O processo de angiogênese envolve uma sequência complexa de estímulos e respostas integradas, como estimulação das células endoteliais (CE) para sua proliferação e migração, estimulação da matriz extracelular, para atração de pericitos e macrófagos, estimulação das células musculares lisas, para sua proliferação e migração, e formação de novas estruturas vasculares. Angiogênese é principalmente uma resposta adaptativa à hipóxia tecidual e depende do acúmulo do fator de crescimento induzido pela hipóxia (FIH-1 α) na zona do miocárdio isquêmico, que serve para aumentar a transcrição do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores VEGF-R, pelas CE em sofrimento isquêmico. Esses passos envolvem mecanismos enzimáticos e proteases ativadoras do plasminogênio, metaloproteinases (MMP) da matriz extracelular (MEC) e cinases que provocam a degradação molecular proteolítica da MEC, bem como pela ativação e a liberação de fatores de crescimento, tais como: fator básico de crescimento dos fibroblastos (FCFb), VEGF e fator de crescimento insulínico-1 (FCI-1). Posteriormente, vem a fase intermediária de estabilização do novo broto neovascular imaturo e a fase final de maturação vascular da angiogênese fisiológica. Como conclusões generalizáveis, é possível afirmar que a angiogênese coronária em adultos é, fundamentalmente, uma resposta parácrina da rede capilar preexistente em condições fisiopatológicas de isquemia e inflamação.
IUniversidad de La Republica, Montevideo, Uruguay (UDELAR); Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
IIInstituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul - Fundação Universitária de Cardiologia - (IC/FUC); Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre - (UFCSPA), Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
O processo de angiogênese envolve uma sequência complexa de estímulos e respostas integradas, como estimulação das células endoteliais (CE) para sua proliferação e migração, estimulação da matriz extracelular, para atração de pericitos e macrófagos, estimulação das células musculares lisas, para sua proliferação e migração, e formação de novas estruturas vasculares.
Angiogênese é principalmente uma resposta adaptativa à hipóxia tecidual e depende do acúmulo do fator de crescimento induzido pela hipóxia (FIH-1 α) na zona do miocárdio isquêmico, que serve para aumentar a transcrição do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores VEGF-R, pelas CE em sofrimento isquêmico.
Esses passos envolvem mecanismos enzimáticos e proteases ativadoras do plasminogênio, metaloproteinases (MMP) da matriz extracelular (MEC) e cinases que provocam a degradação molecular proteolítica da MEC, bem como pela ativação e a liberação de fatores de crescimento, tais como: fator básico de crescimento dos fibroblastos (FCFb), VEGF e fator de crescimento insulínico-1 (FCI-1). Posteriormente, vem a fase intermediária de estabilização do novo broto neovascular imaturo e a fase final de maturação vascular da angiogênese fisiológica.
Como conclusões generalizáveis, é possível afirmar que a angiogênese coronária em adultos é, fundamentalmente, uma resposta parácrina da rede capilar preexistente em condições fisiopatológicas de isquemia e inflamação.
Nesta revisão, aborda-se a angiogênese miocárdica endógena no adulto, sob uma ótica unificada dos diversos mecanismos moleculares descritos. Essa visão se baseia na interpretação "dinâmica" da definição cunhada por Folkman: "Angiogênese é a geração e a expansão de vasos sanguíneos a partir de uma rede vascular preexistente, sob estímulos endógenos ou exógenos"1. No adulto, angiogênese é, em grande parte, uma resposta adaptativa à hipóxia tecidual e ocorre em uma ampla variedade de situações, que vão desde desenvolvimento embrionário até crescimento tumoral2.
Mediando a cascata de eventos celulares e moleculares, está a ativação do FIH- 1, que serve para aumentar a transcrição pelas CE, em sofrimento isquêmico, do VEGF e seus receptores VEGF-R3.
Acredita-se que a rede capilar preexistente é o lugar de início comum, no desenvolvimento e na geração dos novos capilares, mediada pelos diferentes sistemas de sinais que desencadeiam a produção de fatores de crescimento e que terminam induzindo a proliferação das células endoteliais. A definição de angiogênese feita por Folkman, citada, baseia-se em sólidos elementos anátomo-morfométricos.
A relação capilar/fibra miocárdica normal no coração do adulto é de 1 para 1, ou seja, um capilar por fibra miocárdica. O calibre máximo de novos vasos identificados no processo de angiogênese é de 200 µm de diâmetro4. Se não houver circulação coronária epicárdica de alimentação de dita circulação colateral com fluxo sanguíneo adequado, é provável que ocorra a regressão paulatina do processo de angiogênese. Por sua vez, cada fibra do miocárdio tem diâmetro que varia de 10 a 25 µm e o comprimento varia de 50 a 100 µm, com distribuição capilar uniforme na parede ventricular esquerda de 3.000 para 4.000/cm2 5.
Portanto, podemos dizer que essa definição tem forte sustentação morfométrica. Isso significa que, no coração adulto normal em repouso, para que se mantenha a vida celular, deve existir uma fonte de nutrientes ao coração. Em outras palavras, as células progenitoras endoteliais circulantes (CPEc) requerem circulação coronariana preexistente para chegar ao local em que ocorre a isquemia miocárdica.
Ao analisar o segundo componente da definição de Folkman, quando diz: "[...] por estímulos endógenos ou exógenos...", verifica-se que abrangeu os dois principais mecanismos do processo de angiogênese: a endógena são os processos fisiológicos e patológicos, enquanto a exógena é a terapia angiogênica cardiovascular como forma exógena de indução de angiogênese. O objetivo desta revisão é analisar os mecanismos da angiogênese endógena nos processos fisiológicos.
A angiogênese é, principalmente, uma resposta adaptativa à hipóxia tecidual e depende do acúmulo de FIH-1 α, que, em condições de hipóxia tecidual, ativa a expressão de fatores de crescimento e inicia o processo de angiogênese na zona isquêmica, a partir da rede coronariana preexistente6. Além disso, a atração e o recrutamento de CPEc e macrófagos ativam, de forma parácrina, a angiogênese nessa área7. A expressão do VEGF-A é um indicativo do recrutamento dos progenitores mieloides no miocárdio isquêmico, enquanto as células perivasculares da angiogênese são mediadas pelos fatores derivados de células estromais (FDE)-1 (
Na cardiopatia isquêmica, tanto FIH-1α quanto VEGF-A estão presentes na placa aterosclerótica, sugerindo que o FIH, por via da sinalização angiogênica, está diretamente envolvido no crescimento da placa aterosclerótica9.
A isquemia miocárdica grave leva ao acúmulo de FIH-1 e à expressão de fatores que estimulam brotos angiogênicos nas proximidades dos vasos sanguíneos no miocárdio isquêmico. Não podemos esquecer que a isquemia grave e persistente causa apoptose da CE e das fibras miocárdicas. Além disso, os progenitores mieloides e endoteliais derivados da medula óssea também são recrutados para participar ativamente do apoio da angiogênese10.
O FIH-1α é claramente importante para a angiogênese no miocárdio. No entanto, pouco se sabe a respeito do FIH-2α. Cardiomiócitos privados de FIH-1α específicos foram levados a redução da vascularização, alterações no metabolismo energético e anormalidade da função contrátil. Em contrapartida, a superexpressão da proteína de fusão FIH-1α/VP16 (FIH-1α do ADN vinculante e ativador de domínio ligado com heterodimerization VP16) foi capaz de promover a angiogênese e reduzir o tamanho de infarto em modelo experimental em rato. Tal como ocorre com outros tecidos hipóxicos, o FIH-1α é essencial para o aumento da concentração, na medula óssea, de precursores de CE. Mesmo uma deficiência parcial de FIH-1α, decorrente de envelhecimento, está associada a uma redução significativa na concentração dessas células e a uma pobre vascularização em músculo isquêmico11.
A hipoxemia também regula a produção e a expressão do VEGF, em razão do aumento da transcrição do FIH-1 e do aumento na estabilidade do VEGF-dependente da região 3 do ARNm11.
O mecanismo molecular iniciador da angiogênese pode ser impulsionado pela privação de oxigênio e nutrientes, como glicose, que regulam a expressão gênica. Observou-se também que a hipóxia regula os receptores TIE-2, sendo moduladores da atividade do VEGF, o que leva as CE a proliferar pelos mecanismos de brotamento ou divisão. De acordo com o padrão de sinal do VEGF e TIE-2, é possível induzir angiogênese por brotos ou intussuscepção12. Um fato importante, de aplicação terapêutica do VEGF, é que a isquemia estimula sua expressão, bem como a de seus receptores13 (
Durante a isquemia miocárdica, o aumento da expressão e estabilização da transcrição de FIH-1 promove produção local e liberação pela CE em sofrimento isquêmico dos fatores FDE-1 e VEGF-A14. O FIH circulante regula muitos genes da angiogênese, mas a indução do VEGF talvez seja o mais notável. FIH aumenta a concentração local de VEGF em até 30 vezes, em poucos minutos. O VEGF estimula a angiogênese fisiológica e patológica em estrita resposta dose-dependente6. Esses mediadores são capazes de aumentar a mobilização e o recrutamento das CPEc na área isquêmica15.
O aumento da expressão de FDE-1 é essencial para regulação da atração, migração e retenção seletiva, no tecido miocárdico isquêmico, das CPEc ou das CE com o receptor de superficie 4 da quemoquina CXC-R416. Isso significa que a via FIH-1 é o mecanismo de unificação do sistema de sinalização da angiogênese, no contexto do infarto agudo do miocárdio (
Essas CPEc, do mesmo modo que ocorre com as células mesenquimais da medula óssea (entre outras), são mobilizadas, atraídas e deslocadas da circulação periférica para as áreas de isquemia miocárdica17.
Há evidência de que FDE-1 com o receptor de sinal CXC-R4 + desempenha papel importante no recrutamento de células circulantes da medula óssea no contexto de uma grave isquemia miocárdica. Esse sinal é essencial para o recrutamento de células-tronco no coração. O CXC-R4 + é um receptor de superfície celular da FDE-1, expresso nas CPEc e nas células-tronco circulantes hematopoéticas (CTHc)18.
As CPEc desempenham papel importante na manutenção da parede vascular endotelial, auxiliando na reendotelização (mudança fisiológica das CE) e na angiogênese19.
No entanto, os níveis de FDE-1 endógeno secretado diminuem após o IAM e retornam ao nível normal após o 4º ou 7º dias do IAM20.
As células mesenquimais circulantes derivadas da medula óssea (CMcDMO) constituem uma ponte para o interior de miocárdio isquêmico, expresso pelo FDE-1, que poderá ser um sinal facilitador para a migração de células circulantes e da medula óssea17.
Acreditava-se que os precursores endoteliais existiam apenas durante a vida embrionária. Atualmente, foram identificados precursores na medula óssea e em vasos periféricos no adulto. Alguns fatores de crescimento, como o fator estimulador de colônias de granulócitos (FECG), b-FCF e FCI-1, estimulam sua diferenciação e sua mobilização21. Esses precursores de células endoteliais colonizam novas áreas de brotos angiogênicos no adulto e, no futuro, podem ser alvos terapêuticos.
Rehman e cols.22 têm questionado a origem dessas CPEc e sua verdadeira incorporação na parede dos vasos em crescimento. Descobriram que a maior parte das chamadas CPEc deriva de monócitos/macrófagos, com apenas uma pequena população de células-tronco CD-34+/células progenitoras hematopoéticas a partir de células tronco/angioblastos. Esses monócitos/macrófagos secretam múltiplos fatores de crescimento angiogênicos, que promovem, com sua estimulação parácrina, o crescimento neovascular22.
