abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil BM5yBFYpk4VBGBwH5knLqHP 00005 S0066-782X2011001400005 S0066-782X(11)09700505 10.1590/S0066-782X2011005000090 Artigos Originais Efeitos da angiotensina-I e isquemia na recuperação funcional em corações isolados Oliveira Ubirajara Oliveira de Oliveira Álvaro Reischak de Kucharski Luiz Carlos Machado Ubiratan Fabres Irigoyen Maria Claudia Schaan Beatriz D'Agord São Paulo São Paulo Universidade de São Paulo Brazil Porto Alegre Rio Grande do Sul Universidade Federal do Rio Grande do Sul Brazil Porto Alegre Rio Grande do Sul Fundação Universitária de Cardiologia Instituto de Cardiologia Brazil 11 2011 97 5 390 396 22 12 2010 25 02 2011 18 02 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A ressuscitação de parada cardíaca pode apresentar disfunção miocárdica determinada pelo tempo da isquemia, e a inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA) pode reduzir a disfunção cardíaca durante a reperfusão. OBJETIVO: Investigar os efeitos da angiotensina-I e diferentes períodos de isquemia na recuperação funcional em corações de ratos isolados. MÉTODOS: Os corações isolados de ratos Wistar (n = 45; 250-300 g) foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com o tampão Krebs-Henseleit, ou com a adição de 400 nmol/L de angiotensina-I, ou com 400 nmol/L de angiotensina-I + 100 µmol/L de captopril durante o período de reperfusão. RESULTADOS: A derivada positiva máxima de pressão (+dP/dt max) e o produto frequência-pressão foram reduzidos nos corações expostos à isquemia de 25 min (~ 73%) e à isquemia de 30 min (~ 80%) vs. isquemia de 20 min. A pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) e a pressão de perfusão (PP) foram aumentadas nos corações expostos à isquemia de 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e à isquemia de 30 min (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs. isquemia de 20 min. A angiotensina-I ocasionou uma diminuição no +dP/dt max e no produto frequência-pressão (~ 85-94%) em todos os períodos de isquemia e um aumento na PDFVE e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas na isquemia de 20 min. O captopril foi capaz de reverter parcial ou completamente os efeitos da angiotensina-I na recuperação funcional nas isquemias de 20 e 25 min CONCLUSÃO: Os dados sugerem que a angiotensina-II participa direta ou indiretamente no dano pós-isquêmico e que a capacidade de um inibidor da ECA atenuar esse dano depende do tempo de isquemia.

 Angiotensina I isquemia ratos função ventricular 30 09 2011

Efeitos da angiotensina-I e isquemia na recuperação funcional em corações isolados

Ubirajara Oliveira de OliveiraI,II; Álvaro Reischak de OliveiraI; Luiz Carlos KucharskiI; Ubiratan Fabres MachadoIII; Maria Claudia IrigoyenI,III; Beatriz D'Agord SchaanI,II

IUniversidade Federal o Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS

IIInstituto de Cardiologia - Fundação Universitária de Cardiologia, Porto Alegre, RS

IIIUniversidade de São Paulo,São Paulo, SP, Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A ressuscitação de parada cardíaca pode apresentar disfunção miocárdica determinada pelo tempo da isquemia, e a inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA) pode reduzir a disfunção cardíaca durante a reperfusão.

OBJETIVO: Investigar os efeitos da angiotensina-I e diferentes períodos de isquemia na recuperação funcional em corações de ratos isolados.

MÉTODOS: Os corações isolados de ratos Wistar (n = 45; 250-300 g) foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com o tampão Krebs-Henseleit, ou com a adição de 400 nmol/L de angiotensina-I, ou com 400 nmol/L de angiotensina-I + 100 µmol/L de captopril durante o período de reperfusão.

