem do estudo, para o qual não houve fonte de financiamento.

Resultados

As características clínicas dos pacientes estão demonstradas na tabela 2. Cento e quarenta e quatro pacientes foram incluídos no estudo. O grupo dos casos, portadores de FA, foi formado por 24 pacientes (17%). A média etária foi de 59 ± 13 anos, 70% eram do sexo masculino e 50% eram não negros. Em relação às comorbidades, DAC ocorreu em 42% dos pacientes, hipertensão arterial em 74% e diabete melito em 34%. Todos os pacientes eram sintomáticos na admissão, sendo 25% deles apresentando-se em classe funcional III ou IV segundo a NYHA. Noventa e quatro por cento eram tratados com um inibidor da enzima de conversão de angiotensina ou um bloqueador do receptor de angiotensina; 58%, com um antagonista da aldosterona; 72%, com um betabloqueador; e 3%, com amiodarona. Os ecocardiogramas realizados na inclusão do estudo demonstraram a prevalência de pacientes com disfunção sistólica grave do VE (FEVE média = 35,3% ± 9,3) e com AE aumentado (4,7 ± 1,2 cm).

Os dados das distribuições alélicas e das frequências genotípicas estão listados na tabela 3. A população do estudo estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg em relação ao polimorfismo Ser49Gly. No entanto, em relação ao polimorfismo Arg389Gly, a população estava em desequilíbrio, o que pode ter sido causado pelo fato de os pacientes já apresentarem uma doença (IC) que por si só pode tê-lo gerado.

Apenas os genótipos Ser49Ser e Arg389Arg, a idade e o tamanho do átrio esquerdo apresentaram associação significativa com o grupo dos casos (FA) em relação aos controles (sem FA). Não existiu diferença significativa, ao nível de 5%, na proporção das demais variáveis entre os dois grupos.

Inicialmente, a chance de o genótipo Ser49Ser estar associado com FA foi maior do que a chance dos genótipos Ser49Gly e Gly49Gly (odds ratios = 11,07 e intervalo de confiança = 1,44 – 85,02). Após regressão logística levando em conta a idade e o tamanho do AE, a chance permaneceu alta (odds ratios = 8,02 e intervalo de confiança = 1,02 – 63,82). A chance de o genótipo Arg389Arg estar associado com FA também foi maior do que a chance dos genótipos Arg389Gly e Gly389Gly (odds ratios = 3,21 e intervalo de confiança = 1,29 – 8,04). Após regressão logística levando em conta a idade e o tamanho do AE, a chance permaneceu alta (odds ratios = 2,79 e intervalo de confiança = 1,02 – 7,56). A tabela 4 fornece os dados de forma simplificada com valores de odds ratios (OR) e intervalo de confiança (IC).

Discussão

O principal achado deste estudo foi a associação entre os genótipos Ser49Ser e Arg389Arg, que estão envolvidos em estados de exacerbação adrenérgica10-19, e a FA nos pacientes portadores de ICS. A presença da FA em pacientes com ICS é multifatorial. O sistema nervoso simpático e os fatores genéticos a ele relacionados, como os polimorfismos do receptor beta1-adrenérgico, apresentam-se como mais uma variável a ser considerada na tentativa de explicar a associação entre a FA e a ICS.

Em nosso estudo, assim como em outras séries, a FEVE não apresentou associação com FA em pacientes com ICS, o que também não ocorreu em relação à classe funcional NYHA23-25. Os parâmetros que apresentaram associação estatisticamente significativa com FA foram: a idade, o tamanho do AE, o genótipo Ser49Ser e o genótipo Arg389Arg.

O aumento do AE está classicamente relacionado com remodelamento cardíaco e com a fisiopatologia da FA em pacientes com ICS, de forma que contribui de modo direto para o surgimento de FA na ICS. Além disso, a ativação simpática que está significativamente elevada em pacientes com ICS também contribui na patogênese do remodelamento elétrico e mecânico que culmina com o surgimento da FA26. Outro fato a ser analisado é que o tempo de permanência da FA também pode, por si só, gerar remodelamento atrial e causar o crescimento dessa cavidade. Como o tempo de início da arritmia não pôde ser obtido, ela pode ter contribuído para o crescimento do AE.

