FUNDAMENTO: A Contração Pós-Repouso (CPR) do músculo cardíaco fornece informações indiretas sobre a manipulação de cálcio intracelular. OBJETIVO: Nosso objetivo foi estudar o comportamento da CPR e seus mecanismos subjacentes em camundongos com infarto do miocárdio. MÉTODOS: Seis semanas após a oclusão coronariana, a contratilidade dos Músculos Papilares (MP) obtidos a partir de camundongos submetidos à cirurgia sham (C, n = 17), com infarto moderado (MMI, n = 10) e grande infarto (LMI, n = 14), foi avaliada após intervalos de repouso de 10 a 60 segundos antes e depois da incubação com cloreto de lítio (Li+) em substituição ao cloreto de sódio ou rianodina (Ry). A expressão proteica de SR Ca(2+)-ATPase (SERCA2), trocador Na+/Ca2+ (NCX), fosfolambam (PLB) e fosfo-Ser (16)-PLB foi analisada por Western blotting. RESULTADOS: Os camundongos MMI apresentaram potenciação de CPR reduzida em comparação aos camundongos C. Em oposição à potenciação normal para camundongos C, foram observadas degradações de força pós-repouso nos músculos de camundongos LMI. Além disso, a Ry bloqueou a degradação ou potenciação de PRC observada em camundongos LMI e C; o Li+ inibiu o NCX e converteu a degradação em potenciação de CPR em camundongos LMI. Embora os camundongos MMI e LMI tenham apresentado diminuição no SERCA2 (72 ± 7% e 47 ± 9% de camundongos controle, respectivamente) e expressão protéica de fosfo-Ser16-PLB (75 ± 5% e 46 ± 11%, respectivamente), a superexpressão do NCX (175 ± 20%) só foi observada nos músculos de camundongos LMI. CONCLUSÃO: Nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que a remodelação miocárdica pós-IAM em camundongos pode mudar a potenciação regular para degradação pós-repouso, afetando as proteínas de manipulação de Ca(2+) em miócitos.
IDepartamento de Medicina - Divisão de Cardiologia - Universidade Federal de São Paulo;, São Paulo, SP
IIDepartamento de Psicologia - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP
IIIDepartamento de Psicologia e Biofísica - Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade de São Paulo, São Paulo, SP
IVDepartamento de Ciências Psicológicas - Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES, Brasil
No músculo cardíaco, tanto o influxo de cálcio (Ca2+) pelo sarcolema quanto a liberação de Ca2+ no Retículo Sarcoplasmático (RS) contribuem para a ativação de miofilamentos durante a contração, e na maioria dos mamíferos, a liberação de Ca2+ induzida por Ca2+ a partir do SR é quantitativamente dominante1-3. Os mecanismos básicos celulares da contração muscular cardíaca são significativamente modulados pelo ritmo de estimulação. Assim, mudanças na frequência e no ritmo cardíaco são normalmente usadas como manobras experimentais para avaliar o comportamento ou revelar anormalidades na cinética de Ca2+ no acoplamento excitação-contração3. Assim, a Contração Pós-Repouso (CPR) permite uma avaliação indireta da função do RS2,4,5. No miocárdio de camundongos normais, a CPR é potencializada pelo Ca2+ adicional acumulado no RS durante a pausa em razão de atividade de Ca2+-ATPase (SERCA2) no RS e da liberação fracionária de Ca2+ 2,5 mediante a ativação. Por outro lado, a CPR é negativamente modulada pelo efluxo de Ca2+ ao longo do trocador Na+/Ca2+ 1,2,6,7.
O remodelamento ventricular que acontece após o Infarto do Miocárdio (IM) muitas vezes leva ao comprometimento da função contrátil do miocárdio poupado8-11, estando associado ao comprometimento da manipulação intracelular Ca2+ 12,13. Como resultado, foi proposto que a potenciação pós-repouso pudesse ser alterada patologicamente por uma alteração na cinética do cálcio14,15. Relatórios anteriores descreveram redução da potenciação pós-repouso nos músculos papilares do ventrículo esquerdo de camundongos com IM curado de diferentes tamanhos de infarto9,10. Recentemente, foi identificada, pela primeira vez, a degradação das contrações pós-repouso em camundongos com insuficiência cardíaca crônica16. Considerando que os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à gênese da contração pós-repouso no miocárdio de camundongos após a remodelação não estão completamente definidos, no presente relatório foi investigada a CPR do músculo papilar ventricular esquerdo remanescente do MI, e sua relação com a remodelação molecular das principais proteínas de manipulação de Ca2+.
Camundongos Wistar pesando 180-220 g foram tratados e utilizados de acordo com os
O IM foi produzido pela ligadura da artéria coronariana permanente, como descrito pelo nosso laboratório em publicações anteriores11,17. Brevemente, sob anestesia (ketamina 50 mg/kg e xilazina 10 mg/kg, via intraperitoneal) e ventilação artificial (Harvard Rodent Ventilator, modelo 863, Harvard Apparatus, Holliston, MA), foi feita uma toracotomia esquerda. O coração foi exteriorizado e a artéria coronariana descendente anterior foi ligada com sutura de polipropileno 6-0. O coração foi rapidamente reposicionado e o tórax foi fechado. Camundongos submetidos à cirurgia sham foram considerados o grupo controle (C). Todos os resultados morfológicos e funcionais foram avaliados seis semanas após a produção do IM.
A fim de caracterizar o IM, bem como as dimensões e a função do coração, foi realizado um ecocardiograma com Doppler em animais anestesiados (mesma mistura de ketamina com xilazina) seis semanas após a cirurgia. Esses procedimentos foram realizados por um observador cego à condição animal, usando um instrumento HP SONOS 5500 (Philips Medical System, Andover, MA, EUA) com um transdutor de 12 MHz a uma profundidade de 2 cm, de acordo com metodologia previamente descrita11,17,18. Imagens transversais foram obtidas nos níveis basal (na extremidade das válvulas da valva mitral), médio (ao nível dos músculos papilares) e apical (distal ao músculo papilar, mas além do tampão da cavidade). O tamanho do infarto foi estimado como a identificação subjetiva de acinesia ou discinesia da parede ventricular esquerda (VE) em cada plano transversal e apresentado como o comprimento do arco correspondente ao segmento da cicatriz do IM em relação ao perímetro total da borda endocárdica do VE. Recentemente, demonstramos que essa medida ecocardiográfica está satisfatoriamente de acordo com a coloração histoquímica18. Os animais infartados foram divididos em dois grupos, de acordo com o tamanho do IM: um grupo composto de camundongos com IM moderado, entre 20% e 39% do VE (MMI), e outro grupo de camundongos com IM maior que 39% do VE (LMI).