O conceito de CPEc é muito atrativo, porém, mais de uma década após sua descoberta, ainda não existem marcadores específicos das CPEc e os resultados dos ensaios clínicos ainda são controversos. Empregando um enfoque proteômico, um estudo recente mostra que as células com fenótipo de CPEc poderiam ser células mononucleares circulantes com a incorporação de micropartículas de plaquetas23.
Schmeisser e cols.24 demonstraram que o monócito CD-34+ pode desenvolver
Finalmente, Ziegelhoeffer e cols.25 publicaram um estudo que aponta para o fato de que, no organismo adulto, as células-tronco provenientes da medula óssea não promovem crescimento vascular pela incorporação nas paredes vasculares, mas sim através de múltiplos efeitos parácrinos de citocinas angiogênicas25.
Resumindo: a angiogênese é um mecanismo fisiológico organizado sob rigorosa regulação, com muitos fatores que influenciam o processo ativo em nível molecular, incluindo muitos polipeptídios solúveis, como VEGF, angiopoietina, FCF, fatores de crescimento derivado de plaquetas (FCDP), fator de crescimento transformador β (FCT-β), fator de necrose tumoral (FNT)-α, FECG, entre muitos outros26.
O verdadeiro papel desse mecanismo e da quantificação de seu efeito angiogênico é incerto. Células-tronco residentes do miocárdio (CTRM) foram capazes de se diferenciar em cardiomiócitos, células endoteliais e células musculares lisas27. Essas CTRMs expressam receptores para FCH e para FCI-1, que podem levar ao recrutamento e à proliferação das CE e repor algumas funções do coração com dano isquêmico. Assim como ocorre com as células mesenquimais circulantes (MSCc), que são capazes de secretar FCH e FCI-1 em resposta à lesão28.
Em adultos, esse processo se deve, principalmente, à hipoxemia e se encontra mediado pela ativação de FIH-1α, que serve para aumentar a transcrição do VEGF e seus receptores VEGFRs2.
O VEGF estimula a angiogênese fisiológica e patológica em estrita relação dose-dependente29. O VEGF é uma proteína que tem a característica específica de estimular a replicação de células endoteliais vasculares, essenciais para a angiogênese30. O VEGF-A se liga a dois receptores tirosina-quinase (RTK), VEGFR-1 (flt-1) e VEGFR-2 (KDR, Flk-1). Receptores tirosina-quinase flt-1 (VEGF-R1) constituem a segunda maior afinidade para o VEGF. Embora não tão específico, o receptor flk-1 não compartilha afinidades com células do sistema inflamatório, como, por exemplo, monócitos ou células cancerosas, ao contrário do receptor flt -1. Num recente e elegante trabalho da Universidade de Leuven, fez-se importante descoberta com implicações terapêuticas para o futuro, qual seja, a relativa especificidade do VEGF-B, em termos de sua atividade angiogênica no tecido miocárdico isquêmico31.
No mecanismo da angiogênese, devido ao crescimento vascular em forma de broto vascular, é possível determinar os seguintes passos de maneira simplificada:
a) vasodilatação inicial, processo que envolve óxido nítrico e VEGF32;
b) aumento da permeabilidade vascular em resposta ao VEGF, como extravasamento de proteínas plasmáticas que funcionam como suporte para a migração das células endoteliais (CE). O aumento da permeabilidade é produzido pela formação de fenestrações organo-vesiculares e pela redistribuição das moléculas de adesão celular endotelial plaquetária33;
c) degradação proteolítica da MEC: as proteinases expõem proteínas da MEC degradada, como colágeno IV e monômero de colágeno fibrilar, que induzem a migração de CE e CML34.
Os três passos descritos envolvem mecanismos enzimáticos que incluem a Ang2, um inibidor de TIE235, proteases ativadoras do plasminogênio, metaloproteinases (MMP) da MEC e cinases ou família das heparinases.
Todas as proteases influenciam na angiogênese através da degradação molecular proteolítica da MEC, e da ativação e liberação do fator de crescimento, como bFCF, VEGF e IGF1, sequestrado na matriz extracelular (Quadro 8 na
Ao analisar o papel crítico da degradação proteolítica da MEC no crescimento e na manutenção do broto angiogênico, devem ser considerados os limites de tempo de dito processo. O processo também deve ser equilibrado, porque degradação insuficiente impede que as células vasculares deixem suas posições originais. Por outro lado, a excessiva degradação impede o apoio e a orientação para a migração das CE e, consequentemente, também a angiogênese38.
No processo de angiogênese, uma vez produzida a degradação proteolítica da MEC, seguida por fragmentação da membrana basal, produz-se a migração quimiotática das células endoteliais através da membrana basal. Para que isso aconteça, é necessário que as conexões intercelulares endoteliais sejam degradadas. Quando as CE migram para formar novos brotos, a MEC sofre degradação proteolítica e mudanças em sua composição (
A migração das CE ocorre 24 horas antes dos seguintes processos:
a) proliferação;
b) adesão e reestabelecimento de contatos intracelulares;
c) formação do lúmen vascular;
d) maturação funcional do endotélio.
Como se pode apreciar, as proteases desempenham papel crítico no processo de angiogênese39.
A estimulação do VEGF sobre os receptores de membrana tirosina-quinase das células endoteliais vasculares é expressa através de membros de gens Src da familia das tirisina-quinase, como o Src, Fyn, Yes, que regulam múltiplas funções intracelulares. Em primeiro lugar, Src, Fyn e Yes desempenham, cada qual, papel único no sistema de sinalização mitogênica do VEGF. Em segundo lugar, eles contribuem para a modulação do VEGF na migração celular. Em terceiro lugar, Fyn desempenha papel único na indução de VEGF para a formação do tubo neovascular. O Fyn tem um efeito regulador negativo sobre a migração e a estabilização do tubo neovascular induzido pelo VEGF. Esses resultados fornecem provas diretas de que Src, Fyn e Yes têm importante papel na regulação do VEGF nos eventos mediados pelas células endoteliais40.
A existência de tubos com pericitos reflete o início precoce da participação de pericito na angiogênese intussusceptiva (ver Quadro 4 da
O fluxo sanguíneo, com sua pressão sobre a nova parede vascular, interage de forma integrada e dinâmica com o citoesqueleto e a MEC. O fluxo sanguíneo contínuo estimula a proliferação das células endoteliais e regula VEGF, integrina aVb3, PECAM-1 e VE-caderina. A tensão de cisalhamento ("shear stress") estimula a proliferação de células endoteliais e, consequentemente, aumenta o diâmetro do vaso42.
A MEC fornece os contatos necessários entre as CE e os tecidos circundantes, impedindo que os brotos neovasculares degenerem. Uma matriz de colágeno intersticial e elastina entre as células vasculares oferece propriedades de viscoelasticidade e resistência à parede do vaso. A MEC também regula a formação do novo broto vascular. Quando as células endoteliais migram para formar novos brotos vasculares, a matriz não apenas é rompida proteoliticamente, como também sua composição é alterada. Proteinases expõem novos epítopos nas proteínas da MEC (por exemplo, o colágeno IV) ou alteram sua estrutura (monômeras de colágeno fibrilar), levando à migração das CE e CML34. Além disso, fibronectina, fibrina e outros componentes da matriz fornecem um andaime para o apoio e as orientações das CE.
As integrinas são receptores de superfície celular específicos da MEC, que, por transmissão de informações bidirecionais entre o exterior e o interior de células vasculares, ajudam a construir novos brotos vasculares de maneira coordenada. As integrinas α5β3 e α5β5 têm sido, há muito tempo, consideradas um regulador positivo da angiogênese, porque seus antagonistas farmacológicos suprimem a angiogênese patológica43.
O fator de crescimento derivado das plaquetas (FCDP) - β e de seu receptor FCDP-Rβ desempenha papel essencial na estabilização dos vasos sanguíneos nascentes, recrutando células mesenquimais FCDP-Rβ positivo. A falta de recrutamento das CE tem como resultado um crescimento neovascular patológico, o que provoca: alteração da permeabilidade neovascular, fragilidade neovascular, sangramento, insuficiência de perfusão e hipóxia em embriões que têm carência de FCDP-β44. Em vez disso, uma combinação de FCDP-β e VEGF resulta na formação de brotos vasculares mais maduros do que em monoterapia com qualquer dos fatores. Isso é muito importante para o futuro desenvolvimento de estratégias terapêuticas da angiogênese.
Outro sistema de sinalização envolvido na manutenção, crescimento e estabilização do broto neovascular nascente é o receptor TIE-2, que liga as angiopoietinas Ang-1 e Ang-2. Diferentemente da Ang-2, que ativa a TIE-2 em algumas células, mas bloqueia o TIE-2 em outras, a Ang-1 consistentemente ativa o receptor TIE-2. A Ang-1, por sua vez, compacta os brotos neovasculares nascentes, através das moléculas de ligação, e promove interação entre as CE das paredes como um adesivo de proteínas e contração de pericitos. A atividade angiogênica da Ang-2 está em sinergia com o VEGF para estimular a angiogênese no coração, mas, quando os sinais não são suficientes, causa a morte das CE e a regressão do broto neovascular nascente. Ou seja, os sinais de ativação TIE-2 devem funcionar como uma balança de precisão45.
O broto nascente neovascular é estabilizado através do recrutamento de células murais e pela geração de uma nova MEC. Pelo menos quatro vias moleculares estão envolvidas na regulação desse processo: FCDP e seu receptor β (FCDP-Rβ); esfingosina-1/fosfato-1 (S1P1); fator de diferenciação endotelial (receptor proteína esfingosina G-1 (EDG1); Ang1-TIE-2 e o FCT. O FCDP-β é secretado pela CE, presumivelmente em resposta ao VEGF. Embora o FCDP-β seja expressado pelas CE e as células murais, são estas as responsáveis durante a fase de maturação da angiogênese. Também são essenciais, para a formação e a estabilização do broto neovascular, os receptores TIE-1 e TIE-2, e os dois ligantes para TIE-2, como Ang1 e Ang2. As principais fontes de Ang1 e Ang2 são, respectivamente, as CE parietais e as CE de órgãos específicos. O Ang1 é conhecida pela estabilização dos brotos vasculares emergentes e por torná-los resistentes à fuga entre conexões intercelulares. Na ausência de VEGF, a Ang2 atua como um antagonista da Ang1 e desestabiliza o broto neovascular nascente, levando, finalmente, à sua regressão. Na presença de VEGF, Ang2 facilita a angiogênese. O FCT-β1 é uma citoquina multifuncional que promove o ciclo de maturação do broto noevascular em desenvolvimento pela estimulação da MEC, ao estimular a indução e a diferenciação de células mesenquimais em CE murais46.
Os determinantes moleculares de maturação neovascular podem ser agrupados em três categorias: I) União dos fatores de crescimento a um tipo de receptor celular, com seu efeito correspondente; II) Regulação molecular das interações celulares; III) Regulação molecular das interações entre as células endoteliais e a matriz extracelular.