RESULTADOS: A derivada positiva máxima de pressão (+dP/dtmax) e o produto frequência-pressão foram reduzidos nos corações expostos à isquemia de 25 min (~ 73%) e à isquemia de 30 min (~ 80%) vs. isquemia de 20 min. A pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) e a pressão de perfusão (PP) foram aumentadas nos corações expostos à isquemia de 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e à isquemia de 30 min (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs. isquemia de 20 min. A angiotensina-I ocasionou uma diminuição no +dP/dtmax e no produto frequência-pressão (~ 85-94%) em todos os períodos de isquemia e um aumento na PDFVE e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas na isquemia de 20 min. O captopril foi capaz de reverter parcial ou completamente os efeitos da angiotensina-I na recuperação funcional nas isquemias de 20 e 25 min

CONCLUSÃO: Os dados sugerem que a angiotensina-II participa direta ou indiretamente no dano pós-isquêmico e que a capacidade de um inibidor da ECA atenuar esse dano depende do tempo de isquemia.

Palavras-chave: Angiotensina I/efeito de drogas, isquemia/complicações, ratos, função ventricular/efeito de drogas.

Introdução

A ressuscitação de parada cardíaca possui importantes implicações clínicas, principalmente relacionadas à disfunção miocárdica, causada pela duração da isquemia1,2 ou pelo coração atordoado quando a isquemia não resultar em morte celular3,4. Todavia, quando a duração da isquemia miocárdica aumenta, a disfunção contrátil pode ser o resultado de combinações de processos reversíveis e irreversíveis (incluindo a apoptose ou a necrose)1,5. Paradoxalmente, a reperfusão da área isquêmica pode resultar em maior lesão tecidual, o que é mediado principalmente pelas espécies reativas de oxigênio, que são tóxicas e podem levar a dano oxidativo das proteínas, dos lipídios e do DNA6,7.

No miocárdio isquêmico, a inibição local da enzima conversora de angiotensina (ECA) pode melhorar a função cardíaca e reduzir os marcadores bioquímicos de necrose celular8,9, sugerindo a participação da angiotensina-II em dano tecidual. O captopril é o inibidor da ECA estudado mais a fundo e pode efetivamente reduzir a extensão da disfunção contrátil após o infarto do miocárdio10,11.

A descoberta do sistema renina-angiotensina local levou à busca de novas abordagens experimentais para avaliar a atividade desse sistema. A angiotensina-I tem sido utilizada para estimar a atividade da ECA no tecido e na circulação, uma vez que é necessária a conversão em angiotensina-II para determinar uma resposta12-14. No modelo de coração de ratos isolado, a liberação de angiotensina-II somente pode ser mantida adicionando renina e angiotensina12, ou angiotensina-I12-14 ao tampão de perfusão.

Apesar da popularidade do uso de preparações de coração de ratos isoladas, em estudos de lesão de isquemia-reperfusão, muitos protocolos diferentes têm sido empregados com variações na duração da isquemia15,16 e do grau do distúrbio metabólico17,18, o que torna difícil comparar a gravidade dos protocolos. Além disso, a maioria desses estudos não utiliza a angiotensina-I no perfusato, impedindo qualquer conclusão sobre os efeitos da inibição da ECA. Uma vez que o sistema renina-angiotensina está intimamente relacionado com o agravamento da lesão de reperfusão11, a adição de angiotensina no perfusato é necessária para que se obtenha um bom modelo para a investigação de abordagens farmacológicas que possam realmente melhorar a função cardíaca após a isquemia-reperfusão. Dessa forma, este estudo investigou os efeitos da angiotensina-I em diferentes períodos de isquemia na recuperação funcional em coração de ratos isolado.