A idade tem sido descrita como um fator relacionado à FA23. No presente estudo, quanto maior a idade, maior a chance de associação com FA; entretanto, a significância estatística dessa variável com a FA foi limítrofe (p = 0,06).

Em relação aos polimorfismos do receptor beta1-adrenérgico, os genótipos Ser49Ser e Arg389Arg apresentaram associação estatisticamente significativa com a FA. Fisiopatologicamente, a FA e a IC estão relacionadas à maior atividade adrenérgica. Alguns estudos citados anteriormente relacionam esses genótipos com estados de exacerbação adrenérgica10-19, o que sustenta a ideia de esses genótipos estarem realmente envolvidos na fisiopatologia da IC e da FA.

O presente estudo evidenciou uma chance maior de o genótipo Arg389Arg estar relacionado com FA do que os genótipos Arg389Gly e Gly389Gly. No entanto, a amostra estava em desequilíbrio de Hardy-Weinberg, que pode ter sido causado pelo fato de os pacientes já apresentarem uma doença (IC) que por si só pode tê-lo gerado. Esse fato enfraquece o valor da associação encontrada neste estudo.

O achado envolvendo o genótipo Ser49Ser, entretanto, foi mais expressivo do que o primeiro. A chance de esse genótipo estar associado com FA foi oito vezes maior do que a dos outros dois genótipos, mesmo após análise multivariada, e além disso, a amostra estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

A associação de FA com IC está relacionada com prognóstico adverso. Recentemente, uma meta-análise envolvendo mais de 50 mil pacientes demonstrou que a presença de FA em pacientes com IC está associada, de forma independente, a maior mortalidade27. A identificação do alto risco de desenvolvimento de FA nos pacientes com IC possui importância vital. O momento certo para utilizar agentes antitrombóticos ou anticoagulantes, e com isso reduzir os eventos tromboembólicos, e ainda o uso de novos agentes antiarrítmicos para evitar a exacerbação de sintomas da IC provocados pela presença da FA são exemplos que traduzem essa importância28. A aceleração da tecnologia genética tem proporcionado maior entendimento das consequências das variações genéticas. A descoberta dos polimorfismos genéticos dos receptores adrenérgicos e suas interações representam uma parcela significativa desse avanço, contribuindo para maior compreensão da associação FA-IC, em relação ao diagnóstico, à prevenção e ao tratamento29. A gênese dessas cardiopatias está envolvida em um complexo mecanismo que também pode se relacionar com fatores genéticos. Com isso, os polimorfismos aqui estudados, especialmente o Ser49Gly, que apresentaram associação com FA em pacientes com IC sistólica, podem contribuir para o melhor entendimento dessas doenças.

Existem algumas limitações em nosso estudo: primeiro, os pacientes estudados são provenientes de um único centro, em uma área geograficamente específica; segundo, o número de pacientes estudados poderia ter sido maior; terceiro, o estudo não permite estabelecer causa e efeito entre as variáveis; e, quarto, como o diagnóstico da FA foi realizado exclusivamente por ECG durante a consulta de admissão, não foi possível identificar as crises paroxísticas.

Conclusão

Nossos dados enriquecem o conhecimento sobre a associação entre FA em pacientes com ICS e genótipos dos receptores beta1-adrenérgico. Embora a associação não prove causalidade, existe plausibilidade biológica no mecanismo entre a FA e os polimorfismos do receptor beta1-adrenérgico. Se esse achado for confirmado em grandes estudos, esses dados deverão contribuir na melhor estratificação de risco para o desenvolvimento de FA no contexto da ICS, e com isso preveni-la.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Bruno Costa do Nascimento pela Universidade Federal Fluminense.

Bruno Costa do Nascimento

Rua Madre Maria Vitória, 1, bloco 3, apto 304 – Charitas

24370-035 – Niterói, RJ – Brasil

E-mail:

brcnascimento@gmail.com

Artigo recebido em 30/04/11; revisado recebido em 03/05/11; aceito em 20/01/12.

