MicroRNAs (miRNAs) são um grupo recém-descoberto de pequenos RNAs, não codificantes, que representam uma das áreas mais estimulantes da ciência médica moderna por modularem uma enorme e complexa rede regulatória da expressão dos genes.Recentemente, linhas de evidências sugerem que os miRNAs desempenham um papel crucial na patogênese da insuficiência cardíaca. Alguns miRNAs altamente expressos no coração como o miR-1, miR-133 e miR-208 estão fortemente associados ao desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, enquanto o exato papel de miR-21 no sistema cardiovascular permanece controverso. Os níveis séricos de miRNAs circulantes como o miR-423-5p estão sendo avaliados como potenciais biomarcadores no diagnóstico e prognóstico da insuficiência cardíaca.Por outro lado, a manipulação dos níveis de miRNAs usando técnicas como os mimetizadores de miRNAs (miRmimics) e miRNAs antagônicos(antagomiRs) está tornando cada vez mais evidente o enorme potencial dos miRNAs como promissoras estratégias terapêutica sna insuficiência cardíaca.
Instituto do Coração - InCor - HCFMUSP, SP, São Paulo, Brasil
MicroRNAs (miRNAs) são um grupo recém-descoberto de pequenos RNAs, não codificantes, que representam uma das áreas mais estimulantes da ciência médica moderna por modularem uma enorme e complexa rede regulatória da expressão dos genes.Recentemente, linhas de evidências sugerem que os miRNAs desempenham um papel crucial na patogênese da insuficiência cardíaca. Alguns miRNAs altamente expressos no coração como o miR-1, miR-133 e miR-208 estão fortemente associados ao desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, enquanto o exato papel de miR-21 no sistema cardiovascular permanece controverso. Os níveis séricos de miRNAs circulantes como o miR-423-5p estão sendo avaliados como potenciais biomarcadores no diagnóstico e prognóstico da insuficiência cardíaca.Por outro lado, a manipulação dos níveis de miRNAs usando técnicas como os mimetizadores de miRNAs (miR
A síndrome da Insuficiência Cardíaca (IC) é considerada a via final comum de toda cardiopatia e uma importante causa de morte1,2. Essa síndrome possui uma alarmante taxa de mortalidade de aproximadamente 50% em cinco anos, o que pode superar muitos tipos de câncer3. No Brasil, IC representa a maior causa de internação hospitalar por doença cardiovascular, e quando analisadas todas as causas de óbito, representa uma taxa de mortalidade de 6,3%4,5.
A recente descoberta dos microRNAs(miRNAs) os tem colocado entre as áreas mais estimulantes da ciência médica moderna. Os miRNAs são um grupo de pequenos RNAs, não codificadores de proteínas, com aproximadamente 19-25 nucleotídeos de extensão.Diferindo da ampla gama de RNAs codificados pelo genoma humano, essa variedade de RNA tem se destacado por sua singular habilidade de modular uma enorme e complexa rede regulatória da expressão dos genes6.
Recentemente, o papel biológico dos miRNAs no sistema cardiovascular de mamíferos tornou-se um campo de pesquisa de rápida evolução. Vários estudos têm demonstrado o papel crucial dos miRNAs não só no desenvolvimento cardiovascular embrionário, mas também na doença cardiovascular.
O genoma humano codifica uma ampla gama de tipos de RNAs, em que a função da maior parte dessas moléculas foi apenas parcialmente esclarecida ou ainda permanece desconhecida. Juntamente com outras variedades mais comuns de RNA, como o RNAm (RNA mensageiro ou codificador de proteínas) e aqueles com funções estruturais, tais como o RNAt (RNA de transferência) e o RNAr (RNA ribossomal), estão os RNAs não codificadores de proteínas, entre eles os miRNAs.
Sabe-se que os miRNAs geralmente são sintetizados a partir de genes específicos de miRNA ou de determinadas regiões gênicas que não estão associadas à produção de proteínas (introns)7. O processo de maturação dos miRNAs envolve uma complexa via metabólica que se inicia no núcleo e se estende até o citoplasma celular(
Os miRNAs exercem seus efeitos regulatórios através da ligação de seus nucleotídeos aos do RNA mensageiro (RNAm)-alvo em um processo chamado de pareamento. Essa ligação impossibilita que os ribossomos consigam traduzir a informação genética contida no RNAm, acarretando na diminuição da síntese proteica do gene-alvo sem impactar nos níveis correspondentes de RNAm6.
A interação miRNA-RNAm, entretanto, não precisa ser necessariamente perfeita, ou seja, todos os nucleotídeos do miRNA ligados ao RNAm. Normalmente em mamíferos essa ligação é imperfeita. Dessa forma, a não obrigatoriedade de interação completa somado ao fato de os miRNAs possuírem sequências pequenas, um único miRNA pode regular centenas de genes-alvo distintos, além de cooperarem no controle de um único gene-alvo8,9.
O envolvimento dos miRNAs no controle regulatório da expressão gênica e a associação a diferentes funções tornam evidente que os miRNAs podem alterar a progressão de diversas doenças.
Embora as funções biológicas dos miRNAs não estejam totalmente compreendidas, estudos mostraram que alguns miRNAs estão presentes especificamente em determinados tipos de tecidos ou células, incluindo o coração10,11. Por outro lado, miRNAs cuja expressão não são restritas ao coração podem ter um importante papel cardioespecífico12. Com isso, novos miRNAs estão sendo descobertos em outras células que compõem o sistema cardiovascular, tais como fibroblastos, células endoteliais e células musculares lisas, nos quais não podem ser ignoradas quando se estuda a fisiologia do sistema cardiovascular ou sua resposta ao estresse.
Até o momento, parece haver aproximadamente 150-200 miRNAs expressados no sistema cardiovascular.Muitos desses miRNAs são dinamicamente regulados em resposta ao estresse cardíaco agudo, e em alguns casos, em longo prazo durante a resposta compensatória do coração a uma lesão crônica ou sobrecarga hemodinâmica13,14. Assim, há evidências crescentes de que a expressão de miRNAs é uma parte importante do mecanismo de resposta ao estresse agudo do coração, e contribui tanto para a homeostase cardíaca quanto para a doença.
