FUNDAMENTO: A doença coronária tem sido amplamente estudada em pesquisas cardiovasculares. No entanto, pacientes com doença arterial periférica (DAP) têm piores resultados em comparação àqueles com doença arterial coronariana. Portanto, os estudos farmacológicos com artéria femoral são altamente relevantes para a melhor compreensão das respostas clínicas e fisiopatológicas da DAP. OBJETIVO: Avaliar as propriedades farmacológicas dos agentes contráteis e relaxantes na artéria femoral de ratos. MÉTODOS: As curvas de resposta de concentração à fenilefrina contrátil (FC) e à serotonina (5-HT) e os agentes relaxantes isoproterenol (ISO) e forskolina foram obtidos na artéria femoral de ratos isolada. Para as respostas ao relaxamento, os tecidos foram contraídos com FC ou 5-HT. RESULTADOS: A potência de classificação na artéria femoral foi de 5-HT > FC para as respostas contráteis. Em tecidos contraídos com 5-HT, as respostas de relaxamento ao isoproterenol foram praticamente abolidas em comparação aos tecidos contraídos com FC. A forskolina, um estimulante da adenilil ciclase, restaurou parcialmente a resposta de relaxamento ao ISO em tecidos contraídos com 5-HT. CONCLUSÃO: Ocorre uma interação entre as vias de sinalização dos receptores β-adrenérgicos e serotoninérgicos na artéria femoral. Além disso, esta pesquisa fornece um novo modelo para estudar as vias de sinalização serotoninérgicas em condições normais e patológicas que podem ajudar a compreender os resultados clínicos na DAP.
IUniversidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), São Paulo, SP
IIUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
Importante ramo da artéria ilíaca, a artéria femoral irriga os músculos dos membros inferiores e os tecidos periféricos, sendo um vaso sanguíneo único, com uma condução longa, de alta resistência de fluxo e com uma relevância marcante para intervenções médicas1. De fato, aproximadamente 50% das doenças arteriais oclusivas (DAO) ocorrem na artéria femoral, podendo resultar em claudicação intermitente e isquemia crítica do membro, com prejuízo significativo às atividades diárias dos pacientes2. A incidência de doença arterial periférica (DAP) tem aumentado na população mundial, e consideráveis esforços têm sido envidados para melhorar as consequências desfavoráveis da intervenção médica no tratamento de longo prazo. Além disso, fatores como tabagismo, dislipidemia, diabete melito, aterosclerose e idade avançada têm sido implicados na patogênese da DAP3,4. Embora a maioria das pesquisas cardiovasculares tenha se voltado para a doença coronária, tais como avanços em intervenções cirúrgicas e descoberta de novas terapias farmacológicas, os pacientes com DAP têm piores resultados em comparação àqueles com doença da artéria coronária5. Por essa razão, os estudos farmacológicos com artéria femoral são altamente relevantes para a melhor compreensão das respostas clínicas e fisiopatológicas da DAP.
Sabe-se que a serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) desempenha funções biológicas importantes no sistema cardiovascular, incluindo agregação plaquetária, bradicardia ou taquicardia, hipotensão ou hipertensão e vasodilatação ou vasoconstrição6,7. A diversidade das ações funcionais da 5-HT relaciona-se ao número de subtipos de receptores, bem como à complexidade da via de sinalização envolvida nas respostas. A esse respeito, pelo menos 15 subtipos de receptores 5-HT têm sido caracterizados, sendo subdivididos em sete famílias de receptores, de acordo com as propriedades farmacológicas, as sequências de aminoácidos, a organização dos genes e as vias de acoplamento de segundo mensageiro8,9. As famílias de receptores 5-HT11, 5-HT2, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 e 5-HT7 são acopladas a G-proteínas, enquanto os receptores 5-HT3 são canais iônicos associados à 5-HT. Entre os receptores 5-HT, os subtipos 5-HT1 e 5-HT2 desempenham um papel importante na regulação do sistema cardiovascular, em que a família do receptor 5-HT1 está ligada principalmente à proteína G inibitória (Gi/o), que impede a formação da adenosina monofosfato cíclico (AMPc), enquanto a família de receptores 5-HT2 é acoplada preferencialmente a proteínas Gq/11, levando à ativação da via de sinalização IP3/PKC/citosólica [Ca2+]10. Tanto a família de receptor 5-HT1 quanto a de 5-HT2 associam-se à contração do músculo liso vascular e à formação de trombo9,11.
