FUNDAMENTO: A injeção de células-tronco no contexto do infarto agudo do miocárdio (IAM) tem sido testada quase exclusivamente pela via anterógrada intra-arterial coronariana (IAC). A via retrógrada intravenosa coronariana (IVC) pode ser uma via adicional. OBJETIVO: Comparar o padrão de distribuição e retenção celular nas vias anterógrada e retrógrada. Investigar o papel da obstrução microvascular pela ressonância magnética na retenção de células pelo tecido cardíaco após a injeção de células mononucleares da medula óssea (CMMO) no IAM. MÉTODOS: Estudo prospectivo, aberto, randomizado. Foram incluídos pacientes com IAM que apresentassem: (1) reperfusão mecânica ou química com sucesso em até 24 horas do início dos sintomas e (2) infarto acometendo mais de 10% da área do ventrículo esquerdo (VE) pela cintilografia miocárdica. Cem milhões de CMMO foram injetadas na artéria relacionada ao infarto pela via IAC ou veia, pela via IVC. Um por cento das células injetadas foi marcado com Tc99m-hexametil-propileno-amina-oxima(99mTc-HMPAO). A distribuição das células foi avaliada 4 e 24 horas após a injeção da cintilografia miocárdica. Ressonância magnética cardíaca foi realizada antes da injeção de células. RESULTADOS: Trinta pacientes foram distribuídos aleatoriamente em três grupos. Não houve eventos adversos graves relacionados ao procedimento. A retenção precoce e tardia das células marcadas foi maior no grupo IAC do que no grupo IVC, independentemente da presença de obstrução da microcirculação. CONCLUSÃO: A injeção pela abordagem retrógrada mostrou-se viável e segura. A retenção de células pelo tecido cardíaco foi maior pela via anterógrada. Mais estudos são necessários para confirmar esses achados.
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O dano microvascular causado por injúria da isquemia-reperfusão e implante de Stents resulta em espasmo, embolização de debris, radicais livres, células inflamatórias e necróticas, além de trombo nas porções distais da artéria relacionada ao infarto1. No início dos anos 1990, demonstrou-se que um número significativo de pacientes com IAM apresentava defeitos na perfusão em nível tecidual, apesar de um fluxo TIMI normal após a revascularização da artéria relacionada ao infarto. Desde então, diversos estudos apontaram que a presença de obstrução microvascular (OMV) está associada a maior mortalidade e pior prognóstico após o IAM2-4. Estima-se que 30% dos pacientes submetidos à reperfusão apresentam obstrução microvascular. Isso é particularmente importante porque Janssens e cols.5 observaram que metade dos pacientes submetidos a transplante autólogo de células-tronco após IAM apresentava padrão de obstrução microvascular pela ressonância cardíaca, o que pode ter prejudicado a migração das células para o tecido do coração e, consequentemente, a melhora da função cardíaca. Pouco se sabe sobre a abordagem percutânea retrógrada pela veia coronária, embora essa rota se tenha mostrado uma forma eficaz de se fornecerem células em modelos animais e humanos6-8. Supomos que a abordagem por via venosa coronariana pode superar o problema da OMV, porque a diapedese das células circulantes no tecido cardíaco adjacente ocorre no lado venoso da microcirculação9. Os principais objetivos deste subestudo são: 1) comparar o padrão de distribuição e a retenção celular na via anterógrada intra-arterial coronariana (IAC), com a via retrógrada intravenosa coronariana (IVC) e 2) investigar o papel da obstrução microvascular detectada pela ressonância magnética na retenção de células pelo tecido cardíaco no transplante autólogo de CMMO, após o IAM. Usamos células radiomarcadas, a fim de avaliar seu padrão de distribuição no coração, uma vez injetadas.