Alguns miRNAs como miR-128, miR-302, miR-367 e miR-499 são potencialmente cardio específicos, porém, mais estudos são necessários para confirmação. Somente o Mirna miR-208 é conhecido como sendo cardio específico e desempenha um papel importante na manutenção do desenvolvimento e função cardíaca15,16. No entanto, estudos recentes demonstraram que em eventos como lesões ao longo do coração esse miRNA pode extravasar para a corrente sanguínea e ser detectado em sangue periférico. Assim, seus níveis de expressão podem estar ligados ao diagnóstico e prognóstico de doenças17,18.
No músculo esquelético, mir-1, mir-133a, mir-133b e mir-206, juntos, correspondem por aproximadamente 25% de toda a expressão de miRNAs e são muitas vezes referidos como miomiRs19. Os miRNAs miR-1, miR-133a e miR-133b são altamente expressados no músculo esquelético e no coração, enquanto o miR-206 é especificamente expressado no músculo esquelético. Todos os quatro miRNAs musculares são induzidos durante a diferenciação do músculo, e desempenham um papel crítico na regulação desse processo20.
A hipertrofia cardíaca é também acompanhada de uma troca do programa genético que leva à reativação de genes cardíacos normalmente expressos no coração de fetos durante o desenvolvimento embrionário21. Em 2007, uma impressionante semelhança foi encontrada entre o padrão de expressão de miRNAs em corações de indivíduos adultos com insuficiência cardíaca e corações de fetos com 12-14 semanas de gestação.Cerca de mais de 80% dos miRNAs analisados foram encontrados regulados similarmente em ambos os corações.As mudanças mais expressivas foram associadas ao aumento da expressão dos miRNAs miR-21, miR-29b, miR-129, miR-210, miR-211, miR-212, miR-423, e redução da expressão de miR-30, miR-182 e miR-52622.
A desregulação de outros miRNAs, entretanto, também vem sendo associada à insuficiência cardíaca (
Além de miR-1, outro miRNA músculo específico, o miR-133, também tem sua expressão reduzida durante a hipertrofia cardíaca24-26. Camundongos com expressão de miR-133 reduzida manifestaram cardiomiopatia, insuficiência cardíaca e uma proliferação anormal dos cardiomiócitos27. Em estudo recente, a expressão de miR-133 foi induzida em um modelo de rato submetido a estímulo hipertrófico agudo. Embora o peso do coração não tenha sido normalizado, outros aspectos da hipertrofia, como apoptose e fibrose foram restaurados aos níveis basais14.
O miR-21 é um dos poucos miRNAs que demonstram um padrão regular de super expressão na insuficiência cardíaca. Da mesma forma, omiR-21 é também altamente expresso em diversos tipos de câncer e linhagens celulares, o que sugere que esse miRNA possui um comportamento comum em resposta ao estresse e ao crescimento patológico de células. No entanto, o papel exato de miR-21 no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca permanece controverso28.
Apesar de os padrões de expressão de alguns miRNAs já serem conhecidos e associados a insuficiência cardíaca, determinados miRNAs podem estar se expressando diferencialmente em certos tipos da doença. Em estudo conduzido por Ikeda e cols.29 foram analisados os padrões de expressão de Mirna sem amostras de miocárdio de pacientes com cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia idiopática e estenose aórtica. Interessantemente, seus resultados demonstram que os subconjuntos de miRNAs são regulados diferencialmente em cada uma das etiologias29. Resultados semelhantes foram também encontrados por Sucharov e cols.30. Esses dados mostram que diferenças nos padrões de expressão dos miRNAs podem ser clinicamente importantes se usadas com propósitos diagnóstico e/ou prognósticos.
Por outro lado, não somente os subconjuntos de miRNAs têm influência sobre o fenótipo: alguns miRNAs específicos parecem ser chaves regulatórias. Em 2006, van Rooij e cols.26 revelaram que o aumento da expressão de miR-195 no miocárdio de camundongos foi suficiente para induzir um crescimento cardíaco patológico e insuficiência cardíaca dentro de várias semanas após o nascimento. Além disso, enquanto nenhum fenótipo foi obtido pelo aumento da expressão de miR-214, miR-24 resultou em letalidade embrionária. Este estudo indica que alguns miRNAs específicos podem desempenhar papéis determinantes no programa de hipertrofia cardíaca26.
Os medicamentos administrados ao paciente também devem ser levados em conta. Ao utilizar o peixe zebra como modelo, Sanchez-Simon e cols.31 demonstraram que a morfina regula a diferenciação de neurônios dopaminérgicos por meio da redução dos níveis de expressão de miR-133b31. Apesar de o peixe zebra ser evolutivamente distante do homem, esse dado indica que os medicamentos podem influenciar a expressão dos miRNAs.
Em razão de muitos miRNAs serem tecido específicos, a maioria dos estudos clínicos tem se baseado na mensuração dos níveis de expressão de miRNAs em amostras do tecido de origem.Entretanto,recentemente alguns miRNAs também foram encontrados na corrente sanguínea e são denominados como miRNAs circulantes ou c-miRNA. Os mecanismos envolvidos na liberação dos miRNAs no sangue permanecem não bem compreendidos.O fato de que esses c-miRNAs podem ser detectados em sangue periférico os tornam potencialmente utilizáveis para testes rápidos e fáceis, auxiliando o diagnóstico ou guiando terapias.
O primeiro estudo em camundongos mostrou que o nível plasmático de miR-208 (Mirna cardio específico)está relacionado com a lesão do miocárdio, sendo detectável após a indução dessa lesão18. Em humanos, os miRNAsmiR-132,33, miR-13334, miR-208a35 e miR-49936 foram propostos como bons biomarcadores de infarto agudo do miocárdio, apresentando níveis plasmáticos significativamente mais elevados quando comparados a pacientes sem a condição.
Cheng e cols.32 relataram que os perfis de miRNAs no miocárdio são expressos diferencialmente na dependência da etiologia da insuficiência cardíaca, sugerindo que cada forma etiológica é caracterizada por um perfil de expressão de miRNA distinto32. Porém, a necessidade de um procedimento invasivo para obtenção de amostras do miocárdio torna a aplicação clínica dessa abordagem muito limitada. No entanto, uma recente evidência demonstrou que o c-miRNA miR-423-5p apresenta uma expressão aumentada durante a insuficiência cardíaca e pode ser usado como um biomarcador37.