A ativação dos receptores α- e β-adrenérgicos por catecolaminas também produz uma série de respostas funcionais no sistema cardiovascular, incluindo respostas cronotrópicas positivas e controle do tônus vascular12,13. A vasoconstrição mediada pelo receptor α-adrenérgico tem sido amplamente estudada em condições normais e patológicas14-16, mas poucos estudos avaliam a vasodilatação mediada pelos receptores β-adrenérgicos17,18. A esse respeito, pelo menos três subtipos de receptores β-adrenérgicos medeiam as respostas de relaxamento em tecidos vasculares e acoplam-se à proteína Gs, levando à ativação da via de sinalização da proteína quinase (PK) dependente de AMPc19.
As vias de sinalização dos receptores serotoninérgicos ou adrenérgicos são alvos para o tratamento das doenças cardiovasculares, incluindo insuficiência cardíaca, hipertensão arterial, doença coronariana e DAP4,20. Assim, os estudos farmacológicos sobre pequenas artérias e as interações entre as drogas, envolvendo as vias de sinalização dos receptores serotoninérgicos e adrenérgicos, são cruciais para o desenvolvimento de novos compostos em uma tentativa de melhorar a qualidade de vida de pacientes com doenças vasculares. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades farmacológicas dos agentes contráteis (5-HT e fenileprina) e relaxantes (isoproterenol e forskolina) no segmento proximal da artéria femoral de ratos.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Campinas (UNICAMP), sob o protocolo nº 1307-1.
Ratos Wistar machos (407, 6g) foram alojados individualmente em 26 ± 2 ºC, com alimentos e água
A artéria femoral foi rapidamente removida e colocada em solução tampão de Krebs-Henseleit, refrigerada com a seguinte composição (mM): NaCl 118, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4.7H2O 1.17, CaCl2.2H2O 2.5, NaHCO3 25 e glucose 5.6. O segmento proximal da artéria femoral foi isolado, e dois anéis (de aproximadamente 2 mm de comprimento) foram retirados e montados em uma câmara de órgãos de 5 ml. Um miógrafo para gravação de força isométrica (Danish Myo Technology, modelo 610m, Aarthus N, Dinamarca) foi acoplado a um sistema de aquisição, com
Após o período de equilíbrio, os anéis foram contraídos com KCl 80 mM, para verificar a viabilidade do tecido, e foram lavados com Krebs. Alem disso, foram contraídos com fenilefrina (FC, 1 mM) e relaxados com acetilcolina (ACH, 1
A fim de avaliar as respostas contráteis mediadas por receptores serotoninérgicos e α-adrenérgicos, curvas cumulativas concentração-resposta à 5-hidroxitriptamina (5-HT: 1 nM - 100 mM) e à fenilefrina (FC: 1 nM - 100 mM) foram construídas no segmento proximal dos anéis da artéria femoral22.
As curvas concentração-resposta ao isoproterenol (1 nM - 10 mM) foram obtidas em tecidos contraídos com FC (1 mM) ou com 5-HT (10 mM), para analisar a interação entre a ativação dos receptores β-adrenérgicos e a dos receptores α-adrenérgicos ou serotoninérgicos. Também realizamos curvas concentração-resposta para o ativador adenilato ciclase e a forskolina (1 nM - 100
Todos os dados de concentração-resposta foram avaliados a fim de ajustá-los em uma função logística na fórmula: E = Emax/((1 + (10c/10x)n) + Φ), em que E é o efeito do basal acima; Emax é a resposta máxima produzida pelo agonista; c é o logaritmo da EC50, concentração do agonista que produz metade do máximo de resposta; x é o logaritmo da concentração do agonista; n é um parâmetro de ajuste de curvas que define a inclinação da linha de resposta de concentração; e Φ é a resposta observada na ausência do agonista acrescentado. A análise de regressão não linear foi utilizada para determinar os parâmetros Emax e log EC50, utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), com a restrição de que Φ = 0. As respostas para cada agonista são demonstradas como a média ± EPM de potência (pEC50) e resposta máxima (Emax). Os relaxamentos foram plotados como porcentagens das contrações induzidas pela FC ou 5-HT, e as respostas contráteis foram plotadas como porcentagem da concentração induzida por KCl (80 mM).
Os dados são expressos como média ± EPM de experimentos
Cloreto de acetilcolina, hidrocloreto de fenilefrina, 5-hidroxitriptamina, forskolina e isoproterenol foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA).