Entre 3 de janeiro de 2005 e 6 de janeiro de 2006, pacientes internados no Hospital Pró-Cardíaco e no Hospital Municipal Miguel Couto (Rio de Janeiro) foram selecionados para inclusão no estudo se tivessem entre 18 e 80 anos e IAM. Os pacientes selecionados no Hospital Miguel Couto foram transferidos para o Hospital Pró-Cardíaco, onde todos os procedimentos relacionados ao estudo foram realizados. Os pacientes foram incluídos se tivessem: 1) IAM com supradesnível do segmento ST, definido como presença de dor torácica, acompanhado de supradesnível do segmento ST em duas ou mais derivações contíguas de uma parede e também de elevação enzimática, reperfundidos de forma bem-sucedida com tratamento trombolítico ou angioplastia primária até 24 horas após o início dos sintomas, e 2) defeito fixo de perfusão superior a 10% da massa do VE após 72 horas na tomografia por emissão de fóton (SPECT) com tecnécio 99m metoxi-isobutil-isonitrila (99mTc-MIBI) e nitrato sublingual. Os critérios de exclusão foram: 1) indicação de cirurgia de revascularização miocárdica; 2) Nível de creatinina > 2,0 mg/dl ou hemodiálise; 3) artéria coronária relacionada a infarto com fluxo TIMI < 3 até o momento da injeção de células; 4) sepse; 5) choque cardiogênico persistente após 72 horas; 6) doença valvar significativa, definida como estenose aórtica com gradiente VE/Ao > 50 mmHg, Estenose mitral com área valvar inferior a 1,5 cm2 ou regurgitações aórtica e/ou mitral superiores a moderadas; 7) complicações mecânicas do IAM (ruptura miocárdica de septo interventricular e da parede livre do VE, ruptura de músculo papilar); 8) insuficiência hepática; 9) doença pulmonar grave (DPOC em uso contínuo de esteroides ou broncodilatadores); 10) bloqueio de ramo esquerdo completo ou ritmo de marca-passo (a imagem por SPECT no septo interventricular fica comprometida); 11) marca-passo implantado; 12) doenças hematológicas; 13) neoplasia; 14) outras desordens de hemostasia e outras doenças que pudessem ter impacto na expectativa de vida.
O Comitê de Ética do Hospital Pró-Cardíaco (Rio de Janeiro) e o do Conselho Nacional de Ética e Pesquisa com Seres Humanos (CONEP) (Brasília) aprovaram o protocolo. Obteve-se consentimento informado de todos os pacientes.
Este foi um estudo aberto, randomizado, de uma série de pacientes consecutivos. Entre o terceiro e o sexto dia após a reperfusão bem-sucedida da artéria relacionada ao infarto, os pacientes incluídos foram divididos aleatoriamente em um dos três grupos: abordagem IAC anterógrada, abordagem IVC retrógrada e controle. A randomização foi estratificada de acordo com o tamanho do infarto (
Cerca de 80 ml de medula óssea autóloga foram aspirados da crista ilíaca posterior de pacientes randomizados para um dos dois grupos tratados. O procedimento foi realizado sob anestesia local cerca de 6 horas antes do horário programado para o procedimento de injeção. O material foi enviado à equipe da Universidade Federal do Rio de Janeiro para manipulação. As células foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, São Paulo, Brasil) e manipuladas em condições assépticas. Também foram lavadas e resuspensas com solução salina contendo albumina humana a 5% e, finalmente, filtradas por uma malha de nylon de 100 mícrons para a remoção dos agregados celulares. Uma pequena fração de suspensão celular foi usada para contagem de células e controle de viabilidade utilizando-se o teste de exclusão pelo azul de tripan. A viabilidade celular foi > 90% em todos os indivíduos (93,26% ± 2,9).
A injeção de CMMO foi realizada 8,5 ± 1,44 horas após a coleta de células de medula óssea. Os acessos arteriais foram realizados pela via femoral ou radial. Todos os pacientes receberam 10.000 UI de heparina não fracionada após a inserção do introdutor. A intervenção em vasos não relacionados ao infarto, mas que possuíam indicação de tratamento percutâneo, foi realizada antes da transferência de células em três pacientes do grupo IAC e em um paciente do grupo IVC. Eletrocardiograma, oximetria de pulso, sinais vitais e sintomas clínicos foram monitorados durante todo o processo.