Em 2009, Matkovich e cols. avaliaram o perfil de expressão de miRNAs em pacientes com insuficiência cardíaca antes e depois de tratamento comdispositivosde assistência ventricular esquerda. Curiosamente, 71,4% dos miRNAs diferencialmente regulados na insuficiência cardíaca foram normalizados após o tratamento38. Esses resultados sugerem que os miRNAs podem servir como marcadores de recuperação do miocárdio em pacientes com insuficiência cardíaca avançada.
Recentemente, duas estratégias terapêuticas envolvendo o conhecimento acerca dos miRNAs têm sido estudadas: o uso de antagomirs e mimetizadores de miRNA (
Em um estado patológico em que determinados miRNAs estejam super expressados, a primeira coisa que se pensa é como intervir no efeito causado pelo aumento excessivo da expressão desses miRNAs. Para esse propósito foi desenvolvido uma classe de antimiRNAs chamada antagomirs.
Os antagomirs são pequenas sequências nucleotídicas antagônicas, de fitas simples, sintetizadas artificialmente para ser perfeitamente complementares a um miRNA maduro específico. Quando injetados sistêmica ou localmente, os antagomirs interagem com os miRNAs no citoplasma e hibridizam especificamente com o miRNA maduro alvo dificultando a ligação do miRNA com o seu respectivo RNAm. Dessa forma, os antagomirs atuam como inibidores competitivos de miRNAe levam a uma diminuição do efeito causado pelo aumento excessivo da expressão de determinadosmiRNAs39.
Longe de ser utópica, essa estratégia terapêutica já vem sendo estudada por diversos pesquisadores. Em estudo pioneiro, Thum e cols.40 induziram ratos à hipertrofia cardíaca por meio de sobrecarga de pressão. Após três semanas foi administrado um antagomir desenvolvido para inibir funcionalmente o miR-21 (miRNAsuperexpressado em fibroblastos cardíacos durante a hipertrofia). Como resultado, foi observado que os ratos apresentaram uma regressão significativa da hipertrofia cardíaca e fibrose, além da atenuação do comprometimento da função cardíaca40. Outra abordagem de sucesso foi publicada em 2011 por Montgomery e cols.41 em que o antimiR-208a foi administrado sistemicamente durante a hipertensão induzida por insuficiência cardíaca em ratos hipertensos levando a um potente silenciamento de miR-208a no coração. A inibição terapêutica de miR-208a evitou a alteração patológica da miosina e remodelamento cardíaco, melhorando a função cardíaca e a sobrevida41.
Esses resultados demonstram que o uso de antagomirs pode ser útil na prevenção e/ou reversão da hipertrofia cardíaca. No entanto, a maioria dos estudos até a data concentrou-se em "silenciar" apenas miRNAs isolados. Porém, tendo em vista que mais de um miRNA pode estar envolvido no processo patológico, provavelmente diversos miRNAs terão de ser silenciados para a obtenção de uma terapia eficaz.
Assim como o aumento da expressão de alguns miRNAs pode estar relacionado ao desencadeamento de processos patogênicos, a diminuição da expressão de miRNAs específicos também pode levar a um estado patológico.
A intervenção a ser feita para normalizar o nível de expressão destes miRNAs, no entanto, é baseada na administração de moléculas que irão mimetizar funcionalmente os miRNAs naturais.
Os mimetizadores de miRNA (
A reposição de miRNAs, no entanto, está sujeita a um obstáculo adicional: a especificidade. Os mimetizadores de miRNA devem atuar apenas sobre o tecido alvo. De outra forma, como no caso de serem administrados sistemicamente, poderiam resultar em um ou mais miRNAs exercendo função regulatória em tecidos em que esses miRNAs normalmente não são expressos. Essa regulação errônea provavelmente levaria ao desencadeamento de efeitos colaterais.
Para superar esse obstáculo, são necessários sistemas de administração mais complexos e precisos. Para tal, o emprego de vetores virais vem sendo promissor. Esses vetores são produzidos pela bioengenharia a partir de vírus não patogênicos pertencentes à família Parvovirida e que possuem uma alta afinidade pelo miocárdio43.
Assim como os antagomirs, a eficácia terapêutica dos mimetizadores de Mirna também vem sendo estudada. Em estudo conduzido por Suckau e cols., um vetor viral otimizado com mimetizadores foi utilizado com sucesso em ratos com pressão de sobrecarga. Como resultados, os autores observaram que houve uma normalização da dilatação cardíaca e uma redução significativa da hipertrofia cardíaca, diâmetro dos cardiomiócitos e fibrose cardíaca44.
A compreensão da biologia dos miRNAs e o seu papel nos processos patogênicos é uma nova e estimulante fronteira na medicina cardiovascular. Está cada vez mais evidente o potencial dos miRNAs como novas ferramentas no diagnóstico e prognóstico, assim como promissoras estratégias terapêuticas em muitas subáreas da cardiologia, incluindo a insuficiência cardíaca. Entretanto, antes de se tornarem uma realidade, muitos estudos ainda são necessários. Ultrapassado os obstáculos, as terapêuticas baseadas em miRNA podem tornar-se parte do arsenal do cardiologista no tratamento, diagnóstico e prognóstico da insuficiência cardíaca.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Vagner Oliveira Carvalho Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44 - Laboratório de Insuficiência Cardíaca e Transplante - InCor - Bloco 1, 1º Andar 05403-900, São Paulo, SP, Brasil E-mail:
Artigo recebido em 31/08/11; revisado recebido em 25/10/11; aceito em 10/11/2011.
MicroRNAs (miRNAs) are a group of newly discovered small RNAs, non-coding, which represent one of the most exciting areas of modern medical science as they modulate a huge and complex regulatory network of gene expression. Lines of evidence have recently suggested that miRNAs play a key role in the pathogenesis of heart failure. Some miRNAs highly expressed in the heart, such as miR-1, miR-133 and miR-208, are strongly associated with the development of cardiac hypertrophy, while the exact role of miR-21 in the cardiovascular system remains controversial. Serum levels of circulating miRNAs such as miR-423-5p are being evaluated as potential biomarkers in the diagnosis and prognosis of heart failure. On the other hand, the manipulation of levels of miRNAs using techniques such as mimicking the miRNAs (miRmimics) and antagonistic miRNAs (antagomiRs) is making increasingly evident the enormous potential of miRNAs as promising therapeutic strategies in heart failure.