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BACKGROUND: The sympathetic nervous system is of great importance in the pathogenesis of atrial fibrillation in systolic heart failure. The identification of polymorphisms in the beta1-adrenergic receptor gene (ADBR1) represents an important step in understanding this pathogenesis. OBJECTIVE: This study assessed the association between the two functional polymorphisms of the beta1-adrenergic receptor gene (ADBR1), Ser49Gly and Arg389Gly, and the presence of atrial fibrillation in patients with systolic heart failure. METHODS: Case-control study with 144 patients with systolic heart failure, including 24 with atrial fibrillation (cases) and 120 without atrial fibrillation (controls). Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and the genotypes of Ser49Gly and Arg389Gly polymorphisms were identified in all individuals by PCR/RFLP (polymerase chain reaction / restriction fragment length polymorphism). RESULTS: Mean age was 59 ± 13 years, 70% of patients were males, 42% had ischemic causes and 74% had hypertension. Genotypes Ser49Ser and Arg389Arg were significantly associated with atrial fibrillation (p = 0.005 and p = 0.01, respectively). After logistic regression, both adjusted for left atrial size and age, the significant association persisted (Arg389Arg - odds ratios: 2.78, 95% confidence interval = 1.02 to 7.56 and Ser49Ser - odds ratios: 8.02, 95% confidence interval = 1.02 to 63.82). CONCLUSION: Both genotypes were associated with atrial fibrillation in patients; however, only Ser49Gly polymorphism was is in Hardy-Weinberg equilibrium.

 Atrial fibrillation heart failure polymorphism, genetic genotype

Beta1-adrenergic receptor polymorphisms associated with Atrial Fibrillation in Systolic Heart Failure

Bruno Costa do Nascimento; Sabrina Bernardez Pereira; Georgina Severo Ribeiro; Evandro Tinoco Mesquita

Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: The sympathetic nervous system is of great importance in the pathogenesis of atrial fibrillation in systolic heart failure. The identification of polymorphisms in the beta1-adrenergic receptor gene (ADBR1) represents an important step in understanding this pathogenesis.

OBJECTIVE: This study assessed the association between the two functional polymorphisms of the beta1-adrenergic receptor gene (ADBR1), Ser49Gly and Arg389Gly, and the presence of atrial fibrillation in patients with systolic heart failure.

METHODS: Case-control study with 144 patients with systolic heart failure, including 24 with atrial fibrillation (cases) and 120 without atrial fibrillation (controls). Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and the genotypes of Ser49Gly and Arg389Gly polymorphisms were identified in all individuals by PCR/RFLP (polymerase chain reaction / restriction fragment length polymorphism).

RESULTS: Mean age was 59 ± 13 years, 70% of patients were males, 42% had ischemic causes and 74% had hypertension. Genotypes Ser49Ser and Arg389Arg were significantly associated with atrial fibrillation (p = 0.005 and p = 0.01, respectively). After logistic regression, both adjusted for left atrial size and age, the significant association persisted (Arg389Arg - odds ratios: 2.78, 95% confidence interval = 1.02 to 7.56 and Ser49Ser - odds ratios: 8.02, 95% confidence interval = 1.02 to 63.82).

CONCLUSION: Both genotypes were associated with atrial fibrillation in patients; however, only Ser49Gly polymorphism was is in Hardy-Weinberg equilibrium.

Keywords: Atrial fibrillation / genetics; heart failure / complications; polymorphism, genetic; genotype.

Introduction

Atrial fibrillation (AF) and Systolic Heart Failure (SHF) frequently coexist because of common risk factors and similar pathogenic process1,2. The high incidence of AF in patients with SHF may be influenced by numerous factors, including: (i) the hemodynamic effects, especially atrial dilation and diastolic dysfunction, (ii) neurohumoral activation, and (iii) inflammation and oxidative stress. AF can cause SHF (tachycardiomyopathy) or be responsible for its deterioration. The coexistence of AF and SHF is associated with adverse prognosis, such as disease progression, more hospitalizations, cerebrovascular accidents and death3-6.

