abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil S5Xv98hc4zkpQShkLKM9qxz 00005 S0066-782X2011001500005 S0066-782X(11)09700605 10.1590/S0066-782X2011005000110 Artigos Originais Associação de níveis plasmáticos de PAI-1 e polimorfismo 4G/5G em pacientes com doença arterial coronariana Lima Luciana Moreira Carvalho Maria das Graças Fonseca Neto Cirilo Pereira Garcia José Carlos Faria Sousa Marinez Oliveira Viçosa Minas Gerais Universidade Federal de Viçosa Departamento de Medicina e Enfermagem Brazil Belo Horizonte Hospital Socor Departamento de Hemodinâmica Brazil Belo Horizonte Minas Gerais Universidade Federal de Minas Gerais Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas Brazil 12 2011 97 6 462 389 09 05 2011 01 02 2011 13 06 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: O polimorfismo 4G/5G do inibidor ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1) pode influenciar a expressão do PAI-1. Níveis plasmáticos elevados de PAI-1 estão associados com Doença Arterial Coronariana (DAC). OBJETIVO: O presente estudo investigou a influência do polimorfismo 4G/5G do PAI-1 nos níveis plasmáticos de PAI-1 e sua associação com DAC avaliada por angiografia coronária. MÉTODOS: Foi avaliada amostra de sangue de 35 indivíduos com artérias coronárias angiograficamente normais, 31 indivíduos apresentando ateromatose leve/moderada, 57 indivíduos apresentando ateromatose grave e 38 indivíduos saudáveis (controles). Em pacientes e controles, o polimorfismo 4G/5G do PAI-1 foi determinado por amplificação da proteína-C reativa utilizando primers específicos de alelo. Os níveis plasmáticos de PAI-1 foram quantificados pelo ensaio ELISA (American Diagnostica). RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos quanto a sexo, idade e índice de massa corporal. Níveis plasmáticos de PAI-1 e frequência do genótipo 4G/4G mostravam-se significativamente maiores no grupo com ateromatose grave em comparação com os outros grupos (p < 0,001). Além disso, os pacientes com genótipo 4G/4G (r = 0,28, p < 0,001) apresentaram níveis plasmáticos de PAI-1 significativamente maiores do que aqueles com o genótipo 5G/5G (r = 0,02, p = 0,4511). Além disso, em um modelo de regressão logística múltipla, ajustado para todas as outras variáveis, o PAI-1 esteve independentemente associado com DAC > 70% (p < 0,001). CONCLUSÃO: O achado mais importante deste estudo foi a associação entre o genótipo 4G/4G, elevados níveis plasmáticos de PAI-1 e estenose coronariana superior a 70% em indivíduos brasileiros. Ainda não foi estabelecido se elevados níveis plasmáticos de PAI-1 são um fator decisivo para o agravamento da aterosclerose ou se são uma consequência.

 Inibidor 1 de ativador de plasminogênio polimorfismo genético doença das coronárias 21 10 2011

Luciana Moreira LimaI,II; Maria das Graças CarvalhoII; Cirilo Pereira Fonseca NetoIII; José Carlos Faria GarciaIII; Marinez Oliveira SousaII

IDepartamento de Medicina e Enfermagem - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

IIDepartamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil

IIIDepartamento de Hemodinâmica - Hospital Socor, Belo Horizonte, MG, Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: O polimorfismo 4G/5G do inibidor ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1) pode influenciar a expressão do PAI-1. Níveis plasmáticos elevados de PAI-1 estão associados com Doença Arterial Coronariana (DAC).

OBJETIVO: O presente estudo investigou a influência do polimorfismo 4G/5G do PAI-1 nos níveis plasmáticos de PAI-1 e sua associação com DAC avaliada por angiografia coronária.

MÉTODOS: Foi avaliada amostra de sangue de 35 indivíduos com artérias coronárias angiograficamente normais, 31 indivíduos apresentando ateromatose leve/moderada, 57 indivíduos apresentando ateromatose grave e 38 indivíduos saudáveis (controles). Em pacientes e controles, o polimorfismo 4G/5G do PAI-1 foi determinado por amplificação da proteína-C reativa utilizando primers específicos de alelo. Os níveis plasmáticos de PAI-1 foram quantificados pelo ensaio ELISA (American Diagnostica).

RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos quanto a sexo, idade e índice de massa corporal. Níveis plasmáticos de PAI-1 e frequência do genótipo 4G/4G mostravam-se significativamente maiores no grupo com ateromatose grave em comparação com os outros grupos (p < 0,001). Além disso, os pacientes com genótipo 4G/4G (r = 0,28, p < 0,001) apresentaram níveis plasmáticos de PAI-1 significativamente maiores do que aqueles com o genótipo 5G/5G (r = 0,02, p = 0,4511). Além disso, em um modelo de regressão logística múltipla, ajustado para todas as outras variáveis, o PAI-1 esteve independentemente associado com DAC > 70% (p < 0,001).

