abcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCSão Paulo, SP, BrazilNBjSk6CvVHrz35rb9G8PQYyS0066-782X2012000300008S0066-782X(12)0980030810.1590/S0066-782X2012005000014Artigos OriginaisUso de fluorescência em um método de dissector modificado para estimar o número de miócitos no tecido cardíacoNovaesRômulo DiasPenitenteArlete RitaTalvaniAndréNataliAntônio JoséNevesClóvis AndradeMaldonadoIzabel Regina Santos CostaViçosaUniversidade Federal de ViçosaBrazilOuro PretoMinas GeraisUniversidade Federal de Ouro PretoBrazil032012983252258080720112608201118082011This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
FUNDAMENTO: Métodos convencionais de dissector atualmente requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar o número de células, incluindo cardiomiócitos, em uma área de 3D. OBJETIVO: Usar a microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas. MÉTODOS: O estudo empregou camundongos Wistar machos com quatro meses de idade e peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados em grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Os animais do GI foram inoculados com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Após oito semanas, os animais foram pesados e sacrificados. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram removidos para análise estereológica da densidade numérica de cardiomiócitos (Nv [c]) e o número total dessas células no VE (N [c]). Esses parâmetros foram estimados usando um dissector fluorescente (DF) e comparados com os métodos convencionais de dissector óptico (DO) e dissector físico (DFi). RESULTADOS: Em ambos os métodos de dissector, os animais do GI apresentaram queda significativa de Nv[c] e N[c] em comparação com os animais do GC (P > 0,05). Uma correlação forte, igual ou superior a 96%, foi obtida entre DF, DO e DFi. CONCLUSÃO: O método DF parece ser igualmente confiável para determinar Nv[c] e N[c] em condições normais e patológicas, apresentando algumas vantagens em relação aos métodos convencionais de dissector: redução de cortes histológicos e imagens na análise estereológica, redução do tempo de análise das imagens, a construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, distinção de planos de dissector em ampliações inferiores.
separação de célulascitometria de fluxomiócitos cardíacos16022012
Uso de fluorescência em um método de dissector modificado para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco
Rômulo Dias NovaesI; Arlete Rita PenitenteI; André TalvaniII; Antônio José NataliI; Clóvis Andrade NevesI; Izabel Regina Santos Costa MaldonadoI
IUniversidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
IIUniversidade Federal de Ouro Perto, Ouro Preto, MG, Brasil
Correspondência
RESUMO
FUNDAMENTO: Métodos convencionais de dissector atualmente requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar o número de células, incluindo cardiomiócitos, em uma área de 3D.
OBJETIVO: Usar a microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas.
MÉTODOS: O estudo empregou camundongos Wistar machos com quatro meses de idade e peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados em grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Os animais do GI foram inoculados com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Após oito semanas, os animais foram pesados e sacrificados. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram removidos para análise estereológica da densidade numérica de cardiomiócitos (Nv [c]) e o número total dessas células no VE (N [c]). Esses parâmetros foram estimados usando um dissector fluorescente (DF) e comparados com os métodos convencionais de dissector óptico (DO) e dissector físico (DFi).
RESULTADOS: Em ambos os métodos de dissector, os animais do GI apresentaram queda significativa de Nv[c] e N[c] em comparação com os animais do GC (P > 0,05). Uma correlação forte, igual ou superior a 96%, foi obtida entre DF, DO e DFi.
CONCLUSÃO: O método DF parece ser igualmente confiável para determinar Nv[c] e N[c] em condições normais e patológicas, apresentando algumas vantagens em relação aos métodos convencionais de dissector: redução de cortes histológicos e imagens na análise estereológica, redução do tempo de análise das imagens, a construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, distinção de planos de dissector em ampliações inferiores.
Palavras-chave: separação de células, citometria de fluxo, miócitos cardíacos.
Introdução
Nos últimos anos, grandes esforços foram envidados para desenvolver um método confiável e reprodutível para estimar o número de partículas em órgãos e tecidos, mas até 1984, todos esses métodos apresentavam vieses intrínsecos1-3. Em 1984, Sterio descreveu diversas modificações nas abordagens utilizadas para estimar a quantidade de objetos no espaço tridimensional e introduziu o método de dissector4. A maioria dos autores atualmente considera o método de dissector imparcial e fundamentos teóricos bem estabelecidos fazem que o método seja amplamente aceito5-7.
O dissector pode ser obtido por dois métodos diferentes com base nos mesmos princípios teóricos e requisitos básicos para estimar o número de partículas. Esses métodos são o dissector óptico e o dissector físico4,8-10. Embora ambos os métodos possuam vieses reduzidos quanto à estimativa da quantidade de partículas, eles ainda exigiam a aquisição de um grande número de imagens histológicas e muito tempo para realizar as contagens. Particularmente, o dissector óptico também requer um microscópio de luz de alto custo adaptado com fase móvel do eixo Z11. Além disso, o dissector físico é extremamente trabalhoso, pois requer cortes e imagens histológicas com um perfeito alinhamento em diferentes cortes paralelos3,10.
Considerando que o objetivo do projeto de amostragem para a estereologia é obter a quantidade máxima de informações estruturais quantitativas a um determinado custo ou esforço, o objetivo deste estudo foi a utilização de microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas. Assim, um modelo murino de infecção por T. cruzi, que reconhecidamente leva à ruptura de miócitos cardíacos e modifica o número dessas células no miocárdio, foi utilizado12. Nossa hipótese é a de que o método proposto reduziria o custo operacional observado em métodos convencionais, mantendo a precisão das medições de quantidade de células.
Métodos
Animais e os grupos experimentais
Camundongos Wistar machos com quatro meses de idade com peso inicial de 366,25 ± 88,21 g receberam ração para roedores e água ad libitum, e foram mantidos em instalações animais em um ambiente controlado (temperatura a 22 ± 3 ºC, umidade a 60% - 70% e ciclos invertidos de luz/escuridão de 12 horas). Os tamanhos das amostras foram determinados considerando a probabilidade p = 1/2 de ocorrer aumento ou diminuição das variáveis de interesse. Assim, considerando o nível de significância α = 0,05, o número mínimo significativo de animais utilizados na análise estatística foi: p = (02/01)eventos; portanto, se n = 5, p = (1/2)5 ou p = 0,03; então, P < 0,0510. Devido à variabilidade intrínseca do parasitismo em órgãos-alvo e à mortalidade associada à infecção por T. cruzi, um fator de correção de 50% foi incorporado ao cálculo inicial, determinando amostras de oito animais, aleatoriamente alocados nos grupos controle (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8).
Infecção
Animais do GI foram inoculados intraperitonealmente com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/peso corporal de 50 g em 1 mL de sangue de camundongos infectados13. A infecção foi confirmada quatro dias pós-inoculação pela presença de tripomastigotas no sangue periférico coletado da cauda do camundongo, como descrito por Brener14. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, e aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa de Animais do Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa, Brasil (protocolo número 30/2009).
Análise biométrica
Oito semanas após a inoculação, os animais foram sacrificados sob anestesia e os corações foram removidos. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram dissecados e pesados separadamente. Volume do VE foi obtido pelo método de imersão, onde o deslocamento líquido do volume do órgão foi pesado. Como a gravidade específica (Σ) da solução salina isotônica é 1,0048, o volume é obtido por: volume = peso/Σ, ou simplesmente volume (103 mm3) ≈ peso (g)15. O peso e volume do VE foram determinados incluindo o septo interventricular.