Tanto a 5-HT quanto a FC produziram respostas contráteis dependentes da concentração em anéis de artéria femoral (
Em outro conjunto de experimentos, avaliamos as respostas de relaxamento para o isoproterenol agonista β-adrenérgico, em que os anéis da artéria femoral foram contraídos com FC (10
Neste estudo, observou-se que a potência de ordem de classificação no segmento proximal da artéria femoral foi de 5-HT > FC, para as respostas contráteis que podem refletir maior densidade de receptores serotoninérgicos ou elevada eficácia do mecanismo de via de sinalização nessa preparação, em contraste com a via a jusante de receptores α-adrenérgicos/AMPc/PK. Curiosamente, um estudo anterior encontrou potência de classificação semelhante para a 5-HT em diferentes anéis arteriais, incluindo os anéis mesentéricos, caudais e basilares23. Além disso, a potência de 5-HT encontrada em nosso estudo para o segmento proximal na artéria femoral (6,86) mostrou-se intimamente relacionada aos resultados obtidos na artéria basilar (6,88), indicando que ambas as preparações apresentam grandes semelhanças nas propriedades farmacológicas. Além disso, evidências clínicas mostram que a DAP é mais comum em pacientes com enxaqueca do que em pacientes não acometidos pela cefaleia24,25. Ao todo, nossos dados mostram que a artéria femoral é um interessante modelo para o estudo das vias de sinalização dos receptores serotoninérgicos em condições normais e patológicas, como diabete melito e aterosclerose.
Neste estudo, também descobrimos que os tecidos contraídos com 5-HT praticamente aboliram a resposta de relaxamento para o isoproterenol (10% de respostas máximas), tendo sido parcialmente restaurados pela forskolina, um estimulante de ação direta da guanilato ciclase que ignora β-adrenérgicos. Portanto, nossos resultados mostram uma interação entre as vias de sinalização dos receptores β-adrenérgicos e serotoninérgicos na artéria femoral. A esse respeito, um estudo anterior demonstrou uma interação entre o receptor β-adrenérgico e a 5-HT1 na liberação de glutamato nos terminais do nervo cerebrocortical26. Assim, nossos dados reforçam que o segmento proximal da artéria femoral é um tecido vascular interessante para estudar os receptores de 5-HT e a complexa via de sinalização. No entanto, não podemos determinar, a partir deste estudo, que o subtipo de receptor 5-HT medeia a resposta contrátil ou os efetores de transdução que contribuem para a supressão do relaxamento de mediação do receptor β-adrenérgico na artéria femoral de ratos. Evidências indicam que a família de receptores 5-HT1 é fundamentalmente ligada à Gi/o, proteína sensível à toxina pertússis negativamente associada à adenilil ciclase9. Por outro lado, a ativação do receptor β-adrenérgico é acoplada à proteína Gs, que, por sua vez, leva à ativação da via de sinalização AMPc/PK no sistema cardiovascular19. Assim, a interação antagônica entre os receptores 5-HT e β-adrenérgicos pode ocorrer no receptor acoplado à proteína G, bem como no nível dos substratos de PK, tendo em vista que a forskolina restaurou parcialmente a supressão do relaxamento de mediação do receptor β-adrenérgico em anéis da artéria femoral de ratos contraídos com 5-HT. O significado funcional desses dados pode estar relacionado à incidência de doença vascular e à administração de agonistas de 5-HT/bloqueadores de captação de 5-HT em algumas doenças como enxaqueca e obesidade.
Em conclusão, nossos dados mostraram claramente que ocorre uma interação entre as vias de sinalização dos receptores β-adrenérgicos e serotoninérgicos em anéis da artéria femoral de ratos. Além disso, este estudo fornece uma perspectiva interessante para o estudo das vias de sinalização dos receptores serotoninérgicos em condições normais e patológicas, em uma tentativa de melhorar os resultados clínicos em pacientes com DAP.
Maria Andreia Delbin Av. 24A 1515, Bela Vista 13990000 - Rio Claro, São Paulo, Brasil E-mail:
Artigo recebido em 28/04/11; revisado recebido em 29/06/11; aceito em 30/06/11.
BACKGROUND: Coronary heart disease has been widely studied in cardiovascular research. However, patients with peripheral artery disease (PAD) have worst outcomes compared to those with coronary artery disease. Therefore, pharmacological studies using femoral artery are highly relevant for a better understanding of the pathophysiologic responses of the PAD. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the pharmacologic properties of the contractile and relaxing agents in rat femoral artery. METHODS: Concentration response curves to the contractile phenylephrine (PE) and serotonin (5-HT) and the relaxing agents isoproterenol (ISO) and forskolin were obtained in isolated rat femoral artery. For relaxing responses, tissues were precontracted with PE or 5-HT. RESULTS: The order rank potency in femoral artery was 5-HT > PE for contractile responses. In tissues precontracted with 5-HT, relaxing responses to isoproterenol was virtually abolished as compared to PE-contracted tissues. Forskolin, a stimulant of adenylyl cyclase, partially restored the relaxing response to ISO in 5-HT-precontracted tissues. CONCLUSION: An interaction between β-adrenergic- and serotoninergic- receptors signaling pathway occurs in femoral artery. Moreover, this study provides a new model to study serotoninergic signaling pathway under normal and pathological conditions which can help understanding clinical outcomes in the PAD.