Os diâmetros diastólico e sistólico final do VE foram medidos a partir do corte transversal paraesternal usando imagens em modo M. A função sistólica foi definida pela fração de encurtamento e calculada como a média percentual de variação entre os diâmetros diastólico e sistólico. A função diastólica foi analisada pela curva de velocidade de influxo diastólico mitral pelo Doppler pulsado. A partir de uma vista de 4 câmaras, foram adquiridos o pico da onda E e velocidades da onda A e calculada a razão E/A.
Imediatamente após o exame ecocardiográfico, foram feitas preparações
Depois da remoção do músculo papilar, os ventrículos direito e esquerdo foram separados e pesados. O pulmão direito também foi excisado e pesado. Após secagem a 70 ºC durante 12h, o Teor de Água Pulmonar (TAP), considerado um índice de congestão, foi determinado utilizando a seguinte equação: TAP (%) = (perda de peso após a secagem / peso úmido) × 100.
O teor de proteína foi analisado em amostras de VE remanescente dos grupos LMI, MMI e C após a excisão dos músculos papilares e cicatrização do infarto. Homogeneizados de tecido foram analisados por Western blotting de acordo com protocolos previamente descritos5 para comparar a expressão protéica de SERCA2, fosfolambam (PLB), fosfo-Ser16-PLB e NCX em todos os grupos experimentais. Amostras de miocárdios não infartados foram rapidamente congeladas a -70 ºC. Os tecidos foram homogeneizados em tampão de extração gelado (Tris 50 mM, EDTA 1 mM e sacarose mM 250, pH 7,4) usando Polytron (Polytron® PT2100, Kinematica AG, Littau, LU, SWI). Para preparar as frações microssomais de proteínas, foi feita uma centrifugação inicial a 10.000 ×
Os resultados são expressos como média ± EPM e analisados pelo teste
A
A área transversal foi maior no grupo LMI (1,16 ± 0,05 mm2, n = 14) em comparação com o grupo MMI (1,01 ± 0,05 mm2, n = 10) e o grupo C (0,96 ± 0,04 mm2, n = 17). Como podemos ver na
Na
A fim de investigar os mecanismos da CPR em músculos papilares de camundongos infartados, foram utilizadas ferramentas farmacológicas (
Em todos os grupos, foram investigadas proteínas de manipulação cálcio possivelmente envolvidas nessas alterações (
Nossos resultados mostram que a remodelação miocárdica pós-IM em camundongos pode mudar a potenciação regular pós-repouso para pós-degradação da força ativa afetando proteínas de manipulação de Ca(2+) em miócitos. Esse comportamento incomum da mecânica do miocárdio mostrou-se evidente apenas em animais com grande infarto, em que o processo de remodelação incluiu não apenas dilatação do VE com disfunção sistólica e diastólica, mas também pior contração e relaxamento do miocárdio, provavelmente pela deficiência de captação de SR Ca2+ e efluxo excessivo de Ca2+ do sarcolema.
Disfunção ventricular no IM e dilatação das cavidades cardíacas, normalmente observadas em camundongos com infartos maiores23, também são mostradas no presente estudo. A remodelação pós-IAM esteve associada com a diminuição do desenvolvimento de tensão nos músculos papilares de camundongos infartados e taxa reduzida de geração de força e relaxamento, como relatado anteriormente para os músculos papilares9,10,13,20,24. Identificou-se também um comprometimento similar do encurtamento em miócitos ventriculares isolados25,26, e os mecanismos propostos para explicar a disfunção contrátil incluem defeitos no acoplamento excitação-contração13,24.
Durante o repouso do miocárdio, o Ca2+ é removido do citosol para o RS por SERCA2 ou para a mitocôndria pelo uniportador de Ca2+, ou é expulso pelo NCX e Ca2+-ATPase do sarcolema1. Nos protocolos de CPR como o utilizado no presente trabalho, a potenciação da TD ocorre depois de uma pausa de estímulos, como esperado para o músculo cardíaco de camundongos. Normalmente, como a maior parte do Ca2+ retorna ao RS durante o período de repouso, seu teor tende a aumentar com o prolongamento da pausa, aumentando também a liberação de Ca2+ e, por fim, a geração de força sobre a próxima ativação1. Na verdade, a administração de Ry para bloquear a função do RS nos nossos experimentos aboliu completamente a potenciação dos músculos no grupo C, reforçando estudos anteriores que descrevem o papel fundamental da função de armazenamento do RS nesse fenômeno4. Por outro lado, a inibição da extrusão de Ca2+ pelo sarcolema pelo NCX em nossas preparações (usando Li+) aumentou a potenciação dos músculos C, o que confirma a importância dos mecanismos de efluxo de Ca2+ para modular negativamente a CPR do músculo do VE dos camundongos6,7. De fato, relatou-se que a estimulação do NCX leva a um aumento do efluxo de Ca2+ e influxo de Na+ e, consequentemente, a uma diminuição da CPR27,28
Diversos relatos investigaram a remodelação miocárdica pós-infarto e disfunção contrátil, tendo apontado deficiências na movimentação de Ca2+ em cardiomiócitos13,29-31. A literatura é controversa a respeito do comportamento da CPR na remodelação pós-IM. Em miocárdios humanos com disfunção, os autores relataram diminuição da potenciação32,33 ou degradação28 da contração após pausas prolongadas. Em modelos animais9,10, observou-se a diminuição da potenciação em comparação aos controles a partir de ratos infartados. Além disso, em miócitos sobreviventes após IM em cães, houve redução da potenciação da contração após o repouso34. Essas alterações foram atribuídas essencialmente ao comprometimento da função de armazenamento do RS associado com relativa redução da liberação de Ca2+. Recentemente, nosso grupo identificou degradação da CPR nos músculos papilares de camundongos com insuficiência cardíaca 40 semanas após a oclusão coronariana16. No entanto, os mecanismos causais para esse comportamento inédito da CPR em camundongos não foram investigados, tendo em vista que o presente estudo utiliza camundongos adultos com infartos curados de seis semanas de idade.