Angiografia coronariana foi realizada em ambos os grupos de injeção IAC e IVC (GE Medical System, Advantx LCV plus, WI). Um cateter guia de 6-F foi, então, colocado no óstio da artéria coronária relacionada ao infarto, a fim de confirmar a patência do vaso-alvo e avaliar o fluxo sanguíneo coronário (TIMI 3) antes da injeção de células.
No grupo ICA, um cateter balão over-the-wire (OTW) (Maverick ® Over-The- Wire balloon, Boston Scientific, Natick, MA), com diâmetro 0,5 mm maior do que o Stent implantado, foi posicionado no interior do Stent previamente colocado no vaso responsável, a fim de interromper transitoriamente o fluxo sanguíneo anterógrado durante as infusões pela técnica de
No grupo IVC, o acesso da veia jugular interna direita foi utilizado para posicionar cateteres guia de 5 ou 6 Fr JR ou polivalentes no seio coronário, além do acesso arterial. O mesmo tipo de cateter balão OTW (Maverick ®
No final de todos os procedimentos, foi realizada uma angiografia coronária como controle, a fim de verificar o TIMI frame count pré- e pós-ATC e a transferência de células. ECG e enzimas cardíacas seriadas foram feitos antes e após a transferência celular.
Em 12 pacientes do grupo ICA e seis do grupo IVC, cerca de 40 minutos antes da injeção, uma fração de células (1% das 108 células) foi incubada em condições estéreis em um tubo de 10 ml com 150 MBq de 99mTc-hexametil-propilenamina-oxima (HMPAO) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por 107 células, durante 30 minutos, em uma solução salina contendo 2,5% de albumina humana.
A eficiência da marcação foi estimada após a remoção do excesso de radioatividade não ligada por lavagem das células com a solução salina com 2,5% de albumina humana. A radioatividade foi medida com um calibrador de dose (PTW Curiementor 2, Freiburg, Alemanha). A viabilidade das células foi avaliada pela exclusão com azul de tripano.
Células marcadas com 99mTc-HMPAO foram injetadas na forma descrita. A distribuição nos tecidos foi observada com imagens precoces e tardias de corpo total em projeções anterior e posterior, com 1024 × 256 pixels e 12 cm/min.
Para a localização topográfica das células no coração, imagens da tomografia de tórax foram adquiridas com um protocolo semelhante ao usado para imagens de perfusão miocárdica, 64 projeções de 20 segundos cada, com resolução de 64 × 64 pixels. As imagens foram reconstruídas com filtro Butterworth, usando-se o software e-Soft 3,0 n (Cedars, Sinai, QGS e Emory Cardiac Toolbox), e comparadas com as outras adquiridas por tomografia de perfusão. Todas as imagens foram adquiridas em uma gama câmara dual head (Ecam-Duet, a Siemens Medical Systems Inc, IL). Imagens planar e SPECT foram obtidas em 4 horas (3,67 ± 1,03) e 24 horas (22,8 ± 4,46) após a injeção em todos os pacientes. Retenção foi definida como a porcentagem do número de contagens nas projeções anterior e posterior do coração (contagens cardíaca), em relação ao número total de contagens de células marcadas no corpo (corpo), em ambas as imagens precoces e tardias. A taxa de decaimento foi calculada pela seguinte equação: [precoce (contagem cardíaca/contagem de corpos) - tardia (contagens cardíaca/contagem de corpos)] × 100/precoce (contagens cardíaca/contagem de corpos). A taxa de "Decaimento" por hora foi calculada dividindo-se a taxa de Decaimento pelo intervalo entre a retenção de imagens precoces e tardias.
Ressonância magnética cardíaca (RM) foi realizada 3-5 dias após a reperfusão. Todos os estudos foram realizados com o software de RM comercialmente disponível (GE Healthcare Milwaukee, WI, EUA), como descrito anteriormente12. Resumidamente, a obstrução microvascular (OMV) foi definida em imagens de realce tardio tomadas precocemente (dentro de 2-5 minutos) após a injeção de 0,20 mmol/kg de gadopentetato de dimeglumina (Gd-DTPA), no corte transversal e longitudinal do VE na mesma localização utilizada para a cine-RM como uma zona escura, subendocárdica na área do infarto (
Todos os exames de imagem foram analisados por um observador experiente e independente que desconhecia a alocação dos pacientes nos grupos durante o estudo.