The association between FA and SHF has been extensively studied. However, the pathophysiological knowledge remains incomplete and some aspects need further investigation. Currently, the study of genetics proposes that for a considerable number of cardiovascular diseases, susceptibility is related, in part, to genetic polymorphisms, particularly those related to neurotransmitter receptors. Considering the alterations that genetic variations of the beta1-adrenergic receptor can cause in the adrenergic system functions and the impact on predisposition to disease, these polymorphisms have been linked to propensity, evolution and outcome of several heart diseases, including HF7. The central role of the sympathetic nervous system and its receptors in HF makes the study of genetic polymorphisms of these receptors (Arg389Gly and Ser49Gly) an important step towards a better understanding of this pathogenesis8,9.

Some studies have associated the genotype Arg389Arg to higher adrenergic response in physiological states and in acute stages of cardiovascular disease. Moreover, it is associated with increased incidence of ventricular tachycardia10-15. Ser49Ser The genotype is associated with lower down-regulation of beta1-adrenergic receptors and, therefore, shows high levels of expression agonist in chronic diseases with increased adrenergic activity, such as HF. Furthermore, this genotype is associated with adverse events in patients with HF15-19.

Our study evaluated the association between ADBR1 gene polymorphisms and presence of AF in patients with SHF.

Methods

We conducted an observational, case-control study in patients with systolic HF, from the HF clinic of Universidade Federal Fluminense. The case group consisted of 24 patients with atrial fibrillation and the control group, of 120 without the arrhythmia. The aim of this study was to evaluate the association between genotypes Arg389Arg and Ser49Ser and AF in patients with systolic HF.

Patients were included when they were admitted at the HF outpatient clinic. The study involved the following steps: (i) registration of clinical and demographic data of cases and controls, (ii) blood sampling for genetic analysis of beta-adrenergic receptors, and (iii) analysis of demographic, clinical, laboratory, echocardiographic data and genotypes in relation to groups of cases and controls.

Inclusion criteria were age > 18 years, patients with history and physical examination compatible with HF and ejection fraction (LVEF) < 50% by the echocardiographic method of Simpson. Exclusion criteria were patients with indication of or undergoing cardiac resynchronization therapy, active myocarditis, episode of aborted sudden death or presence of defibrillator and indication for angioplasty or coronary artery bypass surgery.

Peripheral blood samples were obtained for DNA isolation and genotyping. Demographic data were recorded: sex, age and self-reported ethnicity. Clinical data were assessed: presence of systemic arterial hypertension (SAH), diabetes mellitus, coronary artery disease (CAD) and use of cardiovascular medication.

Patients with a history of acute myocardial infarction, coronary angioplasty, CABG, coronary artery disease confirmed by coronary angiography and positive provocative test for myocardial ischemia were considered as having CAD. All patients were functionally evaluated according to the New York Heart Association (NYHA). Echocardiographic assessment was performed at baseline by two experienced echocardiographists, according to the guidelines of the European Society of Cardiology20. The analyses performed were: (i) systolic and left ventricular end-diastolic diameter (ii) size of the left atrium (LA), and (iii) LVEF by Simpson's method (Vivid 3, GE Medical Systems Ultrasound, Wisconsin, USA). Heart rate was recorded by means of standard 12-lead electrocardiogram at patient admission to diagnose AF.

The samples were submitted to lysis with 1000 mL of Tris-1 (Tris-HCl 10mM pH 8.0, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 2mM pH 8.0) containing Triton X-100 at 2.5%. After centrifugation at 5,000 rpm for 5 minutes in a centrifuge Beckman® the cell nuclei were lysed with 200 ml of Tris-2 containing SDS at 1%. Proteins were removed by saline precipitation with 100 ml of 5M NaCl. The DNA present in the supernatant was isolated by ethanol precipitation, and finally resuspended in 100 µL of TE (Tris-HCl 10mM and 1mM EDTA, pH 8.0) and kept at -20 ° C until the time of use. After extraction, the integrity of the DNA samples was analyzed by an electrophoresis system (BIO RAD electrophoresis) in agarose gel at 0.8% in TBE 1X buffer (Tris-HCl 90mm, boric acid 90mm and 2mM EDTA) and stained with ethidium bromide. ADBR1 gene polymorphisms (Arg389Gly and Ser49Gly) of the beta1-adrenergic receptor were analyzed by PCR/RFLP (polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism)21,22.