Métodos

Animais e preparação do coração isolado

Os ratos Wistar machos (n = 45; 250-300 g) foram obtidos com o Biotério Central da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brasil. Eles foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 ​h/12 h (as luzes eram acesas das 7 h às 19 h) e em uma temperatura constante (22ºC), em sala de colônia com ar condicionado, e tiveram livre acesso à ração comercial e à água. O cuidado com os animais seguiu as orientações do governo, em conformidade com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e o estudo foi aprovado (sob o protocolo nº 2004313) pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, os corações foram excisados ​de forma rápida e perfundidos via aorta (técnica de Langendorff), utilizando-se um aparelho de coração isolado - tamanho 3 (Hugo Sachs Elektronik, Alemanha)19. Os corações foram perfundidos com um tampão Krebs-Henseleit modificado (composição em mmol/L: NaCl 120, KCl 5,4, MgCl2 1,8, NaHCO3 27, Na2SO4 1,8, NaH2PO4 2, glicose 5,5 e CaCl2 1,4), borbulhado com 95% de O2 - 5% de CO2 (pH de 7,4), aquecidos a 37ºC e mantidos em um constante fluxo de 10 mL/min com uma bomba peristáltica (Miniplus-2, Gilson Medical Electronics, França). O tampão de perfusão foi previamente filtrado através de uma membrana de 0,45 mm (Omnipore, Millipore) para remover as partículas contaminantes. Um balão de látex, conectado a um transdutor de pressão (TPS-2 Incor, São Paulo, Brasil) por meio de uma cânula, foi inserido no ventrículo esquerdo (VE) para medir a função contrátil. O volume do balão foi ajustado para manter uma pressão diastólica final de 8-10 mm Hg no início do experimento. Os corações foram imersos em uma câmara de vidro e mantidos a 37ºC por uma bomba de água com um aquecedor (M3 Lauda, ​Hugo Sachs Elektronik, Alemanha). A pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), a frequência cardíaca (FC), a derivada positiva máxima da pressão do VE (+dP/dtmax) e a derivada negativa máxima da pressão do VE (-dP/dtmax) foram medidas durante o experimento. A pressão desenvolvida (PDVE = pressão sistólica - diastólica) e o produto frequência-pressão (frequência cardíaca x pressão desenvolvida) foram calculados. A pressão de perfusão (PP) foi medida continuamente por um transdutor de pressão (TPS-2 Incor) conectado a um braço lateral da cânula aórtica. Os sinais dos transdutores foram transmitidos para um sistema de aquisição de dados e de análise (Isoheart, Hugo Sachs Elektronik, Alemanha), no quais os dados foram continuamente registrados para posterior análise.

Protocolo de reperfusão

Depois de um período de estabilização de 25 min, os corações foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min), por meio da interrupção do fluxo de perfusão. Em seguida, foram reperfundidos por 30 min apenas com Krebs-Henseleit (KH) ou com a adição de 400 nmol/L de angiotensina-I ou 400 nmol/L de angiotensina-I + 100 µmol/L de captopril (AC), pelo restabelecimento do fluxo de perfusão. Para garantir o funcionamento fisiológico, os corações que não exibiram FC de, pelo menos, 210 batimentos/min, ou PSVE e PP de, pelo menos, 60 mm Hg ao final do período de estabilização foram excluídos.

Análise estatística

Todos os parâmetros medidos foram expressos em relação aos valores basais (comparações entre os dados obtidos antes e depois da isquemia). Os dados foram apresentados como média ± EPM. Os grupos foram comparados a partir da análise de variância (ANOVA) de dois fatores para medidas repetidas, seguidos pelo teste pots hoc de Tukey (Sigma Stat, versão 3.1 para Windows). O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Todos os corações isolados perfundidos apresentaram uma função cardiovascular basal semelhante (PSVE, PDFVE, PDVE, PFP, FC, PP, +dP/dtmax, e -dP/dtmax) antes da isquemia (Tabela 1).Os dados hemodinâmicos registrados após os tempos de isquemia estão exibidos na Figura 1.

 

As mudanças na recuperação do +/-dP/dtmax estão demonstradas na Figura 1A: a recuperação do +/-dP/dtmax foi significativamente reduzida nos grupos KH submetidos a 25 e 30 min de isquemia (74 e 80%, respectivamente), em comparação ao grupo KH submetido a 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma redução de 87 a 94% na +/-dP/dtmax em todos os períodos de isquemia, em comparação aos valores basais. Esses efeitos da angiotensina-I foram completamente revertidos pelo captopril no protocolo de 20 min de isquemia. No entanto, após 25 min de isquemia, o captopril foi capaz apenas de reverter o efeito da angiotensina-I na recuperação da -dP/dtmax. Após 30 min de isquemia, o captopril não reverteu os efeitos da angiotensina-I.