I) União dos fatores de crescimento a um tipo de receptor celular, com seu efeito correspondente:
a) Receptores de CE flt1y, flk1 (VEGF-R1, VEGF-R2): 1) Regulação das proteases na organização da MEC; 2) Geração da MEC provisória, que permite aumentar a permeabilidade; 3) Regulação do FCDP-β, que recruta as células para estabilizar a parede do vaso nascente; 4) Supressão da apoptose nos vasos nascentes; 5) Estabilização das CE.
b) FCDP-Rβ; Ang1/TIE-2: 1) Promoção de proliferação, migração e recrutamento das células murais; 2) Estabilização de vasos nascentes, o que facilita as interações entre as junções intercelulares (CE-CE, CE-MEC); 3) Supressão da apoptose das CEc.
c) Ang2/TIE1: induz apoptose das CE, na ausência de VEGF.
d) Ang1/TIE1: coordenam a polaridade vascular.
e) FCT-β1/FCT-βRII:
1) Promovem a produção de proteases e MEC.
2) Promovem a diferenciação de fibroblastos para miofibroblastos.
f) FCT-β1/ALK1regulam a proliferação e a migração de CE.
g) FCT-β1/ALK5: regulam a maturação dos novos vasos.
h) FCT-β1/ALK1 e a endoglina: promovem a especialização arterial e venosa.
II) Regulação molecular das conexões intercelulares:
a) V caderina: forma as uniões entre as CE.
b) N-caderina: faz conexões entre as células da parede celular e as CE.
c) Conectinas: estabelece conexões entre as CE e as CE e células parietais.
III) Regulação molecular das interações entre as CE e a MEC:
a) α5β1, α1β1, α2β1, αvβ3, αvβ5: supressão da apoptose de CE.
b) Proteases: em sua ação enzimática, promovem a produção da MEC, como, por exemplo, a clivagem do colágeno XVIII para endostatina, o plasminogênio, a angiotensina e proteases como MMP2 e PEX.
c) Proteases inibitórias: evitam a degradação proteolítica da MEC para estabilizar o vaso.
Esses dados suportam, de forma consistente, a hipótese de que Ang2 e VEGF levam à formação dos brotos neovasculares, enquanto Ang1 está envolvida na estabilização do broto, por interação das CE e da célula mural46.
Durante o processo de angiogênese, ocorrem migração e proliferação de CE por aproximadamente 24 horas, período durante o qual as proteases desempenham papel crucial46. A proliferação é registrada no nível das CE e CML47.
O processo de formação do lúmen vascular é uma fase coordenada de adesão molecular-celular durante a extensão do vaso sanguíneo. As moléculas específicas responsáveis pela extensão do vaso não são bem conhecidas48.
O receptor TIE-2 e de CE é necessário para o desenvolvimento de vasos sanguíneos, bem como para sua manutenção e reparação. A Ang foi identificada como ligante específico para o receptor TIE-2. Como já citado, Ang-1 é um agonista dos receptores TIE-2 que promove a sobrevivência das CE e reduz a permeabilidade vascular49.
Em contraste com a Ang-1, a Ang-2 foi inicialmente descrita como antagonista que bloqueia a TIE-2/Ang-1 e leva à ativação do TIE-2, o que resulta na apoptose das CE. No sistema de sinalização das CE para sua sobrevivência e migração, o TIE-2 é componente essencial do desenvolvimento da vasculogênese embrionária, assim como da angiogênese no adulto. Trabalhos recentes identificaram uma proteína tirosina fosfatase beta como uma nova CE-fosfatase específica que regula a sinalização Ang-1-TIE-2 das CE. Assim, estratégias orientadas para HPTP-β podem ser benéficas à sinalização da Ang1 e, portanto, melhoram a formação e a maturação dos neovasos no contexto da angiogênese terapêutica. Além disso, é possível concluir que a hipóxia aumenta a expressão de HPTP-β e diminui a fosforilação da TIE-2, o que lança nova luz sobre o papel potencial da angiogênese do HPTP-β. A indução de HPTP-β pela hipóxia pode representar um importante mecanismo regulador de ativação do TIE-2 na angiogênese patológica50.
Em resumo, as CE têm um receptor tirosina-quinase seletiva; o TIE-2 e seus ligantes, a angiopoietina Ang-1 e Ang-2, por sua vez, são essenciais para a manutenção e a reparação dos vasos sanguíneos. A Ang-1 é um agonista da ativação dos receptores TIE-2. No entanto, a Ang-2 é contexto-dependente, ou seja, pode ser antagonista ou agonista. A proteína tirosina-fosfatase beta (HPTP-β) desempenha papel relevante na sobrevivência das células endoteliais, modulando a sinalização de Ang-1-TIE-2.
O VEGF leva à proliferação e à migração das CE no processo da angiogênese. Foi inicialmente identificado como fator de permeabilidade vascular (VPF). Muitas evidências sugerem que a angiogênese é precedida e/ou acompanhada de aumento da permeabilidade4.
Os mecanismos pelos quais VEGF/VPF aumentam a permeabilidade vascular (PV) persistem desconhecidos. Murohara e cols.51 identificam o óxido nítrico (ON) na regulação da PV, enquanto van der Zee e cols52 identificaram,
Isner4 demonstrou a ação sinérgica entre ON e prostaciclinas produzida pela interação do VEGF/VPF com seu receptor Flk-1/KDR/VEGF-R2 como mediador da permeabilidade vascular induzida por VEGF/VPF, constituindo uma propriedade única do VEGF/VPF entre as citocinas angiogênicas. Quando as proteases foram avaliadas por sua capacidade de aumentar a permeabilidade pelo teste de Miles, o VEGF foi o único a aumentar a permeabilidade - o mecanismo de ação, contudo, é desconhecido. O óxido nítrico tem sido implicado como um fator regulador da permeabilidade, dependendo de sua concentração local4.
Existem três tipos diferentes de permeabilidade vascular:
1) permeabilidade da membrana basal vascular (PBV), presente nos tecidos normais;
2) aumento da permeabilidade vascular produzido em resposta a uma única e breve exposição a VEGF-A ou a outros agentes;
3) aumento crônico da permeabilidade vascular, que caracteriza a angiogênese patológica.
Finalmente, observou-se que o VEGF-A varia significativamente em diferentes cepas do rato, e é provável que a resposta da permeabilidade, tanto basal quanto induzida por alguns fatores, também difere em camundongos com diferentes estruturas genéticas, embora isso ainda não tenha sido investigado de forma sistemática53.
A hipóxia leva ao aumento da sinalização através da transcrição do FIH-1.
Existem dois mecanismos identificados na hipoxemia que estão ligados à angiogênese ou ao seu bloqueio: um, que promove a proliferação e a sobrevivência através de CE pela ativação de receptores VEGF de sinalização e expressão de eNOS e, outro, que inicia a apoptose. Os resultados podem depender da gravidade da hipóxia. Hipoxemia moderada promove, principalmente, proliferação e sobrevivência, enquanto hipoxemia grave, próxima a condições anaeróbicas, pode causar apoptose significativa.
Tal como ocorre com as células endoteliais, a hipoxemia grave provoca apoptose das CML, enquanto a hipoxemia moderada aumenta sua proliferação. Induzida por hipóxia, a expressão da ciclo-oxigenase (COX)-2 e FCDP-β é importante para os receptores de CML que estimulam sua proliferação. O mecanismo preciso é desconhecido, mas uma possibilidade é que o MT1-MMP possa agir como uma molécula acessória da atividade proteolítica associada com receptor FCDP-β45.
Em resposta à hipoxemia tecidual, um grande número de monócitos é recrutado da circulação para os tecidos hipóxicos, onde se diferenciam em macrófagos. Vários fatores e proteínas nos tecidos hipóxicos contribuem para o recrutamento dos monócitos, a saber: proteína-1 (MCP-1), FNT-a, FEC-1, fator derivado estromal (FDE)-1 e VEGF-A. Os macrófagos promovem a angiogênese ao estimular a secreção de metaloproteinases da matriz (MMP) e uma variedade de fatores angiogênicos, tais como VEGF-A, FCF, interleucina-2 e fator de necrose tumoral. Além disso, os macrófagos também secretam um curto peptídeo de 39 resíduos de aminoácidos (PR39), que podem facilmente atravessar a membrana plasmática, entrar nas células e inibir a degradação do FIH-α. Essa função do PR39 pode melhorar a capacidade das células residentes dos tecidos hipóxicos de secretar fatores angiogênicos, devido ao aumento da concentração local de FIH-16.
Finalmente, também os macrófagos respondem à hipoxemia através da produção de uma proteína reguladora de oxigênio (PRO) pelo retículo endoplasmático e que promove a secreção de VEGF-A pelo mesmo retículo endoplasmático6.
De forma geral, a angiogênese coronária em adultos é, fundamentalmente, uma resposta potente parácrina da rede capilar preexistente em condições fisiopatológicas de isquemia e/ou de inflamação. A pesquisa básica e o entendimento dos mecanismos são necessários, a fim de dar suporte às grandes lacunas no conhecimento e possibilitar a execução de efetivas estratégias no campo da terapia angiogênica coronariana.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Gabriel Lorier pela IC/FUC.
Renato Abdala Karam Kalil Av. Princesa Isabel, 370 90620-000 - Santana, Porto Alegre, RS, Brasil E-mail:
Artigo recebido em 24/03/11; revisado recebido em 13/06/11; aceito em 04/07/11.
El proceso de angiogénesis involucra una serie compleja de estímulos y de respuestas integradas, como la estimulación de las células endoteliales (CE), para su proliferación y migración, estimulación de la matriz extracelular, para la atracción de pericitos y macrófagos, estimulación de las células musculares lisas, para su proliferación y migración, y formación de nuevas estructuras vasculares. La angiogénesis es principalmente una respuesta adaptativa a la hipoxia tisular y depende de la acumulación del factor de crecimiento inducido por la hipoxia (FIH-1 α) en la zona del miocardio isquémico, que sirve para aumentar la transcripción del factor de crecimiento endotelial vascular (con sus siglas en inglés: VEGF vascular endotelial growth factor), y sus receptores VEGF-R, por las CE en el sufrimiento isquémico. Esos pasos aglutinan mecanismos enzimáticos y proteasas activadoras del plasminógeno, metaloproteinasas (MMP) de la matriz extracelular (MEC), y cinasas que provocan la degradación molecular proteolítica de la MEC, como también la activación y la liberación de factores de crecimiento, tales como: factor básico de crecimiento de los fibroblastos (FCFb), VEGF y factor de crecimiento insulínico-1 (FCI-1). Posteriormente, viene la fase intermedia de estabilización del nuevo brote neovascular inmaduro y la fase final de maduración vascular de la angiogénesis fisiológica. Como conclusiones generales, podemos afirmar que la angiogénesis coronaria en adultos es fundamentalmente, una respuesta paracrina de la red capilar preexistente en condiciones fisiopatológicas de isquemia e inflamación.
IUniversidad de La Republica, Montevideo, Uruguay (UDELAR); Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
IIInstituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul - Fundação Universitária de Cardiologia - (IC/FUC); Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre - (UFCSPA), Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
Correspondencia
El proceso de angiogénesis involucra una serie compleja de estímulos y de respuestas integradas, como la estimulación de las células endoteliales (CE), para su proliferación y migración, estimulación de la matriz extracelular, para la atracción de pericitos y macrófagos, estimulación de las células musculares lisas, para su proliferación y migración, y formación de nuevas estructuras vasculares.