Processamento de tecidos e determinação de áreas histológicas
Os átrios e ventrículos foram colocados em fixador histológico por 48 horas (preparado na hora com 10% w/v de formaldeído em 0,1 M de tampão fosfato pH 7.2)16,17. Fragmentos do VE foram obtidos através do método orientador para definir cortes aleatórios isotrópicos e uniformes (IUR) exigidos no estudo estereológico3. Esses fragmentos foram desidratados em etanol, diafanizadas em xilol e fixados em parafina. Os blocos foram cortados em cortes de 3 µm e corados por hematoxilina-eosina (H & E) ou 4',6-diamidino-2-fenilindol em 0,2% (DAPI)18.
O número representativo de dissectores utilizados na análise estereológica para cada animal foi determinado considerando-se a estabilização do coeficiente de variação (CV) do número de núcleos de miócitos amostras aleatórias crescentes de dissectores (5, 10, 15, 20 e 25). Então, a média aritmética e os respectivos CV para cada tamanho de amostra foram calculados. Quando o aumento de números de dissectores resultou em nenhuma diferença significativa de CV entre três amostras consecutivas, o menor tamanho de amostra foi considerado como o tamanho mínimo representativo19. Usando esse método, a variação do número de núcleos de miócitos estabilizou-se a partir da amostra de 10 dissectores.
Métodos de dissector ópticos e físicos
Cortes corados com H&E foram montados em lâminas histológicas utilizando o meio de montagem Entelan® (Merk, Darmstadt, Alemanha) e as imagens foram capturadas usando um microscópio de luz (Olympus BX-60®, Tóquio, Japão) conectado a uma câmera digital (Olympus QColor-3®, Tóquio, Japão). A observação foi feita com uma objetiva planacromática de 100× de imersão a óleo (NA= 1,25) para identificar claramente as fronteiras dos núcleos de cardiomiócitos (cmyn)16,17.
O número de núcleos de cardiomiócitos (cmyn) em uma sonda tridimensional foi estimado utilizando os métodos de dissector óptico (DO) e físico (DFi)3. O dissector consiste de dois planos paralelos destinados a fazer a amostragem dos "pontos superiores" das partículas presentes entre os dois. O volume de amostragem foi criado com dois cortes paralelos separados por 3 µm (h) e 2 planos de referência ambos contendo um suporte de ensaio (AT). Em ambos os métodos de dissector, um par de fotomicrografias separados pela distância h é usado para formar os dois planos de referência. No DO, as fotomicrografias paralelas são obtidas na mesma área histológica ajustando o plano focal (h= 3 µm), utilizando o parafuso micrométrico. No DFi, dois cortes seriais são obtidos no micrótomo (h = 3 µm) e a mesma área histológica é fotografada em ambos os cortes, fornecendo duas fotomicrografias fisicamente separadas.
Método de dissector fluorescente
No método de dissector fluorescente (DF), os cortes corados com DAPI foram montados em lâminas histológicas utilizando solução de sacarose de 50% em água destilada (w/v). As imagens foram capturadas em um modo de epifluorescência do mesmo microscópio usando uma lâmpada de mercúrio HBO 100 e um filtro para excitação do pigmento a 365 nm e emissão de luz a 460 nm. A observação foi feita com as mesmas lentes planacromáticas de 100× descritas anteriormente. Nesse método, usando os cortes 3 µm (h), os dois planos de referência necessários para delimitar o dissector são obtidos em uma imagem única e pares de fotomicrografias não são necessários como no método convencional. Além disso, o cmyn presente sobre a espessura do corte pode ser observado dentro ou fora do plano focal. Para evitar a contagem repetida de células, os cortes foram obtidos em semisséries utilizando 1 em cada 20 cortes. O DF foi adicionalmente obtido com uma lente objetiva de 40× apenas para demonstrar a possibilidade de aplicar o método usando ampliações menores.
Estimativa da densidade numérica e número total de cardiomiócitos
A densidade numérica do cmyn (Nv[c], cmyn por mm3) foi determinada a partir de 10 pares aleatórios de dissectores para cada animal, definidos como Nv[c] = Q-[cmyn] / h×AT, onde Q- representa o número de perfis de cmyn contados na área de teste na seção de referência do dissector (plano look-up)3,17. No DF, o valor Q- na fórmula Nv[c] foi multiplicado por um fator de correção de 0,5 para evitar a superestimação das medidas. O número total de cmyn no VE (N[c]) foi estimado como o produto do volume Nv[c] / VE. As contagens foram realizadas em AT= 2.670 µm2. Todas as análises estereológicas foram realizadas utilizando o software Image Pro-Plus 4.5® (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA).
Análise estatística
Todas as análises foram realizadas utilizando a plataforma estatística GraphPad Prism (versão 5.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Os dados são expressos como média e desvio padrão (média ± DP). A normalidade da distribuição dos dados foi verificada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Com base nesse teste, os dados de peso e volume foram comparados com o teste t. O teste U de Mann-Whitney foi usado para comparar os dados estereológicos entre os grupos. Os métodos de dissector foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e correlacionados utilizando o método de Spearman. A significância estatística foi estabelecida em α=0,05.
Resultados
Não houve diferença estatística na massa corporal (GC, 502,17 ± 57,76 g vs. GI, 494,69 ± 87,90 g; p > 0,05) e volume do ventrículo esquerdo (GC, 456,47 ± 26,18 mm3 versus GI, 487,69 ± 34,89 mm3; p > 0,05) entre os grupos.
A análise histopatológica do VE mostrou um infiltrado inflamatório difuso acentuado no GI. Além disso, esse grupo tinha uma desorganização da estrutura histológica com um aumento da área intersticial e maior distância entre os miócitos ventriculares. Essas células também mostraram uma área transversal aumentada e algumas apresentaram estreitamento da região citoplasmática induzida por uma grande quantidade de formas amastigotas de T. cruzi (fig. 1).
O DO convencional é representado na figura 2. Nesse método, o dissector foi obtido na mesma imagem microscópica ajustando-se o eixo Z do microscópio para criar uma separação óptica de 3 µm entre as imagens. No método físico (imagem não mostrada), o dissector foi obtido usando as imagens microscópicas de dois cortes histológicos seriais diferentes fisicamente separados na mesma distância como no DO (3 µm).
O método de dissector proposto, denominado dissector fluorescente (DF), é representado na figura 3. Nesse método, o dissector foi obtido na mesma imagem microscópica através da emissão de fluorescência diferencial pelo cmyn. Enquanto no DO e DFi foram necessárias 160 fotomicrografias (80 pares de dissector) na análise estereológica, no DF, metade das imagens microscópicas (80 dissectores individuais) foi utilizadas.
No DF, um fator de correção de 50% foi incorporado à fórmula utilizada para determinar Nv[c] em DO e DFi. Assim, a fórmula usada para estimar Nv[c] no DF foi Nv[c]= Q-[cmyn] × 0,5 / h×AT; onde a constante 0,5 foi criada para evitar a superestimação da contagem de cmyn no DF.
Os resultados de Nv[c] e N[c] obtidos usando os diferentes métodos de dissector são apresentados na tabela 1. Em ambos os métodos de dissector, os animais infectados apresentaram queda significativa de ambas as variáveis em relação aos animais controle. Não houve diferença significativa nos valores dessas variáveis, apesar dos métodos de dissector usados.
A tabela 2 mostra o resultado da análise de correlação de Nv[c] e N[c] obtidos usando os diferentes métodos de dissector. Uma correlação forte, direta e significativa foi obtida em todas as correlações entre os métodos.