As variáveis contínuas são apresentados como média ± DP (salvo indicação em contrário). As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste exato de Fisher, enquanto as variáveis contínuas foram comparadas pelo teste de Kruskal-Wallis.
A rejeição da hipótese zero baseou-se em significância de 5%, valor de P < 0,05. Todos os P-valores relatados são bicaudais. A análise estatística foi realizada com o SPSS (versão 13.0, SPSS Inc.).
Trinta pacientes foram incluídos no estudo: 14 no grupo do IAC, 10 no grupo do IVC e 6 no grupo-controle. Não houve diferença significativa nos parâmetros demográficos entre os grupos estudados (
As injeções nos grupos IAC e IVC foram realizadas com êxito em todos os pacientes, exceto em um caso no grupo IVC, devido à tortuosidade da veia interventricular anterior. A distribuição de células marcadas com 99mTc-HMPAO nos tecidos foi observada no fígado, pulmões, baço e em outros órgãos além do coração (
A Obstrução Microvascular (OMV) foi observada em 50% do grupo IAC e em 60% do grupo do IVC. Não houve diferença na retenção de células pelo tecido cardíaco em relação à presença de OMV dentro dos grupos (
Os achados deste estudo demonstram que, embora as vias anterógrada e retrógrada se tenham mostrado viáveis e seguras, a liberação de células no miocárdio infartado mostrou-se mais eficaz com a primeira técnica, em termos de número de células retidas pelo tecido cardíaco, e a obstrução da microcirculação não interferiu no número de células retidas no miocárdio infartado em cada grupo estudado, pela cintilografia miocárdica.
Na maioria dos estudos de terapia com células-tronco autólogas para o tratamento do IAM, a fração de CMMO foi injetada pela artéria relacionada ao infarto após a reperfusão, com o objetivo de alcançar a área de miocárdio que foi diretamente afetada pela interrupção da circulação sanguínea. Essa abordagem anterógrada tem-se mostrado viável e segura. No entanto, a circulação sanguínea na área de infarto pode ser gravemente afetada, dificultando o potencial acesso das células injetadas na área em que elas são necessárias para a reparação tecidual. Portanto, a abordagem retrógrada alternativa intravenosa proposta é viável e segura, mas tem sido menos utilizada para a entrega de células-tronco. Uma comparação entre essas duas técnicas foi necessária para se avaliar se eventual presença de micro-obstrução vascular dificultando o acesso das CMMO ao tecido danificado faria da via retrógrada melhor opção de liberação dessas células.
Nosso grupo publicou uma descrição do primeiro paciente desta série13. Uma característica importante das vias estudadas foi a grande presença de células marcadas para outros órgãos como pulmões, provavelmente pelo efeito de primeira passagem em órgãos relacionados com a hematopoiese e a linfopoiese, como fígado e baço. Achados estavam presentes também em estudos pré-clínicos do nosso e de outros grupos11,14. O percentual de células retidas precocemente na via IAC (16,14%) é outro dado que nos chama a atenção. Estudos prévios relatam que a taxa de retenção celular pelo miocárdio varia entre 1% a 5 % pela via IAC6,15,16. Fatores relacionados ao tipo de traçador utilizado e sua meia-vida, tempo para injeção de células e preparo celular podem explicar esses achados. Janssens e cols.5 realizaram procedimentos de injeção 24 horas após a reperfusão, enquanto nós realizamos, em média, cinco dias após. Diferenças no preparo das células de medula óssea também podem influenciar a qualidade das células e, portanto, a retenção e o benefício terapêutico. Nós realizamos as injeções de CMMO no mesmo dia após o preparo, 8 horas após a coleta. Outros autores utilizaram diferentes protocolos para isolamento e armazenamento, o que pode ter implicações na migração e na retenção dessas células pelo miocárdio17. Este estudo fornece evidência de que a adesão e a retenção de CMMO via injeção IAC no miocárdio infartado são viáveis e seguras, corroborando resultados prévios sobre a sinalização de mobilização e
Este estudo foi planejado para responder a questões de técnicas de liberação e consequente distribuição de células19. Seu pequeno tamanho amostral e seu caráter aberto nos impedem de chegar a conclusões definitivas em avaliações de subgrupos20. Nós decidimos marcar apenas uma pequena fração de células (1%), a fim de evitar efeitos negativos imprevistos sobre as células, devido à maior radiação total. Essa pequena fração pode não refletir a distribuição de células globalmente. Sob as condições estudadas, a via anterógrada parece apresentar vantagem em relação à retrógrada, porém mais estudos ainda se fazem necessários, com a introdução de novos parâmetros, como, por exemplo, seleção de células e associação de fatores de crescimento21,22.