Uma vez que as recuperações da PDVE e do produto frequência-pressão foram quase idênticas, apenas a recuperação do produto frequência-pressão é apresentada (Figura 1B). O produto frequência-pressão foi significativamente reduzido nos grupos KH submetidos a 25 e 30 min de isquemia (73 e 78%, respectivamente), em comparação ao grupo KH submetido a 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma redução de 85 a 93% na recuperação do produto frequência-pressão em todos os períodos de isquemia, em comparação aos valores basais. Esse efeito da angiotensina-I foi revertido pelo captopril nos grupos submetidos a 20 min e 25 min de isquemia (85% e 29%, respectivamente, com base nos valores basais), mas não no protocolo de 30 min de isquemia.

A Figura1.C representa a PDFVE, que foi significativamente reduzida durante a reperfusão nos grupos KH submetidos a 25 e 30 min de isquemia (5.5 e 6 vezes, respectivamente), em comparação ao grupo KH submetido a 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou um aumento de, aproximadamente, 6,9 vezes na recuperação da PDFVE em comparação ao grupo KH submetido a 20 min de isquemia. Esse efeito foi revertido pelo captopril. No entanto, nos grupos submetidos a 25 e 30 min de isquemia, a angiotensina-I e o captopril não tiveram qualquer efeito significativo na PDFVE.

A PP, ilustrada na Figura1.D, foi significativamente aumentada durante a reperfusão nos grupos KH submetidos a 25 e 30 min de isquemia (1.08 e 1.10 vezes, respectivamente), em comparação ao grupo KH submetido a 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou um aumento de, aproximadamente, 1,25 vezes na recuperação da PP, em comparação ao grupo KH submetido a 20 min de isquemia. Esse efeito foi parcialmente revertido pelo captopril. No entanto, nos grupos submetidos a 25 e 30 min de isquemia, a angiotensina-I e o captopril não tiveram qualquer efeito significativo na PP.

Não houve diferenças significativas na PSVE ou na FC (dados não exibidos) entre os grupos, em diferentes protocolos de isquemia. Não houve interação entre os fatores analisados ​(tratamentos e tempo de reperfusão).

Discussão

Este estudo mostrou que, no modelo de coração de ratos isolado, 20 minutos de isquemia global resultam em disfunção contrátil leve ou moderada, enquanto períodos de isquemia mais longos podem levar à disfunção contrátil grave. Além disso, os efeitos da angiotensina-I e do captopril sobre a recuperação funcional foram mais bem demonstrados quando os corações foram submetidos a 20 min de isquemia. Este é o primeiro estudo que avalia a recuperação funcional e a capacidade de resposta da ECA em corações de ratos submetidos a três períodos de isquemia diferentes.

No modelo de coração isolado, tanto a isquemia quanto a reperfusão induzem a liberação de enzimas cardíacas16-18,20. No entanto, apesar de importantes, os resultados apresentados são discordantes e ilustram a falta de padronização entre os diferentes ensaios e a sensibilidade dos métodos utilizados. Além disso, os dados são frequentemente expressos em várias unidades (unidade/mg de proteína, unidade/g de peso seco etc.), o que torna difícil comparar os resultados. Devido a esse fato, preferimos usar vários índices funcionais para avaliar a extensão da lesão tecidual na cardiopatia isquêmica, uma vez que consideramos que essa abordagem seria mais reprodutível.

O período das alterações cardiovasculares induzidas pela isquemia global (20, 25 e 30 min) no modelo de coração de ratos isolado mostrou que, quando os corações foram expostos a 20 min de isquemia, a recuperação funcional reduziu na fase inicial de reperfusão, mas não no fim da reperfusão (30 min), sugerindo que o grau de dano tecidual foi leve ou moderado. No entanto, quando o período de isquemia aumentou para 25 ou 30 min, uma redução acentuada na recuperação funcional foi observada, conforme indicado pelo menor +/-dP/dtmax e produto frequência-pressão e pela maior PDFVE e PP durante o período de reperfusão. Assim, quando o tempo de isquemia exceder 20 min, a consequência é a contratura do miocárdio, sugerindo um alto grau de dano tecidual. Essa provavelmente é a causa da menor capacidade de resposta demonstrada pelo tecido cardíaco quando o período de isquemia foi aumentado de 25 para 30 min.