Instituto do Coração - InCor - HCFMUSP, SP, São Paulo, Brazil
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MicroRNAs (miRNAs) are a group of newly discovered small RNAs, non-coding, which represent one of the most exciting areas of modern medical science as they modulate a huge and complex regulatory network of gene expression. Lines of evidence have recently suggested that miRNAs play a key role in the pathogenesis of heart failure. Some miRNAs highly expressed in the heart, such as miR-1, miR-133 and miR-208, are strongly associated with the development of cardiac hypertrophy, while the exact role of miR-21 in the cardiovascular system remains controversial. Serum levels of circulating miRNAs such as miR-423-5p are being evaluated as potential biomarkers in the diagnosis and prognosis of heart failure. On the other hand, the manipulation of levels of miRNAs using techniques such as mimicking the miRNAs (miR
The syndrome of heart failure (HF) is considered the final common pathway of every heart disease and a major cause of death1,2. This syndrome has an alarming mortality rate of approximately 50% in five years, which can overcome many types of cancer3. In Brazil, HF represents a major cause of hospitalization for cardiovascular disease, and when considering all causes of death, it represents a mortality rate of 6.3%4,5.
The recent discovery of microRNAs (miRNAs) has placed them among the most exciting areas of modern medical science. MiRNAs are a group of small RNAs, non protein encoders, with approximately 19-25 nucleotides of extension. Differing from the wide range of RNAs encoded by the human genome, this type of RNA has been noted for its unique ability to modulate an enormous and complex regulatory network of gene expression6.
The biological role of miRNAs in the cardiovascular system of mammals has recently become a research field of rapid evolution. Several studies have demonstrated the crucial role of miRNAs not only in embryonic cardiovascular development, but also in cardiovascular disease.
The human genome encodes a broad range of types of RNAs, in which the function of most of these molecules has been only partially elucidated and remains unknown. Along with other more common types of RNA such as mRNA (messenger RNA or protein-coding RNA) and those with structural functions, such as tRNA (transfer RNA) and rRNA (ribosomal RNA) are the non-protein-coding RNAs, including the miRNAs.
It is known that miRNAs are usually synthesized from miRNA-specific genes or specific genetic regions that are not associated with the production of proteins (introns)7. The maturation of miRNAs involves a complex metabolic pathway that begins in the nucleus and extends to the cell cytoplasm (
MiRNAs exert their regulatory effects by binding their nucleotides to those of the target messenger RNA (mRNA) in a process called pairing. This binding prevents the ribosomes from translating the genetic information contained in the mRNA, resulting in decreased protein synthesis of the target gene without impacting the corresponding levels of RNAm6.
The miRNA-mRNA interaction, however, does not necessarily need to be perfect, i.e., all miRNA nucleotides bound to the mRNA. In mammals, this binding is usually imperfect. Therefore, lack of necessity for a complete interaction coupled with the fact that miRNAs have small sequences, a single miRNA can regulate hundreds of target genes, and cooperate in control of a single target gene8,9.
The involvement of miRNAs in regulatory control of gene expression and association with different functions make it clear that miRNAs can alter the progression of several diseases.
Although the biological functions of miRNAs are not fully understood, studies have shown that some miRNAs are specifically present in certain tissues or cell types, including the heart10,11. On the other hand, miRNAs whose expression is not restricted to the heart can have an important heart-specific role12. Therefore, new miRNAs are being discovered in other cells that make up the cardiovascular system, such as fibroblasts, endothelial cells and smooth muscle cells, which cannot be ignored when studying the physiology of the cardiovascular system or its response to stress.
So far, there seems to be about 150-200 miRNAs expressed in the cardiovascular system. Many of these miRNAs are dynamically regulated in response to acute cardiac stress and in some cases during long-term compensatory response of the heart to a chronic injury or hemodynamic overload13,14. Therefore, there is growing evidence that the expression of miRNAs is an important part of the mechanism of response to acute stress of the heart, contributing both to cardiac homeostasis and to the heart disease.
Some miRNAs such as miR-128, miR-302, miR-367 and miR-499 are potentially heart-specific, but more studies are needed for confirmation. Only the miRNAmiR-208 is known as heart-specific and plays an important role in the maintenance of heart development and function15,16. However, recent studies have shown that in long events such as heart injuries, this miRNA can flow into the bloodstream and be detected in peripheral blood. Thus, its levels of expression may be linked to the diagnosis and prognosis of diseases17,18.
In the skeletal muscle, mir-1, mir-133A, miR-133b and miR-206, together, account for approximately 25% of the expression of miRNAs and are often referred to as miomiRs19. The miRNAs miR-1, miR-133a and miR-133b are highly expressed in the skeletal muscle and in the heart, while the miR-206 is specifically expressed in skeletal muscle. All four muscle miRNAs are induced during muscle differentiation and play a critical role in the regulation of this process20.
Cardiac hypertrophy is also accompanied by an exchange of the genetic program that leads to the reactivation of cardiac genes normally expressed in fetal heart during embryonic development21. In 2007, a striking similarity was found between the expression pattern of miRNAs in hearts of adult individuals with heart failure and hearts of fetuses at 12-14 weeks of gestation. About 80% of miRNAs analyzed were found similarly regulated in both hearts. The most significant changes were associated with increased expression of miR-21, miR-29b, miR-129, miR-210, miR-211, miR-212, miR-423 miRNAs, and reduced expression of miR-30, miR-182 e miR-52622.
Deregulation of other miRNAs, however, has also been associated with heart failure (
In addition to miR-1, another muscle-specific miRNA, the miR-133, also has reduced expression during cardiac hypertrophy24-26. Mice with reduced expression of miR-133 showed cardiomyopathy, heart failure and an abnormal proliferation of cardiomyocytes27. In a recent study, the expression of miR-133 was induced in a rat model subjected to acute hypertrophic stimulus. Although the weight of the heart has not been standardized, other aspects of hypertrophy, such as apoptosis and fibrosis were restored to basal levels14.
The miR-21 is one of the few miRNAs that show a regular pattern of over-expression in heart failure. Likewise, the miR-21 is also highly expressed in many cancers and cell lines, suggesting that this miRNA has a common behavior in response to stress and pathological growth of cells. However, the exact role of miR-21 in the development of cardiac hypertrophy remains controversial28.