Nossos experimentos sugerem que as alterações do acoplamento excitação-contração contribuem para a redução da CPR nos camundongos LMI: a disfunção de armazenamento do RS associada com a intensificação da extrusão de Ca2+, uma vez que a Ry aboliu este fenômeno, ao passo que a inibição de NCX normalizou-o.
O comprometimento da função de reabsorção do RS, o que provavelmente ocorre tanto no grupo MMI quanto no grupo LMI, pode não se dar somente pela diminuição da expressão proteica de SERCA2, mas também ao menor teor de Ser16-PLB como mostra os ensaios de Western blotting. Quando fosforilada, a proteína reguladora PLB alivia a inibição da SERCA2, permitindo a sua função de captação de Ca2+1. De fato, a diminuição da fosforilação de PLB no miocárdio remodelado de camundongos infartados também tem sido descrita como levando à disfunção do RS31. Além disso, não podemos ignorar a ocorrência de vazamento diastólico elevado de Ca2+ das vesículas do RS. Relata-se que as proteínas reguladoras receptoras da Ry (FKBP, em especial, FKBP12.6) podem ser patologicamente alteradas em sua estrutura e conteúdo, bem como nos mecanismos de fosforilação que modulam o acoplamento do receptor FKBP-rianodina, resultando em uma subcondutância no remodelamento do miocárdio29,35.
Particularmente nos músculos do grupo LMI, usando Li+ em vez de Na+ na solução de Krebs-Henseleit, a degradação da CPR em experimentos realizados no grupo LMI passou a se constituir em uma potenciação típica da CPR, sugerindo o papel fundamental do NCX sobre a deficiência da contração subseqüente quando ocorre degradação da CPR. Como mencionado anteriormente, embora a acumulação de Ca2+ no RS seja relativamente limitada pelo efluxo de Ca2+ através do sarcolema, o RS normalmente reabsorve a maior parte do Ca2+ como resultado da absorção dominante de SERCA2 sobre a extrusão deste íon pelo sarcolema em cardiomiócitos de camundongos. Por outro lado, se os mecanismos de efluxo de Ca2+ pelo sarcolema estão desempenhando um papel mais importante do que a reabsorção pelo RS, a degradação do teor de Ca2+ pelo RS tende a ocorrer com o prolongamento da pausa em coelhos27. De fato, nos mamíferos em que a importância da SERCA2 é contrabalançada pelo NCX na realização da retirada de Ca2+, como é o caso dos coelhos, o miocárdio normalmente exibe essa redução na força da primeira contração seguinte às restantes, proporcionalmente à duração da pausa, designada como degradação pós-repouso1. De fato, nossos resultados mostram uma superexpressão significativa do teor do NCX no grupo LMI quando comparado aos grupos MMI e C, o que corrobora a ideia que o aumento da atividade e/ou expressão de NCX está relacionado com a degradação pós-repouso após o IM e insuficiência cardíaca, pelo menos nos camundongos.
Embora o miocárdio remodelado tanto do grupo MMI quanto do grupo LMI tenha diminuído os teores de SERCA2 e Ser16-PLB, observou-se elevação do nível de proteína NCX somente no grupo LMI, o grupo experimental que apresentou degradação pós-repouso. Assim, o perfil molecular com remodelação pós-IM deve ser uma variável de fundamental importância para a ocorrência de degradação pós-repouso. De fato, as mudanças em diferentes proteínas de cardiomiócitos foram relatadas em modelos animais21,30,36 e humanos com insuficiência cardíaca37,38 como causadoras do acoplamento disfuncional excitação-contração. Como resultado, sugerimos que a importância alterada do efluxo de Ca2+ pelo sarcolema provocado pela superexpressão de NCX associada com a captação disfuncional por parte do RS tenha, provavelmente, levado ao comprometimento miocárdico dos camundongos, apresentando essa degradação da CPR.
Embora não tenhamos medido diretamente o [Ca2+]i ou a atividade das proteínas manipuladoras de cálcio analisadas, limitações reconhecidas no presente estudo, nossos resultados sugerem que o comprometimento da função de reabsorção do RS associado com o aumento de efluxo de cálcio durante a diástole do músculo do grupo LMI é a causa provável da degradação da força pós-repouso. Portanto, é possível especular também que menores índices de [Ca2+]i devido ao aumento de NCX, embora possa reduzir a sobrecarga deletéria de Ca2+, pode diminuir o Ca2+ disponível para reabsorção durante a diástole e, conseqüentemente, a quantidade liberada durante a sístole.
Em suma, nossos resultados confirmaram que camundongos infartados apresentam disfunção ventricular global e também distúrbios contráteis do miocárdio decorrentes do infarto diretamente relacionado à gravidade da remodelação. Contribuindo para essa alteração, o uso do protocolo CPR identificou um comportamento excepcional do miocárdio dos camundongos, designado como degradação da força pós-repouso. Atribui-se esse fenômeno a um distúrbio nas proteínas de manipulação de Ca2+ no exercício das suas funções normais, especialmente em grandes infartos do miocárdio, devido à associação da reduzida reabsorção de Ca2+ pela SERCA2 com o efluxo excessivo de Ca2+ pelo NCX.
Correspondência: Danilo Sales Bocalini Rua General Chagas Santos, 392 - Saúde 04146-050 - São Paulo, SP, Brasil E-mail:
Artigo recebido em 31/05/11
Revisado recebido em 13/09/11
Aceito em 20/09/11.