CONCLUSÃO: O achado mais importante deste estudo foi a associação entre o genótipo 4G/4G, elevados níveis plasmáticos de PAI-1 e estenose coronariana superior a 70% em indivíduos brasileiros. Ainda não foi estabelecido se elevados níveis plasmáticos de PAI-1 são um fator decisivo para o agravamento da aterosclerose ou se são uma consequência.

Palavras-chave: Inibidor 1 de ativador de plasminogênio/genética, polimorfismo genético, doença das coronárias.

Introdução

O principal inibidor da fibrinólise é o inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1), que é o inibidor primário do ativador fisiológico do plasminogênio (t-PA). Níveis plasmáticos elevados de PAI-1 foram relatados em pacientes sobreviventes de Infarto do Miocárdio (IM) em comparação com a população em geral, e esse aumento está correlacionado com a recorrência de IM1,2. Disfunção fibrinolítica tem estado associada a Doença Arterial Coronariana (DAC) e IM.

A inserção ou exclusão de um nucleotídeo na região promotora do gene PAI-1 (-675 4G/5G) foi identificada em 675 pares de bases antes do início da transcrição3. Indivíduos homozigotos para a deleção de 4G/4G possuem elevados níveis plasmáticos de PAI-1, portadores de 5G/5G possuem níveis reduzidos, e indivíduos heterozigotos 4G/5G possuem níveis intermediários4,5. A incapacidade de ligar uma proteína transcricional repressora esteve associado com o alelo 4G, resultando em maior expressão de PAI-1 mRNA e maior nível de circulação de PAI-16. Níveis plasmáticos de PAI-1 podem ser influenciados por idade, sexo, obesidade, hipertensão, tabagismo, hipercolesterolemia e polimorfismos genéticos, incluindo polimorfismo -675 4G/5G6,7. Níveis plasmáticos elevados de PAI-1 podem prejudicar o sistema fibrinolítico e promover a sobrevivência do coágulo de fibrina. Portanto, a genotipagem desse polimorfismo pode ser relevante para avaliar o desempenho do sistema fibrinolítico em pacientes com diagnóstico estabelecido de DAC.

Existem dados limitados e controversos em relação ao impacto do polimorfismo 4G/5G do gene do PAI-1 na extensão da DAC. Esse polimorfismo está envolvido na CAD, com o maior risco em homozigotos 4G/4G em algumas populações8, mas não em outras9. O papel do polimorfismo PAI-1 em pacientes brasileiros que sofrem de DAC não foi estabelecido até o momento. A frequência de distribuição do gene PAI-1 foi estudada para testar a hipótese de que o genótipo 4G/4G favorece a gravidade da DAC em indivíduos submetidos à angiografia coronariana

Métodos

Indivíduos e desenho do estudo

A aprovação para o estudo foi concedida pelo Hospital Socor e o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes, e os detalhes clínicos relevantes para cada indivíduo foram registrados. Entre esses detalhes, destacam-se dados pessoais e demográficos, histórico familiar, fatores de risco e resultados de angiografia coronária que foram inicialmente registrados por três cardiologistas independentes (tab. 1). Um total de 123 indivíduos do sexo masculino e feminino presentes na clínica de angiografia coronária do Departamento de Hemodinâmica do Hospital Socor de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil, com idade entre 42 a 69 anos, foram estudados. Com base nos resultados da angiografia coronariana, os participantes foram classificados em três grupos: artérias angiograficamente normais (n = 35), ateromatose leve/moderada (n = 31) e ateromatose grave (n = 57). O grupo com ateromatose grave também foi subdividido de acordo com o número de artérias afetadas em ateromatose grave em um vaso (SA-1, n = 16), dois vasos (SA-2, n = 13) e três ou mais vasos sanguíneos afetados (SA -3, n = 28). Todos os pacientes tinham histórico de angina estável. No entanto, nenhum dos pacientes tinha tido infarto do miocárdio recente ou angina instável (pelo menos nos últimos três meses), insuficiência cardíaca congestiva, distúrbios de coagulação, problemas renais, doença hepática ou autoimune ou câncer, ou estavam em tratamento com warfarin ou em terapia de modificação lipídica. No mesmo período, 38 indivíduos saudáveis foram selecionados a partir da comunidade em geral (grupo controle), com idade média e Índice de Massa Corpórea (IMC) semelhante à média dos três grupos de pacientes. No entanto, este estudo não tinha a intenção de desenvolver um estudo do tipo caso-controle.