Discussão
Por muitos anos, os estudos morfológicos de tecidos biológicos foram baseados em descrições histopatológicas ambíguas. Os símbolos usados para indicar o aumento ou diminuição de uma variável é a melhor maneira de expressar os dados em um contexto semiquantitativo20. À medida que essas abordagens morfológicas foram aperfeiçoadas, um sistema bidimensional (2D) quantitativo foi incorporada à análise histológica e patológica para descrever as características morfométricas de órgãos e tecidos1,21,22. Esses aperfeiçoamentos introduziram avanços significativos nos estudos histoquantitativos. No entanto, a estimativa de parâmetros microscópicos em um espaço tridimensional (3D) manteve-se como uma questão ainda não bem resolvida, e os métodos convencionais morfométricos apresentavam vieses intrínsecos que reduziam a confiabilidade de medidas morfológicas2,3,23.
Considerando o viés intrínseco de diversas medidas morfométricas, os cálculos das estatísticas de probabilidade e geometria aplicadas na geologia e outras ciências do solo foram adaptados para o estudo de materiais biológicos1,24, formando a base da estereologia atual3. O desenvolvimento da estereologia é uma evolução importante nos métodos histoquantitativos, permitindo o desenvolvimento de dados morfológico mais precisos e confiáveis9,10,25,26.
A estimativa da quantidade de objetos no tecido biológico tem sido uma questão crucial em estudos morfológicos e de patologia diagnósticos, constituindo as medidas mais refinadas na estereologia3,7. O desenvolvimento de métodos de dissector por Sterio em 1984 levou a uma forma criativa e relativamente simples de estimar o número de partículas em um órgão ou tecido4. No entanto, o método de dissector ainda exige uma série de requisitos técnicos que aumentam o tempo e o custo da aquisição de dados5,8,10. A necessidade de obter e analisar um grande número de imagens microscópicas é uma limitação comum dos métodos DO e DFi, principalmente quando vários grupos e amostras de tecidos são estudados ao mesmo tempo. Além disso, os custos para a aquisição ou adaptação de um microscópio com eixo Z controlado contribuem para limitar a aplicação do DO11. Por outro lado, a obtenção de um DFi é extremamente trabalhosa, pois envolve a qualidade da microtomia, o processamento adequado de cortes seriados e capacidade técnica para determinar um alinhamento perfeito desses cortes4. Além disso, um mínimo erro de alinhamento pode levar a um viés na contagem de células caracterizado por uma superestimação ou subestimação dos resultados estereológicos. Assim, esses métodos convencionais de dissector ainda requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar a quantidade de partículas em um área tridimensional11.
O presente estudo propõe um método alternativo para estimar a quantidade de miócitos no tecido cardíaco usando microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado. A construção de um DF baseou-se nos requisitos semelhantes aos usados para a contagem de partículas descritos nos métodos de dissector convencionais. No entanto, uma adaptação da fórmula para determinar N[c] foi necessária no DF. A introdução de um fator de correção foi necessário para reduzir a superestimação das medições. Nos métodos convencionais, os resultados da contagem de partículas excluem aquelas que atingiram o plano proibido (geralmente o plano look-down), contribuindo para reduzir o viés de medição27,28. Como no DF, a presença ou ausência da mesma partícula não pode ser observada em ambos os planos de dissector, como ocorre no DO e no DFi. O cálculo de probabilidade determina um fator de correção 0,5 para a fórmula N[c], considerando 50% de chance de uma partícula ser observada ou não em ambos os planos.
A aplicação do DF com o método proposto forneceu resultados similares de Nv[c] e N[c] em comparação com os outros métodos de dissector, sem diferenças significativas entre os métodos. Ambos os métodos apresentaram sensibilidade suficiente para determinar a redução do número dos miócitos no ventrículo esquerdo no modelo murino de infecção cardíaca induzida por T. cruzi. Esse modelo foi selecionado para este estudo, devido ao tropismo bem estabelecido para o tecido cardíaco apresentado por esse parasita e sua capacidade de reduzir o número de miócitos devido à diferenciação, replicação e evasão de células do parasita, que se propaga em um processo destrutivo contínuo12,13. Além disso, as correlações entre o DF com os métodos convencionais eram fortes, indicando que o método DF pode ser igualmente confiável para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco. A confiabilidade dessas medidas parece ser mantida tanto em condições de saúde quanto em condições patológicas.
Embora o DF também seja um método óptico, o presente estudo demonstrou que o DF pode também ser obtido utilizando lente objetiva com aumentos menores (40×), em comparação com as lentes convencionais (100×) necessárias no DO. No DO, ampliações menores não são usadas frequentemente porque determinam uma grande profundidade de campo, o que dificulta a aquisição de diferentes planos focais de dissector (look-up e look-down), pois mantém todas as estruturas dos cortes dentro do foco a despeito do ajuste do eixo Z3.
Conclusão
O DF descrito neste estudo ofereceu um método alternativo para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco. Esse método parece ser confiável tanto em condições normais quanto em condições patológicas para determinar os mesmos parâmetros de Nv[c] e N[c] obtidos por métodos convencionais de dissector. Embora os resultados tenham sido semelhantes entre os três métodos, o DF mostrou algumas vantagens em relação ao DO e ao DFi, tais como: 1) redução (pela metade) do número de cortes histológicos e imagens necessárias na análise estereológica, 2) redução do tempo de análise das imagens necessárias, 3) construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, 4) distinção dos planos de dissector de look-up e look-down ampliações menores, 5) confiabilidade dos resultados estereológicos que envolvem custos técnicos e operacionais reduzidos em comparação com os métodos DO e DFi.
Correspondência:
Rômulo Dias Novaes
Av. PH Rolfs, S/N - Campus Universitário - Centro
36570-000 - Viçosa, MG, Brasil
E-mail:
romuonovaes@yahoo.com.br
Artigo recebido em 08/07/11
Revisado recebido em 18/08/11
Aceito em 26/08/11.
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BACKGROUND: Conventional disector methods currently require considerable financial, technical and operational costs to estimate the number of cells, including cardyomyocytes, in a 3D area. OBJECTIVE: To use fluorescence microscopy in a modified disector method to determine the number of myocytes in cardiac tissue in normal and pathological conditions. METHODS: The study employed four-month-old male Wistar rats with weight of 366.25 ± 88.21g randomized in control (CG, n=8) and infected (IG, n=8) groups. IG animals were inoculated with T. cruzi Y strain (300,000 trypomastigotes/50g wt). After eight weeks, the animals were weighted and euthanized. The left ventricles (LV) were removed for stereological analysis of numerical density of cardiomyocytes (Nv[c]) and total number of these cells in the LV (N[c]). These parameters were estimated using a fluorescent disector (FD) and compared with the conventional optical (OD) and physical (PD) disector methods. RESULTS: In both disector methods, IG animals presented significant decrease of Nv[c] and N[c] compared to CG animals (P< 0.05). There was no significant difference in these variables despite the disector method applied in CG and IG animals (P> 0.05). A strong correlation, equal or above 96%, was obtained between FD, OD and PD. CONCLUSION: The FD method seems to be equally reliable to determine Nv[c] and N[c] in normal and pathological conditions and presents some advantages compared to conventional disector methods: reduction of histological slices and images in the stereological analysis, reduction of time to analyze the images, construction of FD in simple microscopes using the epifluorescence mode, distinction of disector planes in lower magnifications.