FUNDAMENTO: La Contracción pos pausa (CPP) del músculo cardíaco provee informaciones indirectas sobre la manejo del calcio intracelular. OBJETIVO: Nuestro objetivo fue estudiar el comportamiento de la CPP y sus mecanismos subyacentes en Ratas con infarto de miocardio. MÉTODOS: Seis semanas después de la oclusión coronaria, la contractilidad de los Músculos Papilares (MP) obtenidos a partir de Ratas sometidos a falsa cirurgia (C, n = 17), con infarto moderado (MMI, n = 10) y gran infarto (LMI, n = 14), fue evaluada después de pausas de estímulos de 10 a 60 segundos antes y después de la incubación con cloruro de litio (Li+) en substitución del cloruro de sodio o rianodina (Ry). La expresión proteica de SR Ca(2+)-ATPasa (SERCA2), intercambiador Na+/Ca2+ (NCX), fosfolamban (PLB) y fosfo-Ser (16)-PLB fue analizada por Western blotting. RESULTADOS: Los Ratas MMI presentaron potenciación de CPP reducida en comparación a los Ratas C. En oposición a la potenciación normal para Ratas C, fueron observadas decaimientos de fuerza post-reposo en los músculos de Ratas LMI. Además de eso, la Ry bloqueó la decaimiento o potenciación de PRC observada en Ratas LMI y C; el Li+ inhibió el NCX y convirtió la decaimiento en potenciación de CPP en Ratas LMI. Aunque los Ratas MMI y LMI hayan presentado disminución en el SERCA2 (72 ± 7% y 47 ± 9% de Ratas control, respectivamente) y expresión proteica de fosfo-Ser16-PLB (75 ± 5% y 46 ± 11%, respectivamente), la superexpresión del NCX (175 ± 20%) sólo fue observada en los músculos de Ratas LMI. CONCLUSIÓN: Nuestros resultados mostraron, por primera vez, que el remodelado miocárdico post-IAM en Ratas puede cambiar la potenciación regular para decaimiento post-reposo, afectando las proteínas de manejo del Ca(2+) en miocitos.
IDepartamento de Medicina - Divisão de Cardiologia - Universidade Federal de São Paulo
IIDepartamento de Fisiologia e Biofísica - Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade de São Paulo, São Paulo, SP
IIIDepartamento de Biologia Estrutural e Funcional - Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP
IVDepartamento de Ciências Fisiológicas - Universidade Federal do Espírito Santo
VDepartamento de Ciências Morfofuncionais - Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia, Vitória, ES, Brasil
Correspondencia
En el músculo cardíaco, tanto el influjo de calcio (Ca2+) por el sarcolema como la liberación de Ca2+ en el Retículo Sarcoplasmático (RS) contribuyen para la activación de miofilamentos durante la contracción, y en la mayoría de los mamíferos, la liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ a partir del SR es cuantitativamente dominante1-3. Los mecanismos básicos celulares de la contracción muscular cardíaca son significativamente modulados por el ritmo de estimulación. Así, cambios en la frecuencia y en el ritmo cardíaco son normalmente usados como maniobras experimentales para evaluar el comportamiento o revelar anormalidades en la cinética de Ca2+ en el acoplamiento excitación-contracción3. Así, la Contracción pos pausa (CPP) permite una evaluación indirecta de la función del RS2,4,5. En el miocardio de Ratas normales, la CPP es potenciada por el Ca2+ adicional acumulado en el RS durante la pausa en razón de actividad de Ca2+-ATPasa (SERCA2) en el RS y de la liberación fraccionaria de Ca2+ 2,5 mediante la activación. Por otro lado, la CPP es negativamente modulada por el eflujo de Ca2+ a lo largo del intercambiador Na+/Ca2+ 1,2,6,7.
El remodelado ventricular que sucede después del Infarto de Miocardio (IM) muchas veces lleva al compromiso de la función contráctil del miocardio no infartado8-11, estando asociado al compromiso de la manipulación intracelular Ca2+ 12,13. Como resultado, fue propuesto que la potenciación post-reposo pudiese ser alterada patológicamente por una alteración en la cinética del calcio14,15. Informes anteriores describieron reducción de la potenciación post-reposo en los músculos papilares del ventrículo izquierdo de Ratas con IM curado de diferentes tamaños de infarto9,10. Recientemente, fue identificada, por primera vez, la decaimiento de las contracciones post-reposo en Ratas con insuficiencia cardíaca crónica16. Considerando que los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la génesis de la Contracción pos pausa en el miocardio de Ratas después del remodelado no están completamente definidos, en el presente informe fue investigada la CPP del músculo papilar ventricular izquierdo remanente del MI, y su relación con el remodelado molecular de las principales proteínas de manipulación de Ca2+.
Ratas Wistar pesando 180-220 g fueron tratados y utilizados de acuerdo con los
El IM fue producido por la ligadura permanente de la arteria coronaria, como fue descripto por nuestro laboratorio en publicaciones anteriores11,17. Brevemente, bajo anestesia (ketamina 50 mg/kg y xilazina 10 mg/kg, via intraperitoneal) y ventilación artificial (Harvard Rodent Ventilator, modelo 863, Harvard Apparatus, Holliston, MA), fue hecha una toracotomía izquierda. El corazón fue exteriorizado y la arteria coronaria descendente anterior fue ligada con sutura de polipropileno 6-0. El corazón fue rápidamente reposicionado y el tórax fue cerrado. Ratas sometidos a la falsa cirurgia fueron considerados el grupo control (C). Todos los resultados morfológicos y funcionales fueron evaluados seis semanas después de la producción del IM.
A fin de caracterizar el IM, así como las dimensiones y la función del corazón, fue realizado un ecocardiograma con Doppler en animales anestesiados (misma mezcla de ketamina con xilazina) seis semanas después de la cirugía. Esos procedimientos fueron realizados por un observador ciego a la condición animal, usando un instrumento HP SONOS 5500 (Philips Medical System, Andover, MA, EUA) con un transductor de 12 MHz a una profundidad de 2 cm, de acuerdo con metodología previamente descripta11,17,18. Imágenes transversales fueron obtenidas en los niveles basal (en la extremidad de las valvas de la válvula mitral), medio (al nivel de los músculos papilares) y apical (distal al músculo papilar, pero además del tapón de la cavidad). El tamaño del infarto fue estimado como la identificación subjetiva de acinesia o discinesia de la pared ventricular izquierda (VI) en cada plano transversal y presentado como el largo del arco correspondiente al segmento de la cicatriz del IM en relación al perímetro total del borde endocárdico del VI. Recientemente, demostramos que esa medida ecocardiográfica está satisfactoriamente de acuerdo con la coloración histoquímica18. Los animales infartados fueron divididos en dos grupos, de acuerdo con el tamaño del IM: un grupo compuesto de Ratas con IM moderado, entre 20% y 39% del VI (MMI), y otro grupo de Ratas con IM mayor que 39% del VI (LMI).