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Femoral artery is an important branch of the iliac artery that irrigates the lower limb skeletal muscles and peripheral tissues and it is a unique blood vessel with a long conduction, high-flow resistance and a striking relevance for medical interventions1. Indeed, approximately 50% of all athero-occlusive disease takes place in the femoral artery which can result in intermittent claudication and critical limb ischemia with significant impairment of patients' daily activity2. The incidence of peripheral artery occlusive disease (PAD) has been increasing in the world population and considerable efforts have been made to improve the poor interventional outcomes in long-term treatment. Moreover, factors such as smoking, dyslipidemia, diabetes mellitus, atherosclerosis and advancing age have been implicated in the pathogenesis of the PAD3,4. Although most of the many cardiovascular researches have been focused on the coronary heart disease such as advances in surgical interventions and discovery of new pharmacological therapies, patients with PAD have worst outcomes compared to those with coronary artery disease5. For that reason, pharmacological studies using femoral artery are highly relevant for a better understanding of clinical and pathophysiologic responses of the PAD.
It is well known that serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) plays important biologic functions in the cardiovascular system including platelet aggregation, bradycardia or tachycardia, hypotension or hypertension, and vasodilatation or vasoconstriction6,7. The diversity of the functional actions of the 5-HT relates to its receptor subtypes number as well as to the complexity of the signaling pathway involved in their responses. In this regard, at least fifteen 5-HT receptor subtypes have been characterized which are subdivided into seven receptor families according to their pharmacologic properties, amino acid sequences, gene organization, and second messenger coupling pathways8,9. The 5-HT1, 5-HT2, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6, and 5-HT7 receptor families are coupled to G-proteins, whereas the 5-HT3 receptors are 5-HT-gated ion channels. Among the 5-HT receptors, 5-HT1 and 5-HT2 receptors subtypes play an important role in the cardiovascular system regulation where 5-HT1 receptor family is mostly linked to Gi/o protein, which inhibit cAMP formation, whereas 5-HT2 receptors family is coupled preferentially via Gq/11 protein leading to the activation of IP3/PKC/cytosolic [Ca2+] signaling pathway10. Both 5-HT1 and 5-HT2 receptor families have been associated with contraction of vascular smooth muscle and thrombus formation9,11.
The activation of α- and β-adrenergic receptors by catecholamines also produces a number of functional responses in the cardiovascular system including positive chronotropic responses and vascular tone control12,13. The α-adrenergic receptor-mediated vasoconstriction has been widely studied under normal and pathological conditions14-16, but few studies evaluate the β-adrenergic receptors-mediated vasodilatation17,18. In this regard, at least three β-adrenergic receptors subtypes mediate the relaxation responses in vascular tissues, which are coupled to Gs protein leading to the activation of cAMP-dependent protein kinase (PKA) signaling pathway19.
Either serotoninergic or adrenergic receptors signaling pathways are targets for the treatment of the cardiovascular diseases including heart failure, arterial hypertension, coronary artery disease and PAD4,20. Thus, pharmacological studies regarding small arteries and the interactions between drugs involving both serotoninergic and adrenergic receptor signaling pathways are crucial for developing new compounds in a attempt to improve the quality of life of patients with vascular disease. Therefore, the objective of this study was to evaluate the pharmacologic properties of the contractile (5-HT and phenylephrine) and relaxing agents (isoproterenol and forskolin) in the proximal segment of rat femoral artery.
This study was approved (protocol: 1307-1) by the Ethical Committee of the Medical School of Universidade de Campinas (UNICAMP). They were individually housed at 26 ± 2 ºC with food and water delivered ad libitum on a 12 h light: dark cycle with the lights turned on at 6:00 a.m. Male Wistar rats (407±6g) were stunned by inhalation of CO2, euthanized by decapitation, and exsanguinated.
The femoral artery was quickly removed and placed in chilled Krebs-Henseleit buffer with the following composition (mM): NaCl 118, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4.7H2O 1.17, CaCl2.2H2O 2.5, NaHCO3 25 and glucose 5.6. The proximal segment of the femoral artery was isolated and two rings (approximately 2 mm length) were taken and mounted in a 5 ml organ chamber. A wire myograph for isometric force recording (Danish Myo Technology, model 610M, Aarthus N, Denmark) coupled with an acquisition system with specific software (PowerLab 8/30, LabChart 7, ADInstruments, Sydney-NSW, Austrália). The bathing solution was maintained at 37ºC and continuously gassed with 95%-O2 and 5%-CO2, with of pH 7.4. The tissues were allowed to equilibrate for 60 minutes under a resting tension of 1 mN21.