A injeção pela abordagem retrógrada demonstrou-se viável e segura. A retenção de células pelo tecido cardíaco foi maior pela via anterógrada. Mais estudos são necessários para confirmar esses achados.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Correspondência: Rodrigo de Carvalho Moreira Praia do Flamengo, Flamengo 22210030 - Rio de Janeiro - RJ - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 22/02/11; revisado recebido em 05/05/11; aceito em 13/06/11.
BACKGROUND: The injection of stem cells in the context of acute myocardial infarction (AMI) has been tested almost exclusively by anterograde intra-arterial coronary (IAC) delivery. The retrograde intravenous coronary (IVC) delivery may be an additional route. OBJECTIVE: To compare the cell distribution and retention pattern in the anterograde and retrograde routes. To investigate the role of microvascular obstruction by magnetic resonance imaging in cell retention by cardiac tissue after the injection of bone marrow mononuclear cells (BMMC) in AMI. METHODS: This was a prospective, open label, randomized study. Patients with AMI who presented: (1) successful chemical or mechanical reperfusion within 24 hours of symptom onset and (2) infarction involving more than 10% of the left ventricle (LV) at the myocardial scintigraphy were included in the study. One hundred million BMMC were injected into the infarction-related artery through IAC route, or vein through the IVC route. One percent of the injected cells were labeled with 99mTc-hexamethyl-propylene-amine-oxime (99mTc-HMPAO). Cell distribution was evaluated at 4 and 24 hours after the myocardial scintigraphy injection. Cardiac magnetic resonance imaging was performed before cell injection. RESULTS: Thirty patients were randomized into three groups. There were no serious adverse events related to the procedure. The early and late retention of labeled cells was higher in the IAC group than in IVC group, regardless of the presence of microcirculation obstruction. CONCLUSION: The injection using the retrograde approach was feasible and safe. Cell retention by cardiac tissue was higher using the anterograde approach. More studies are needed to confirm these findings.
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The microvascular damage caused by ischemia-reperfusion injury and stent implants results in spasm, embolization of debris, free radicals, inflammatory and necrotic cells, in addition to thrombus in the distal portions of the infarct-related artery1. In the early 1990s, it was demonstrated that a significant number of AMI patients had perfusion defects at tissue level, despite a normal TIMI flow after revascularization of the infarct-related artery. Since then, several studies have indicated that the presence of microvascular obstruction (MVO) is associated with increased mortality and worse prognosis after AMI2-4.
It has been estimated that 30% of patients undergoing reperfusion have microvascular obstruction. This is particularly important because Janssens et al5 found that half of patients undergoing autologous stem-cell transplant after AMI showed a microvascular obstruction pattern at the cardiac MRI, which may have impaired the migration of cells to cardiac tissue and hence, heart function improvement. Little is known about the retrograde percutaneous approach through the coronary vein, although this route has shown to be an effective way to deliver cells in animal human and models6-8. We suppose that the intravenous coronary (IVC) delivery can overcome the problem of MVO, because the diapedesis of circulating cells in the adjacent cardiac tissue occurs in the venous side of microcirculation9.
The main objectives of this sub-study are: 1) to compare the pattern of cell distribution and retention in anterograde intra-arterial coronary (IAC) route, with the retrograde intravenous coronary (IVC) route and 2) to investigate the role of microvascular obstruction detected by MRI in the retention of cells by cardiac tissue in autologous BMMC after AMI. We used radiolabelled cells to assess their distribution pattern in the heart, after they had been injected.