The PCR reaction was performed in a total volume of 25 µL and the following was used: 50-100 ng of genomic DNA, after concentration adjustment, 1U of Fermentas Taq DNA polymerase, reaction buffer (KCl 50mM, MgCl2 1,5mM, Tris-HCl 10mM), 200 mM of each deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 15 pmol of each oligonucleotide. The amplification and digestion conditions for the identification of polymorphisms are detailed in Table 1. The wild-type allele was defined according to the frequency of the study population.

Statistical analysis was performed using the SPSS statistical software, release 17.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Continuous data were expressed as mean ± standard deviation (SD) and categorical variables as absolute numbers and percentage. The chi-square test was performed to analyze the deviation from Hardy-Weinberg equilibrium regarding the distribution of genotypes of beta-1-adrenergic receptor polymorphisms and to investigate their association with the presence of AF. The Hardy-Weinberg Law describes the principle of genetic equilibrium in a population. This equilibrium will occur if in a given population, over the generations, both allele frequencies and genotype frequencies remain at the same proportion. For that to occur there must be forces that will favor the formation of another gamete, such as migration, mutation or natural selection.

To verify whether there is a significant association between clinical, laboratory, and echocardiographic variables and those of polymorphisms (Arg389Arg and Ser49Ser) with AF, the following methods were applied: (i) the chi-square test (2) or Fisher's exact test was applied for comparisons of categorical data; and (ii) Student's t test for independent samples or the Mann-Whitney test (nonparametric) were used to compare numerical data. The homogeneity of variance was tested using Levene test.

The logistic regression analysis was performed to identify the significant independent variables that are associated with AF. The criterion for determining significance was set at 5%.

This study was performed in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. The protocol was approved by a research ethics committee and all patients signed a free and informed consent form before enrolling in the study, for which there was no funding source.

Results

Clinical characteristics of patients are shown in Table 2. One hundred and forty-four patients were included in the study. The group of cases, patients with AF, consisted of 24 patients (17%). The mean age was 59 ± 13 years, 70% were males and 50% were non-Blacks. Regarding comorbidities, CAD occurred in 42% of patients, hypertension in 74% and diabetes mellitus in 34%. All patients were symptomatic at baseline, 25% of them presenting in functional class III or IV according to NYHA. Ninety-four percent were treated with angiotensin-converting enzyme inhibitor or an angiotensin-receptor blocker; 58%, with an aldosterone antagonist, 72%, with a beta-blocker and 3%, with amiodarone. The echocardiograms included in the study showed a prevalence of patients with severe systolic LV dysfunction (mean LVEF = 35.3 ± 9.3%) and enlarged left atrium (4.7 ± 1.2 cm).

The data on allelic and genotype frequencies are listed in Table 3. The study population was in Hardy-Weinberg equilibrium in relation to the polymorphism Ser49Gly. However, in relation to the polymorphism Arg389Gly, the population was not in equilibrium, which may be due to the fact that the patients already had a disease (HF) that may have generated it.

Only the genotypes Ser49Ser and Arg389Arg, age and left atrial size were significantly associated with the group of cases (AF) compared to controls (without AF). There was no significant difference, at 5% level, in the proportion of the remaining variables between the two groups.

Initially, the chance of the genotype Ser49Ser being associated with AF was greater than the chance of Ser49Gly and Gly49Gly genotypes (odds ratio = 11.07, confidence interval = 1.44 to 85.02). After logistic regression analysis taking into account age and LA size, the chance remained high (odds ratio = 8.02, confidence interval = 1.02 to 63.82). The chance of the genotype Arg389Arg being associated with AF was also greater than the chance of Gly389Gly and Arg389Gly genotypes (odds ratio = 3.21, confidence interval = 1.29 to 8.04). After logistic regression analysis, taking into account age and LA size, the chance remained high (odds ratio = 2.79, confidence interval = 1.02 to 7.56). Table 4 shows simplified data with odds ratio (OR) and confidence interval (CI) values.