Following the equilibration period, the rings were precontracted with KCl 80 mM to verify the tissue viability and washed with Krebs. The rings were precontracted with phenylephrine (PE: 1
To evaluate the contractile responses mediated by serotoninergic and α-adrenergic receptors, cumulative concentration-response curves to 5-hydroxytryptamine (5-HT: 1 nM - 100
Concentration-response curves to isoproterenol (1 nM - 10 mM) were obtained in precontracted tissues with PE (1
All the concentration-response data were evaluated in order to fit into a logistics function in the formula:
E = Emax/((1 + (10c/10x)n) + Φ)
where E is the effect of above basal; Emax is the maximum response produced by the agonist; c is the logarithm of the EC50, the concentration of the agonist that produces half-maximal response; x is the logarithm of the concentration of the agonist; the exponential term, n is a curve-fitting parameter that defines the slope of the concentration response line, and Φ is the response observed in the absence of the agonist added. Nonlinear regression analysis was used to determine the parameters Emax and log EC50, by using GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) with the constraint that Φ = 0. The responses for each agonist are shown as the mean ± SEM of potency (pEC50) and maximal response (Emax). The relaxations were plotted as percentages of the contractions induced by PE or 5-HT and the contractile responses were plotted as percentage of the concentration induced by KCl (80 mM).
The data are expressed as mean ± SEM of
Acetylcholine chloride, phenylephrine hydrochloride, 5-hydroxytryptamine, forskolin and isoproterenol were purchased from Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA).
Both 5-HT and PE produced concentration-dependent contractile responses in femoral artery rings (
In another set of experiments, we evaluate the relaxing responses to β-adrenergic agonist isoproterenol where femoral artery rings were precontracted with PE (10
In this study, we observed that the order rank potency in the proximal segment of femoral artery was 5-HT > PE for contractile responses that may reflect a greater density of serotoninergic receptors and/or high effectiveness of its signaling pathway mechanism in this preparation compared to the activation of α-adrenergic receptor/cAMP/PKA downstream pathway. Interestingly, a previous study found a similar rank potency for 5-HT in different artery rings including mesenteric, caudal and basilar23. Moreover, the potency for 5-HT found in our study for proximal segment in the femoral artery (6.86) was closely related to those obtained in the basilar artery (6.88) indicating that both preparations present great similarities in pharmacologic properties. Interestingly, clinical evidences have shown that PAD is more common in migraineurs than in controls24,25. Altogether, our data showed that femoral artery is an interestingly model to study serotoninergic receptor signaling pathway under normal and pathological conditions such as diabetes mellitus and atherosclerosis.
In this study, we have also found that precontracted tissues with 5-HT virtually abolished the relaxing responses to isoproterenol (10% of maximal responses) that was partially restored by forskolin, a direct-acting stimulant of adenylyl cyclase that bypass β-adrenergic receptors. Therefore, our findings showed an interaction between β-adrenergic- and serotoninergic- receptors signaling pathway in rat femoral artery. In this regard, a previous study demonstrated a cross-talk between β-adrenergic receptor and 5-HT1 on glutamate release in cerebrocortical nerve terminals26. Thus, our data reinforce that the proximal segment of the femoral artery is an interesting vascular tissue to study 5-HT receptors and its complex signaling pathway. However, we cannot ascertain from this study which 5-HT receptor subtype is mediating the contractile response and/or which transduction effectors are contributing to the suppression of the β-adrenergic receptor-mediating relaxation in rat femoral artery. Evidence has shown that the 5-HT1 receptors family is mostly linked to Gi/o, which are pertussis toxin sensitive and negatively coupled with adenylyl cyclase9. On the other hand, β-adrenergic receptor activation is coupled to Gs protein which in turn leads to the activation of cAMP/PKA signaling pathway in the cardiovascular system19. Thus, the antagonistic cross-talk between 5-HT receptors and β-adrenergic receptor could be occurring at G-protein-coupled receptor as well as at the level of PKA substrates since forskolin partially restored the suppression of the β-adrenergic receptor-mediating relaxation in 5-HT-precontracted rat femoral artery ring. The functional significance of these data may be related to the incidence of vascular disease and 5-HT agonists/5-HT uptake blockers administration in some disorders such migraine and obesity.