Between January 3, 2005 and January 6, 2006, patients admitted at the Pro-Cardiaco Hospital and Hospital Municipal Miguel Couto (Rio de Janeiro) were selected for enrollment in the study if they were aged 18 to 80 years and had AMI. The patients selected at Hospital Miguel Couto were transferred to the Pro-Cardiaco Hospital, where all study-related procedures were performed. Patients were included if they: 1) had AMI with ST-segment elevation, defined as the presence of chest pain accompanied by ST elevation in two or more contiguous leads of a wall as well as enzymatic elevation, successfully reperfused with thrombolytic therapy or primary angioplasty within 24 hours of symptom onset, and 2) a fixed perfusion defect of more than 10% of LV mass after 72 hours at the single photon emission computed tomography (SPECT) with Technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile (99mTc-MIBI) and sublingual nitrate.
Exclusion criteria were: 1) indication of coronary artery bypass surgery, 2) creatinine level> 2.0 mg / dl or hemodialysis, 3) infarct-related coronary artery with TIMI flow <3 by the time of cell injection; 4) sepsis, 5) persistent cardiogenic shock after 72 hours, 6) significant valve disease, defined as aortic stenosis with LV/Ao gradient > 50 mmHg, mitral stenosis with a valve area < 1.5 cm2 or aortic and / or mitral regurgitation greater than moderate, 7) mechanical complications of AMI (myocardial rupture of the interventricular septum and LV free wall, papillary muscle rupture), 8) liver failure, and 9) severe pulmonary disease (COPD under continuous use of bronchodilators or steroids); 10) complete left bundle branch block or pacemaker rhythm (the SPECT imaging in the interventricular septum is compromised); 11) implanted pacemaker; 12) hematological diseases; 13) neoplasias, 14) other disorders of hemostasis and other diseases that could have an impact on life expectancy.
The Ethics Committee of Hospital Pro-Cardiaco (Rio de Janeiro) and the National Council on Ethics and Human Research (CONEP) (Brazil) approved the protocol. Informed consent was obtained from all patients.
This was an open, randomized study of a series of consecutive patients. Between the third and sixth days after successful reperfusion of the infarct-related artery, enrolled patients were randomly divided into three groups: anterograde IAC approach, retrograde IVC approach and control. Randomization was stratified according to infarct size (
Approximately 80 ml of autologous bone marrow was aspirated from the posterior iliac crest of patients randomized to one of two treated groups. The procedure was performed under local anesthesia about 6 hours before the time scheduled for the injection procedure. The material was sent to the staff of the Federal University of Rio de Janeiro for handling. The cells were isolated by density gradient centrifugation in Ficoll-Paque Plus equipment (Amersham Biosciences, São Paulo, Brazil) and handled under aseptic conditions. They were also washed and resuspended in saline solution containing 5% human albumin, and finally filtered through a 100-micron nylon mesh to remove cell aggregates. A small fraction of the cell suspension was used for cell count and viability control using the trypan blue exclusion test. Cell viability was >90% in all subjects (93.26% ± 2.9).
The BMMC injection was performed 8.5 ± 1.44 hours after the bone marrow cell collection. The arterial access was performed via radial or femoral route. All patients received 10,000 IU of unfractionated heparin after sheath insertion. The intervention in vessels not related to infarction, but had indication for percutaneous treatment was performed before cell transfer in three patients in the IAC group and in one patient in the IVC group. Electrocardiogram, pulse oximetry, vital signs and clinical symptoms were monitored throughout the process.
Coronary angiography was performed in both IAC and IVC groups (GE Medical System, Advantx LCV plus, WI). A 6-F catheter guide was then placed in the ostium of the infarct-related coronary artery in order to confirm the patency of the target vessel and assess coronary blood flow (TIMI 3) before the cell injection.