La angiogénesis es principalmente una respuesta adaptativa a la hipoxia tisular y depende de la acumulación del factor de crecimiento inducido por la hipoxia (FIH-1 α) en la zona del miocardio isquémico, que sirve para aumentar la transcripción del factor de crecimiento endotelial vascular (con sus siglas en inglés: VEGF
Esos pasos aglutinan mecanismos enzimáticos y proteasas activadoras del plasminógeno, metaloproteinasas (MMP) de la matriz extracelular (MEC), y cinasas que provocan la degradación molecular proteolítica de la MEC, como también la activación y la liberación de factores de crecimiento, tales como: factor básico de crecimiento de los fibroblastos (FCFb), VEGF y factor de crecimiento insulínico-1 (FCI-1). Posteriormente, viene la fase intermedia de estabilización del nuevo brote neovascular inmaduro y la fase final de maduración vascular de la angiogénesis fisiológica.
Como conclusiones generales, podemos afirmar que la angiogénesis coronaria en adultos es fundamentalmente, una respuesta paracrina de la red capilar preexistente en condiciones fisiopatológicas de isquemia e inflamación.
En esta revisión, traemos a colación la angiogénesis miocárdica endógena en el adulto, bajo un prisma unificado de los diversos mecanismos moleculares ya descritos. Esa visión se basa en la interpretación "dinámica" de la definición refrendada por Folkman: "La angiogénesis es la generación y la expansión de los vasos sanguíneos a partir de una red vascular preexistente, bajo estímulos endógenos o exógenos"1. En el adulto, la angiogénesis es en gran medida, una respuesta adaptativa a la hipoxia tisular y ocurre en una amplia variedad de situaciones, que van desde el desarrollo embrionario hasta el crecimiento tumoral2.
Como mediador de la cascada de eventos celulares y moleculares, está la activación del FIH- 1, que sirve para aumentar la transcripción por las CE, en el sufrimiento isquémico, del VEGF y sus receptores VEGF-R3.
Creemos que la red capilar preexistente es el lugar de inicio común para el desarrollo y la generación de los nuevos capilares, intermediada por los diferentes sistemas de signos que desencadenan la producción de factores de crecimiento y que terminan induciendo a la proliferación de las células endoteliales. La definición de angiogénesis hecha por Folkman, ya citada, se basa en sólidos elementos anátomo-morfométricos.
La relación capilar/fibra miocárdica normal en el corazón del adulto es de 1 para 1, o sea, un capilar por fibra miocárdica. El calibre máximo de nuevos vasos identificados en el proceso de angiogénesis es de 200 µm de diámetro4. Si no hay una circulación coronaria epicárdica de alimentación de esa circulación colateral con un flujo sanguíneo adecuado, es posible que ocurra la regresión paulatina del proceso de angiogénesis. A su vez, cada fibra del miocardio tiene un diámetro que varía de 10 a 25 µm y su largura también varía de 50 a 100 µm, con una distribución capilar uniforme en la pared ventricular izquierda de 3.000 para 4.000/cm2 5.
Por tanto, podemos decir que esa definición posee una fuerte sustentación morfométrica. Eso significa que, en el corazón adulto normal en reposo, para que se mantenga la vida celular, debe existir una fuente de nutrientes para el corazón. En otras palabras, las células progenitoras endoteliales circulantes (CPEc), necesitan una circulación coronaria preexistente para llegar a la región en que ocurre la isquemia miocárdica.
Al analizar el segundo componente de la definición de Folkman, cuando dice: "[...] por estímulos endógenos o exógenos...", verificamos que se extendió a los dos principales mecanismos del proceso de la angiogénesis: la endógena son los procesos fisiológicos y patológicos, mientras que la exógena es la terapia angiogénica cardiovascular como forma exógena de inducción de la angiogénesis. El objetivo de esta revisión es analizar los mecanismos de la angiogénesis endógena en los procesos fisiológicos.
La angiogénesis es principalmente, una respuesta adaptativa a la hipoxia tisular y depende de la acumulación de FIH-1 α, que, en condiciones de hipoxia tisular, activa la expresión de factores de crecimiento e inicia el proceso de angiogénesis en la región isquémica a partir de la red coronaria preexistente6. Además, la atracción y el reclutamiento de CPEc y de macrófagos activan, de forma paracrina, la angiogénesis en esa región7. La expresión del VEGF-A es un indicativo del reclutamiento de los progenitores mieloides en el miocardio isquémico, mientras que las células perivasculares de la angiogénesis están intermediadas por los factores derivados de las células estromales (FDE)-1 (
En la cardiopatía isquémica, tanto FIH-1α como VEGF-A, están presentes en la placa arteriosclerótica, lo que indica que el FIH, por vía de la señalización angiogénica, está directamente involucrado en el crecimiento de la placa arteriosclerótica9.
La isquemia miocárdica grave conlleva a la acumulación de FIH-1 y a la expresión de factores que estimulan brotes angiogénicos en las cercanías de los vasos sanguíneos en el miocardio isquémico. No nos podemos olvidar que la isquemia grave y persistente causa apoptosis de la CE y de las fibras miocárdicas. Además, los progenitores mieloides y endoteliales derivados de la médula ósea también son reclutados para participar activamente en el apoyo a la angiogénesis10.
El FIH-1α es muy importante para la angiogénesis en el miocardio. Sin embargo, poco se sabe respecto del FIH-2α. Los cardiomiocitos privados de FIH-1α específicos fueron llevados a la reducción de la vascularización, alteraciones en el metabolismo energético y anormalidad de la función contráctil. En contrapartida, la superexpresión de la proteína de fusión FIH-1α/VP16 (FIH-1α del ADN vinculante y activador de dominio vinculado con la heterodimerización VP16), fue capaz de promover la angiogénesis y de reducir el tamaño del infarto en un modelo experimental en ratones. Tal como ocurre en otros tejidos hipóxicos, el FIH-1α es esencial para el aumento de la concentración en la médula ósea, de los precursores de CE. Incluso una deficiencia parcial de FIH-1α, proveniente del envejecimiento, está asociada a una reducción significativa de la concentración de esas células, y a una vascularización pobre en el músculo isquémico11.
La hipoxemia también regula la producción y la expresión del VEGF, en razón del aumento de la transcripción del FIH-1 y del aumento en la estabilidad del VEGF-dependiente de la región 3 del ARNm11.
El mecanismo molecular iniciador de la angiogénesis puede ser impulsado por la privación de oxígeno y de los nutrientes, como la glucosa, que regulan la expresión génica. También observamos, que la hipoxia regula los receptores TIE-2, siendo moduladores de la actividad del VEGF, lo que conlleva las CE a proliferar por los mecanismos de brote o división. De acuerdo con el estándar del signo del VEGF y TIE-2, se puede inducir la angiogénesis por brotes o intususcepción12. Un hecho importante, de aplicación terapéutica del VEGF, es que la isquemia estimula su expresión, como también la de sus receptores13 (
Durante la isquemia miocárdica, el aumento de la expresión y estabilización de la transcripción de FIH-1, genera una producción local y la liberación por la CE en el sufrimiento isquémico de los factores FDE-1 y VEGF-A14. El FIH circulante regula muchos genes de la angiogénesis, pero la inducción del VEGF tal vez sea lo que más notamos. FIH aumenta la concentración local de VEGF en hasta 30 veces en pocos minutos. El VEGF estimula la angiogénesis fisiológica y patológica en una respuesta estricta de dosis-dependente6. Esos mediadores pueden aumentar la movilización y el reclutamiento de las CPEc en el área isquémica15.
El aumento de la expresión de FDE-1 es esencial para la regulación de la atracción, migración y retención selectiva en el tejido miocárdico isquémico, de las CPEc o de las CE, con el receptor de superficie 4 de la quemoquina CXC-R416. Eso significa que la vía FIH-1 es el mecanismo de unificación del sistema de señalización de la angiogénesis en el contexto del infarto agudo del miocardio (
Esas CPEc, del mismo modo que ocurre con las células mesenquimales de la médula ósea (entre otras), son movilizadas, atraídas y desplazadas de la circulación periférica hacia las áreas de isquemia miocárdica17.
Existen pruebas de que FDE-1 con el receptor de señal CXC-R4 + desempeña un rol importante en el reclutamiento de células circulantes de la médula ósea en el contexto de una grave isquemia miocárdica. Esa señal es esencial para el reclutamiento de células-tronco en el corazón. El CXC-R4 + es un receptor de superficie celular de la FDE-1, expresado en las CPEc y en las células-tronco circulantes hematopoéticas (CTHc)18.
Las CPEc desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la pared vascular endotelial, auxiliando en la reendotelización (cambio fisiológico de las CE), y en la angiogénesis19.
Pero los niveles de FDE-1 endógeno segregado, se reducen después del IAM y vuelven al nivel normal después del 4º ó 7º días del IAM20.
Las células mesenquimales circulantes derivadas de la médula ósea (CMcDMO), son un puente hacia el interior del miocardio isquémico, expresado por el FDE-1, que podrá ser una señal que facilite la migración de las células circulantes y de la médula ósea17.
Antes se creía que los precursores endoteliales existían solo durante la vida embrionaria. Actualmente, ya se han identificado precursores en la médula ósea y en los vasos periféricos en el adulto. Algunos factores de crecimiento, como el factor estimulador de colonias de granulocitos (FECG), b-FCF y FCI-1, estimulan su diferenciación y su movilización21. Esos precursores de células endoteliales colonizan nuevas áreas de brotes angiogénicos en el adulto, y en el futuro, pueden ser objetos terapéuticos.
Rehman et al22 han cuestionado el origen de esas CPEc y su verdadera incorporación en la pared de los vasos en crecimiento. Ellos descubrieron que la mayor parte de las llamadas CPEc deriva de monocitos/macrófagos, con una pequeña población de células-tronco CD-34+/células progenitoras hematopoéticas solamente, a partir de células tronco/angioblastos. Esos monocitos/macrófagos segregan múltiples factores de crecimiento angiogénicos, que a su vez también generan, con su estimulación paracrina, el crecimiento neovascular22.
El concepto de CPEc es muy interesante, aunque más de una década después de su descubrimiento, aún no hay marcadores específicos de las CPEc y los resultados de los ensayos clínicos todavía son controvertidos. Usando un enfoque proteómico, un reciente estudio muestra que las células con fenotipo de CPEc podrían ser células mononucleares circulantes con la incorporación de micropartículas de plaquetas23.
Schmeisser et al24 demostraron que el monocito CD-34+ puede desarrollar
Finalmente, Ziegelhoeffer et al25 publicaron un estudio que nos conduce a la conclusión de que, en el organismo adulto, las células-tronco provenientes de la médula ósea no generan un crecimiento vascular por la incorporación en las paredes vasculares, pero sí que lo hacen a través de múltiples efectos paracrinos de citocinas angiogénicas25.
En resumen, la angiogénesis es un mecanismo fisiológico organizado bajo una restringida regulación, con muchos factores que influyen en el proceso activo a nivel molecular, incluyendo diversos polipéptidos solubles, como VEGF, angiopoietina, FCF, factores de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), factor de crecimiento transformador β (FCT-β), factor de necrosis tumoral (FNT)-α, FECG, entre muchos outros26.
El verdadero papel de ese mecanismo y de la cuantificación de su efecto angiogénico no se conoce a ciencia cierta. Las células-tronco residentes en el miocardio (CTRM), fueron capaces de diferenciarse en los cardiomiocitos, células endoteliales y células musculares lisas27. Esas CTRMs expresan receptores para FCH y para FCI-1, que pueden conllevar al reclutamiento y a la proliferación de las CE y reponer algunas funciones del corazón que han sufrido daño isquémico. De la misma forma ocurre con las células mesenquimales circulantes (MSCc), que son capaces de segregar FCH y FCI-1 en respuesta a la lesión28.