Although the expression patterns of some miRNAs are already known and associated with heart failure, certain miRNAs may be are differentially expressed in certain types of disease. A study by Ikeda et al29 analyzed the expression patterns of miRNAs in myocardial samples of patients with ischemic cardiomyopathy, idiopathic cardiomyopathy and aortic stenosis. Interestingly, their results show that subsets of miRNAs are differentially regulated in each etiology29. Similar results were also found by Sucharov et al30. These data show that differences in expression patterns of miRNAs may be clinically important if used for the purposes of diagnosis and/or prognosis.
On the other hand, not only the subsets of miRNAs have influence on the phenotype: some specific miRNAs appear to be key regulators. In 2006, van Rooij et al26 showed that the increased expression of miR-195 in the myocardium of mice was sufficient to induce a pathological cardiac growth and heart failure within several weeks after birth. Moreover, while no phenotype was obtained by increasing expression of miR-214, miR-24 resulted in embryonic lethality. This study indicates that some specific miRNAs may play determining roles in cardiac hypertrophy26.
The drugs prescribed to the patient must also be taken into account. By using the zebrafish as a model, Simon-Sanchez et al31 demonstrated that morphine regulates the differentiation of dopaminergic neurons through the reduction of expression levels of miR-133b.31 Although the zebrafish is evolutionarily distant from man, this data indicates that the drugs may influence the expression of miRNAs.
Because many miRNAs are tissue specific, most clinical studies have been based on the measurement of expression levels of miRNAs in origin tissue samples. However, some miRNAs were recently found in the bloodstream and are referred to as circulating or c-miRNAs. The mechanisms involved in the release of miRNAs in the blood are not well understood. The fact that these c-miRNAs can be detected in peripheral blood make them potentially useful for fast and easy tests, assisting the diagnosis or guiding therapy.
The first study in mice showed that the plasma level of miR-208 (heart-specific miRNA) is related to myocardial injury and is detectable after induction of this injury18. In humans, the miRNAs miR-132,33, miR-13334, miR-208a35 and miR-49936 have been proposed as good biomarkers of acute myocardial infarction, showing significantly higher plasma levels compared to patients without this condition.
Cheng et al32 reported that the profiles of miRNAs are differentially expressed in the myocardium based on the etiology of heart failure, suggesting that each form of etiology is characterized by a distinct expression profile of miRNA32. However, the need for an invasive procedure to obtain samples from the myocardium makes the clinical application of this approach very limited. However, recent evidence has shown that the c-miRNA miR-423-5p shows an increased expression during heart failure and can be used as a biomarker37.
In 2009, Matkovich et al. evaluated the expression profile of miRNAs in heart failure patients before and after treatment with left ventricular assistance devices. Interestingly, 71.4% of miRNAs differentially regulated in heart failure were normalized after treatment38. These results suggest that miRNAs may serve as markers of myocardial recovery in patients with advanced heart failure.
Two therapeutic strategies involving the knowledge of miRNAs have been recently studied: the use of antagomirs and miR-mimics. These strategies are based on the normalization of tissue level of specific miRNAs, silencing those who have over-expressed or replacing those that have a deficit in expression in pathological processes (
In a pathological condition in which certain miRNAs are over expressed, the first thing one think is how to intervene in the effect caused by the excessive increase in the expression of these miRNAs. For this purpose, a class of antimiRNAs called antagomirs was developed.
Antagomirs are small antagonistic nucleotide sequences, of single strands, artificially synthesized to be perfectly complementary to a specific mature miRNA. When injected systemically or locally, antagomirs interact with miRNAs in the cytoplasm and hybridize specifically to the target mature miRNA making it difficult to bind the miRNA with its respective mRNA. Thus, the antagomirs act as competitive inhibitors of miRNA and lead to a decrease in the effect caused by excessive increase in the expression of certain miRNAs39.
Far from being utopian, this therapeutic strategy has already been studied by many researchers. In a pioneering study, Thum et al40 induced mice to cardiac hypertrophy through pressure overload. After three weeks, the mice received antagomir designed to functionally inhibit miR-21 (miRNAs over-expressed in cardiac fibroblasts during hypertrophy). As a result, it was observed that the mice showed a significant regression of cardiac hypertrophy and fibrosis, as well as attenuation of impairment of cardiac function40. Another successful approach was published in 2011 by Montgomery et al41. in which the antimiR-208a was systemically administered during hypertension induced by heart failure in hypertensive rats leading to a potent silencing of miR-208a in the heart. The therapeutic inhibition of miR-208a avoided the pathological change of myosin and cardiac remodeling, improving cardiac function and survival41.
These results demonstrate that the use of antagomirs can be useful in preventing and/or reversing cardiac hypertrophy. However, most studies to date have focused on "silencing" only isolated miRNAs. However, considering that more than one miRNA may be involved in the pathological process, probably several miRNAs must be silenced to obtain an effective therapy.
Just as the increased expression of some miRNAs may be related to the outbreak of pathogenic processes, decreased expression of specific miRNAs can also lead to a pathological state.
The intervention to be made to normalize the level of expression of these miRNAs, however, is based on the administration of molecules that will functionally mimic natural miRNAs.
The miRmimics are short double-strand artificial nucleotide sequences that resemble miRNA precursors (pre-miRNA). When introduced into cells, the miR-mimics are recognized by the miRNA biogenesis machinery and processed by the enzyme Dicer, and then incorporated into the RISC enzyme complex. Thus, the mimics will work as a replacement of little expressed miRNAs by regulating the target mRNA as endogenous miRNAs42.
The replacement of miRNAs, however, is subject to an additional obstacle: specificity. The miR-mimics should act only on the target tissue. Otherwise, as if administered systemically, they could result in one or more miRNAs exercising regulatory function in tissues where these miRNAs are not normally expressed. This erroneous regulation would likely lead to triggering side effects.
To overcome this obstacle, more complex and accurate management systems are required. To this end, the use of viral vectors has proven to be promising. These vectors are produced by bioengineering from non-pathogenic viruses belonging to the Parvovirida family and have a high affinity with the myocardium43.
Like antagomirs, the therapeutic effectiveness of miR-mimics is also being studied. In a study by Suckau et al., a viral vector optimized with mimics has been successfully used in rats with pressure overload. As a result, the authors observed that there was a normalization of cardiac dilation and a significant reduction of cardiac hypertrophy, cardiomyocyte diameter and cardiac fibrosis44.