Esses achados estão de acordo com os dados funcionais e metabólicos anteriores de Wang e cols.21 e Palmer e cols.16, que relataram uma disfunção pós-isquêmica leve quando curtos períodos de isquemia global (15-20 min) foram empregados, embora tenham observado uma disfunção miocárdica grave com elevação persistente da creatina quinase após 25 min de isquemia, sugerindo uma lesão miocárdica irreversível. Esses resultados, juntamente com os do presente estudo, sugerem que a transição de dano tecidual leve ou moderado para grave ocorre após 20 min de isquemia global. No entanto alterações no tampão de perfusão (por exemplo, concentração de substrato e composição22, fluxo23 e temperatura24) podem modificar esse limiar isquêmico.

Muitos relatos confirmam que a atividade da ECA está presente no tecido cardíaco e que o sistema renina-angiotensina pode modular a homeostase cardiovascular por meio de seus sistemas local e sistêmico12-14,25. No entanto, no modelo de coração de ratos isolado, o substrato (angiotensina-I) deve ser adicionado no perfusato para estudar a ECA local12-14. No presente estudo, a adição de angiotensina-I ao perfusato resultou em uma diminuição acentuada na recuperação funcional do VE, conforme indicado pelo +/-dP/dtmax e produto frequência-pressão mais baixos em todos os períodos de isquemia testados. Essa constatação também é corroborada por maiores PDFVE e PP encontradas em grupos submetidos a 20 min de isquemia. Relatos anteriores também mostraram que a angiotensina-I e a angiotensina-II reduziram a contratilidade cardíaca ou a constrição das artérias coronárias9,15, mas outros autores não observaram qualquer efeito deletério induzido por esses compostos26. Os efeitos deletérios da angiotensina na função cardíaca podem envolver uma produção de ERO aumentada, uma vez que os estudos indicam que a angiotensina-I pode estimular a oxidase de NADPH27.

Os efeitos da angiotensina-I sobre a recuperação funcional do VE foram totalmente ou parcialmente revertidos pelo captopril nos grupos submetidos a 20 e 25 min (mas não a 30 min) de isquemia, sugerindo que dependem da conversão local para a angiotensina-II. É provável que fatores múltiplos tenham um papel no efeito protetor dos inibidores da ECA na lesão de isquemia-reperfusão: diminuem a infiltração de leucócitos28, possui efeitos anti-inflamatórios29 e propriedades de captura dos radicais livres30, e efeitos mediados pelo aumento dos níveis de bradicinina e prostaglandina31. Uma vez que a inibição da ECA pode aumentar os níveis circulantes da angiotensina-I (1-7)32, esta pode mediar alguns desses efeitos cardiovasculares33,34. A incapacidade do captopril abolir completamente as respostas mediadas pela angiotensina é possivelmente um resultado da atividade intrínseca da angiotensina-I, uma vez que a formação da angiotensina-II em corações intactos de ratos depende principalmente da ECA12,13. No entanto, muitos caminhos alternativos para formar a angiotensina-II (cimase, calicreína e catepsina G) podem ser ativados em diversas condições patológicas, tais como isquemia, hipercolesterolemia, hipertensão e inflamação35.

Esses resultados mostraram que a recuperação funcional do VE foi significativamente reduzida e proporcionalmente menos afetada pela angiotensina-I ou pelo captopril, quando o coração foi exposto a mais de 20 min de isquemia. Dessa forma, a baixa capacidade de resposta do tecido cardíaco às drogas deve-se à contratura isquêmica, ao invés do possível esgotamento da ECA cardíaca.