Angiografia

A angiografia coronariana foi realizada pela via percutânea transfemoral. As imagens foram gravadas digitalmente e todas as angiografias foram analisadas por três cardiologistas experientes que não tinham conhecimento dos detalhes clínicos dos pacientes. Apenas os pacientes que tiveram três resultados idênticos foram selecionados. A extensão e a progressão da DAC angiograficamente documentada foram classificadas da seguinte forma:

1. Artérias coronárias normais (sem estenose angiográfica)

2. Leve (até 30% de estenose do diâmetro luminal em uma ou mais artérias coronárias)

3. Moderada (de 30% a 70% de estenose do diâmetro luminal em uma ou mais artérias coronárias)

4. Grave (estenose maior que 70% do diâmetro luminal em uma ou mais artérias coronárias)

Coleta de amostras e determinações laboratoriais

Amostras de sangue venoso periférico foram coletadas em jejum de cada participante antes da angiografia. Quatro mL e meio de sangue foram coletados em tubos vacutainer contendo 3,8% de citrato trissódico anticoagulante (Becton-Dickinson) utilizando uma agulha calibre 21. Além disso, 5 mL foram coletados em um tubo sem anticoagulante e 5 mL com EDTA. As amostras foram imediatamente centrifugadas por 15 minutos a 1.100 g. O plasma e o soro foram imediatamente isolados e as alíquotas foram armazenadas a -70 ºC para a análise dos lotes. As amostras de sangue com EDTA foram submetidas à extração do DNA genômico utilizando o sistema de purificação de Wizard (Promega, Inc.). A dosagem do PAI-1 foi realizada utilizando alíquotas de plasma com o kit de diagnóstico IMUBIND® Plasma PAI-1 ELISA (American Diagnostica® Inc. - USA) de acordo com as instruções do fabricante.

O polimorfismo 4G/5G foi determinado utilizando a reação em cadeira da polimerase (PCR) alelo-específica, como já descrito2. As reações de PCR foram realizadas em um termociclador PCR PT100 (MJ Research, Waltham, EUA) usando 1 pMol de cada primer (Invitrogen®, São Paulo, SP), 0,2 mM de dNTPs (GIBCO BRL®, São Paulo, SP), e 1 unidade de Taq polimerase (Phoneutria®-Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil). As reações de PCR foram submetidas a 15 ciclos constituídos por 1 min a 95 ºC para desnaturação, 1 minuto a 59 ºC para o anelamento do primer e 1 min a 72 ºC para a extensão do primer, precedida por uma etapa inicial de desnaturação a 95 ºC por 5 minutos, seguidos de 20 ciclos com anelamento a 52 ºC e terminando com um espaçamento de 72 ºC por 5 minutos. DNAs de indivíduos previamente analisados foram incluídos em cada amostra a fim de controlar a atividade enzimática. As amostras foram então analisadas por eletroforese em gel de acrilamida em banho de prata.

Considerações estatísticas

Os dados foram analisados pelo software Sigma Stat versão 1.0 utilizando-se ANOVA de um fator ou Kruskal-Wallis em classificações seguidas pelo teste de Tukey. Variáveis categóricas (fatores de risco e polimorfismo 4G/5G) foram analisadas usando o teste do qui-quadrado. O teste de Spearman foi utilizado para a correlação entre o estado de polimorfismo (variável categórica) e PAI-1 plasmático (variável contínua) e entre DAC (variável categórica) e PAI-1 (variável contínua). Utilizou-se o teste goodness-of-fit X2 para confirmar se as frequências genotípicas observadas eram consistentes com as esperados sob a hipótese de Hardy-Weinberg. Além disso, utilizou-se a regressão logística múltipla, pois as variáveis não podem ser consideradas independentes.

Nesse modelo, DAC > 70% foi considerada como variável dependente. O tamanho da amostra foi calculada considerando os valores médios obtidos e os desvios-padrão para PAI-1 com base em um estudo piloto que incluiu 50 amostras. O nível de erro alfa ou nível de confiança foi de 5% correspondente a um intervalo de confiança de 95%. O nível de erro beta ou poder estatístico [1 - beta] foi de 20%. A potência estatística calculada (erro tipo II ou beta), com nível de erro alfa de 5% foi de 97,3%. Assim, um tamanho mínimo de uma amostra satisfatória para avaliar níveis plasmáticos poderia ser de 15 indivíduos em cada grupo. Tendo em vista que o grupo com ateromatose grave foi subdividido, o tamanho mínimo da amostra foi definida de acordo com o coeficiente de variação descrito anteriormente na literatura, considerando-se uma variação de dez por cento para um número médio e um número mínimo de onze indivíduos por grupo. Foram encontradas diferenças estatísticas com 5% de nível de significância. Para os genótipos do polimorfismo 4G5G do PAI-1, considerando a variação observada do alelo e frequências genotípicas de diferentes estudos, o tamanho da amostra calculada foi de um mínimo de 29 indivíduos em cada grupo com um nível de erro alfa de 5%, intervalo de confiança de 95% e poder estatístico de 80% (1-beta).

Resultados

A caracterização dos grupos, incluindo sexo e idade, bem como os fatores de risco associados com a aterosclerose, número de indivíduos e percentual de cada variável são apresentados na tabela 1. Os quatro grupos estudados apresentaram homogeneidade em relação a idade, sexo e índice de massa corpórea. Observou-se uma diferença significativa o parâmetro tabagismo para o grupo com ateromatose grave em comparação com o grupo angiograficamente normal (p = 0,02). Com relação a um estilo de vida sedentário, os grupos com ateromatose leve/moderada e grave mostraram-se significativamente diferentes do grupo controle e angiograficamente normal (p < 0,05). Parâmetros do perfil lipídico convencional também são apresentados na tabela 1 como médias e desvios-padrão. Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para colesterol total, HDL e LDL. Apenas os níveis de triglicerídeos foram significativamente menores no grupo controle em comparação com os outros.