En los adultos, ese proceso se debe, principalmente, a la hipoxemia, y se encuentra intermediado por la activación de FIH-1 a, que sirve para aumentar la transcripción del VEG F y de sus receptores VEGFRs 2.
El VEG F estimula la angiogénesis fisiológica y patológica en una estricta relación dosis dependente29. El VEG F es una proteína que tiene la característica específica de estimular la replicación de células endoteliales vasculares, esenciales para la angiogénesis30. El VEGF-A se conecta a dos receptores tirosina-quinasa (RTK), VEGFR-1 (flt-1) y VEGFR-2 (KDR, Flk-1). Los receptores tirosina-quinasa flt-1 (VEGF-R1), constituyen la segunda mayor afinidad para el VEGF. Aunque no sea tan específico, el receptor flk-1 no comparte las afinidades con las células del sistema inflamatorio, como por ejemplo, monocitos o células cancerosas, al contrario del receptorjlt -1 . En un reciente y elegante trabajo de la Universidad de Leuven, se hizo un importante descubrimiento con implicaciones terapéuticas para el futuro, sea cual sea, la relativa especificidad del VEGF-B en términos de su actividad angiogénica en el tejido miocárdico isquémico31.
En el mecanismo de la angiogénesis, debido al crecimiento vascular en forma de brote vascular, es posible determinar los siguientes pasos de manera simplificada:
a) vasodilatación inicial, proceso que envuelve el óxido nítrico y VEGF 32;
b) aumento de la permeabilidad vascular en respuesta al VEGF, como extravasación de proteínas plasmáticas que funcionan como un soporte para la migración de las células endoteliales (CE). El aumento de la permeabilidad es producido por la formación de fenestraciones órgano-vesiculares y por la redistribución de las moléculas de adhesión celular endotelial plaquetaria33;
c) degradación proteolítica de la MEC : las proteinasas exponen proteínas de la ME C degradada, como colágeno IV y monómero de colágeno fibrilar, que inducen a la migración de CE y CML34.
Los tres pasos descritos envuelven mecanismos enzimáticos que incluyen la Ang2, un inhibidor de TIE2 35, proteasas activadoras del plasminógeno, metaloproteinasas (MMP) de la MEC , y cinasas o familia de las heparinasas.
Todas as proteasas influyen en la angiogénesis a través de la degradación molecular proteolítica de la MEC , y de la activación y liberación del factor de crecimiento, como bFCF, VEG F y IGF1 , secuestrado en la matriz extracelular (Cuadro 8 en la
Al analizar el papel crítico de la degradación proteolítica de la ME C en el crecimiento y en el mantenimiento del brote angiogénico, deben ser considerados los límites de tiempo de ese proceso. El proceso también debe ser equilibrado, porque una degradación insuficiente impide que las células vasculares dejen sus posiciones originales. Por otro lado, la excesiva degradación trunca el apoyo y la orientación para la migración de las CE y por ende, también la angiogénesis38.
En el proceso de la angiogénesis, una vez producida la degradación proteolítica de la MEC , seguida por la fragmentación de la membrana basal, se produce la migración quimiotáctica de las células endoteliales a través de la membrana basal. Para que eso ocurra, se hace necesario que las conexiones intercelulares endoteliales estén degradadas. Cuando las CE migran para formar nuevos brotes, la ME C sufre una degradación proteolítica y cambios en su composición (
La migración de las CE ocurre 24 horas antes de los siguientes procesos:
a) proliferación;
b) adhesión y reestablecimento de contactos intracelulares;
c) formación del lumen vascular;
d) maduración funcional del endotelio.
Como se puede apreciar, las proteasas desempeñan un rol crítico en el proceso de la angiogénesis39. La estimulación del VEG F sobre los receptores de la membrana tirosina-quinasa de las células endoteliales vasculares, se expresa a través de miembros de genes Src de la familia de las tirisinaquinasa, como el Src, Fyn, Yes, que regulan múltiples funciones intracelulares. En primer lugar, el Src, Fyn y Yes desempeñan cada uno, un papel único en el sistema de señalización mitogénica del VEGF. En segundo lugar, contribuyen para la modulación del VEGF en la migración celular. En tercer lugar, Fyn desempeña un papel único en la inducción de VEG F para la formación del tubo neovascular. El Fyn tiene un efecto regulador negativo sobre la migración y la estabilización del tubo neovascular inducido por el VEGF. Esos resultados suministran pruebas directas de que Src, Fyn y Yes tienen un importante papel en la regulación del VEG F en los eventos intermediados por las células endoteliales40.
La existencia de tubos con pericitos refleja el rápido inicio de la participación del pericito en la angiogénesis intususceptiva (ver Cuadro 4 de la
El flujo sanguíneo, con su presión sobre la nueva pared vascular, interactúa de forma integrada y dinámica con el citoesqueleto y la MEC . El flujo sanguíneo continuo estimula la proliferación de las células endoteliales y regula el VEGF, integrina aVb3, PECAM-1 y VE-cadherina. La tensión de cizallamiento
La ME C suministra los contactos necesarios entre las CE y los tejidos circundantes, impidiendo que los brotes neovasculares se degeneren. Una matriz de colágeno intersticial y elastina entre las células vasculares, ofrece propiedades de viscoelasticidad y resistencia a la pared del vaso. La ME C también regula la formación del nuevo brote vascular. Cuando las células endoteliales migran para formar nuevos brotes vasculares, la matriz no solo se rompe proteolíticamente, sino que también su composición se altera. Las proteinasas exponen nuevos epítopos en las proteínas de la ME C (por ejemplo, el colágeno IV, o alteran su estructura (monómeras de colágeno fibrilar), lo que conlleva a la migración de las CE y CML 34. Además de eso, la fibronectina, fibrina y otros componentes de la matriz suministran un mosaico de sustentación para el apoyo y las orientaciones de las CE.
Las integrinas son receptores de superficie celular específicos de laMECque , por transmisión de informaciones bidireccionales entre el exterior y el interior de las células vasculares, ayudan a construir nuevos brotes vasculares de manera coordinada. Las integrinas a5p3 y a5p5 han venido siendo, desde hace ya mucho tiempo, consideradas un regulador positivo de la angiogénesis, porque sus antagonistas farmacológicos suprimen la angiogénesis patológica43.
El factor de crecimiento derivado de las plaquetas (FCDP) - p y de su receptor FCDP-Rp, desempeña un papel esencial en la estabilización de los vasos sanguíneos nacientes, reclutando células mesenquimales FCDP-Rp positivo. La falta de reclutamiento de las CE tienen como resultado un crecimiento neovascular patológico, lo que provoca: la alteración de la permeabilidad neovascular, la fragilidad neovascular, el sangramiento, la insuficiencia de perfusión e hipoxia en embriones que les falta FCDP-β44. En vez de eso, una combinación de FCDP-βy VEGF resultaen la formación de brotes vasculares más maduros que una monoterapia con cualquier uno de los factores. Eso es muy importante para el futuro desarrollo de estrategias terapéuticas de la angiogénesis.
Otro sistema de señalización involucrado en el mantenimiento, crecimiento y estabilización del brote neovascular naciente, es el receptor TIE-2, que liga las angiopoietinas Ang-1 y Ang-2. A diferencia de la Ang-2, que activa la TIE-2 en algunas células, pero bloquea el TIE-2 en otras, la Ang-1 activa consistentemente el receptor TIE-2. La Ang-1 a su vez, compacta los brotes neovasculares nacientes, a través de las moléculas de adhesión y genera una interacción entre las CE de las paredes como un adhesivo de proteínas y la contracción de pericitos. La actividad angiogénica de la Ang-2 está en la sinergia con el VEGF para estimular la angiogénesis en el corazón, pero cuando los signos no son suficientes, causa la muerte de las CE y la regresión del brote neovascular naciente. O sea, que los signos de activación TIE-2 deben funcionar como una báscula de precisión45.
El brote naciente neovascular se estabiliza a través del reclutamiento de las células murales y por la generación de una nueva MEC . Por lo menos cuatro vías moleculares están involucradas en la regulación de ese proceso: FCD P y su receptor p (FCDP-Rβ); esfingosina-1/fosfato-1 (S1P1); factor de diferenciación endotelial (receptor proteína esfingosina G-1 (EDG1); Ang1 -TIE-2 y el FCT El FCDP-β es segregado por la CE, tal vez como respuesta al VEGF Aunque el FCDP-β esté expresado por las CE y las células murales, son ésas las responsables durante la fase de maduración de la angiogénesis. También son esenciales para la formación y la estabilización del brote neovascular, los receptores TIE-1 y TIE-2, y los dos ligadores para TIE-2, como Ang1 y Ang2. Las principales fuentes de Ang1 y Ang2 son respectivamente, las CE parietales y las CE de los órganos específicos. El Ang1 es conocida por la estabilización de los brotes vasculares emergentes y por hacerlos resistentes a la fuga entre las conexiones intercelulares. En la ausencia de VEGF, la Ang2 actúa como un antagonista de la Ang1 y desestabiliza el brote neovascular naciente, conllevando, finalmente, a su regresión. En presencia de VEGF, Ang2 facilita la angiogénesis. El FCT-pi es una citoquina multifuncional que genera el ciclo de maduración del brote neovascular en desarrollo por la estimulación de la MEC , al estimular la inducción y la diferenciación de las células mesenquimales en CE murales46.
Los determinantes moleculares de maduración neovascular pueden ser agrupados en tres categorías: I) Unión de los factores de crecimiento a un tipo de receptor celular, con su efecto correspondiente; II) Regulación molecular de las interacciones celulares; III) Regulación molecular de las interacciones entre las células endoteliales y la matriz extracelular.
I) Unión de los factores de crecimiento a un tipo de receptor celular, con su correspondiente efecto:
a) Receptores de CE fltly flkl (VEGF-R1, VEGF-R2): 1) Regulación de las proteasas en la organización de la MEC ; 2) Generación de la ME C provisional, que permite aumentar la permeabilidad; 3) Regulación del FCDP-β, que recluta las células para estabilizar la pared del vaso naciente; 4) Supresión de la apoptosis en los vasos nacientes; 5) Estabilización de las CE.
b) FCDP-Rβ; Ang1/TIE-2: 1) Promoción de proliferación, migración y reclutamiento de las células murales; 2) Estabilización de vasos nacientes, lo que facilita las interacciones entre las junciones intercelulares (CE-CE, CE-MEC); 3) Supresión de la apoptosis de las CEc.
c) Ang2/TIE1: induce a la apoptosis de las CE, en ausencia de VEGF
d) Ang1/TIE1: coordinan la polaridad vascular.
e) FCT-βVFCT-βRII:
1) Promueven la producción de proteasas y MEC .
2) Promueven la diferenciación de fibroblastos para miofibroblastos.
f) FCT-β1/ALK1 regulan la proliferación y la migración de CE.
g) FCT-β1/ALK5: regulan la maduración de los nuevos vasos.
h) FCT-β1/ALK1 y la endoglina: promueven la especialización arterial y venosa.
II) Regulación molecular de las conexiones intercelulares:
a) V cadherina: forma las uniones entre las CE.
b) N-cadherina: conecta las células de la pared celular y las CE.
c) Conectinas: establece conexiones entre las CE y las CE y células parietales.