Los diámetros diastólico y sistólico final del VI fueron medidos a partir del corte transversal paraesternal usando imágenes en modo M. La función sistólica fue definida por la fracción de acortamiento y calculada como la media porcentual de variación entre los diámetros diastólico y sistólico. La función diastólica fue analizada por la curva de velocidad de influjo diastólico mitral por el Doppler pulsado. A partir de una vista de 4 cámaras, fueron adquiridos el pico de la onda E y velocidades de la onda A y calculada la razón E/A.
Inmediatamente después del examen ecocardiográfico, fueron hechas preparaciones
Después de la remoción del músculo papilar, los ventrículos derecho e izquierdo fueron separados y pesados. El pulmón derecho también fue excisado y pesado. Después de secado a 70 ºC durante 12h, el Tenor de Agua Pulmonar (TAP), considerado un índice de congestión, fue determinado utilizando la siguiente ecuación: TAP (%) = (pérdida de peso después del secado / peso húmedo) × 100.
El tenor de proteína fue analizado en muestras de VI remanente de los grupos LMI, MMI y C después de la escisión de los músculos papilares y cicatrización del infarto. Homogeneizados de tejido fueron analizados por Western blotting de acuerdo con protocolos previamente descritos5 para comparar la expresión proteica de SERCA2, fosfolamban (PLB), fosfo-Ser16-PLB y NCX en todos los grupos experimentales. Muestras de miocardios no infartados fueron rápidamente congeladas a -70 ºC. Los tejidos fueron homogeneizados en tapón de extracción helado (Tris 50 mM, EDTA 1 mM y sacarosa mM 250, pH 7,4) usando Polytron (Polytron® PT2100, Kinematica AG, Littau, LU, SWI). Para preparar las fracciones microsomales de proteínas, fue hecha una centrifugación inicial a 10.000 ×
Los resultados son expresados como media ± DEM y analizados por el test
La
El área transversal fue mayor en el grupo LMI (1,16 ± 0,05 mm2, n = 14) en comparación con el grupo MMI (1,01 ± 0,05 mm2, n = 10) y el grupo C (0,96 ± 0,04 mm2, n = 17). Como podemos ver en la
En la
A fin de investigar los mecanismos de la CPP en músculos papilares de Ratas infartados, fueron utilizadas herramientas farmacológicas (
En todos los grupos, fueron investigadas proteínas de manipulación calcio posiblemente envueltas en esas alteraciones (
Nuestros resultados muestran que el remodelado miocárdico post-IM en Ratas puede cambiar la potenciación regular post-reposo para post-decaimiento de la fuerza activa afectando proteínas de manejo del Ca(2+) en miocitos. Ese comportamiento poco común de la mecánica del miocardio se mostró evidente apenas en animales con gran infarto, en los que el proceso de remodelado incluyó no apenas dilatación del VI con disfunción sistólica y diastólica, sino también peor contracción y relajación del miocardio, probablemente por la deficiencia de captación de SR Ca2+ y eflujo excesivo de Ca2+ del sarcolema.
Disfunción ventricular en el IM y dilatación de las cavidades cardíacas, normalmente observadas en Ratas con infartos mayores23, también son mostradas en el presente estudio. El remodelado post-IAM estuvo asociado a la disminución del desarrollo de tensión en los músculos papilares de Ratas infartados y tasa reducida de generación de fuerza y relajación, como fue relatado anteriormente para los músculos papilares9,10,13,20,24. Se identificó también un compromiso similar del acortamiento en miocitos ventriculares aislados25,26, y los mecanismos propuestos para explicar la disfunción contráctil incluyen defectos en el acoplamiento excitación-contracción13,24.
Durante el reposo del miocardio, el Ca2+ es removido del citosol para el RS por SERCA2 o para la mitocondria por el uniportador de Ca2+, o es expulsado por el NCX y Ca2+-ATPasa del sarcolema1. En los protocolos de CPP como el utilizado en el presente trabajo, la potenciación de la TD ocurre después de una pausa de estímulos, como es esperado para el músculo cardíaco de Ratas. Normalmente, como la mayor parte del Ca2+ retorna al RS durante el período de reposo, su tenor tiende a aumentar con la prolongación de la pausa, aumentando también la liberación de Ca2+ y, por fin, la generación de fuerza sobre la próxima activación1. En verdad, la administración de Ry para bloquear la función del RS en los nuestros experimentos abolió completamente la potenciación de los músculos en el grupo C, reforzando estudios anteriores que describen el papel fundamental de la función de almacenamiento del RS en ese fenômeno4. Por otro lado, la inhibición de la extrusión de Ca2+ por el sarcolema por el NCX en nuestras preparaciones (usando Li+) aumentó la potenciación de los músculos C, lo que confirma la importancia de los mecanismos de eflujo de Ca2+ para modular negativamente la CPP del músculo del VI de los Ratas6,7. De hecho, se relató que la estimulación del NCX lleva a un aumento del eflujo de Ca2+ y influjo de Na+ y, consecuentemente, a una disminución de la CPP27,28.
Diversos relatos investigaron el remodelado miocárdico post-infarto y disfunción contráctil, habiendo señalado deficiencia en el movimiento de Ca2+ en cardiomiocitos13,29-31. La literatura es controvertida respecto al comportamiento de la CPP en el remodelado post-IM. En miocardios humanos con disfunción, los autores relataron disminución de la potenciación32,33 o decaimiento28 de la contracción después de pausas prolongadas. En modelos animales9,10, se observó la disminución de la potenciación en comparación a los controles a partir de Ratas infartados. Además de eso, en miocitos sobrevivientes después de IM en canes, hubo reducción de la potenciación de la contracción después del reposo34. Esas alteraciones fueron atribuidas esencialmente al compromiso de la función de almacenamiento del RS asociado con relativa reducción de la liberación de Ca2+. Recientemente, nuestro grupo identificó decaimiento de la CPP en los músculos papilares de Ratas con insuficiencia cardíaca 40 semanas después de la oclusión coronaria16. Mientras tanto, los mecanismos causales para ese comportamiento inédito de la CPP en Ratas no fueron investigados, teniendo en vista que el presente estudio utiliza Ratas adultos con infartos curados de seis semanas de edad.
Nuestros experimentos sugieren que las alteraciones del acoplamiento excitación-contracción contribuyen para la reducción de la CPP en los Ratas LMI: la disfunción de almacenamiento del RS asociada con la intensificación de la extrusión de Ca2+, una vez que la Ry abolió este fenómeno, al tiempo que la inhibición de NCX lo normalizó.