Discussion

The main finding of this study was the association between genotypes Ser49Ser and Arg389Arg, which are involved in states of adrenergic exacerbation10-19 and AF in patients with SHF. The presence of AF in patients with SHF is multifactorial. The sympathetic nervous system and genetic factors related to it, such as beta1-adrenergic receptor polymorphisms, present as an additional variable to be considered in order to explain the association between AF and SHF.

In our study, as well as in other series, the LVEF was not associated with AF in patients with SHF, which did not occur in relation to NYHA functional class, either23-25.

The parameters that were significantly associated with AF were age, LA size, genotype Ser49Ser and genotype Arg389Arg.

The LA increase is classically associated with cardiac remodeling and the physiopathology of AF in patients with SHF, so that it directly contributes to the onset of AF in SHF. Moreover, sympathetic activation that is significantly elevated in patients with SHF also contributes to the pathogenesis of electrical and mechanical remodeling that culminates with the onset of AF26. Another fact to be considered is that the time of permanence of the AF can also, by itself, generate atrial remodeling and cause the enlargement of this cavity. As the start time of the arrhythmia onset could not be obtained, it may have contributed to the increase in the LA.

Age has been described as a factor related to AF23. In this study, the older the age, the greater the chance of its association with AF; however, the statistical significance of this variable with the AF was borderline (p = 0.06).

Regarding the beta1-adrenergic receptor polymorphisms, the Arg389Arg and Ser49Ser genotypes were significantly associated with AF. Physiopathologically, AF and HF are related to greater adrenergic activity. Some aforementioned studies associated these genotypes with states of adrenergic exacerbation10-19, supporting the idea that these genotypes are actually involved in the physiopathology of HF and AF.

The present study showed there is a greater chance of genotype Arg389Arg being related to AF than Arg389Gly and Gly389Gly genotypes. However, the sample lacked Hardy-Weinberg equilibrium, which may have been due to the fact that the patients already had a disease (HF) that may have generated it. This fact weakens the value of the association found in this study.

The finding involving genotype Ser49Ser, however, was more significant than the first one. The chance of this genotype to be associated with atrial fibrillation was eight times higher than the other two genotypes, even after multivariate analysis, and additionally, the sample was in Hardy-Weinberg equilibrium.

The association of AF with heart failure is associated with adverse prognosis. Recently, a meta-analysis involving more than 50,000 patients showed that the presence of AF in patients with HF is independently associated with increased mortality27. The identification of a high risk of developing AF in patients with HF is crucial. The right time to use antithrombotic agents or anticoagulants, and thereby reduce thromboembolic events, and even the use of new antiarrhythmic agents to prevent the exacerbation of HF symptoms caused by the presence of AF are examples of this importance28. The acceleration of gene technology has provided greater understanding of the consequences of genetic variations.

The discovery of genetic polymorphisms of adrenergic receptors and their interactions represent a significant part of this development, contributing to greater understanding of the AF-HF association, concerning the diagnosis, prevention and treatment29. The genesis of these heart diseases is involved in a complex mechanism that may also be related to genetic factors. Thus, the polymorphisms studied here, especially Ser49Gly, which was associated with AF in patients with systolic HF, may contribute to a better understanding of these diseases.

There are some limitations in our study: first, the studied patients are from a single center, in a specific geographical area; second, the number of patients studied could have been higher; third, the study does not allow establishing cause and effect between variables and four, as the diagnosis of AF was carried out only by ECG during the admission consultation, it was not possible to identify the paroxysmal attacks.

Conclusion

Our data add to knowledge about the association between AF in patients with SHF and genotypes of the beta 1-adrenergic receptors. Although the association does not prove causality, there is biological plausibility in the mechanism between the AF and beta 1-adrenergic receptor polymorphisms. If this finding is confirmed in larger studies, these data should contribute to better risk stratification for the development of AF in the context of SHF, and thus, prevent it.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Bruno Costa do Nascimento, from Universidade Federal Fluminense.

References