III) Regulación molecular de las interacciones entre las CE y la MEC:
a) α5β1, α1β1, α2β1, αvβ3, αvβ5: supresión de la apoptosis de CE.
b) Proteasas: en su acción enzimática promueven la producción de la MEC, como por ejemplo, la segmentación del colágeno XVIII para endostatina, el plasminógeno, la angiotensina y proteasas como MMP 2 y PEX.
c) Proteasas inhibitorias: evitan la degradación proteolítica de la ME C para estabilizar el vaso.
Esos datos sustentan de forma consistente, la hipótesis de que Ang2 y VEG F conllevan a la formación de los brotes neovasculares, mientras que Ang1 está involucrada en la estabilización del brote por interacción de las CE y de la célula mural46.
Durante el proceso de angiogénesis, ocurre la migración y la proliferación de CE por aproximadamente 24 horas, período durante el cual las proteasas tienen un papel crucial46. La proliferación queda registrada al nivel de las CE y CML47.
El proceso de formación del lumen vascular es una fase coordinada de adhesión molecular-celular durante la extensión del vaso sanguíneo. Las moléculas específicas responsables de la extensión del vaso no se conocen muy bien48.
El receptor TIE-2 y de CE es necesario para el desarrollo de los vasos sanguíneos, como también para su mantenimiento y reparación. La Ang fue identificada como un ligador específico para el receptor TIE-2. Como ya se ha dicho, Ang-1 es un agonista de los receptores TIE-2 que promueve la supervivencia de las CE y reduce la permeabilidad vascular49.
En contraposición con la Ang-1, la Ang-2 fue inicialmente descrita como un antagonista que bloquea la TIE-2/Ang-1 y que conduce a la activación del TIE-2, lo que resulta en la apoptosis de las CE. En el sistema de señalización de las CE para su supervivencia y migración, el TIE-2 es un componente esencial en el desarrollo de la vasculogénesis embrionaria, como también de la angiogénesis en el adulto. Algunos trabajos recientes identificaron una proteína tirosina fosfatasa beta como una nueva CE-fosfatasa específica que regula la señalización Ang1-TIE-2 de las CE. Así, algunas estrategias dirigidas para HPTP-P pueden ser beneficiosas para la señalización de la Ang1 y por tanto, mejoran la formación y la maduración de los neovasos en el contexto de la angiogénesis terapéutica. Además, podemos concluir diciendo que la hipoxia aumenta la expresión de H PTP-P y que reduce la fosforilación de la TIE-2, lo que nos da un nuevo horizonte sobre el papel potencial de la angiogénesis del H PTP-p. La inducción de HPTP-P por la hipoxia, puede representar un importante mecanismo regulador de activación del TIE-2 en la angiogénesis patológica50.
Como colofón, podemos afirmar que las CE tienen un receptor tirosina-quinasa selectiva; el TIE-2 y sus ligadores, la angiopoietina Ang-1 y Ang-2, a su vez, son esenciales para el mantenimiento y la reparación de los vasos sanguíneos. La Ang-1 es un agonista de la activación de los receptores TIE-2. Sin embargo, la Ang-2 es contexto-dependiente, o sea, que puede ser antagonista o agonista. La proteína tirosina-fosfatasa beta (H PTP-P), desempeña un papel relevante en la supervivencia de las células endoteliales, modulando la señalización de Ang-1-TIE-2.
El VEG F conlleva a la proliferación y a la migración de las CE en el proceso de la angiogénesis. Fue inicialmente identificado como factor de permeabilidad vascular (VPF). Muchas evidencias sugieren que la angiogénesis viene precedida y/o seguida del aumento de la permeabilidad4.
Los mecanismos por los cuales VEGF/VP F aumentan la permeabilidad vascular (PV), continúan siendo desconocidos. Murohara et al51 identifican el óxido nítrico (ON) en la regulación de la PV, mientras que Van Der Zee et al5 2 identificaron,
Isner4 demostró la acción sinérgica entre ON y las prostaciclinas producida por la interacción del VEGF/VP F con su receptor Flk-1/KDR/VEGF-R2 como mediador de la permeabilidad vascular inducida por VEGF/VPF, constituyendo una propiedad única del VEGF/VP F entre las citocinas angiogénicas. Cuando las proteasas fueron evaluadas por su capacidad de aumentar la permeabilidad por el test de Miles, el VEGF fue el único que aumentó la permeabilidad. Sin embargo, su mecanismo de acción no se conoce. El óxido nítrico ha sido usado como un factor regulador de la permeabilidad, dependiendo de su concentración local4.
Existen tres tipos diferentes de permeabilidad vascular:
1) permeabilidad de la membrana basal vascular (PBV), presente en los tejidos normales; 2) aumento de la permeabilidad vascular producido en respuesta a una única y a una breve exposición a la VEGF-A o a otros agentes;
3) aumento crónico de la permeabilidad vascular, que caracteriza la angiogénesis patológica.
Finalmente, observamos que el VEGF-A varía significativamente en diferentes cepas del ratón, y que es probable que la respuesta de la permeabilidad, tanto basal como inducida por algunos factores, también sea diferente en ratones caseros con diferentes estructuras genéticas, aunque eso todavía no haya sido investigado de forma sistemática53.
La hipoxia conlleva al aumento de la señalización a través de la transcripción del FIH-1.
Existen dos mecanismos identificados en la hipoxemia que están ligados a la angiogénesis o a su bloqueo: uno, el que genera la proliferación y la supervivencia a través de CE por la activación de los receptores VEG F de señalización y expresión de eNOS , y otro, el que inicia la apoptosis. Los resultados pueden depender de la gravedad de la hipoxia. La hipoxemia moderada genera, principalmente, la proliferación y la supervivencia mientras que la hipoxemia grave, que se acerca a las condiciones anaeróbicas, puede causar una apoptosis significativa.
Tal como ocurre con las células endoteliales, la hipoxemia grave provoca apoptosis de las CML, mientras que la hipoxemia moderada aumenta su proliferación. Inducida por la hipoxia, la expresión de la ciclo-oxigenasa (COX)-2 y FCDP-β es importante para los receptores de CML, que estimulan su proliferación. El mecanismo preciso no se conoce, pero una posibilidad es que el MT1 -MM P actúe como una molécula accesoria de la actividad proteolítica asociada con el receptor FCDP-β45.
En respuesta a la hipoxemia tisular, un gran número de monocitos es reclutado de la circulación hacia los tejidos hipóxicos, donde se diferencian en macrófagos. Varios factores y proteínas en los tejidos hipóxicos contribuyen para el reclutamiento de los monocitos, a saber: proteína-1 (MCP-1), FNT-a, FEC-1, factor derivado del estroma (FDE)-1 y VECF-A. Los macrófagos generan la angiogénesis al estimular la secreción de metaloproteinasas de la matriz (MMP), y una variedad de factores angiogénicos, tales como VECF-A, FCF, interleucina-2 y factor de necrosis tumoral. Además, los macrófagos también segregan un corto péptido de 39 residuos de aminoácidos (PR39), que fácilmente pueden atravesar la membrana plasmática, entrar en las células e inhibir la degradación del FIH-a. Esa función del PR39 puede mejorar la capacidad de las células residentes de los tejidos hipóxicos de segregar factores angiogénicos, debido al aumento de la concentración local de FIH-1 6.
Finalmente, también los macrófagos responden a la hipoxemia a través de la producción de una proteína reguladora de oxígeno (PRO), por el retículo endoplasmático, que genera la secreción de VECF-A por el mismo retículo endoplasmático6.
De manera general, la angiogénesis coronaria en los adultos es fundamentalmente, una respuesta potente paracrinade la red capilar preexistente en condiciones fisiopatológicas de isquemia y/o de inflamación. La investigación básica y el entendimiento de los mecanismos son necesarios para darle fundamento a las grandes lagunas que tenemos en el conocimiento y posibilitar la ejecución de efectivas estrategias en el campo de la terapia angiogénica coronaria.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio no tuve fuentes de financiación externas.
Este artículo forma parte de tesis de Doctorado de Gabriel Lorier, por IC/FUC.
The process of angiogenesis involves a complex sequence of stimuli and integrated responses, such as stimulation of endothelial cells (ECs) for their proliferation and migration, stimulation of the extracellular matrix (ECM) for the attraction of pericytes and macrophages, stimulation of smooth muscle cells for their proliferation and migration, and formation of new vascular structures. Angiogenesis is mainly an adaptive response to tissue hypoxia and depends on the accumulation of the hypoxia-inducible factor (HIF-1α) in the ischemic myocardial area, which increases the transcription of the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors VEGF-R by the ECs undergoing ischemia. Those steps involve enzymatic mechanisms and plasminogen activator proteases, metalloproteinases (MMP) of the ECM, and kinases that cause proteolytic molecular degradation of the ECM and activation and release of growth factors, such as: basic fibroblast growth factor (bFGF), VEGF, and insulin growth factor-1 (IGF-1). In the intermediate phase, stabilization of the immature neovascular sprout occurs. The final phase is characterized by vascular maturation of the physiological angiogenesis. In conclusion, coronary angiogenesis in adults is fundamentally a paracrine response of the preexisting capillary network under pathophysiological condition of ischemia and inflammation.
IUniversidad de La Republica, Montevideo, Uruguay (UDELAR); Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
IIInstituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul - Fundação Universitária de Cardiologia - (IC/FUC); Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre - (UFCSPA), Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
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The process of angiogenesis involves a complex sequence of stimuli and integrated responses, such as stimulation of endothelial cells (ECs) for their proliferation and migration, stimulation of the extracellular matrix (ECM) for the attraction of pericytes and macrophages, stimulation of smooth muscle cells for their proliferation and migration, and formation of new vascular structures.
Angiogenesis is mainly an adaptive response to tissue hypoxia and depends on the accumulation of the hypoxia-inducible factor (HIF-1α) in the ischemic myocardial area, which increases the transcription of the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors VEGF-R by the ECs undergoing ischemia.
Those steps involve enzymatic mechanisms and plasminogen activator proteases, metalloproteinases (MMP) of the ECM, and kinases that cause proteolytic molecular degradation of the ECM and activation and release of growth factors, such as: basic fibroblast growth factor (bFGF), VEGF, and insulin growth factor-1 (IGF-1). In the intermediate phase, stabilization of the immature neovascular sprout occurs. The final phase is characterized by vascular maturation of the physiological angiogenesis.
In conclusion, coronary angiogenesis in adults is fundamentally a paracrine response of the preexisting capillary network under pathophysiological condition of ischemia and inflammation.
This review article approaches endogenous myocardial angiogenesis in the adult considering a unified view of several molecular mechanisms. Such view is based on the "dynamic" interpretation of Folkman's definition: "Angiogenesis is the generation and expansion of blood vessels from a preexisting vascular network under endogenous or exogenous stimuli"1. In the adult, angiogenesis is mainly an adaptive response to tissue hypoxia and occurs in a wide variety of situations, ranging from embryonic development to tumor growth2.
Mediating the cascade of cell and molecular events is the activation of the hypoxia-inducible factor (HIF-1), which increases the transcription of vascular endothelial growth factors (VEGF) and their receptors (VEGF-R) by endothelial cells (ECs) undergoing ischemia3.
The preexisting capillary network is believed to be the common site of beginning in the development and generation of new capillaries, mediated by different signal systems that trigger the production of growth factors and that induce the proliferation of endothelial cells. Folkman's definition of angiogenesis is based on solid anatomical and morphometric elements.