Os resultados dos níveis plasmáticos do PAI-1 e polimorfismo 4G/5G são apresentados na tabela 2. Os níveis plasmáticos do PAI-1 mostraram-se significativamente maiores no grupo com ateromatose grave do que nos demais (p < 0,001). O grupo com ateromatose grave também parece ter maior frequência de genótipo 4G/4G e menor frequência de 4G/5G em comparação com os outros grupos. Nenhuma diferença significativa foi observada no genótipo 5G/5G entre os grupos. Nenhum desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado. Quando o grupo com ateromatose grave foi subdividido, os participantes com um vaso sanguíneo afetado apresentou maiores níveis de PAI-1, em comparação com dois e três vasos sanguíneos afetados (fig. 1).

A regressão linear mostrou que o PAI-1 pode ser previsto a partir de uma combinação linear de DAC (r = 0,47, p < 0,0001). De fato, uma vez que esses resultados foram analisados usando um modelo de regressão logística binária, ajustado para todas as outras variáveis , o PAI-1 parece estar independentemente associado com DAC > 70% (p < 0,001). Essa observação foi confirmada pela razão de chances obtida para o PAI-1 (2,358, 95%, IC = 1,085-9,432, p < 0,001). Além disso, os níveis plasmáticos de PAI-1 mostraram uma associação positiva e significativa com o genótipo 4G/4G (r = 0,28, p < 0,001).

Discussão

Vários autores têm demonstrado a associação de elevados níveis de PAI-1 com a presença de DAC. Esses resultados corroboram o conceito da contribuição de fibrina intravascular na aterotrombogênese10. A diminuição da atividade fibrinolítica, causada principalmente pelo aumento da concentração plasmática do PAI-1, tem estado associada com a DAC em diversos estudos11. Neste estudo, os níveis plasmáticos de PAI-1 mostraram-se significativamente maiores no grupo com ateromatose grave em comparação com os outros grupos (tab. 2). As médias obtidas para os subgrupos SA-1, SA-2 e SA-3 também foram significativamente elevadas em relação ao grupo controle e o grupo angiograficamente normal (fig. 1). Esses dados mostram uma associação entre a concentração plasmática de PAI-1 e a gravidade da DAC, considerando uma estenose com porcentagem maior que 70%, independentemente do número de artérias afetadas. Após o ajuste para fatores de risco e outras variáveis, os resultados da análise multivariada podem ser inferidos sobre uma associação independente entre os níveis plasmáticos do PAI-1 e a presença de estenose da artéria coronariana superior a 70% (p < 0,001). O subgrupo SA-1 também mostrou diferença significativa em comparação com o grupo com ateromatose leve/ moderada (p = 0,004, fig. 1).

Outro achado do presente estudo foi a associação entre o genótipo 4G/4G, aumento dos níveis plasmáticos de PAI- 1 (r = 0,28, p < 0,001) e estenose da artéria coronária com obstrução superior a 70%, sugerindo que a presença do alelo 4G pode ter influenciado o aumento dos níveis plasmáticos de PAI-1, e que esse aumento pode ter afetado o sistema fibrinolítico, sendo assim um fator decisivo para a progressão da aterosclerose nos indivíduos avaliados. Estudos anteriores haviam demonstrado a associação entre o alelo 4G, alta concentração de PAI-1 e DAC12-16. Embora essa associação possa ser uma correlação promissora, não pode ser demonstrada em todas as populações17-19. Este é o primeiro estudo a demonstrar essa correlação na população brasileira. Os níveis plasmáticos de PAI-1 podem ser influenciados por diversos fatores20, dentre os quais fatores genéticos. Hong e cols.21 mostraram que 42% das variações encontradas nos níveis plasmáticos de PAI-1 se deram por fatores genéticos, em um estudo envolvendo a população sueca. Naram e cols.11, examinando a população sul-africana, observaram que níveis plasmáticos inferiores de PAI-1 foram obtidos entre a população negra em comparação com caucasianos. Os autores concluíram que a principal razão para a detecção de baixos níveis de PAI- 1 em indivíduos negros foi a baixa prevalência do alelo 4G nesse grupo de indivíduos. Embora a etnia influencie os níveis plasmáticos de PAI-1, este estudo não mostrou diferenças significativas nos níveis PAI-1 para os diferentes grupos étnicos. O desenho do estudo poderia justificar tal achado porque o grupo estudado neste trabalho (n = 161) foi composto de 30,9% de caucasianos, 26,8% de negros e 42,3% de mestiços, porém uniformemente distribuídos em três grupos, mostrando diferenças estatisticamente significativas entre eles para as diferentes etnias. A frequência de alelos 4G e 5G descritos para a população brasileira, que apresenta uma variedade de grupos étnicos, ainda não foi completamente estabelecida na literatura. Neste estudo, 51% dos participantes (n = 161) tinham alelo 4G, enquanto 49% tinham o alelo 5G.