In conclusion, our data showed clearly that an interaction between β adrenergic- and serotonergic- receptors signaling pathway occurs in rat femoral artery rings. Moreover, this study provides an interesting perspective to study serotoninergic receptor signaling pathway under normal and pathological conditions in an attempt to improve the clinical outcomes in patients with PAD.
FUNDAMENTO: La enfermedad coronaria ha sido ampliamente estudiada en las investigaciones cardiovasculares. Sin embargo, los pacientes con enfermedad arterial periférica (EAP), tienen los peores resultados en comparación con aquellos con la enfermedad arterial coronaria. Por tanto, los estudios farmacológicos con la arteria femoral son extremadamente importantes para obtener una mejor comprensión de las respuestas clínicas y fisiopatológicas de la EAP. OBJETIVO: Evaluar las propiedades farmacológicas de los agentes contráctiles y relajantes en la arteria femoral de los ratones. MÉTODOS: Las curvas de concentración-respuesta a los agentes conctráctiles fenilefrina (FE) y a la serotonina (5-HT) y los agentes relajantes isoproterenol (ISO) y forskolina, se obtuvieron en la arteria femoral de ratones ya aislada. Para las respuestas a la relajación, los tejidos fueron contraídos con FE o 5-HT. RESULTADOS: La potencia de clasificación en la arteria femoral fue de 5-HT > FE para las respuestas contráctiles. En los tejidos contraídos con 5-HT, las respuestas de relajación al isoproterenol fueron prácticamente eliminadas en comparación con los tejidos contraídos con FE. La forskolina, un estimulante de la adenilil ciclasa, restauró parcialmente la respuesta de relajación al ISO en los tejidos contraídos con 5-HT. CONCLUSIÓN: Ocurre una interacción entre las vías de señalización de los receptores β-adrenérgicos y serotoninérgicos en la arteria femoral. Además, esa investigación suministra un nuevo modelo para estudiar las vías de señalización serotoninérgicas en condiciones normales y patológicas que puedan ayudar a comprender los resultados clínicos en la EAP.
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Correspondencia
Una importante rama de la arteria ilíaca, la arteria femoral, irriga los músculos de los miembros inferiores y los tejidos periféricos, siendo un vaso sanguíneo único, con una conducción larga, de alta resistencia de flujo y con una fuerte relevancia para las intervenciones médicas1. De hecho, aproximadamente un 50% de las enfermedades arteriales oclusivas (EAO) ocurren en la arteria femoral, pudiendo conllevar a una claudicación intermitente y a una isquemia crítica del miembro, con un daño significativo para las actividades diarias de los pacientes2. El aparecimiento de la enfermedad arterial periférica (EAP), ha aumentado en la población mundial y se han hecho ostensibles esfuerzos para intentar mejorar las consecuencias no favorables de la intervención médica en el tratamiento a largo plazo. Además de eso, factores como el tabaquismo, la dislipidemia, la diabetes mellitus, la arteriosclerosis y la edad avanzada, han sido involucrados en la patogénesis de la EAP3,4. Aunque la mayoría de las investigaciones cardiovasculares se haya concentrado en la enfermedad coronaria, tales como los avances en las intervenciones quirúrgicas y el descubrimiento de nuevas terapias farmacológicas, los pacientes con EAP gozan de los peores resultados en comparación con aquellos con la enfermedad de la arteria coronaria5. Por esa razón, los estudios farmacológicos con la arteria femoral son muy importantes para obtener una mejor comprensión de las respuestas clínicas y fisiopatológicas de la EAP.
Sabemos que la serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) desempeña funciones biológicas importantes en el sistema cardiovascular, incluyendo la agregación plaquetaria, bradicardia o la taquicardia, hipotensión o la hipertensión y la vasodilatación o la vasoconstrición6,7. La diversidad de las acciones funcionales de la 5-HT se relaciona con el número de subtipos de receptores, como también con la complejidad de la vía de señalización que está involucrada en las respuestas. En ese sentido, por lo menos 15 subtipos de receptores 5-HT han sido caracterizados, que a su vez se subdividen en siete familias de receptores, de acuerdo con las propiedades farmacológicas, las secuencias de aminoácidos, la organización de los genes y las vías de acoplamiento del segundo mensajero8,9. Las familias de receptores 5-HT11, 5-HT2, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 y 5-HT7 se acoplan a las G-proteínas, mientras que los receptores 5-HT3 son canales iónicos asociados a la 5-HT. Entre los receptores 5-HT, los subtipos 5-HT1 y 5-HT2 realizan un papel importante en la regulación del sistema cardiovascular, en que la familia del receptor 5-HT1 está ligada principalmente a la proteína G inhibitoria (Gi/o), que impide la formación de la adenosina monofosfato cíclico (AMPc), mientras que la familia de receptores 5-HT2 está acoplada preferentemente a las proteínas Gq/11, conllevando a la activación de la vía de señalización IP3/PKC/citosólica [Ca2+]10. Tanto la familia del receptor 5-HT1 como la de 5-HT2 se asocian a la contracción del músculo liso vascular y a la formación del trombo9,11.