Understanding the biology of miRNAs and their role in pathogenic processes is an exciting new milestone in cardiovascular medicine. The potential of miRNAs is increasingly evident as new tools in the diagnosis and prognosis, as well as promising therapeutic strategies in many sub-areas of cardiology, including heart failure. However, before becoming a reality, many studies are still needed. Overcoming obstacles, miRNA-based therapies can become part of the arsenal of cardiologists in the treatment, diagnosis and prognosis of heart failure.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This study is not associated with any post-graduation program.
MicroRNAs(miRNAs) son un grupo recién descubierto de pequeños RNAs, no codificantes, que representan una de las áreas más estimulantes de la ciencia médica moderna por modular en una enorme y compleja red regulatoria de la expresión de los genes. Recientemente, líneas de evidencias sugieren que los miRNAs desempeñan un papel crucial en la patogénesis de la insuficiencia cardíaca. Algunos miRNAs altamente expresados en el corazón como el miR-1, miR-133 y miR-208 están fuertemente asociados al desarrollo de la hipertrofia cardíaca, mientras que el exacto papel de miR-21 en el sistema cardiovascular permanece controvertido. Los niveles séricos de miRNAs circulantes como el miR-423-5p están siendo evaluados como potenciales biomarcadores en el diagnóstico y pronóstico de la insuficiencia cardíaca. Por otro lado, la manipulación de los niveles de miRNAs usando técnicas como los mimetizadores de miRNAs (miRmimics) y miRNAs antagónicos (antagomiRs) está volviendo cada vez más evidente el enorme potencial de los miRNAs como promisorias estrategias terapéuticas en la insuficiencia cardíaca.
Instituto do Coração - InCor - HCFMUSP, SP, São Paulo, Brasil
Correspondencia
MicroRNAs(miRNAs) son un grupo recién descubierto de pequeños RNAs, no codificantes, que representan una de las áreas más estimulantes de la ciencia médica moderna por modular en una enorme y compleja red regulatoria de la expresión de los genes. Recientemente, líneas de evidencias sugieren que los miRNAs desempeñan un papel crucial en la patogénesis de la insuficiencia cardíaca. Algunos miRNAs altamente expresados en el corazón como el miR-1, miR-133 y miR-208 están fuertemente asociados al desarrollo de la hipertrofia cardíaca, mientras que el exacto papel de miR-21 en el sistema cardiovascular permanece controvertido. Los niveles séricos de miRNAs circulantes como el miR-423-5p están siendo evaluados como potenciales biomarcadores en el diagnóstico y pronóstico de la insuficiencia cardíaca. Por otro lado, la manipulación de los niveles de miRNAs usando técnicas como los mimetizadores de miRNAs (miR
El síndrome de Insuficiencia Cardíaca (IC) es considerada la vía final común de toda cardiopatía y una importante causa de muerte1,2. Ese síndrome posee una alarmante tasa de mortalidad de aproximadamente 50% en cinco años, lo que puede superar muchos tipos de cáncer3. En el Brasil, IC representa la mayor causa de internación hospitalaria por enfermedad cardiovascular, y cuando son analizadas todas las causas de óbito, representa una tasa de mortalidad de 6,3%4,5.
El reciente descubrimiento de los microRNAs(miRNAs) los han colocado entre las áreas más estimulantes de la ciencia médica moderna. Los miRNAs son un grupo de pequeños RNAs, no codificadores de proteínas, con aproximadamente 19-25 nucleótidos de extensión. Difiriendo de la amplia gama de RNAs codificados por el genoma humano, esa variedad de RNA se ha destacado por su singular habilidad de modular una enorme y compleja red regulatoria de la expresión de los genes6.
Recientemente, el papel biológico de los miRNAs en el sistema cardiovascular de mamíferos se volvió un campo de investigación de rápida evolución. Varios estudios han demostrado el papel crucial de los miRNAs no sólo en el desarrollo cardiovascular embrionario, sino también en la enfermedad cardiovascular .
El genoma humano codifica una amplia gama de tipos de RNAs, en que la función de la mayor parte de esas moléculas fue apenas parcialmente esclarecida o aun permanece desconocida. Juntamente con otras variedades más comunes de RNA, como el RNAm (RNA mensajero o codificador de proteínas) y aquellos con funciones estructurales, tales como el RNAt (RNA de transferencia) y el RNAr (RNA ribosomal), están los RNAs no codificadores de proteínas, entre ellos los miRNAs.
Se sabe que los miRNAs generalmente son sintetizados a partir de genes específicos de miRNA o de determinadas regiones génicas que no están asociadas a la producción de proteínas (intrones)7. El proceso de maduración de los miRNAs envuelve una compleja vía metabólica que se inicia en el núcleo y se extiende hasta el citoplasma celular (
Los miRNAs ejercen sus efectos regulatorios a través de la ligación de sus nucleótidos a los del RNA mensajero (RNAm)-blanco en un proceso llamado pareamiento. Esa ligación imposibilita que los ribosomas consigan traducir la información genética contenida en el RNAm, acarreando la disminución de la síntesis proteica del gen-blanco sin impactar en los niveles correspondientes de RNAm6.
La interacción miRNA-RNAm, entre tanto, no precisa ser necesariamente perfecta, o sea, todos los nucleótidos del miRNA ligados al RNAm. Normalmente en mamíferos esa ligación es imperfecta. De esa forma, la no obligatoriedad de interacción completa sumada al hecho de que los miRNAs poseen secuencias pequeñas, un único miRNA puede regular centenas de genes-blanco distintos, además de cooperar en el control de un único gen-blanco8,9.
El envolvimiento de los miRNAs en el control regulatorio de la expresión génica y la asociación a diferentes funciones vuelven evidente que los miRNAs pueden alterar la progresión de diversas enfermedades.
Aunque las funciones biológicas de los miRNAs no estén totalmente comprendidas, estudios mostraron que algunos miRNAs están presentes específicamente en determinados tipos de tejidos o células, incluyendo el corazón10,11. Por otro lado, miRNAs cuya expresión no es restringida al corazón pueden tener un importante papel cardioespecífico12 . Con eso, nuevos miRNAs están siendo descubiertos en otras células que componen el sistema cardiovascular, tales como fibroblastos, células endoteliales y células musculares lisas, en los cuales no pueden ser ignoradas cuando se estudia la fisiología del sistema cardiovascular o su respuesta al estrés.