Se o aumento nos níveis plasmáticos de PAI-1 é um fator decisivo para o agravamento da aterosclerose ou seus níveis mais elevados são uma consequência dessa lesão ainda está para ser esclarecido. O PAI-1 foi estudado em diferentes contextos com fisiopatologia trombótica. O PAI-1 também desempenha um papel importante na transdução de sinal, adesão celular e migração1. Em casos de artérias comprometidas, há uma população heterogênea de células que podem estar sintetizando o PAI-117. Essas observações sugerem que O PAI-1 pode estar envolvido na DAC como resultado da inicialização e progressão da ateromatose com maior acúmulo de fibrina, seja por efeito de fibrinólise diminuída ou por meio do aumento da resposta da síntese via realimentação.

Conclusão

O achado mais importante deste estudo foi a associação entre o genótipo 4G/4G, elevados níveis plasmáticos de PAI-1 e estenose coronariana superior a 70% em indivíduos brasileiros. A relação observada com ateromatose grave mostrou-se independente do tabagismo, hipertensão arterial, sedentarismo, histórico familiar e perfil lipídico. Esses dados apóiam a hipótese de que o PAI-1 desempenha um papel na patogênese da aterosclerose ou na sua principal manifestação clínica, a DAC. Ainda não foi estabelecido se elevados níveis plasmáticos de PAI-1 são um fator decisivo para o agravamento da aterosclerose ou se são uma consequência.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq, CAPES e FAPEMIG.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Luciana Moreira Lima pela Universidade Federal de Minas Gerais.

Luciana Moreira Lima

Av. PH Rolfs, s/n, Centro

36570-000 - Viçosa, MG, Brasil

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Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) 4G/5G polymorphism, coronary thrombosis, and myocardial infarction in middle-aged Finnish men who died suddenly Thromb Haemost 2000 78 82 1 84 Mikkelsson J Perola M Wartiovaara U Peltonen L Palotie A Penttila A 17. Anderson JL, Muhlestein JB, Habashi J, Carlquist JF, Bair TL, Elmer SP, et al. Lack of association of a common polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1 gene with coronary artery disease and myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 1999;34(6):1778-83. Lack of association of a common polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1 gene with coronary artery disease and myocardial infarction J Am Coll Cardiol 1999 1778 83 6 34 Anderson JL Muhlestein JB Habashi J Carlquist JF Bair TL Elmer SP 18. Mulligan-Kehoe MJ, Schwartz GN. The functions of plasminogen activator inhibitor-1: Do we have all the pieces of PAI? Thromb Res. 2006;117(5):483- 6. 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Triglyceride concentration and waist circumference influence alcohol-related plasminogen activator inhibitor-1 activity increase in black South Africans Blood Coagul Fibrinolysis 2010 736 43 8 21 Pieters M de Lange Z Hoekstra T Ellis SM Kruger A 21. Hong Y, Pedersen NL, Egberg N, de Faire U. Moderate genetic influences on plasma levels of plasminogen activator inhibitor-1 and evidence of genetic and environmental influences shared by plasminogen activator inhibitor-1, triglycerides, and body mass index. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997;17(11):2776-82. Moderate genetic influences on plasma levels of plasminogen activator inhibitor-1 and evidence of genetic and environmental influences shared by plasminogen activator inhibitor-1, triglycerides, and body mass index Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997 2776 82 11 17 Hong Y Pedersen NL Egberg N de Faire U Original Articles PAI-1 4G/5G polymorphism and plasma levels association in patients with coronary artery disease

BACKGROUND: Type-1 plasminogen activator inhibitor (PAI-1) 4G/5G polymorphism may influence the PAI-1 expression. High plasma levels of PAI-1 are associated with coronary artery disease (CAD). OBJECTIVE: This study investigated the influence of PAI-1 4G/5G polymorphism on plasma PAI-1 levels and its association with CAD assessed by coronary angiography. METHODS: Blood sample of 35 individuals with angiographycally normal coronary arteries, 31 individuals presenting mild/moderate atheromatosis, 57 individuals presenting severe atheromatosis and 38 healthy individuals (controls) were evaluated. In patients and controls, the PAI-1 4G/5G polymorphism was determined by PCR amplification using allele-specific primers. Plasma PAI-1 levels were quantified by ELISA assay (American Diagnostica). RESULTS: No difference was found between groups regarding age, gender and body mass index. Plasma PAI-1 levels and 4G/4G genotype frequency were significantly higher in the severe atheromatosis group compared to the other groups (p<0.001). Furthermore, patients with 4G/4G genotype (r=0.28, p<0.001) had significantly higher plasma PAI-1 levels than those with 5G/5G genotype (r=0.02, p=0.4511). In addition, in a multiple logistic regression model, adjusted for all the other variables, PAI-1 was observed to be independently associated with CAD > 70% (p<0.001). CONCLUSION: The most important finding of this study was the association between 4G/4G genotype, high plasma PAI-1 levels and coronary stenosis higher than 70% in Brazilian individuals. Whether high plasma PAI-1 levels are a decisive factor for atherosclerosis worsening or it is a consequence remains to be established.