Cell separationflow cytometrymyocytes, cardiac
Rômulo Dias NovaesI; Arlete Rita PenitenteI; André TalvaniII; Antônio José NataliI; Clóvis Andrade NevesI; Izabel Regina Santos Costa MaldonadoI
IUniversidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brazil
IIUniversidade Federal de Ouro Perto, Ouro Preto, MG, Brazil
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ABSTRACT
BACKGROUND: Conventional disector methods currently require considerable financial, technical and operational costs to estimate the number of cells, including cardyomyocytes, in a 3D area.
OBJECTIVE: To use fluorescence microscopy in a modified disector method to determine the number of myocytes in cardiac tissue in normal and pathological conditions.
METHODS: The study employed four-month-old male Wistar rats with weight of 366.25 ± 88.21g randomized in control (CG, n=8) and infected (IG, n=8) groups. IG animals were inoculated with T. cruzi Y strain (300,000 trypomastigotes/50g wt). After eight weeks, the animals were weighted and euthanized. The left ventricles (LV) were removed for stereological analysis of numerical density of cardiomyocytes (Nv[c]) and total number of these cells in the LV (N[c]). These parameters were estimated using a fluorescent disector (FD) and compared with the conventional optical (OD) and physical (PD) disector methods.
RESULTS: In both disector methods, IG animals presented significant decrease of Nv[c] and N[c] compared to CG animals (P< 0.05). There was no significant difference in these variables despite the disector method applied in CG and IG animals (P> 0.05). A strong correlation, equal or above 96%, was obtained between FD, OD and PD.
CONCLUSION: The FD method seems to be equally reliable to determine Nv[c] and N[c] in normal and pathological conditions and presents some advantages compared to conventional disector methods: reduction of histological slices and images in the stereological analysis, reduction of time to analyze the images, construction of FD in simple microscopes using the epifluorescence mode, distinction of disector planes in lower magnifications.
Over the past years a great effort was made to develop a reliable and reproducible method to estimate the number of particles in organs and tissues, but until 1984, all these methods had intrinsic biases1-3. In 1984, Sterio described several modifications in the approaches used to estimate the quantity of objects in three-dimensional space and introduced the disector method4. Most authors currently consider the disector method unbiased and the well-established theoretical background makes the method largely acceptable5-7.
The disector may be obtained through two different methods based on the same theoretical principles and basic requirements to estimate the number of particles. These methods are the optical and physical disector4,8-10. Although both methods have reduced the bias of particle quantity estimation, they still required the acquisition of a large number of histological images and a great deal of time to perform the counts. Particularly, the optical disector also requires a light microscope of high cost adapted with axis-Z mobile stage11. Moreover, the physical disector is extremely laborious because it requires serial histological sections and images with a perfect alignment in the different parallel sections3,10.
Considering that the aim of the sampling design for stereology is to obtain the maximal amount of quantitative structural information at a given total cost, time or effort, the purpose of this study was to use fluorescence microscopy in a modified disector method to determine the number of myocytes in cardiac tissue in normal and pathological conditions. Thus, a murine model of T. cruzi infection that recognizably conduces to disruption of cardiac myocytes and modifies the number of these cells in the myocardium was used.12 We hypothesized that the proposed method would reduce the operational cost observed in conventional methods, while maintaining the accuracy of cell quantity measurements.
Methods
Animals and experimental groups
Four-month-old male Wistar rats with initial weight of 366.25 ± 88.21 g were provided with rodent chow and water ad libitum and maintained in animal facilities in a controlled environment (temperature at 22 ± 3 ºC, humidity at 60 - 70 % and 12 hour light/dark inverted cycles). Sample sizes were determined considering the probability p = 1/2 to occur increase or decrease of the variables of interest. Thus, considering the significance level α = 0.05, the minimal significant number of animals used in the statistical analysis was: p = (1/2)events; therefore, if n = 5, p = (1/2)5 or p = 0.03; then, p < 0.05.10 Due to the intrinsic variability of the parasitism in target organs and the mortality associated with T. cruzi infection, a correction factor of 50% was incorporated into the initial calculation, determining samples of 8 animals, randomly allocated into control (CG, n = 8) and infected (IG, n = 8) groups.
Infection
IG animals were inoculated intraperitoneally with T. cruzi Y strain (300,000 trypomastigotes/50g body weight in 1 mL of infected mice blood13. Infection was confirmed four days post-inoculation by the presence of trypomastigotes in peripheral blood collected from the rat's tail as described by Brener14. All experimental procedures were conducted in accordance with the Brazilian College of Animal Experimentation and approved by the Animal Research Ethics Commission of the Veterinary Department of the Universidade Federal de Viçosa, Brazil (protocol number 30/2009).
Biometrical analysis
Eight weeks after inoculation, the animals were euthanized under anesthesia and the hearts were removed. The left ventricles (LV) were dissected and weighed separately. LV volume was obtained by the submersion method, where the liquid displacement from the organ volume is weighed. As the specific gravity (Σ) of isotonic saline is 1.0048, the volume is obtained by: volume= weight/Σ, or simply volume (103 mm3) ≈ weight (g)15. LV weight and volume was determined including the interventricular septum.
Tissue processing and determination of histological areas
The atria and ventricles were put into histological fixative for 48 hours (freshly prepared 10% w/v formaldehyde in 0.1 M phosphate buffer pH 7.2)16,17. LV fragments were obtained through the orientator method to define isotropic and uniform random sections (IUR) required in the stereological study3. These fragments were dehydrated in ethanol, cleared in xylol and waxed. Blocks were cut into 3 µm sections and stained by hematoxylin-eosin (H&E) or 4',6-diamidino-2-phenylindole at 0.2% (DAPI)18.
The representative number of disectors used in the stereological analysis for each animal was determined considering the stabilization of the coefficient of variation (CV) of number of myocytes nuclei in ascending random samples of disectors (5, 10, 15, 20 and 25). Then, the arithmetical mean and the respective CV for each sample size were calculated. When the increase of disector numbers resulted in no significant difference of CV between 3 consecutive samples, the smallest sample size was considered as the minimal representative size19. Using this method, the variation of number of myocytes nuclei was stabilized from the sample of 10 disectors.
Optical and physical disector methods
Sections stained with H&E were mounted on histology slides using Entelan® mounting medium (Merk, Darmstadt, Germany) and the images were captured using a light microscope (Olympus BX-60®, Tokyo, Japan) connected to a digital camera (Olympus QColor-3®, Tokyo, Japan). Observation was made with a 100× planachromatic oil immersion objective (NA= 1.25) to clearly identify cardiomyocyte (cmy) nuclei boundaries16,17.
The number of cardiomyocyte nuclei (cmyn) in a 3-dimensional probe was estimated using the optical (OD) and physical (PD) disector methods3. The disector consists of 2 parallel planes aimed at sampling ''top points'' of particles in between. Sampling volume was created with 2 parallel sections separated by 3 µm (h) and 2 reference planes both containing a test frame (AT). In both disector methods, a pair of photomicrographs separated by h distance is used to form the two reference planes. In the OD, the parallel photomicrographs are obtained in the same histological area adjusting the focal plane (h = 3 µm) using the micrometrical screw. In the PD, two serial sections are obtained in the microtome (h = 3 µm) and the same histological area is photographed in both sections, supplying two photomicrographs physically separated.