La activación de los receptores α- y β-adrenérgicos por catecolaminas también produce una serie de respuestas funcionales en el sistema cardiovascular, incluyendo las respuestas cronotrópicas positivas y el control del tono vascular12,13. La vasoconstricción mediada por el receptor α-adrenérgico, ha sido ampliamente estudiada en las condiciones normales y patológicas14-16, pero pocos estudios evalúan la vasodilatación mediada por los receptores β-adrenérgicos17,18. En ese sentido, por lo menos tres subtipos de receptores β-adrenérgicos median las respuestas de relajación en los tejidos vasculares y se acoplan a la proteína Gs, conllevando a la activación de la vía de señalización de la proteína quinasa (PK) dependiente de AMPc19.
Las vías de señalización de los receptores serotoninérgicos o adrenérgicos son dianas para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, incluyendo la insuficiencia cardíaca, la hipertensión arterial, la enfermedad coronaria y la EAP4,20. Así, los estudios farmacológicos sobre pequeñas arterias y las interacciones entre los fármacos, involucrando las vías de señalización de los receptores serotoninérgicos y adrenérgicos, son cruciales para el desarrollo de nuevos compuestos en un intento de mejorar la calidad de vida de los pacientes con enfermedades vasculares. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar las propiedades farmacológicas de los agentes contráctiles (5-HT y fenilefrina) y los relajantes (isoproterenol y forskolina), en el segmento proximal de la arteria femoral de los ratones.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la
Ratones Wistar machos (407, 6g) que se alojaron individualmente en 26 ± 2 ºC, con alimentos y agua
La arteria femoral fue rápidamente retirada y puesta en una solución tampón de Krebs-Henseleit, refrigerada con la siguiente composición (mM): NaCl 118, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4.7H2O 1.17, CaCl2.2H2O 2.5, NaHCO3 25 y glucosa 5.6. El segmento proximal de la arteria femoral se aisló, y dos anillos (de aproximadamente 2 mm de largura), fueron retirados y montados en una cámara de órganos de 5 ml. Un miógrafo para la grabación de la fuerza isométrica (Danish Myo Technology, modelo 610m, Aarthus N, Dinamarca), se acopló a un sistema de adquisición, con el
Posteriormente al período de equilibrio, los anillos fueron contraídos con KCl 80 mM, para verificar la viabilidad del tejido y fueron lavados con Krebs. Además de eso, fueron contraídos con fenilefrina (FE, 1 mM) y relajados con acetilcolina (ACH, 1
Con el fin de evaluar las respuestas contráctiles mediadas por los receptores serotoninérgicos y α-adrenérgicos, las curvas acumulativas concentración-respuesta a la 5-hidroxitriptamina (5-HT: 1 nM - 100 mM) y a la fenilefrina (FE: 1 nM - 100 mM), fueron construidas en el segmento proximal de los anillos de la arteria femoral22.
Las curvas concentración-respuesta al isoproterenol (1 nM - 10 mM) se obtuvieron en los tejidos contraídos con FE (1 mM) o con 5-HT (10 mM), para analizar la interacción entre la activación de los receptores b-adrenérgicos y la de los receptores α-adrenérgicos o serotoninérgicos. También realizamos curvas concentración-respuesta para el activador adenilato ciclasa y la forskolina (1 nM - 100
Todos los datos de concentración-respuesta fueron evaluados para ajustarlos en una función logística con la fórmula: E = Emax/((1 + (10c/10x)n) + F), en que E es el efecto del basal por encima; Emax es la respuesta máxima producida por el agonista; c es el logaritmo de la EC50, concentración del agonista que produce la mitad del máximo de respuesta; x es el logaritmo de la concentración del agonista; n es un parámetro de ajuste de curvas que define la inclinación de la línea de respuesta de concentración; y F es la respuesta observada en ausencia del agonista añadido. El análisis de regresión no lineal fue utilizado para determinar los parámetros Emax y log EC50, utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), con la restricción de que F = 0. Las respuestas para cada agonista quedan demostradas como el promedio ± EPM de potencia (pEC50) y respuesta máxima (Emax). Las relajaciones fueron plotadas como porcentajes de las contracciones inducidas por la FE o 5-HT, y las respuestas contráctiles fueron plotadas como porcentaje de la concentración inducida por KCl (80 mM).