 Plasminogen activator inhibitor 1 polymorphism, genetic coronary disease

Luciana Moreira LimaI,II; Maria das Graças CarvalhoII; Cirilo Pereira Fonseca NetoIII; José Carlos Faria GarciaIII; Marinez Oliveira SousaII

IDepartamento de Medicina e Enfermagem - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

IIDepartamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil

IIIDepartamento de Hemodinâmica - Hospital Socor, Belo Horizonte, MG, Brasil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Type-1 plasminogen activator inhibitor (PAI-1) 4G/5G polymorphism may influence the PAI-1 expression. High plasma levels of PAI-1 are associated with coronary artery disease (CAD).

OBJECTIVE: This study investigated the influence of PAI-1 4G/5G polymorphism on plasma PAI-1 levels and its association with CAD assessed by coronary angiography. METHODS: Blood sample of 35 individuals with angiographycally normal coronary arteries, 31 individuals presenting mild/moderate atheromatosis, 57 individuals presenting severe atheromatosis and 38 healthy individuals (controls) were evaluated. In patients and controls, the PAI-1 4G/5G polymorphism was determined by PCR amplification using allele-specific primers. Plasma PAI-1 levels were quantified by ELISA assay (American Diagnostica).

RESULTS: No difference was found between groups regarding age, gender and body mass index. Plasma PAI-1 levels and 4G/4G genotype frequency were significantly higher in the severe atheromatosis group compared to the other groups (p<0.001). Furthermore, patients with 4G/4G genotype (r=0.28, p<0.001) had significantly higher plasma PAI-1 levels than those with 5G/5G genotype (r=0.02, p=0.4511). In addition, in a multiple logistic regression model, adjusted for all the other variables, PAI-1 was observed to be independently associated with CAD > 70% (p<0.001).

CONCLUSION: The most important finding of this study was the association between 4G/4G genotype, high plasma PAI-1 levels and coronary stenosis higher than 70% in Brazilian individuals. Whether high plasma PAI-1 levels are a decisive factor for atherosclerosis worsening or it is a consequence remains to be established.

Keywords: Plasminogen activator inhibitor 1/genetics; polymorphism, genetic; coronary disease.

Introduction

The main inhibitor of fibrinolysis is the type-1 plasminogen activator inhibitor (PAI-1), which is the primary inhibitor of the physiological plasminogen activator (t-PA). Increased plasma PAI-1 levels have been reported in survivors of myocardial infarction (MI) compared with the general population, and this increase is correlated with the recurrence of MI1,2. Impaired fibrinolytic function has been associated with coronary artery disease (CAD) and MI.

The insertion or deletion of a nucleotide in the promoter region of the PAI-1 gene (-675 4G/5G) was identified in 675 base pairs before the onset of the transcript3. Homozygous individuals for the 4G/4G deletion have high plasma PAI-1 levels, carriers of 5G/5G have reduced levels, and 4G/5G heterozygous individuals have intermediate levels4,5. The inability to bind a transcriptional repressor protein has been associated with the 4G allele, resulting in higher PAI-1 mRNA expression and higher circulating PAI-1 levels6.

Plasma PAI-1 levels may be influenced by age, sex, obesity, hypertension, smoking, hypercholesterolemia, and genetic polymorphisms, including polymorphism -675 4G/5G6,7. Increased plasma PAI-1 levels may undermine the fibrinolytic system and promote the survival of the fibrin clot. Therefore, the genotyping of this polymorphism could be relevant to assess the performance of the fibrinolytic system in patients with established diagnosis of CAD.

There are limited and controversial data regarding the impact of 4G/5G polymorphism of the PAI-1 gene in the extent of CAD. This polymorphism is involved in CAD, with the highest risk in 4G/4G homozygotes in some populations8, but not in others9. The role of PAI-1 polymorphism in Brazilian patients suffering from CAD has not been established so far. The distribution frequency of the PAI-1 gene was studied to test the hypothesis that the 4G/4G genotype favors the CAD severity in individuals submitted to coronary angiography.

Methods

Individuals and study design

The approval for the study was granted by the Hospital Socor and Ethical Research Committee of the Universidade Federal de Minas Gerais. Informed consent was obtained from all participants, and the relevant clinical details for each individual were recorded. These details included personal and demographic data, family history, risk factors and coronary angiographic results that were initially recorded by three independent cardiologists (Table 1). A total of 123 male and female individuals attending the coronary angiography clinic in the Hemodynamic Department of Hospital Socor of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, with ages ranging from 42 to 69 years, were studied. Based on coronary angiography results, the participants were classified into three groups: angiographically normal arteries (n = 35), mild/moderate atheromatosis (n = 31) and severe atheromatosis (n = 57). The severe atheromatosis group was also subdivided according to the number of affected arteries into severe atheromatosis in one vessel (SA-1, n = 16), two vessels (SA-2, n = 13) and three or more affected blood vessels (SA-3, n = 28). All patients had a history of stable angina. However, none had a recent myocardial infarction or unstable angina (at least within the last three months), congestive heart failure, coagulation disorders, renal problems, hepatic or auto-immune diseases or cancer or were on warfarin treatment or undergoing lipid-modifying therapy. In the same period, 38 healthy individuals were selected from the community in general (control group), with mean age and body mass index (BMI) similar to the average of three groups of patients. However, this study was not intended to develop a case-control study type.