Fluorescent disector method
In the fluorescent disector method (FD), sections stained with DAPI were mounted on histology slides using 50% sucrose solution in distillated water (w/v). Images were captured in an epifluorescence mode of the same microscope using a HBO 100 mercury lamp and a filter for dye excitation at 365 nm and a light emission at 460 nm. Observation was made with the same 100× planachromatic lens previously described. In this method, using the 3 µm (h) sections, the two reference planes required to delimitate the disector are obtained in a unique image and pairs of photomicrographs are not required as in the conventional methods. Furthermore, the cmyn present over the thickness of the section may be observed inside or outside the focal plane. To avoid repeat cells count, sections were obtained in semi-series, using 1 in every 20 sections. The FD was additionally obtained with a 40× objective lens only to demonstrate the possibility of applying the method using smaller magnifications.
Estimation of numerical density and total number of cardiomyocytes
The numerical density of cmyn (Nv[c], cmyn per mm3) was determined from 10 random disector pairs for each animal, defined as Nv[c]= Q-[cmyn] / h×AT ; where Q- represents the number of profiles of cmyn counted in the test area on the disector reference section (''look-up'' plane).3,17 In the FD, the Q- value in the Nv[c] formula was multiplied by a correction factor of 0.5 to avoid overestimation of measures. The total number of cmyn in the LV (N[c]) was estimated as the product of Nv[c] / LV volume. The counts were performed in an AT= 2670 µm2. All stereological analyses were performed using the software Image Pro-Plus 4.5® (Media Cybernetics, Silver Spring, USA).
Statistical analysis
All analyses were performed using the statistical platform GraphPad Prism (version 5.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Data are expressed as mean and standard deviation (mean ± S.D.). The normality of data distribution was verified using the Kolmogorov-Smirnov test. Based on this test, weight and volume data were compared using the t-test. The Mann-Whitney U test was used to compare the stereological data between the groups. The disector methods were compared using the Kruskal-Wallis test and correlated using the Spearman's method. Statistical significance was established at α = 0.05.
Results
There was no statistical difference in body mass (CG, 502.17 ± 57.76 g vs. IG, 494.69 ± 87.90 g; p > 0.05) and left ventricle volume (CG, 456.47 ± 26.18 mm3 vs. IG, 487.69 ± 34.89 mm3; p > 0.05) between the groups.
The histopathological analysis of the LV showed a marked diffuse inflammatory infiltrate in IG. Moreover, this group had a disorganization of histological structure with an increased interstitial area and a larger distance between the ventricular myocytes. These cells also showed an increased cross-sectional area and some these presented a narrowing of cytoplasm region induced by a large amount of T. cruzi amastigote forms (Fig. 1).
The conventional OD is represented in fig. 2. In this method, the disector was obtained in the same microscopic image adjusting the Z axis of the microscope to create an optical separation of 3 µm between the images. In the physical method (image not shown), the disector was obtained using the microscopic images of two different serial histological sections physically separated at the same distance as in the OD (3 µm).
The proposed disector method, named fluorescent disector (FD), is represented in fig. 3. In this method, the disector was obtained in the same microscopic image through the differential fluorescence emission by the cmyn. While in the OD and PD 160 photomicrographs (80 disector pairs) were required in the stereological analysis, in FD, half of the microscopic images (80 individual disectors) was used.
In the FD, a correction factor of 50% was incorporated into the formula used to determine Nv[c] in OD and PD. Thus, the formula used to estimate Nv[c] in the FD was Nv[c]= Q-[cmyn] × 0.5 / h×AT; where the constant 0.5 was established to avoid overestimation of cmyn count in FD.
The results of Nv[c] and N[c] obtained using the different disector methods are showed in table 1. In both disector methods, the infected animals presented significant decrease of both variables compared to control animals. There was no significant difference in the values of these variables despite the disector methods used.
Table 2 shows the result of correlation analysis of Nv[c] and N[c] obtained using the different disector methods. A strong, direct and significant correlation was obtained in all correlations between both methods.
Discussion
For many years, the morphological studies of biological tissues were based on ambiguous histopathological descriptions. The symbols used to indicate the increase or decrease of a variable is the best way to express the data in a semi-quantitative context20. As these morphological approaches were further refined, a two-dimension (2D) quantitative system was incorporated into the histological and pathological analysis to describe the morphometrical characteristics of organs and tissues1,21,22. These refinements introduced significant advances in histo-quantitative studies. However, the estimation of microscopic parameters in a three-dimension (3D) space remained as an issue still not well resolved, and the conventional morphometric methods presented intrinsic biases that reduced the reliability of morphological measurements2,3,23.
Considering the intrinsic bias of several morphometrical measurements, calculations of probability statistics and geometry applied in geology and other soil sciences were adapted to the study of biological materials1,24, forming the basis of current stereology3. The development of stereology is an important evolution in histo-quantitative methods, allowing the development of more accurate and reliable morphological data9,10,25,26.
Estimation of quantity of objects in biological tissue has been a crucial issue in morphological studies and diagnostic pathology, constituting the more refined measures in stereology3,7. The development of disector methods by Sterio in 1984 led to a creative and relatively simple way to estimate the number of particles in an organ or tissue4. However, the disector method still requires a series of technical requirements that increase the time and cost of data acquisition5,8,10. The need to obtain and analyze a large number of microscopic images is a common limitation of both OD and PD methods, especially when several groups and tissue samples are studied at once. Moreover, the costs for acquiring or adapting a microscope with controlled Z axis contribute to limit the application of OD11. On other hand, obtaining a PD is extremely laborious because it involves the quality of the microtomy, appropriate processing of serial sections and technical ability to determine a perfect alignment of these sections4. Furthermore, minimal alignment error can lead to a bias in the cell count characterized by an overestimation or underestimation of stereological outcomes. Thus, these conventional disector methods still require considerable financial, technical and operational costs to estimate the quantity of particles in a 3D area11.
This study proposes an alternative method to estimate the quantity of myocytes in the cardiac tissue using fluorescence microscopy in a modified disector method. The construction of a FD was based on similar requirements as used for particle counts described in the conventional disector methods. However, an adaptation of the formula to determine N[c] was required in FD. The introduction of a correction factor was necessary to reduce overestimation of measurements. In conventional methods, particle count results exclude those which hit the forbidden plane (generally look-down plane), contributing to reduce the measurement bias27,28. As in the FD, the presence or absence of the same particle cannot be observed in both disector planes, as it occurs in OD and PD. The calculation of probability determines a 0.5 correction factor to the N[c] formula, considering 50% of chances of a particle be observed or not in both planes.
The application of the FD using the proposed method provided similar results of Nv[c] and N[c] compared to the other disector methods, without any significant differences between the methods. Both methods presented sufficient sensibility to determine the reduction of left ventricle myocyte number in the murine model of T. cruzi-induced cardiac infection. This model was selected for this study due to the well-established tropism to cardiac tissue presented by this parasite and its ability to reduce the number of myocytes due to parasite replication, differentiation and cell evasion, which propagates in an ongoing destructive process12,13. In addition, the correlations between the FD with conventional methods were strong, indicating that the FD method may be equally reliable to estimate the number of myocytes in the cardiac tissue. The reliability of these measures seems to be maintained in both health and pathological conditions.
Although the FD is also an optical method, this study demonstrated that the FD may also be obtained using objective lens with lower magnifications (40×) compared with conventional lens (100×) required in OD. In OD, lower magnifications are not often used because they determine a large depth-of-field, which hinders the acquisition of different disector focal planes (look-up and look-down) because it maintains all section structures inside the focus, in despite of the Z axis adjustment3.