Los datos están expresados como promedio ± EPM de experimentos
El cloruro de acetilcolina, hidrocloruro de fenilefrina, 5-hidroxitriptamina, forskolina y el isoproterenol, se adquirieron por Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA).
Tanto la 5-HT como la FE generaron respuestas contráctiles dependientes de la concentración en anillos de arteria femoral (
En otro conjunto de experimentos, evaluamos las respuestas de relajación para el isoproterenol agonista β-adrenérgico, en que los anillos de la arteria femoral fueron contraídos con FE (10
En este estudio pudimos observar, que la potencia de orden de clasificación en el segmento proximal de la arteria femoral fue de 5-HT > FE, para las respuestas contráctiles pudiendo reflejar una mayor densidad de los receptores serotoninérgicos o una elevada eficacia del mecanismo de vía de señalización en esa preparación, en contraste con la vía descendente de receptores α-adrenérgicos/AMPc/PK. Curiosamente, un estudio anterior encontró una potencia de clasificación similar para la 5-HT en diferentes anillos arteriales, incluyendo los anillos mesentéricos, caudales y basilares23. Además, la potencia de 5-HT encontrada en nuestro estudio para el segmento proximal en la arteria femoral (6,86) estuvo íntimamente relacionada con los resultados obtenidos en la arteria basilar (6,88), indicando que ambas preparaciones presentan grandes similitudes en las propiedades farmacológicas. Además, las evidencias clínicas demuestran que la EAP es más común en los pacientes con jaqueca que en los pacientes no afectados por la cefalea24,25. En su totalidad, nuestros datos demuestran que la arteria femoral es un interesante modelo para el estudio de las vías de señalización de los receptores serotoninérgicos en condiciones normales y patológicas, como diabetes mellitus y la arteriosclerosis.
En este estudio, también descubrimos que los tejidos contraídos con 5-HT prácticamente eliminaron la respuesta de relajación para el isoproterenol (10% de respuestas máximas), habiendo sido parcialmente restaurados por la forskolina, como estimulante de acción directa de la guanilato ciclasa que ignora a los β-adrenérgicos. Por tanto, nuestros resultados demuestran una interacción entre las vías de señalización de los receptores b-adrenérgicos y serotoninérgicos en la arteria femoral. En ese sentido, un estudio anterior arrojó una interacción entre el receptor β-adrenérgico y la 5-HT1 en la liberación de glutamato en los terminales del nervio cerebrocortical26. Por lo tanto, nuestros datos refuerzan el postulado de que el segmento proximal de la arteria femoral es un tejido vascular interesante para estudiar a los receptores de 5-HT y la compleja vía de señalización. Sin embargo, no podemos determinar, a partir de este estudio, que el subtipo de receptor 5-HT media la respuesta contráctil o los efectores de transducción que contribuyen para la supresión de la relajación de mediación del receptor β-adrenérgico en la arteria femoral de ratones. Algunas evidencias nos indican que la familia de receptores 5-HT1 está fundamentalmente vinculada a la Gi/o, proteína sensible a la toxina pertussis y negativamente asociada a la adenilil ciclasa9. Por otro lado, la activación del receptor β-adrenérgico está acoplada a la proteína Gs que, a su vez, conlleva a la activación de la vía de señalización AMPc/PK en el sistema cardiovascular19. Por tanto, la interacción antagónica entre los receptores 5-HT y β-adrenérgicos, puede darse en el receptor acoplado a la proteína G, como también en el nivel de los sustratos de PK, teniendo en cuenta que la forskolina restauró parcialmente la supresión de la relajación de mediación del receptor β-adrenérgico en los anillos de la arteria femoral de ratones contraídos con 5-HT. El significado funcional de esos datos puede estar relacionado con el aparecimiento de la enfermedad vascular y de la administración de agonistas de 5-HT/bloqueadores de captación de 5-HT en algunas enfermedades como la jaqueca y la obesidad.
Como conclusión, nuestros datos revelaron claramente que ocurre una interacción entre las vías de señalización de los receptores b-adrenérgicos y serotoninérgicos en los anillos de la arteria femoral de ratones. Además, este estudio suministra una perspectiva interesante para el estudio de las vías de señalización de los receptores serotoninérgicos en condiciones normales y patológicas, en un intento de mejorar los resultados clínicos en pacientes con EAP.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
FAPESP financió el presente estudio.
Este artículo forma parte de tesis de Doctorado de Alexandre Sérgio Silva, por Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho e Universidade Estadual de Campinas.