Angiography

Coronary angiography was performed via percutaneous transfemoral approach. The images were digitally recorded and all angiograms were analyzed by three experienced cardiologists who were not aware of the patients' clinical details. Only patients who had three identical awards were selected. The extent and the progression of angiographically documented CAD were classified as follows:

1. Normal coronary arteries (No angiographic stenosis)

2. Mild (Up to 30% stenosis of the luminal diameter in one or more coronary arteries)

3. Moderate (30 to 70% stenosis of the luminal diameter in one or more coronary arteries)

4. Severe (Greater than 70% stenosis of the luminal diameter in one or more coronary arteries)

Sample collection and laboratory determinations

Fasting peripheral venous blood samples were collected from each participant prior to angiography. Four and a half mL of blood was collected into vacutainer tubes containing 3.8% trisodium citrate anticoagulant (Becton-Dickinson) using a 21-gauge needle. Additionally, 5mL was collected in a tube without anticoagulant and 5mL with EDTA. Samples were immediately centrifuged for 15 minutes at 1100g. Plasma and serum were immediately isolated and aliquots were stored at -70ºC for batch-wise analysis. The EDTA blood samples were submitted to genomic DNA extraction using the Wizard purification system (Promega, Inc.). The PAI-1 dosage was performed using plasma aliquots with the IMUBIND® Plasma PAI-1 ELISA (American Diagnostica® Inc. - USA) kit diagnostics according to instructions from manufacturer.

The 4G/5G polymorphism was determined using allele-specific polymerase chain reaction (PCR), as previously described2. PCR reactions were performed in a PT100 PCR thermocycler (MJ Research, Waltham, USA) using 1 pMol of each primer (Invitrogen®, São Paulo, SP), 0.2 mM of dNTPs (GIBCO BRL®, São Paulo, SP), and 1 unit of Taq polimerase (Phoneutria®-Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil). PCR reactions were submitted to 15 cycles consisting of 1 min at 95ºC for denaturing, 1 min at 59ºC for primer annealing and 1 min at 72ºC for primer extension, preceded by an initial step of the desnaturing at 95ºC for 5 minutes, followed by 20 cycles with girdling at 52ºC and finishing with a pitch of 72ºC for 5 minutes. DNAs from previously typed individuals were included in each sample set in order to control enzyme activity. Samples were then analyzed by silver stained acrylamide gel electrophoresis.

Statistical considerations

Data were analyzed by a Sigma Stat version 1.0 software system using one-way ANOVA or Kruskal-Wallis one-way ANOVA on ranks followed by the Tukey test. Categorical variables (risk factors and 4G/5G polymorphism) were analyzed using the Chi-square test. Spearman's test was used for correlation between polymorphism status (categorical variable) and plasma PAI-1 (continuous variable) and between CAD (categorical variable) and PAI-1 (continuous variable). An X2 goodness-of-fit test was used to confirm whether the observed genotype frequencies agreed with those expected under the hypothesis of Hardy-Weinberg. In addition, multiple logistic regression was performed since the variables cannot be considered independent. In this model, CAD > 70% was considered as a dependent variable. The sample size was calculated considering the average values measured and standard deviations for PAI-1 based on a pilot study that included 50 samples. The alpha error level or confidence level was 5% corresponding to a 95% Confidence Interval. The beta error level or statistical power [1 - beta] was 20%. A calculated statistical power (type II or beta error), with alpha error level 5% was 97.3%. Accordingly, a minimum satisfactory sample size for plasma levels could be 15 individuals in each group. Since the severe atheromatosis group was subdivided, the minimum sample size was defined using the coefficient of variation previously described in the literature, considering a ten percent variation for the average and a minimum number of eleven individuals per group. Statistical differences with 5% of significance level were found. For genotypes of PAI-1 4G5G polymorphism, considering the variation observed of the allele and genotype frequencies from different studies, the sample size calculated was a minimum of 29 individuals in each group with an alpha error level of 5%, 95% confidence interval and 80% of statistical power (1-beta).

Results

The characterization of groups, including sex and age, as well as the risk factors associated with atherosclerosis, number of individuals and percentage of each variable are shown in Table 1. The four groups studied presented homogeneity with respect to age, sex and body mass index. A significant difference was observed for the smoking parameter for the severe atheromatosis group compared to the angiographycally normal group (p = 0.02). Regarding a sedentary lifestyle, mild/moderate and severe atheromatosis groups were significantly different from the control and angiographycally normal group (p < 0.05). Conventional lipid profile parameters are also presented in Table 1 as the means and standard deviations. No significant differences were found between groups for total cholesterol, HDL and LDL. Only triglyceride levels were significantly lower in the control group compared to the others.