Conclusion
The FD described in this study offered an alternative method to estimate the number of myocytes in the cardiac tissue. This method seems to be equally reliable in normal and pathological conditions to determine the same parameters of Nv[c] and N[c] obtained using conventional disector methods. Although the results has been similar between the three methods, the FD showed some advantages compared to OD and PD such as: 1) reduction (by half) of the number of histological slices and images required in the stereological analysis, 2) reduction of time to analyze the required images, 3) construction of FD in simple microscopes using the epifluorescence mode, 4) distinction of disector look-up and look-down planes using lower magnifications, 5) reliability of stereological results demanding reduced technical and operational cost compared to the OD and PD methods.
References
Uso de fluorescencia en un método de disector modificado para estimar el número de miocitos en el tejido cardíaco
FUNDAMENTO: Métodos convencionales de disector actualmente requieren considerables costos financieros, técnicos y operativos para estimar el número de células, incluyendo cardiomiocitos, en un área de 3D. OBJETIVO: Usar la microscopia de fluorescencia en un método de disector modificado para determinar el número de miocitos en el tejido cardíaco en condiciones normales y patológicas. MÉTODOS: El estudio empleó ratones Wistar machos de cuatro meses de edad y peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados en grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Los animales del GI fueron inoculados con cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Después de ocho semanas, los animales fueron pesados y sacrificados. Los Ventrículos Izquierdos (VI) fueron removidos para análisis estereológico de la densidad numérica de cardiomiocitos (Nv [c]) y el número total de esas células en el VI (N [c]). Esos parámetros fueron estimados usando un disector fluorescente (FD) y comparados con los métodos convencionales de disector óptico (OD) y disector físico (PD). RESULTADOS: En ambos métodos de disector, los animales del GI presentaron caída significativa de Nv[c] y N[c] en comparación con los animales del GC (P > 0,05). Una correlación fuerte, igual o superior a 96%, fue obtenida entre FD, OD y PD. CONCLUSIÓN: El método FD parece ser igualmente confiable para determinar Nv[c] y N[c] en condiciones normales y patológicas, presentando algunas ventajas en relación a los métodos convencionales de disector: reducción de cortes histológicos e imágenes en el análisis estereológico, reducción del tiempo de análisis de las imágenes, la construcción de FD en microscopios simples, utilizando el modo de epifluorescencia, distinción de planos de disector en ampliaciones inferiores.
Cardiomiocitoscorazónmicroscopía de fluorescenciamorfología
ARTÍCULO ORIGINAL
Rômulo Dias NovaesI; Arlete Rita PenitenteI; André TalvaniII; Antônio José NataliI; Clóvis Andrade NevesI; Izabel Regina dos Santos Costa MaldonadoI
IUniversidade Federal de Viçosa, Viçosa
IIUniversidade Federal de Ouro Preto e NUPEB, Ouro Preto, MG, Brasil
Correspondencia
RESUMEN
FUNDAMENTO: Métodos convencionales de disector actualmente requieren considerables costos financieros, técnicos y operativos para estimar el número de células, incluyendo cardiomiocitos, en un área de 3D.
OBJETIVO: Usar la microscopia de fluorescencia en un método de disector modificado para determinar el número de miocitos en el tejido cardíaco en condiciones normales y patológicas.
MÉTODOS: El estudio empleó ratones Wistar machos de cuatro meses de edad y peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados en grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Los animales del GI fueron inoculados con cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Después de ocho semanas, los animales fueron pesados y sacrificados. Los Ventrículos Izquierdos (VI) fueron removidos para análisis estereológico de la densidad numérica de cardiomiocitos (Nv [c]) y el número total de esas células en el VI (N [c]). Esos parámetros fueron estimados usando un disector fluorescente (FD) y comparados con los métodos convencionales de disector óptico (OD) y disector físico (PD).
RESULTADOS: En ambos métodos de disector, los animales del GI presentaron caída significativa de Nv[c] y N[c] en comparación con los animales del GC (P > 0,05). Una correlación fuerte, igual o superior a 96%, fue obtenida entre FD, OD y PD.
CONCLUSIÓN: El método FD parece ser igualmente confiable para determinar Nv[c] y N[c] en condiciones normales y patológicas, presentando algunas ventajas en relación a los métodos convencionales de disector: reducción de cortes histológicos e imágenes en el análisis estereológico, reducción del tiempo de análisis de las imágenes, la construcción de FD en microscopios simples, utilizando el modo de epifluorescencia, distinción de planos de disector en ampliaciones inferiores.
Palabras clave: Cardiomiocitos, corazón, microscopía de fluorescencia, morfología.
Introducción
En los últimos años, grandes esfuerzos fueron hechos para desarrollar un método confiable y reproducible para estimar el número de partículas en órganos y tejidos, pero hasta 1984, todos esos métodos presentaban sesgos intrínsecos1-3. En 1984, Sterio describió diversas modificaciones en los abordajes utilizados para estimar la cantidad de objetos en el espacio tridimensional e introdujo el método de disector4. La mayoría de los autores actualmente considera el método de disector imparcial y fundamentos teóricos bien establecidos hacen que el método sea ampliamente aceptado5-7.
El disector puede ser obtenido por dos métodos diferentes con base en los mismos principios teóricos y requisitos básicos para estimar el número de partículas. Esos métodos son el disector óptico y el disector físico4,8-10. Aunque ambos métodos posean sesgos reducidos en cuanto a la estimativa de la cantidad de partículas, ellos aun exigían la adquisición de un gran número de imágenes histológicas y mucho tiempo para realizar los recuentos. Particularmente, el disector óptico también requiere un microscopio de luz de alto costo adaptado con fase móvil del eje Z11. Además de eso, el disector físico es extremamente trabajoso, pues requiere cortes e imágenes histológicas con un perfecto alineamiento en diferentes cortes paralelos3,10.
Considerando que el objetivo del proyecto de muestreo para la estereología es obtener la cantidad máxima de informaciones estructurales cuantitativas a un determinado costo o esfuerzo, el objetivo de este estudio fue la utilización de microscopia de fluorescencia en un método de disector modificado para determinar el número de miocitos en el tejido cardíaco en condiciones normales y patológicas. Así, un modelo murino de infección por T. cruzi, que reconocidamente lleva a la ruptura de miocitos cardíacos y modifica el número de esas células en el miocardio, fue utilizado12. Nuestra hipótesis es la de que el método propuesto reduciría el costo operativo observado en métodos convencionales, manteniendo la precisión de las mediciones de cantidad de células.
Métodos
Animales y los grupos experimentales
Ratones Wistar machos con cuatro meses de edad con peso inicial de 366,25 ± 88,21 g recibieron ración para roedores y agua ad libitum, y fueron mantenidos en instalaciones animales en un ambiente controlado (temperatura a 22 ± 3 ºC, humedad a 60% - 70% y ciclos invertidos de luz/oscuridad de 12 horas). Los tamaños de las muestras fueron determinados considerando la probabilidad p = 1/2 de que ocurriese aumento o disminución de las variables de interés. Así, considerando el nivel de significación α = 0,05, el número mínimo significativo de animales utilizados en el análisis estadístico fue: p = (02/01)eventos; por tanto, si n = 5, p = (1/2)5 o p = 0,03; entonces, p < 0,0510. Debido a la variabilidad intrínseca del parasitismo en órganos-blanco y a la mortalidad asociada a la infección por T. cruzi, un factor de corrección de 50% fue incorporado al cálculo inicial, determinando muestras de ocho animales, aleatoriamente ubicados en los grupos control (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8).