In the IAC group, an over-the-wire (OTW) balloon catheter (Maverick ® Over-The-Wire balloon, Boston Scientific, Natick, MA), with a diameter 0.5 mm larger than the implanted stent was placed inside the stent previously placed in the culprit vessel, in order to temporarily stop the anterograde blood flow during infusions using the stop-flow technique10. Ten milliliters of solution containing 100 million autologous BMMC were infused through the central lumen of the balloon catheter during three consecutive coronary occlusions, lasting 2-3 minutes each, followed by 2 minutes of balloon deflation. One milliliter of solution containing labeled cells (see below) was diluted in 3 ml of saline solution and infused into the IAC as a final solution, using the same technique described before.
In the IVC group, access to the right internal jugular vein was used to position 5 or 6 Fr guide catheters, JR or multipurpose ones, in the coronary sinus, in addition to the arterial access. The same type of OTW balloon catheter (Maverick ® Over-The-Wire balloon), ranging from 3.5 to 4.0 × 9.0 mm in size was then advanced through the cardiac vein corresponding to the culprit vessel and positioned side by side with the balloon in the coronary artery, in the previously implanted stent. The total occlusion of the cardiac vein was then performed and maintained for at least 12 minutes. Four intermittent occlusions of the coronary arteries were performed simultaneously, in order to reduce the washing of cells by the pressure of the anterograde flow. One milliliter of labeled cells (see below) was diluted in a solution containing 100 million mononuclear cells. During the first insufflation to stop the anterograde flow, 11 ml of the final cell solution were infused through the central lumen of the venous catheter balloon for one minute11.
At the end of all procedures, a coronary angiography was performed as a control to verify the TIMI frame count pre-and post-PTA and cell transfer. Serial cardiac enzymes and ECG were performed before and after cell transfer.
In 12 patients from the IAC group and six from the IVC group, about 40 minutes before injection, a fraction of cells (1% of 108 cells) was incubated in sterile conditions in a 10 ml tube with 150 MBq of 99mTc-hexamethyl-propylene-amine-oxime (99mTc-HMPAO) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) per 107 cells for 30 minutes in a saline solution containing 2.5% human albumin.
The labeling efficiency was estimated after the removal of excess unbound radioactivity by washing the cells with saline with 2.5% human albumin. Radioactivity was measured with a dose calibrator (PTW Curiementor 2, Freiburg, Germany). Cell viability was assessed by exclusion with trypan blue.
Cells labeled with 99mTc-HMPAO were injected as described. The distribution in the tissue was observed with early and delayed whole-body imaging in anterior and posterior views, with 1024 x 256 pixels and 12 cm / min. For the topographic location of cells in the heart, chest CT images were acquired with a protocol similar to that used for myocardial perfusion imaging, 64 projections of 20 seconds each, with a resolution of 64 × 64 pixels. Images were reconstructed with a Butterworth filter, using the e-Soft 3.0 n software (Cedars Sinai QGS and Emory Cardiac Toolbox), and compared with the others acquired by perfusion CT.
All images were acquired using a dual-head gamma chamber (ECAM Duet, Siemens Medical Systems Inc, IL). Planar and SPECT images were obtained at 4 hours (3.67 ± 1.03) and 24 hours (22.8 ± 4.46) after the injection in all patients. Retention was defined as the percentage of the number of counts in anterior and posterior views of the heart (cardiac counts) in relation to the total number of counts of labeled cells in the body (body) in both early and delayed images. The decay rate was calculated by the following equation: [early (heart count/body count) - delayed (heart count/body count)] × 100/early (heart count/body count). The decay rate per hour was calculated by dividing the decay rate by the interval between retention of early and delayed images.
Cardiac magnetic resonance (CMR) imaging was performed 3-5 days after reperfusion. All studies were performed with commercially available software for MRI (GE Healthcare Milwaukee, WI, USA) as described before12. Briefly, the microvascular obstruction (MVO) was defined as delayed enhancement images taken early (within 2-5 minutes) after the injection of 0.20 mmol / kg gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) through LV cross-sectional and longitudinal view in the same location used for the cine-MRI as a dark zone, subendocardial in the area of †infarction (
All imaging studies were analyzed by an independent experienced observer who was blinded to the allocation of patients to the two groups during the study. Continuous variables are shown as mean ± SD (unless otherwise stated). Categorical variables were compared by Fisher's exact test, whereas continuous variables were compared by Kruskal-Wallis test.