El compromiso de la función de reabsorción del RS, lo que probablemente ocurre tanto en el grupo MMI como en el grupo LMI, puede no darse solamente por la disminución de la expresión proteica de SERCA2, sino también por el menor tenor de Ser16-PLB como muestran los ensayos de Western blotting. Cuando es fosforilada, la proteína reguladora PLB alivia la inhibición de la SERCA2, permitiendo su función de captación de Ca2+1. De hecho, la disminución de la fosforilación de PLB en el miocardio remodelado de Ratas infartados también ha sido descripta como llevando a la disfunción del RS31. Además de eso, no podemos ignorar la ocurrencia de derramamiento diastólico elevado de Ca2+ de las vesículas del RS. Se relata que las proteínas reguladoras receptoras de la Ry (FKBP, en especial, FKBP12.6) pueden ser patológicamente alteradas en su estructura y contenido, así como en los mecanismos de fosforilación que modulan el acoplamiento del receptor FKBP-rianodina, resultando en una subconductancia en el remodelado del miocardio29,35.
Particularmente en los músculos del grupo LMI, usando Li+ en vez de Na+ en la solución de Krebs-Henseleit, la decaimiento de la CPP en experimentos realizados en el grupo LMI pasó a constituirse una potenciación típica de la CPP, sugiriendo el papel fundamental del NCX sobre la deficiencia de la contracción subsecuente cuando ocurre decaimiento de la CPP. Como fue mencionado anteriormente, aunque la acumulación de Ca2+ en el RS sea relativamente limitada por el eflujo de Ca2+ a través del sarcolema, el RS normalmente reabsorbe la mayor parte del Ca2+ como resultado de la absorción dominante de SERCA2 sobre la extrusión de este ión por el sarcolema en cardiomiocitos de Ratas. Por otro lado, si los mecanismos de eflujo de Ca2+ por el sarcolema están desempeñando un papel más importante que la reabsorción por el RS, la decaimiento del tenor de Ca2+ por el RS tiende a ocurrir con la prolongación de la pausa en conejos27. De hecho, en los mamíferos en que la importancia de la SERCA2 es contrabalanceada por el NCX en la realización de la retirada de Ca2+, como es el caso de los conejos, el miocardio normalmente exhibe esa reducción en la fuerza de la primera contracción siguiente a las restantes, proporcionalmente a la duración de la pausa, designada como decaimiento post-reposo1. De hecho, nuestros resultados muestran una superexpresión significativa del tenor del NCX en el grupo LMI cuando es comparado a los grupos MMI y C, lo que corrobora la idea que el aumento de la actividad y/o expresión de NCX está relacionado con la decaimiento post-reposo después del IM e insuficiencia cardíaca, por lo menos en los Ratas.
Aunque el miocardio remodelado tanto del grupo MMI como del grupo LMI haya disminuido los tenores de SERCA2 y Ser16-PLB, se observó elevación del nivel de proteína NCX solamente en el grupo LMI, el grupo experimental que presentó decaimiento post-reposo. Así, el perfil molecular con remodelado post-IM debe ser una variable de fundamental importancia para la ocurrencia de decaimiento post-reposo. De hecho, los cambios en diferentes proteínas de cardiomiocitos fueron relatados en modelos animales21,30,36 y humanos con insuficiencia cardíaca37,38 como causadoras del acoplamiento disfuncional excitación-contracción. Como resultado, sugerimos que la importancia alterada del eflujo de Ca2+ por el sarcolema provocado por la superexpresión de NCX asociada con la captación disfuncional por parte del RS haya, probablemente, llevado al compromiso miocárdico de los Ratas, presentando esa decaimiento de la CPP.
Aunque no hayamos medido directamente el [Ca2+]i o la actividad de las proteínas manipuladoras de calcio analizadas, limitaciones reconocidas en el presente estudio, nuestros resultados sugieren que el compromiso de la función de reabsorción del RS asociado con el aumento de eflujo de calcio durante la diástole del músculo del grupo LMI es la causa probable de la decaimiento de la fuerza post-reposo. Por lo tanto, es posible especular también que menores índices de [Ca2+]i debido al aumento de NCX, aunque puedan reducir la sobrecarga deletérea de Ca2+, pueden disminuir el Ca2+ disponible para reabsorción durante la diástole y, consecuentemente, la cantidad liberada durante la sístole.
En suma, nuestros resultados confirmaron que Ratas infartados presentan disfunción ventricular global y también trastornos contráctiles del miocardio resultantes del infarto directamente relacionado a la gravedad del remodelado. Contribuyendo para esa alteración, el uso del protocolo CPP identificó un comportamiento excepcional del miocardio de los Ratas, designado como decaimiento de la fuerza post-reposo. Se atribuye ese fenómeno a un trastorno en las proteínas de manipulación de Ca2+ en el ejercicio de sus funciones normales, especialmente en grandes infartos de miocardio, debido a la asociación de la reducida reabsorción de Ca2+ por la SERCA2 con el eflujo excesivo de Ca2+ por el NCX.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio no tuve fuentes de financiación externas.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.
BACKGROUND: Post-rest contraction (PRC) of cardiac muscle provides indirect information about the intracellular calcium handling. OBJECTIVE: Our aim was to study the behavior of PRC, and its underlying mechanisms, in rats with myocardial infarction. METHODS: Six weeks after coronary occlusion, the contractility of papillary muscles (PM) obtained from sham-operated (C, n=17), moderate infarcted (MMI, n=10) and large infarcted (LMI, n=14) rats was evaluated, following rest intervals of 10 to 60 seconds before and after incubation with lithium chloride (Li+) substituting sodium chloride or ryanodine (Ry). Protein expression of SR Ca(2+)-ATPase (SERCA2), Na+/Ca2+ exchanger (NCX), phospholamban (PLB) and phospho-Ser(16)-PLB were analyzed by Western blotting. RESULTS: MMI exhibited reduced PRC potentiation when compared to C. Opposing the normal potentiation for C, post-rest decays of force were observed in LMI muscles. In addition, Ry blocked PRC decay or potentiation observed in LMI and C; Li+ inhibited NCX and converted PRC decay to potentiation in LMI. Although MMI and LMI presented decreased SERCA2 (72±7% and 47±9% of Control, respectively) and phospho-Ser16-PLB (75±5% and 46±11%, respectively) protein expression, overexpression of NCX (175±20%) was only observed in LMI muscles. CONCLUSION: Our results showed, for the first time ever, that myocardial remodeling after MI in rats may change the regular potentiation to post-rest decay by affecting myocyte Ca(2+) handling proteins.