The results for plasma PAI-1 and 4G/5G polymorphism are shown in Table 2. The plasma PAI-1 levels were significantly higher in the severe atheromatosis group than in the others (p<0.001). The severe atheromatosis group also appear to have higher frequency of 4G/4G genotype and lower frequency of 4G/5G compared to the other groups. No significant difference was seen in the 5G/5G genotype between groups. No deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium was observed. When the severe atheromatosis group was subdivided, participants with one affected blood vessel presented higher PAI-1 levels compared with two and three affected blood vessels (Figure 1).

A linear regression showed that PAI-1 can be predicted from a linear combination of CAD (r = 0.47; p < 0.0001). Indeed, since these results were analyzed by using a binary logistic regression model, adjusted for all the other variables, PAI-1 seems to be independently associated with CAD > 70% (p < 0.001). This observation was confirmed by the odds ratio obtained for PAI-1 (2.358; 95%; CI = 1.085 - 9.432; p < 0.001). In addition, plasma PAI-1 levels showed a positive and significant association with 4G/4G genotype (r = 0.28, p < 0.001).

Discussion

Several authors have demonstrated the association of high PAI-1 levels with the presence of CAD. These results support the concept of the contribution of fibrin in intravascular atherothrombogenesis10. Decreased fibrinolytic activity, mainly caused by the increase in plasma PAI-1concentration, has been associated with CAD in several studies11. In this study, plasma PAI-1 levels were significantly higher in the severe atheromatosis group compared to the other groups (Table 2). The averages obtained for SA-1, SA-2, and SA-3 subgroups were also significantly high compared to the control and angiographycally normal group (Figure 1). These data show an association between the plasma PAI-1 concentration and CAD severity, considering the percentage of stenosis of more than 70%, regardless of the number of affected arteries. After adjusting for risk factors and other variables, the results of the multivariate analysis be inferred about an independent association between plasma PAI-1 levels and the presence of coronary artery stenosis greater than 70% (p < 0.001). The SA-1 subgroup also showed significant difference compared to the mild/moderate atheromatosis group (p = 0.004, Figure 1).

Another finding of this study was the association between 4G/4G genotype, increased plasma PAI-1 levels (r = 0.28, p < 0.001) and coronary artery stenosis with obstruction greater than 70%, suggesting that the presence of 4G allele may have influenced the increase in plasma PAI-1 levels, and that this increase may have affected the fibrinolytic system, being thus a decisive factor for the progression of atherosclerosis in the individuals evaluated. Previous studies had demonstrated the association between 4G allele, high PAI-1 concentrations and CAD12-16. Although this may be a promising correlation, it may not be demonstrated in all populations17-19. This is the first study to demonstrate this correlation in the Brazilian population. Plasma PAI-1 levels may be influenced by several factors20, among which genetic factors. Hong et al21 showed that 42% of the variations found in plasma PAI-1 levels were due to genetic factors, in a study involving the Swedish population. Naram et al11, examining the South African population, observed that lower plasma PAI-1 levels were obtained for the black population compared with Caucasians. The authors concluded that the main reason for the detection of lower PAI-1 levels in black individuals was the low prevalence of 4G allele in this group of individuals. Although ethnicity influences plasma PAI-1 levels, this study showed no significant difference in PAI-1 levels for the different ethnic groups. The study design could justify such finding, because the group studied in this work (n=161) was composed of 30.9% of Caucasians, 26.8% of blacks and 42.3% of mestizos, but uniformly distributed in the three groups, showing no statistically significant differences between them for different ethnicities. The frequency of 4G and 5G alleles described for the Brazilian population, which presents a variety of ethnic groups, has not yet been fully established in literature. In this study, 51% of participants (n= 161) had 4G allele, while 49% had 5G allele.

Whether an increase in plasma PAI-1 levels is a decisive factor for worsening of atherosclerosis or its increased levels are a consequence of this injury still remains to be clarified. PAI-1 has been studied in different settings with thrombotic pathophysiology. PAI-1 also plays an important role in signal transduction, cell adherence, and migration1. In a diseased artery environment there is a heterogeneous population of cells, all of which may be synthesizing PAI-117. These observations suggest that PAI-1 may be involved in CAD as a result of the initialization and progression of atheromatosis with enhanced fibrin accumulation, either by a fibrinolysis impaired effect or by enhancing the feedback synthesis response.

Conclusion

The most important finding of this study was the association between 4G/4G genotype, high plasma PAI-1 levels and coronary stenosis higher than 70% in Brazilian individuals. The relationship observed with severe atheromatosis was irrespective of smoking, arterial hypertension, sedentary lifestyle, family history and lipid profile. These data support the hypothesis that PAI-1 plays a role in the pathogenesis of atherosclerosis or its major clinical manifestation, CAD. Whether high plasma PAI-1 levels are a decisive factor for atherosclerosis worsening or it is a consequence of it, remains to be established.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was partially funded by CNPq, CAPES and FAPEMIG.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Luciana Moreira Lima, from Universidade Federal de Minas Gerais.

References