Infección
Animales del GI fueron inoculados intraperitonealmente con cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/peso corporal de 50 g en 1 ml de sangre de ratones infectados13. La infección fue confirmada cuatro días post inoculación por la presencia de tripomastigotas en la sangre periférica recolectada de la cola del ratón, como fue descripto por Brener14. Todos los procedimientos experimentales fueron conducidos de acuerdo con el Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, y aprobados por la Comisión de Ética en Investigación de Animales del Departamento de Veterinaria de la Universidad Federal de Viçosa, Brasil (protocolo número 30/2009).
Análisis biométrico
Ocho semanas después de la inoculación, los animales fueron sacrificados bajo anestesia y los corazones fueron removidos. Los Ventrículos Izquierdos (VI) fueron disecados y pesados separadamente. Volumen del VI fue obtenido por el método de inmersión, donde el desplazamiento líquido del volumen del órgano fue pesado. Como la gravedad específica (σ) de la solución salina isotónica es 1,0048, el volumen es obtenido por: volumen = peso/σ, o simplemente volumen (103 mm3) ≈ peso (g)15. El peso y volumen del VI fueron determinados incluyendo el septo interventricular.
Procesamiento de tejidos y determinación de áreas histológicas
Los atrios y ventrículos fueron colocados en fijador histológico por 48 horas (preparado en la hora con 10% w/v de formaldehído en 0,1 M de tapón fosfato pH 7.2)16,17. Fragmentos del VI fueron obtenidos a través del método orientador para definir cortes aleatorios isotrópicos y uniformes (IUR) exigidos en el estudio estereológico3. Esos fragmentos fueron deshidratados en etanol, diafanizadas en xilol y fijados en parafina. Los bloques fueron cortados en cortes de 3 µm y coloreados por hematoxilina-eosina (H & E) o 4',6-diamidino-2-fenilindol en 0,2% (DAPI)18.
El número representativo de disectores utilizados en el análisis estereológico para cada animal fue determinado considerando la estabilización del coeficiente de variación (CV) del número de núcleos de miocitos muestras aleatorias crecientes de disectores (5, 10, 15, 20 y 25). Entonces, la media aritmética y los respectivos CV para cada tamaño de muestra fueron calculados. Cuando el aumento de números de disectores no resultó en ninguna diferencia significativa de CV entre tres muestras consecutivas, el menor tamaño de muestra fue considerado como el tamaño mínimo representativo19. Usando ese método, la variación del número de núcleos de miocitos se estabilizó a partir de la muestra de 10 disectores.
Métodos de disector ópticos y físicos
Cortes coloreados con H&E fueron montados en láminas histológicas utilizando el medio de montaje Entelan® (Merk, Darmstadt, Alemania) y las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de luz (Olympus BX-60®, Tokio, Japón) conectado a una cámara digital (Olympus QColor-3®, Tokio, Japón). La observación fue hecha con un objetivo planacromático de 100× de inmersión a aceite (NA= 1,25) para identificar claramente las fronteras de los núcleos de cardiomiocitos (cmyn)16,17.
El número de núcleos de cardiomiocitos (cmyn) en una sonda tridimensional fue estimado utilizando los métodos de disector óptico (DO) y físico (PD)3. El disector consiste de dos planos paralelos destinados a hacer el muestreo de los "puntos superiores" de las partículas presentes entre los dos. El volumen de muestreo fue creado con dos cortes paralelos separados por 3 µm (h) y 2 planos de referencia ambos conteniendo un soporte de ensayo (AT). En ambos métodos de disector, un par de fotomicrografías separados por la distancia h es usado para formar los dos planos de referencia. En el OD, las fotomicrografías paralelas son obtenidas en la misma área histológica ajustando el plano focal (h= 3 µm), utilizando el tornillo micrométrico. En el PD, dos cortes seriales son obtenidos en el micrótomo (h = 3 µm) y la misma área histológica es fotografiada en ambos cortes, proveyendo dos fotomicrografías físicamente separadas.
Método de disector fluorescente
En el método de disector fluorescente (FD), los cortes coloreados con DAPI fueron montados en láminas histológicas utilizando solución de sacarosa de 50% en agua destilada (w/v). Las imágenes fueron capturadas en un modo de epifluorescencia del mismo microscopio usando una lámpara de mercurio HBO 100 y un filtro para excitación del pigmento a 365 nm y emisión de luz a 460 nm. La observación fue hecha con las mismas lentes planacromáticas de 100× descriptos anteriormente. En ese método, usando los cortes 3 µm (h), los dos planos de referencia necesarios para delimitar el disector son obtenidos en una imagen única y pares de fotomicrografías no son necesarios como en el método convencional. Además de eso, el cmyn presente sobre el espesor del corte puede ser observado dentro o fuera del plano focal. Para evitar el recuento repetido de células, los cortes fueron obtenidos en semiseries utilizando 1 en cada 20 cortes. El FD fue adicionalmente obtenido con una lente objetiva de 40× apenas para demostrar la posibilidad de aplicar el método usando ampliaciones menores.
Estimativa de la densidad numérica y número total de cardiomiocitos
La densidad numérica del cmyn (Nv[c], cmyn por mm3) fue determinada a partir de 10 pares aleatorios de disectores para cada animal, definidos como Nv[c] = Q-[cmyn]/h×AT, donde Q- representa el número de perfiles de cmyn contados en el área de test en la sección de referencia del disector (plano look-up)3,17. En el FD, el valor Q-en la fórmula Nv[c] fue multiplicado por un factor de corrección de 0,5 para evitar la superestimación de las medidas. El número total de cmyn en el VI (N[c]) fue estimado como el producto del volumen Nv[c]/VI. Los recuentos fueron realizados en AT= 2.670 µm2. Todos los análisis estereológicos fueron realizados utilizando el software Image Pro-Plus 4.5® (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA).
Análisis estadístico
Todos los análisis fueron realizados utilizando la plataforma estadística GraphPad Prism (versión 5.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Los datos son expresados como media y desvío estándar (media ± DE). La normalidad de la distribución de los datos fue verificada por el test de Kolmogorov-Smirnov. Con base en ese test, los datos de peso y volumen fueron comparados con el test t. El test U de Mann-Whitney fue usado para comparar los datos estereológicos entre los grupos. Los métodos de disector fueron comparados por el test de Kruskal-Wallis y correlacionados utilizando el método de Spearman. La significación estadística fue establecida en α = 0,05.
Resultados
No hubo diferencia estadística en la masa corporal (GC, 502,17 ± 57,76 g vs. GI, 494,69 ± 87,90 g; p > 0,05) y volumen del ventrículo izquierdo (GC, 456,47 ± 26,18 mm3 versus GI, 487,69 ± 34,89 mm3; p > 0,05) entre los grupos.
El análisis histopatológico del VI mostró un infiltrado inflamatorio difuso acentuado en el GI. Además de eso, ese grupo tenía una desorganización de la estructura histológica con un aumento del área intersticial y mayor distancia entre los miocitos ventriculares. Esas células también mostraron un área transversal aumentada y algunas presentaron estrechamiento de la región citoplasmática inducida por una gran cantidad de formas amastigotas de T. cruzi (fig. 1).
El OD convencional es representado en la figura 2. En ese método, el disector fue obtenido en la misma imagen microscópica ajustándose el eje Z del microscopio para crear una separación óptica de 3 µm entre las imágenes. En el método físico (imagen no mostrada), el disector fue obtenido usando las imágenes microscópicas de dos cortes histológicos seriales diferentes físicamente separados en la misma distancia como en el OD (3 µm).