The rejection of the null hypothesis was based on a 5% significance, with a P value <0.05. All reported P values †are two-tailed. The statistical analysis was performed using the SPSS software (version 13.0, SPSS Inc.).
Thirty patients were enrolled in the study: 14 in the IAC group, 10 in the IVC group and 6 in the control group. There was no significant difference in demographic parameters between the studied groups (
The injections in IAC and IVC groups were performed successfully in all patients, except in one case in the IVC group, due to the tortuosity of the anterior interventricular vein. The distribution of cells labeled with 99mTc-HMPAO in the tissues was observed in the liver, lungs, spleen and other organs in addition to the heart (
The findings of the present study demonstrate that, although the anterograde and retrograde routes have shown to be viable and safe, the delivery of cells in the infarcted myocardium was more effective with the first technique, in terms of number of cells retained by the cardiac tissue, and the fact that the microcirculation obstruction did not affect the number of cells retained in the infarcted myocardium in each group studied by myocardial scintigraphy.
In most studies of therapy with autologous stem cells for the treatment of AMI, the BMMC fraction was injected through the infarct-related artery after reperfusion, in order to reach the area of myocardium that was directly affected by blood flow interruption. This anterograde approach has proven to be feasible and safe. However, blood flow in the infarcted area can be severely affected, hindering the potential access of the injected cells into the area where they are needed for tissue repair. Therefore, the proposed alternative of retrograde intravenous approach is feasible and safe, but has been less used for the delivery of stem cells. A comparison between these two techniques was necessary to assess whether the possible presence of micro-vascular obstruction hindering the access of BMMC to the damaged tissue would make the retrograde approach the best option for cell delivery.
Our group has published a description of the first patient in this series13. An important characteristic of the studied routes was the large presence of labeled cells in other organs such as the lungs, probably due to the first-pass effect in organs related with hematopoiesis and lymphopoiesis, such as the liver and the spleen. Findings were also observed in pre-clinical studies of our and other groups11,14. The percentage of cells that were retained early in the IAC route (16.14%) is another noteworthy factor. Previous studies have reported that the rate of myocardial cell retention varied between 1% and 5% through IAC route6,15,16.
Factors related to the type of tracer used and its half-life, time for cell injection and cell preparation may explain these findings. Janssens et al5 performed injection procedures 24 hours after reperfusion, while we performed it, on average, five days later. Differences in the preparation of bone marrow cells can also influence cell quality and, therefore, retention and therapeutic benefit. We carried out the BMMC injections on the same day after preparation, 8 hours after collection. Other authors have used different protocols for isolation and storage, which may have implications in the migration and retention of these cells by the myocardium17. This study provides evidence that the BMMC adhesion and retention via IAC injection in the infarcted myocardium is feasible and safe, confirming previous findings on the mobilization signaling and homing of stem cells by the damaged tissue, during the period of acute ischemic lesion18.
It also shows that the delivery via the IAC route was more effective in terms of cell retention by the myocardium than the IVC approach. This information is valuable, because a premise for therapy benefit is the graft of cells in the damaged tissue. New studies in cell therapies should improve the possible means, in order to release more cells in the region affected by ischemia. Possibly in the future, the choice of route will be individualized based on multiple criteria, for instance, cell type, type of heart disease, disease severity, comorbidities, inherent contraindications to the type of route and even choice based on patient preference.
This study was designed to answer questions on the release techniques and the consequent distribution of cells19. Its small sample size and its open-label nature prevent us from reaching definitive conclusions when evaluating subgroups20. We decided to label only a small fraction of cells (1%), in order to avoid unexpected negative effects on the cells, due to the higher total radiation. This small fraction may not reflect the overall cell distribution. Under the studied conditions, the anterograde route seems to have advantage over the retrograde one, but more studies are still needed, with the introduction of new parameters, such as, cell selection and association of growth factors21,22.
The injection using the retrograde approach showed to be feasible and safe. Cell retention by cardiac tissue was higher with the anterograde route. More studies are needed to confirm these findings.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This study is not associated with any post-graduation program.