Hasta el momento, parece haber aproximadamente 150-200 miRNAs expresados en el sistema cardiovascular. Muchos de esos miRNAs son dinámicamente regulados en respuesta al estrés cardíaco agudo, y en algunos casos, a largo plazo durante la respuesta compensatoria del corazón a una lesión crónica o sobrecarga hemodinámica13,14 . Así, hay evidencias crecientes de que la expresión de miRNAs es una parte importante del mecanismo de respuesta al estrés agudo del corazón, y contribuye tanto a la homeostasis cardíaca como a la enfermedad.
Algunos miRNAs como miR-128, miR-302, miR-367 y miR-499 son potencialmente cardioespecíficos, sin embargo, más estudios son necesarios para confirmación. Solamente el miRNAmiR-208 es conocido como siendo cardioespecífico y desempeña un papel importante en la manutención del desarrollo y función cardíaca15,16. Mientras tanto, estudios recientes demostraron que en eventos como lesiones a lo largo del corazón ese miRNA puede volcarse a la corriente sanguínea y ser detectado en sangre periférica. Así, sus niveles de expresión pueden estar ligados al diagnóstico y pronóstico de enfermedades17,18.
En el músculo esquelético, mir-1, mir-133a, mir-133b y mir-206, juntos, responden por aproximadamente 25% de toda la expresión de miRNAs y son muchas veces referidos como miomiRs19. Los miRNAs miR-1, miR-133a y miR-133b son altamente expresados en el músculo esquelético y en el corazón, en cuanto el miR-206 es específicamente expresado en el músculo esquelético. Los cuatro miRNAs musculares son inducidos durante la diferenciación del músculo, y desempeñan un papel crítico en la regulación de ese processo20.
La hipertrofia cardíaca es también acompañada de un intercambio del programa genético que lleva a la reactivación de genes cardíacos normalmente expresados en el corazón de fetos durante el desarrollo embrionario21. En 2007, una impresionante semejanza fue encontrada entre el estándar de expresión de miRNAs en corazones de individuos adultos con insuficiencia cardíaca y corazones de fetos con 12-14 semanas de gestación. Cerca de más de 80% de los miRNAs analizados fueron encontrados regulados similarmente en ambos corazones. Los cambios más expresivos fueron asociados al aumento de la expresión de los miRNAs miR-21, miR-29b, miR-129, miR-210, miR-211, miR-212, miR-423, y reducción de la expresión de miR-30, miR-182 y miR-52622.
La desregulación de otros miRNAs, entre tanto, también viene siendo asociada a la insuficiencia cardíaca (
Además de miR-1, otro miRNA musculoespecífico, el miR-133, también tiene su expresión reducida durante la hipertrofia cardíaca24-26. Ratones con expresión de miR-133 reducida manifestaron cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca y una proliferación anormal de los cardiomiocitos27. En estudio reciente, la expresión de miR-133 fue inducida en un modelo de ratón sometido a estímulo hipertrófico agudo. Aunque el peso del corazón no haya sido normalizado, otros aspectos de la hipertrofia, como apoptosis y fibrosis fueron restaurados a los niveles basales14.
El miR-21 es uno de los pocos miRNAs que demuestran un estándar regular de superexpresión en la insuficiencia cardíaca. De la misma forma, el miR-21 es también altamente expresado en diversos tipos de cáncer y linajes celulares, lo que sugiere que ese miRNA posee un comportamiento común en respuesta al estrés y al crecimiento patológico de células. Mientras tanto, el papel exacto de miR-21 en el desarrollo de la hipertrofia cardíaca permanece controvertido28.
A pesar de que los estándares de expresión de algunos miRNAs ya sean conocidos y asociados a la insuficiencia cardíaca, determinados miRNAs pueden estar expresándose diferencialmente en ciertos tipos de la enfermedad. En estudio conducido por Ikeda et al29 fueron analizados los estándares de expresión de miRNAs en muestras de miocardio de pacientes con cardiomiopatía isquémica, cardiomiopatía idiopática y estenosis aórtica. Interesantemente, sus resultados demuestran que los subconjuntos de miRNAs son regulados diferencialmente en cada una de las etiologías29. Resultados semejantes fueron también encontrados por Sucharov et al30. Esos datos muestran que diferencias en los estándares de expresión de los miRNAs pueden ser clínicamente importantes si son usadas con propósitos diagnóstico y/o pronósticos.
Por otro lado, no solamente los subconjuntos de miRNAs tienen influencia sobre el fenotipo: algunos miRNAs específicos parecen ser llaves regulatorias. En 2006, van Rooij et al26 revelaron que el aumento de la expresión de miR-195 en el miocardio de ratones fue suficiente para inducir un crecimiento cardíaco patológico e insuficiencia cardíaca dentro de varias semanas después del nacimiento. Además de eso, en cuanto ningún fenotipo fue obtenido por el aumento de la expresión de miR-214, miR-24 resultó en letalidad embrionaria. Este estudio indica que algunos miRNAs específicos pueden desempeñar papeles determinantes en el programa de hipertrofia cardíaca26.
Los medicamentos administrados al paciente también deben ser tenidos en cuenta. Al utilizar el pez cebra como modelo, Sanchez-Simon et al31 demostraron que la morfina regula la diferenciación de neuronas dopaminérgicas por medio de la reducción de los niveles de expresión de miR-133b31. A pesar de que el pez cebra es evolutivamente distante del hombre, ese dato indica que los medicamentos pueden influenciar la expresión de los miRNAs.
En razón de que muchos miRNAs son tejidoespecíficos, la mayoría de los estudios clínicos se han basado en la medición de los niveles de expresión de miRNAs en muestras del tejido de origen. Entre tanto, recientemente algunos miRNAs también fueron encontrados en la corriente sanguínea y son denominados como miRNAs circulantes o c-miRNA. Los mecanismos envueltos en la liberación de los miRNAs en la sangre permanecen no bien comprendidos. El hecho de que esos c-miRNAs pueden ser detectados en sangre periférica los vuelven potencialmente utilizables para tests rápidos y fáciles, auxiliando el diagnóstico o guiando terapias.