The normal capillary/myocardial fiber ratio in the adult heart is 1:1, meaning one capillary to one myocardial fiber. The maximum diameter of new vessels identified in the angiogenesis process is 200-µm4. If there is no epicardial coronary circulation to feed that collateral circulation with adequate blood flow, gradual regression of the angiogenesis process is likely to occur. Myocardial fibers have diameters and lengths ranging from 10 to 25 µm and 50 to 100 µm, respectively, and uniform capillary distribution in the left ventricular wall from 3,000 to 4,000/cm2 5.
Thus, that definition has strong morphometric support, meaning that, in the normal adult heart at rest, a source of nutrients has to exist to maintain cell life. In other words, circulating endothelial progenitor cells (cEPCs) require preexisting coronary circulation to get to the site where myocardial ischemia occurs.
Analyzing the second component of Folkman's definition, "[...] under endogenous or exogenous stimuli...", it clearly encompassed the two major mechanisms of the angiogenesis process: the endogenous, which comprises the physiological and pathological processes; and the exogenous, which is the cardiovascular angiogenic therapy as an exogenous angiogenesis-inducing form. This review was aimed at assessing the mechanisms of endogenous angiogenesis in physiological processes.
Angiogenesis is mainly an adaptive response to tissue hypoxia and depends on the accumulation of HIF-1α, which, under tissue hypoxia conditions, activates the expression of growth factors and initiates the process of angiogenesis in the ischemic zone from the preexisting coronary network6. In addition, the attraction and recruitment of cEPCs and macrophages activate, in the paracrine form, angiogenesis in the area7. The VEGF-A expression indicates recruitment of myeloid progenitors in the ischemic myocardium, while the perivascular cells of angiogenesis are mediated by stromal-cell-derived factors (SDF)-1 (
In ischemic heart disease, both HIF-1α and VEGF-A are present in the atherosclerotic plaque, suggesting that HIF, through angiogenic signaling, is directly involved in the atherosclerotic plaque growth9.
Severe myocardial ischemia leads to accumulation of HIF-1 and the expression of factors that stimulate angiogenic sprouts in the proximities of blood vessels in the ischemic myocardium. It is worth noting that severe and persistent ischemia causes apoptosis of the ECs and myocardial fibers. In addition, myeloid and endothelial bone-marrow-derived progenitors are also recruited to actively support angiogenesis10.
In the myocardium, HIF-1α is clearly important for angiogenesis. However, little is known about HIF-2α. Cardiomyocytes deprived from specific HIF-1α led to a reduction in vascularization, alterations in the energetic metabolism, and abnormality in the contractile function. On the other hand, overexpression of the HIF-1α/VP16 fusion protein (fusion protein containing HIF-1α and herpes virus VP16 sequences) could promote angiogenesis and reduce the size of the infarction in a rat experimental model. Similarly to that which occurs in other hypoxic tissues, HIF-1α is essential to increase the concentration of EC precursors in the bone marrow. Even a partial deficiency of HIF-1α, due to aging, is associated with a significant reduction in the concentration of those cells and with poor vascularization in the ischemic muscle11.
Hypoxemia also regulates the VEGF production and expression, because of the increase in HIF-1 transcription and in mRNA region-3-dependent VEGF stability11.
The molecular mechanism starting angiogenesis can be triggered by deprivation of oxygen and nutrients, such as glucose, which regulate gene expression. In addition, hypoxia regulates TIE-2 receptors, modulators of the VEGF activity, leading ECs to proliferate through the mechanisms of sprouting or division. According to the signal pattern of VEGF and TIE-2, angiogenesis can be induced by sprouts or intussusception12. An important fact regarding the therapeutic application of VEGF is that ischemia stimulates its expression and that of its receptors13. (
During myocardial ischemia, the increase in expression and stabilization of HIF-1 transcription promotes local production and release of SDF-1 and VEGF-A by ischemic ECs14. Circulating HIF regulates several genes of angiogenesis, and VEGF induction is probably the most remarkable. HIF increases the local VEGF concentration in up to 30 times in a few minutes. VEGF stimulates physiological and pathological angiogenesis in a strict dose-dependent response6. Those mediators can increase the mobilization and recruitment of cEPCs in the ischemic area15.
The increase in the SDF-1 expression is essential to regulate the selective attraction, migration and retention, in the ischemic myocardium, of cEPCs or ECs with the surface chemokine receptor type 4, CXC-R416. This means that the HIF-1 pathway is the unifying mechanism of the angiogenesis signaling system in the context of acute myocardial infarction (
Those cEPCs, similarly to that which occurs with bone marrow mesenchymal cells and others, are mobilized, attracted and redirected from the peripheral circulation to myocardial ischemic areas17.
There is evidence that SDF-1 along with signal receptor CXC-R4+ play an important role in the recruitment of circulating bone marrow cells in the context of severe myocardial ischemia. That signal is essential for the recruitment of stem cells in the heart. CXC-R4+ is a cell-surface receptor of SDF-1, expressed on cEPCs and on circulating hematopoeitic stem-cells18.
Circulating endothelial progenitor cells play an important role in endothelial vascular wall maintenance, aiding in reendothelialization (physiological change in ECs) and angiogenesis19.
However, endogenous SDF-1 levels decrease after an AMI, returning to normal four to seven days after the AMI20.
Circulating bone marrow-derived mesenchymal cells constitute a bridge to the interior of the ischemic myocardium, expressed by SDF-1, which can be a facilitating signal to the migration of circulating and bone marrow cells17.
Endothelial precursors were believed to exist only during embryonic life. Currently, precursors are known to exist in the bone marrow and peripheral vessels in adults. Some growth factors, such as the granulocyte colony stimulating factor (GCSF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and insulin growth factor 1 (IGF-1), stimulate their differentiation and mobilization21. Those endothelial cell precursors colonize new areas of angiogenic sprouts in adults, and, in the future, can be therapeutic targets.
Rehman et al22 have questioned the origin of those cEPCs and their true incorporation into the wall of growing vessels. Those authors have reported that most cEPCs derive from monocytes/macrophages, with only a small population of CD-34+ stem cells/hematopoeitic progenitor cells originating from stem cells/angioblasts. Those monocytes/macrophages secret multiple angiogenic growth factors, which promote, with their paracrine stimulation, neovascular growth22.
The concept of cEPCs is very attractive; however, more than one decade after their discovery, specific markers for cEPCs still lack, and the results of the clinical trials are still controversial. A recent study has shown, by use of a proteomic approach, that cells with a cEPC phenotype could be circulating mononuclear cells with the incorporation of platelet microparticles23.
Schmeisser et al24 have shown that CD-34+ monocytes can develop
Finally, Ziegelhoeffer et al25 have reported that, in an adult organism, bone marrow-derived stem cells do not promote vascular growth through their incorporation into vascular walls, but rather through multiple paracrine effects of angiogenic cytokines25.
Briefly: angiogenesis is a physiological mechanism organized under strict regulation, with several factors influencing the active process at molecular level, including several soluble polypeptides, such as VEGF, angiopoietin (Ang), FGF, platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor β (TGF-β), tumor necrosis factor (TNF)-α, and GCSF26.
The true role of the mechanism of endogenous angiogenesis through resident cardiac stem cell activation and of the quantification of its angiogenic effect is uncertain. Resident cardiac stem cells were able to differentiate into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells27. Those resident cardiac stem cells express receptors for hepatocyte growth factor (HGF) and for IGF-1, which can lead to the recruitment and proliferation of ECs and restore some functions of the ischemically injured heart, similarly to that which occurs with circulating mesenchymal cells, which can secret HGF and IGF-1 in response to injury28.
In adults, that process is mainly due to hypoxemia and mediated by the activation of HIF-1α, that increases the transcription of VEGF and its receptors, VEGFRs2.
The VEGF stimulates physiological and pathological angiogenesis on a strict dose-dependent relation29. The VEGF is a protein with the specific characteristic of stimulating the replication of vascular endothelial cells, essential to angiogenesis30. The VEGF-A binds to two tyrosine-kinase receptors (RTKs), VEGFR-1 (Flt-1) and VEGFR-2 (KDR, Flk-1). The Flt-1 tyrosine-kinase receptors (VEGFR-1) are the second highest-affinity receptors for VEGF. Although not so specific, Flk-1 receptors do not have an affinity with cells of the inflammatory system, such as monocytes or cancer cells, unlike the Flt-1 receptor. A recent and elegant study of the Leuven University has made an important discovery with therapeutic implications for the future, which is the relative specificity of VEGF-B regarding its angiogenic activity in ischemic myocardial tissue31.
Regarding the mechanism of angiogenesis, because of the vascular growth in the form of a vascular sprout, the following steps could be determined:
a) initial vasodilation, a process that involves nitric oxide and VEGF32;
b) increased vascular permeability in response to VEGF, such as plasma protein extravasation, which functions as a support for EC migration. The increase in permeability is produced by the formation of organo-vesicular fenestrations and redistribution of platelet endothelial cell adhesion molecules (PECAMs)33;
c) proteolytic degradation of the extracellular matrix (ECM): proteinases expose proteins of the degraded ECM, such as collagen IV and fibrillar collagen monomer, which induce migration of ECs and smooth muscle cells (SMCs)34.
The three steps described involve enzyme mechanisms that include Ang-2, a TIE-2 inhibitor35, plasminogen activator proteases, matrix metalloproteinases (MMP), and kinases or heparinase family.
All proteases influence angiogenesis through proteolytic molecular degradation of the ECM and activation and release of growth factors, such as bFGF, VEGF, and IGF1, sequestered in the ECM (box 8 of
Analyzing the critical role of the ECM proteolytic degradation in the growth and maintenance of the angiogenic sprout, the time limits of that process should be considered. In addition, the process should be balanced, because insufficient degradation prevents vascular cells from leaving their original positions. On the other hand, excessive degradation hinders the support and orientation for EC migration, and, consequently, also angiogenesis38.
In the angiogenesis process, the ECM proteolytic degradation is followed by fragmentation of the basal membrane, and then by chemotactic migration of the ECs through the basal membrane. That requires cleavage of endothelial intercellular connections. When the ECs migrate to form new sprouts, the ECM undergoes proteolytic degradation and changes in its composition (
Migration of the ECs occurs 24 hour before the following processes:
a) proliferation;
b) adhesion and reestablishment of intracellular contacts;
c) formation of the vascular lumen;
d) functional maturation of the endothelium.
As shown, proteases play a critical role in the angiogenesis process39.
The VEGF stimulation of the tyrosine-kinase membrane receptors of the ECs is expressed through Src genes of the tyrosine-kinase family, such as Src, Fyn, and Yes, which regulate multiple intracellular functions. Each of the Src, Fyn and Yes genes plays a unique role in the VEGF mitogenic signaling system. They contribute to VEGF modulation in cell migration. The Fyn gene plays a unique role in VEGF induction for the formation of the neovascular tube, having a negative regulatory effect on the migration and stabilization of the VEGF-induced neovascular tube. Those results provide direct evidence that the Src, Fyn and Yes genes play an important role in VEGF regulation in EC-mediated events40.
The existence of tubes with pericytes reflects the early beginning of the participation of pericytes in intussusceptive angiogenesis (box 4 of
Blood flow, exerting pressure on the new vascular wall, interacts in an integrated and dynamic way with the cytoskeleton and ECM. Continuous blood flow stimulates the proliferation of ECs and regulates VEGF, integrin aVb3, PECAM-1, and VE-cadherin. Shear stress stimulates EC proliferation, and, thus, increases the diameter of the vessel42.