IDepartamento de Medicina - Divisão de Cardiologia - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP
IIDepartamento de Psicologia - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP
IIIDepartamento de Psicologia e Biofísica - Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade de São Paulo, São Paulo, SP
IVDepartamento de Ciências Psicológicas - Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES, Brazil
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In the cardiac muscle, both transarcolemmal calcium (Ca2+) influx and sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ release contribute to the myofilament activation during contraction and in the majority of mammals, the Ca2+-induced Ca2+ release from SR is quantitatively dominant1-3. The basic cellular mechanisms of cardiac muscle contraction are significantly modulated by the rhythm of stimulation. Thus, changes in rate and rhythm are frequently used as experimental maneuvers to evaluate the behavior or disclose abnormalities of Ca2+ kinetics on the excitation-contraction coupling3. Accordingly, post-rest contraction (PRC) allows indirect evaluation of the SR function2,4,5. In the myocardium of normal rats, PRC is potentiated due to the additional Ca2+ accumulated in the SR during the pause due to SR Ca2+-ATPase (SERCA2) activity and the increased fractional Ca2+ release2,5 upon activation. On the other hand, PRC is negatively modulated by the Ca2+ efflux throughout the Na+/Ca2+ exchanger (NCX)1,2,6,7.
The ventricular remodelling that follows myocardial infarction (MI) often leads to impaired contractile function of the spared myocardium8,11 and is associated with defective intracellular Ca2+ handling12,13. As a result, it has been proposed that post-rest potentiation may be altered pathologically by an alteration in calcium kinetics14,15. Previous reports described reduction of the post-rest potentiation in left ventricular papillary muscles from rats with healed MI of different infarct sizes9,10. Recently, we identified, for the first time, decay of the post-rest contractions in rats with chronic heart failure16. Since the pathophysiological mechanisms underlying the genesis of post-rest contraction in the rat myocardium after remodeling are not completely defined, in this report, we investigated the PRC of left ventricular papillary muscle derived from the MI, and its relationship with the molecular remodeling of the primary Ca2+-handling proteins.
Wistar rats weighing 180 to 220 g were handled and used according to the
The MI was produced by permanent coronary artery ligature as described by our laboratory in previous publications11,17. Under anesthesia (ketamine 50 mg/kg and xylazine 10 mg/kg, intraperitoneally) and artificial ventilation (Harvard Rodent Ventilator, model 863; Harvard Apparatus, Holliston, MA), a left thoracotomy was briefly performed. The heart was exteriorized and the left anterior descending coronary artery ligated with 6-0 polypropylene suture. The heart was quickly repositioned and the thorax was closed. Sham-operated rats were considered the control group (C). All morphological and functional outcomes were assessed six weeks after MI production.
In order to characterize the MI and heart dimensions and function, Doppler echocardiography was performed in anesthetized animals (same mixture of ketamine plus xylazine) six weeks after surgery. These procedures were performed by one observer blind to the animal condition, using an HP SONOS 5500 instrument (Philips Medical System, Andover, MA, USA) with a 12-MHz transducer at a depth of 2 cm, according to previously described methodology11,17,18. Transverse images were obtained at basal (at the tip of the mitral valve leaflets), middle (at the papillary muscle level) and apical (distal to the papillary muscle but beyond the cavity cap) levels. Infarct size was estimated as the subjective identification of akinesis or dyskinesis of the left ventricle (LV) wall on each transverse plane and presented as the length of the arc corresponding to the segment of the MI scar in relation to the total perimeter of the endocardial border of LV. We recently demonstrated that this echocardiographic measurement presents satisfactory agreement with histochemical staining18. Infarcted animals were divided into two groups, according to the MI size: one group composed of rats with moderate MI, between 20 and 39% of LV (MMI), and another group of rats with MI larger than 39% of LV (LMI).
The end-diastolic and end-systolic LV diameters were measured from the transverse parasternal view using M-mode images. Systolic function was defined by fractional shortening, and calculated as the average of percent change between the diastolic and systolic diameters. Diastolic function was analyzed by the mitral diastolic influx velocity curve on the pulsed-wave Doppler. From the 4-chamber view, peak E-wave and A-wave velocities were acquired and E/A ratio was calculated.
Immediately after the echocardiographic examination,
After papillary muscle was removed, left and right ventricles were separated and weighed. The right lung was also excised and weighed. After drying at 70ºC for 12 h, the pulmonary water content (PWC), considering a congestion index, was determined using the following equation: PWC (%) = (weight loss after drying / wet weight) × 100.
Protein content was analyzed in samples of LV of LMI, MMI and C groups after excision of the papillary muscles and infarct scar. Tissue homogenates were analyzed by Western blotting according to previously described protocols5 to compare the protein expression of SERCA2, phospholamban (PLB), phospho-Ser16-PLB and NCX in all experimental groups. Samples of non-infarcted myocardium were rapidly frozen at -70ºC. Tissues were homogenized in ice-cold extraction buffer (Tris 50 mM, EDTA 1 mM and sacarose 250 mM, pH 7.4) using Polytron (Polytron® PT2100, Kinematica AG, Littau, LU, SWI). To prepare the microsomal fractions of proteins, an initial centrifugation was made at 10,000×
Results are expressed as means ± SEM and analyzed by Student
The cross sectional area was larger in LMI (1.16 ± 0.05 mm2, n = 14) compared to MMI (1.01 ± 0.05 mm2, n = 10) and C (0.96 ± 0.04 mm2, n = 17). As seen in
In
In order to investigate the mechanisms of PRC in papillary muscles from infarcted rats, pharmacological (
Calcium handling proteins potentially involved in these alterations were investigated in all groups (
In this study, we demonstrated that myocardial remodeling after MI in rats may change the regular post-rest potentiation to post-rest decay of active force by affecting myocyte Ca(2+) handling proteins. This uncommon behavior of myocardial mechanics was evident only in animals with large infarcts, in which the remodeling process included not only LV dilation with systolic and diastolic dysfunction, but also worse myocardial contraction and relaxation probably due to impaired SR Ca2+ uptake and excessive sarcolemmal Ca2+ efflux.