El primer estudio en ratones mostró que el nivel plasmático de miR-208 (miRNAcardioespecífico) está relacionado con la lesión del miocardio, siendo detectable después de la inducción de esa lesión18. En humanos, los miRNAsmiR-132,33 ;, miR-13334, miR-208a35 y miR-49936 fueron propuestos como buenos biomarcadores de infarto agudo de miocardio, presentando niveles plasmáticos significativamente más elevados cuando comparados son a pacientes sin la condición.
Cheng et al.32 relataron que los perfiles de miRNAs en el miocardio son expresados diferencialmente en la dependencia de la etiología de la insuficiencia cardíaca, sugiriendo que cada forma etiológica es caracterizada por un perfil de expresión de miRNA distinto32. Sin embargo, la necesidad de un procedimiento invasivo para obtención de muestras del miocardio vuelve la aplicación clínica de ese abordaje muy limitada. Mientras tanto, una reciente evidencia demostró que el c-miRNAmiR-423-5p presenta una expresión aumentada durante la insuficiencia cardíaca y puede ser usado como un biomarcador37.
En 2009, Matkovich et al. evaluaron el perfil de expresión de miRNAs en pacientes con insuficiencia cardíaca antes y después de tratamiento con dispositivos de asistencia ventricular izquierda. Curiosamente, 71,4% de los miRNAs diferencialmente regulados en la insuficiencia cardíaca fueron normalizados después del tratamento38. Esos resultados sugieren que los miRNAs pueden servir como marcadores de recuperación del miocardio en pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada.
Recientemente, dos estrategias terapéuticas envolviendo el conocimiento acerca de los miRNAs han sido estudiadas: el uso de antagomirs y mimetizadores de miRNA (
En un estado patológico en que determinados miRNAs estén superexpresados, lo primero que se piensa es como intervenir en el efecto causado por el aumento excesivo de la expresión de esos miRNAs. Para ese propósito fue desarrollada una clase de antimiRNAs llamada antagomirs.
Los antagomirs son pequeñas secuencias nucleotídicas antagónicas, de cintas simples, sintetizadas artificialmente para ser perfectamente complementarias a un miRNA maduro específico. Cuando son inyectados sistémica o localmente, los antagomirs interactúan con los miRNAs en el citoplasma e hibridizan específicamente con el miRNA maduro blanco dificultando la ligación del miRNA con su respectivo RNAm. De esa forma, los antagomirs actúan como inhibidores competitivos de miRNA y llevan a una disminución del efecto causado por el aumento excesivo de la expresión de determinados miRNAs39.
Lejos de ser utópica, esa estrategia terapéutica ya viene siendo estudiada por diversos investigadores. En estudio pionero, Thum et al40 indujeron ratones a hipertrofia cardíaca por medio de sobrecarga de presión. Después de tres semanas fue administrado un antagomir desarrollado para inhibir funcionalmente el miR-21 (miRNA superexpresado en fibroblastos cardíacos durante la hipertrofia). Como resultado, fue observado que los ratones presentaron una regresión significativa de la hipertrofia cardíaca y fibrosis, además de la atenuación del compromiso de la función cardíaca40. Otro abordaje de éxito fue publicado en 2011 por Montgomery et al41 en que el antimiR-208a fue administrado sistémicamente durante la hipertensión inducida por insuficiencia cardíaca en ratones hipertensos llevando a un potente silenciamiento de miR-208a en el corazón. La inhibición terapéutica de miR-208a evitó la alteración patológica de la miosina y remodelado cardíaco, mejorando la función cardíaca y la sobrevida41.
Esos resultados demuestran que el uso de antagomirs puede ser útil en la prevención y/o reversión de la hipertrofia cardíaca. Mientras tanto, la mayoría de los estudios hasta la fecha se concentró en "silenciar" apenas miRNAs aislados. Sin embargo, teniendo en vista que más de un miRNA puede estar envuelto en el proceso patológico, probablemente diversos miRNAs tendrán que ser silenciados para la obtención de una terapia eficaz.
Así como el aumento de la expresión de algunos miRNAs puede estar relacionado al desencadenamiento de procesos patogénicos, la disminución de la expresión de miRNAs específicos también puede llevar a un estado patológico.
La intervención a ser hecha para normalizar el nivel de expresión de estos miRNAs, mientras tanto, es basada en la administración de moléculas que mimetizarán funcionalmente los miRNAs naturales.
Los mimetizadores de miRNA (
La reposición de miRNAs, mientras tanto, está sujeta a un obstáculo adicional: la especificidad. Los mimetizadores de miRNA deben actuar apenas sobre el tejido blanco. De otra forma, como en el caso de ser administrados sistémicamente, podrían resultar en uno o más miRNAs ejerciendo función regulatoria en tejidos en que esos miRNAs normalmente no son expresados. Esa regulación errónea probablemente llevaría al desencadenamiento de efectos colaterales.
Para superar ese obstáculo, son necesarios sistemas de administración más complejos y precisos. Para tal, el empleo de vectores virales viene siendo promisorio. Esos vectores son producidos por la bioingeniería a partir de virus no patogénicos pertenecientes a la familia Parvovirida y que poseen una alta afinidad por el miocardio43.
Así como los antagomirs, la eficacia terapéutica de los mimetizadores de Mirna también viene siendo estudiada. En estudio conducido por Suckau et al., un vector viral optimizado con mimetizadores fue utilizado con éxito en ratones con presión de sobrecarga. Como resultados, los autores observaron que hubo una normalización de la dilatación cardíaca y una reducción significativa de la hipertrofia cardíaca, diámetro de los cardiomiocitos y fibrosis cardíaca44.
La comprensión de la biología de los miRNAs y su papel en los procesos patogénicos es una nueva y estimulante frontera en la medicina cardiovascular. Está cada vez más evidente el potencial de los miRNAs como nuevas herramientas en el diagnóstico y pronóstico, así como promisorias estrategias terapéuticas en muchas subáreas de la cardiología, incluyendo la insuficiencia cardíaca. Entre tanto, antes de volverse una realidad, muchos estudios aun son necesarios. Superados los obstáculos, las terapéuticas basadas en miRNA pueden volverse parte del arsenal del cardiólogo en el tratamiento, diagnóstico y pronóstico de la insuficiencia cardíaca.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio no tuve fuentes de financiación externas.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.