The ECM provides the necessary contacts between the ECs and surrounding tissues, preventing the degeneration of the neovascular sprouts. A matrix of interstitial collagen and elastin between the vascular cells provide viscoelasticity and resistance to the vascular wall. The ECM also regulates the formation of the new vascular sprout. When the ECs migrate to form new vascular sprouts, the matrix is not only proteolytically cleaved, but its composition is altered as well. Proteinases expose new epitopes in the ECM proteins (for example, collagen IV) or alter their structure (fibrillar collagen monomers), leading to migration of ECs and SMCs34. In addition, fibronectin, fibrin and other components of the matrix provide support and orientation for ECs.
Integrins are specific cell surface receptors of the ECM, which, through transmission of bidirectional information between the exterior and interior of the vascular cells, help in constructing new vascular sprouts coordinately. Integrins α5β3 and α5β5 have long been considered a positive regulator of angiogenesis, because their pharmacological antagonists suppress pathological angiogenesis43.
Platelet-derived growth factor-β and its receptor (PDGF-Rβ) play an essential role in the stabilization of new blood vessels, recruiting PDGF-Rβ-positive mesenchymal cells. The lack of EC recruitment results in pathological neovascular growth, which causes: neovascular permeability changes; neovascular fragility; bleeding; insufficient perfusion; and hypoxia in embryos lacking PDGF-β44. However, a combination of PDGF-β and VEGF results in the formation of more mature vascular sprouts than that obtained with monotherapy with any of the factors. That is extremely important for the future development of therapeutic strategies of angiogenesis.
Another signaling system involved in the maintenance, growth, and stabilization of the neovascular sprout is the TIE-2 receptor, which binds Ang-1 and Ang-2. Differently from Ang-2, which activates TIE-2 in some cells, but blocks TIE-2 in other cells, Ang-1 consistently activates the TIE-2 receptor. On its turn, Ang-1 compacts the neovascular sprouts through binding molecules and causes the interaction of mural ECs, as a protein adhesive, and the contraction of pericytes. The angiogenic activity of Ang-2 is synergic with VEGF to stimulate cardiac angiogenesis, but when the signals are not sufficient, it causes the death of the ECs and regression of the neovascular sprout. The TIE-2 activation signs should function as a precision scale45.
The neovascular sprout is stabilized through the recruitment of mural cells and generation of a new ECM. At least four molecular pathways are involved in the regulation of that process: PDGF and PDGF-Rβ; sphingosine-1-phosphate-1 (S1P1); endothelial differentiation factor [sphingosine G-1 protein receptor (EDG1)]; Ang-1-TIE-2; and TGF. The PDGF-β is secreted by the EC, probably in response to VEGF. Although PDGF-β is expressed by ECs and mural cells, the latter are responsible during the maturation phase of angiogenesis. In addition, the TIE-1 and TIE-2 receptors and the two TIE-2 ligands, Ang-1 and Ang-2, are essential for the formation and stabilization of the neovascular sprout. The major sources of Ang-1 and Ang-2 are the mural and specific organ ECs, respectively. Angiopoietin-1 is known due to its ability to stabilize the emerging vascular sprouts and to make them resistant to evasion between intercellular connections. In the absence of VEGF, Ang-2 acts as an Ang-1 antagonist and destabilizes the emerging neovascular sprout, eventually leading to its regression. In the presence of VEGF, Ang-2 facilitates angiogenesis. The TGF-β1 is a multifunctional cytokine that promotes the maturation cycle of the developing neovascular sprout through ECM stimulation, by stimulating the induction and differentiation of mesenchymal cells into mural ECs46.
The molecular determinants of neovascular maturation can be grouped into three categories: I) growth factor binding to a cell receptor type, and its corresponding effect; II) molecular regulation of cell interactions; III) molecular regulation of the interactions between ECs and ECM.
I) Growth factor binding to a cell receptor type, and its corresponding effect:
a) EC receptors Flt-1 and Flk-1 (VEGF-R1, VEGF-R2): 1) Regulation of proteases in the ECM organization; 2) Generation of temporary ECM, which allows permeability increase; 3) Regulation of PDGF-β, which recruits cells to stabilize the emerging vessel wall; 4) Suppression of apoptosis in emerging vessels; 5) Stabilization of ECs.
b) PDGF-Rβ; Ang-1/TIE-2: 1) Promotion of proliferation, migration and recruitment of mural cells; 2) Stabilization of emerging vessels, which facilitates the interactions between intercellular junctions (EC-EC, EC-ECM); 3) Suppression of apoptosis of ECs.
c) Ang-2/TIE-1: induce apoptosis of ECs, in the absence of VEGF.
d) Ang-1/TIE-1: coordinate vascular polarity.
e) TGF-β1/TGF-βRII:
1) Promote the production of proteases and ECM.
2) Promote the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts.
f) TGF-β1/ALK1: regulate the proliferation and migration of ECs.
g) TGF-β1/ALK5: regulate the maturation of new vessels.
h) TGF-β1/ALK1 and endoglin: promote arterial and venous specialization.
II) Molecular regulation of cell interactions:
a) V-cadherin: binds ECs.
b) N-cadherin: connect the cells of the vascular wall to ECs.
c) Connectins: establish connections between ECs and ECs and mural cells.
III) Molecular regulation of the interactions between ECs and ECM:
a) α5β1, α1β1, α2β1, αvβ3, αvβ5: suppression of EC apoptosis.
b) Proteases: their enzymatic action promotes the production of the ECM, such as cleavage of the collagen XVIII to endostatin, plasminogen, angiotensin and proteases (for example, MMP2 and PEX).
c) Inhibitory proteases: prevent the ECM proteolytic cleavage to stabilize the vessel.
Such data consistently support the hypothesis that Ang-2 and VEGF lead to the formation of neovascular sprouts, while Ang-1 is involved in stabilizing the sprout through the interaction of ECs and mural cells46.
During the angiogenesis process, EC migration and proliferation occur for approximately 24 hours, a period during which proteases play a crucial role46. Proliferation is recorded at the level of ECs and SMCs47.
The process of the vascular lumen formation is a coordinate phase of molecular-cellular adhesion during blood vessel extension. The specific molecules responsible for vessel extension are not well known48.
The receptor of TIE-2 and EC is necessary for the development of blood vessels, as well as for their maintenance and repair. Angiopoietin was identified as a specific ligand for the TIE-2 receptor. As already cited, Ang-1 is an agonist of TIE-2 receptors that promotes EC survival and reduces vascular permeability49.
Unlike Ang-1, Ang-2 has been initially described as an antagonist that blocks TIE-2/Ang-1 and activates TIE-2, which results in EC apoptosis. In the signaling system of ECs, for their survival and migration, TIE-2 is an essential component for the development of embryonic vasculogenesis, as well as for angiogenesis in the adult. Recent studies have identified protein tyrosine phosphatase beta (HPTP-β) as a new specific EC-phosphatase that regulates the Ang-1-TIE-2 signaling of ECs. Thus, the strategies oriented to HPTP-β can benefit Ang-1 signaling, and, thus, improve the formation and maturation of neovessels in the context of therapeutic angiogenesis. In addition, one can conclude that hypoxia increases HPTP-β expression and decreases TIE-2 phosphorylation, shedding new light on the potential role of HPTP-β on angiogenesis. The induction of HPTP-β due to hypoxia can represent an important regulatory mechanism of TIE-2 activation in pathological angiogenesis50.
Briefly, ECs have a selective tyrosine-kinase receptor; TIE-2 and its ligands, Ang-1 and Ang-2, are essential for the maintenance and repair of blood vessels. Ang-1 is an agonist of the activation of TIE-2 receptors. However, Ang-2 is context-dependent, which means, it can be either antagonist or agonist. In the survival of ECs, HPTP-β plays a relevant role modulating Ang-1-TIE-2 signaling.
In the angiogenesis process, VEGF leads to proliferation and migration of ECs. It was initially identified as a vascular permeability factor (VPF). There is plenty of evidence suggesting that angiogenesis is preceded and/or accompanied by increased permeability4.
The mechanisms by which VEGF/VPF increases vascular permeability (VP) remain unknown. Murohara et al51 have identified nitric oxide (NO) in VP regulation, while van der Zee et al52 have identified,
Isner4 has shown the synergic action between NO and prostacyclins produced by the interaction of VEGF/VPF with its receptor Flk-1/KDR/VEGF-R2 as a mediator of the VEGF/VPF-induced vascular permeability, constituting a unique property of VEGF/VPF among the angiogenic cytokines. When the proteases were assessed based on their capacity to increase permeability by the Miles test, VEGF was the only to increase permeability - the mechanism of action, however, is unknown. Nitric oxide has been implicated as a permeability regulator factor, depending on its local concentration4.
There are three different types of vascular permeability:
1) vascular basal membrane permeability (VBMP), present in normal tissues;
2) increased vascular permeability in response to a single and brief exposure to VEGF-A or other agents;
3) chronic increase in vascular permeability, which characterizes pathological angiogenesis.
Finally, VEGF-A varies significantly in different rat strains, and the permeability response, both basal and induced by some factors, is likely to differ in mice with different genetic structures, although systematic investigation still lacks53.
Hypoxia leads to increased signaling through HIF-1transcription.
There are two mechanisms identified in hypoxemia that are linked to angiogenesis or its block: one that promotes proliferation and survival of ECs through the activation of VEGF receptors and eNOS signaling and expression; and another that initiates apoptosis. The results depend on the severity of hypoxia. Moderate hypoxemia mainly promotes proliferation and survival, while severe hypoxemia, close to anaerobic conditions, can cause significant apoptosis.
Similarly to that which occurs with ECs, severe hypoxemia causes apoptosis of SMCs, while moderate hypoxemia increases their proliferation. Induced by hypoxia, the expression of cyclooxygenase (COX)-2 and PDGF-β is important for the receptors of SMCs that stimulate their proliferation. The precise mechanism is unknown, but membrane-type matrix metalloproteinase (MT1-MMP) might act as an accessory molecule of the proteolytic activity associated with the PDGF-β receptor45.
In response to tissue hypoxemia, a large number of monocytes are recruited from the circulation to hypoxic tissues, where they differentiate into macrophages. Several factors and proteins in hypoxic tissues contribute to the recruitment of monocytes as follows: monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1); TNF-a; colony stimulating factor-1 (CSF-1); SDF-1, and VEGF-A. Macrophages promote angiogenesis by stimulating the secretion of MMPs and several angiogenic factors, such as VEGF-A, FGF, interleukin-2, and TNF. In addition, macrophages also secret a short peptide with 39 amino acid residues (PR39), which can easily cross the plasma membrane, enter the cells, and inhibit HIF-α cleavage. That PR39 function can improve the capacity of the resident cells of hypoxic tissue to secret angiogenic factors, because of the increase in the local HIF-1 concentration6.
Finally, macrophages respond to hypoxemia through the production of an oxygen-regulated protein (ORP) by the endoplasmic reticulum and the secretion of VEGF-A by the same endoplasmic reticulum6.
In general, coronary angiogenesis in adults is fundamentally a potent paracrine response of the preexisting capillary network to pathophysiological conditions of ischemia and/or inflammation. Basic research and understanding the mechanisms are required to fill in the knowledge gaps and enable the establishment of effective strategies in the field of coronary angiogenic therapy.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Gabriel Lorier, from IC/FUC.