El método de disector propuesto, denominado disector fluorescente (FD), es representado en la figura 3. En ese método, el disector fue obtenido en la misma imagen microscópica a través de la emisión de fluorescencia diferencial por el cmyn. En cuanto en el OD y PD fueron necesarias 160 fotomicrografías (80 pares de disector) en el análisis estereológico, en el FD, la mitad de las imágenes microscópicas (80 disectores individuales) fueron utilizadas.
En el FD, un factor de corrección de 50% fue incorporado a la fórmula utilizada para determinar Nv[c] en OD y PD. Así, la fórmula usada para estimar Nv[c] en el FD fue Nv[c]= Q-[cmyn] × 0,5/h×AT; donde la constante 0,5 fue creada para evitar la superestimación del recuento de cmyn en el FD.
Los resultados de Nv[c] y N[c] obtenidos usando los diferentes métodos de disector son presentados en la tabla 1. En ambos métodos de disector, los animales infectados presentaron caída significativa de ambas variables en relación a los animales control. No hubo diferencia significativa en los valores de esas variables, a pesar de los métodos de disector usados.
La tabla 2 muestra el resultado del análisis de correlación de Nv[c] y N[c] obtenidos usando los diferentes métodos de disector. Una correlación fuerte, directa y significativa fue obtenida en todas las correlaciones entre los métodos.
Discusión
Por muchos años, los estudios morfológicos de tejidos biológicos fueron basados en descripciones histopatológicas ambiguas. Los símbolos usados para indicar el aumento o disminución de una variable es la mejor manera de expresar los datos en un contexto semicuantitativo20. A medida que esos abordajes morfológicos fueron perfeccionados, un sistema bidimensional (2D) cuantitativo fue incorporado al análisis histológico y patológica para describir las características morfométricas de órganos y tejidos1,21,22. Esos perfeccionamientos introdujeron avances significativos en los estudios histocuantitativos. Mientras tanto, la estimativa de parámetros microscópicos en un espacio tridimensional (3D) se mantuvo como una cuestión aun no bien resuelta, y los métodos convencionales morfométricos presentaban sesgos intrínsecos que reducían la confiabilidad de medidas morfológicas2,3,23.
Considerando el sesgo intrínseco de diversas medidas morfométricas, los cálculos de las estadísticas de probabilidad y geometría aplicadas en la geología y otras ciencias del suelo fueron adaptados para el estudio de materiales biológicos1,24, formando la base de la estereología actual3. El desarrollo de la estereología es una evolución importante en los métodos histocuantitativos, permitiendo el desarrollo de datos morfológico más precisos y confiables9,10,25,26.
La estimativa de la cantidad de objetos en el tejido biológico ha sido una cuestión crucial en estudios morfológicos y de patología diagnósticos, constituyendo las medidas más refinadas en la estereología3,7. El desarrollo de métodos de disector por Sterio en 1984 llevó a una forma creativa y relativamente simple de estimar el número de partículas en un órgano o tejido4. Mientras tanto, el método de disector aun exige una serie de requisitos técnicos que aumentan el tiempo y el costo de la adquisición de datos5,8,10. La necesidad de obtener y analizar un gran número de imágenes microscópicas es una limitación común de los métodos OD y PD, principalmente cuando varios grupos y muestras de tejidos son estudiados al mismo tiempo. Además de eso, los costos para la adquisición o adaptación de un microscopio con eje Z controlado contribuyen para limitar la aplicación del OD11. Por otro lado, la obtención de un PD es extremamente trabajosa, pues envuelve la calidad de la microtomía, el procesamiento adecuado de cortes seriados y capacidad técnica para determinar un alineamiento perfecto de esos cortes4. Además de eso, un mínimo error de alineamiento puede llevar a un sesgo en el recuento de células caracterizado por una superestimación o subestimación de los resultados estereológicos. Así, esos métodos convencionales de disector aun requieren considerables costos financieros, técnicos y operativos para estimar la cantidad de partículas en un área tridimensional11.
El presente estudio propone un método alternativo para estimar la cantidad de miocitos en el tejido cardíaco usando microscopía de fluorescencia en un método de disector modificado. La construcción de un FD se basó en los requisitos semejantes a los usados para el recuento de partículas descriptos en los métodos de disector convencionales. Mientras tanto, una adaptación de la fórmula para determinar N[c] fue necesaria en el FD. La introducción de un factor de corrección fue necesario para reducir la superestimación de las mediciones. En los métodos convencionales, los resultados del recuento de partículas excluyen aquellas que alcanzaron el plano prohibido (generalmente el plano look-down), contribuyendo para reducir el sesgo de medición27,28. Como en el DF, la presencia o ausencia de la misma partícula no puede ser observada en ambos planos de disector, como ocurre en el OD y en el PD. El cálculo de probabilidad determina un factor de corrección 0,5 para la fórmula N[c], considerando 50% de posibilidad de que una partícula sea observada o no en ambos planos.
La aplicación del FD con el método propuesto proveyó resultados similares de Nv[c] y N[c] en comparación con los otros métodos de disector, sin diferencias significativas entre los métodos. Ambos métodos presentaron sensibilidad suficiente para determinar la reducción del número de los miocitos en el ventrículo izquierdo en el modelo murino de infección cardíaca inducida por T. cruzi. Ese modelo fue seleccionado para este estudio, debido al tropismo bien establecido para el tejido cardíaco presentado por ese parásito y su capacidad de reducir el número de miocitos debido a la diferenciación, replicación y evasión de células del parásito, que se propaga en un proceso destructivo continuo12,13. Además de eso, las correlaciones entre el FD con los métodos convencionales eran fuertes, indicando que el método FD puede ser igualmente confiable para estimar el número de miocitos en el tejido cardíaco. La confiabilidad de esas medidas parece ser mantenida tanto en condiciones de salud como en condiciones patológicas.
Aunque el FD también sea un método óptico, el presente estudio demostró que el FD puede también ser obtenido utilizando lente objetiva con aumentos menores (40×), en comparación con las lentes convencionales (100×) necesarias en el OD. En el OD, ampliaciones menores no son usadas frecuentemente porque determinan una gran profundidad de campo, lo que dificulta la adquisición de diferentes planos focales de disector (look-up y look-down), pues mantienen todas las estructuras de los cortes dentro del foco a despecho del ajuste del eje Z3.
Conclusión
El FD descripto en este estudio ofreció un método alternativo para estimar el número de miocitos en el tejido cardíaco. Ese método parece ser confiable tanto en condiciones normales como en condiciones patológicas para determinar los mismos parámetros de Nv[c] y N[c] obtenidos por métodos convencionales de disector. Aunque los resultados hayan sido semejantes entre los tres métodos, el FD mostró algunas ventajas en relación al OD y al PD, tales como: 1) reducción (por la mitad) del número de cortes histológicos y imágenes necesarias en el análisis estereológico, 2) reducción del tiempo de análisis de las imágenes necesarias, 3) construcción de FD en microscopios simples, utilizando el modo de epifluorescencia, 4) distinción de los planos de disector de look-up y look-down ampliaciones menores, 5) confiabilidad de los resultados estereológicos que envuelven costos técnicos y operativos reducidos en comparación con los métodos OD y PD.
Potencial Conflicto de Intereses
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
Fuentes de Financiación
El presente estudio no tuve fuentes de financiación externas.
Vinculación Académica
Este artículo forma parte de tesis de Doctorado de Rômulo Dias Novaes, por Universidade Federal de Viçosa.