MI ventricular dysfunction and chamber dilatation, normally observed in rats with larger infarctions23, are also shown in this study. Post-MI remodeling was associated with a depressed tension development in papillary muscles from infarcted rats and reduced rate of force generation and relaxation, as previously reported for papillary muscles9,10,13,20,24. Similar impairment of shortening was identified in isolated ventricular myocytes as well25,26, and the proposed mechanisms explaining the contractile dysfunction include defects in the excitation-contraction coupling13,24.
During myocardial rest, Ca2+ is removed from the cytosol into the SR by SERCA2 or into the mitochondria by the Ca2+-uniporter, or it is extruded by the sarcolemmal NCX and Ca2+-ATPase1. In the PRC protocols such as that used in this work, a potentiation of DT occurs after a pause of stimuli as expected for the rat cardiac muscle. Normally, as most of the Ca2+ returns to the SR during the rest period, its content tends to increase with increased duration of the pause, also increasing Ca2+ release and, finally, the force generation upon the next activation1. In fact, the administration of Ry to block SR function in our experiments completely abolished the PRC potentiation of C muscles, reinforcing previous reports describing the key role of SR storing function in this phenomenon4. On the other hand, the inhibition of transsarcolemmal Ca2+ extrusion by NCX in our preparations (by using Li+) enhanced the potentiation of C muscles, which confirms the importance of Ca2+ efflux mechanisms to negatively modulate the PRC of rat LV muscle6,7. Indeed, it was reported that the stimulation of NCX leads to an increasing Ca2+ efflux and Na+ influx, and consequently, a depression of the PRC27,28.
Several reports investigated the myocardial remodeling post-infarct contractile dysfunction and pointed out impairments on the cardiomyocyte Ca2+ movement13,29-31. The literature is controversial concerning the behavior of PRC in post-MI remodeling. In human failing myocardium, authors reported either depressed potentiation32,33 or decay28 of contraction after prolonged pauses. In animal models9,10, depressed potentiation compared to controls were reported from infarcted rats. Also, in surviving myocytes after MI in dogs, there was a diminished potentiation of contraction after rest34. These alterations have been attributed essentially to the defective SR storing function, associated with a relative reduction of released Ca2+. Recently, our group identified decay of PRC on the papillary muscles from heart failure rats 40 weeks after coronary occlusion16. However, the causal mechanisms for this unprecedented PRC behavior in rats were not investigated, as in this study used adult rats with healed six-week-old infarcts.
Our experiments suggest that excitation-contraction coupling alterations contribute to the depression of PRC in LMI rats: the SR storing dysfunction was associated with enhanced Ca2+ extrusion, since Ry abolished this phenomenon while NCX inhibition normalized it.
The impaired SR reuptake function, which probably occurs in both MMI and LMI groups, may not be due only to the decreased protein expression of SERCA2, but also to the lower Ser16-PLB content as evidenced by the Western blotting assays. When phosphorylated, the regulatory protein PLB relieves the inhibition of SERCA2, allowing its Ca2+ uptake function1. In fact, the decreased PLB phosphorylation in remodeled myocardium of infarcted rats has also been described as leading to SR dysfunction31. Moreover, we cannot exclude that a high diastolic Ca2+ leak from SR vesicles is occurring. It has been reported that Ry receptor regulatory proteins (FKBP, especially FKBP12.6) can be pathologically altered in structure and content, as well as in phosphorylation mechanisms that modulate the FKBP-ryanodine receptor coupling, resulting in a sub-conductance status in myocardium remodeling29,35Especially in LMI muscles, using Li+ instead of Na+ in the Krebs-Henseleit solution, the PRC decay in LMI experiments changed to a typical PRC potentiation, suggesting the key role of NCX on the weakness of subsequent contraction when PRC decay occurs. As mentioned before, although Ca2+ SR accumulation is relatively limited by the Ca2+ efflux through the sarcolemma, SR normally re-uptakes most of Ca2+ as a result of the dominant SERCA2 uptake over the transsarcolemmal extrusion of this ion in rat cardiomyocyte. On the other hand, while sarcolemmal Ca2+ efflux mechanisms are playing a more important role than that of the SR re-uptake, a decay of SR Ca2+ content tends to occur with a longer duration of pause in rabbits27. Actually, in mammals in which the importance of SERCA2 is counteracted by NCX in carrying out the Ca2+ withdrawal, such as the rabbits, the myocardium normally exhibits this reduction in the force of the first contraction following the rest proportionally to the pause duration, referred to as post-rest decay1. In fact, our results show a significant overexpression of NCX content in LMI compared to the MMI and C groups, thus supporting the idea that increased NCX activity and/or expression relates to post-rest decay after MI and heart failure, at least in rats.
Although the remodeled myocardium from both MMI and LMI groups decreased SERCA2 and Ser16-PLB contents, an increase of the NCX protein level was observed only in LMI, the experimental group that exhibited post-rest decay. Thus, the molecular profile with post-MI remodeling should be a critical variable for post-rest decay occurrence. Actually, changes in different cardiomyocyte proteins were reported in animal models21,30,36 and humans with heart failure37,38 as causing dysfunctional excitation-contraction coupling. As a result, we suggest that the altered importance of transsarcolemmal Ca2+ efflux caused by overexpressed NCX associated with dysfunctional SR uptake probably led the rat failing myocardium to exhibit this PRC decay.
Although we have not measured directly the [Ca2+]i or the activity of calcium-handling proteins analyzed, we recognize limitations in this study. Our results suggest that impaired SR reuptake function associated with an increased calcium efflux during diastole of muscle from LMI is the probable cause of the post-rest decay of force. Therefore, it is also possible to speculate that although lower [Ca2+]i due to increased NCX reduces the deleterious Ca2+ overload, it may reduce the Ca2+ available for reuptake during diastole and consequently the amount released during systole.
In summary, our results confirmed that infarcted rats present global ventricular dysfunction and contractile myocardial disturbances derived from infarction directly related to the severity of the remodeling. Contributing to that alteration, the use of PRC protocol identified an exceptional behavior of rat myocardium, assigned as post-rest decay of force. This phenomenon is ascribed to a disorder of Ca2+ handling proteins in carrying out normal functions, particularly in large myocardial infarctions, due to the association of reduced Ca2+ re-uptake by SERCA2 with excessive Ca2+ efflux by NCX.