Em conclusão, 20 min de isquemia global são, provavelmente, o melhor período para o estudo da disfunção contrátil do miocárdio leve à moderada, em um nível que possa ser atenuada ou agravada pelas drogas testadas. Períodos mais longos de isquemia levam a um dano miocárdico ainda mais intenso, com o desenvolvimento de contratura isquêmica, que não pode ser revertida por drogas testadas durante a reperfusão. Dessa maneira, a abordagens farmacológicas testadas durante esses períodos podem não ter efeito por razões metodológicas. Ademais, esses dados sugerem que a angiotensina-II participa direta ou indiretamente no dano pós-isquêmico e que a capacidade de um inibidor da ECA atenuar esse dano, depende do tempo de isquemia.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Sra. Tânia R.G. Fernandes (Instituto de Ciências Básicas da Saúde/Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICBS/UFRGS) pela sua assistência técnica.

Esta pesquisa foi suportada por concessões da CAPES, CNPq, FAPESP e FAPERGS, agências de pesquisa brasileiras.

Os autores relatam não haver conflito de interesse relacionado ao conteúdo deste manuscrito.

Ubirajara Oliveira de Oliveira

Av. Princesa Isabel, 370 - Unidade de Pesquisa - Santana

90620-001 - Porto Alegre, RS, Brasil

E-mail:

biraoliveira@yahoo.com,

biraoliva@gmail.com

Artigo recebido em 22/12/10; revisado recebido em 18/02/11; aceito em 25/02/11.

1. Reimer KA, Heide RSV, Richard VJ. Reperfusion in acute myocardial infarction: effect of timing and modulating factors in experimental models. Am J Cardiol. 1993;72(19):13G-21G. Reperfusion in acute myocardial infarction: effect of timing and modulating factors in experimental models Am J Cardiol 1993 13G 21G 19 72 Reimer KA Heide RSV Richard VJ 2. Kern KB, Hilwig RW, Rhee KH, Berg RA. Myocardial dysfunction after resuscitation from cardiac arrest: an example of global myocardial stunning. J Am Coll Cardiol. 1996;28(1):232-40. Myocardial dysfunction after resuscitation from cardiac arrest: an example of global myocardial stunning J Am Coll Cardiol 1996 232 40 1 28 Kern KB Hilwig RW Rhee KH Berg RA 3. Bolli R, Marban E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 1999;79(2):609-34. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning Physiol Rev 1999 609 34 2 79 Bolli R Marban E 4. Kloner RA, Jennings RB. Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 1. Circulation. 2001;104(24):2981-9. Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 1 Circulation 2001 2981 9 24 104 Kloner RA Jennings RB 5. Galinanes M, Hearse DJ. Assessment of ischemic injury and protective interventions: the Langendorff versus working rat heart preparation. Can J Cardiol. 1990;6(2):83-91. Assessment of ischemic injury and protective interventions: the Langendorff versus working rat heart preparation Can J Cardiol 1990 83 91 2 6 Galinanes M Hearse DJ 6. Hensley K, Robinson KA, Gabbita SP, Salsman S, Floyd RA. Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury. Free Radic Biol Med. 2000;28(10):1456-62. Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury Free Radic Biol Med 2000 1456 62 10 28 Hensley K Robinson KA Gabbita SP Salsman S Floyd RA 7. Lefer DJ, Granger DN. Oxidative stress and cardiac disease. Am J Med. 2000;109(4):315-23. Oxidative stress and cardiac disease Am J Med 2000 315 23 4 109 Lefer DJ Granger DN 8. Arad M, Shotan A, Horowitz LR. Effect of captopril on metabolic and hemodynamic alterations in global ischemia and reperfusion in the isolated working rat heart. J Cardiovasc Pharmacol. 1992;19(3):319-23. Effect of captopril on metabolic and hemodynamic alterations in global ischemia and reperfusion in the isolated working rat heart J Cardiovasc Pharmacol 1992 319 23 3 19 Arad M Shotan A Horowitz LR 9. Neves LAA, Almeida AP, Klosla MC, Santos RA. Metabolism and angiotensin I in isolated rat hearts: effect of angiotensin converting enzyme inhibitors. Biochem Pharmacol. 1995;50(9):1451-9. Metabolism and angiotensin I in isolated rat hearts: effect of angiotensin converting enzyme inhibitors Biochem Pharmacol 1995 1451 9 9 50 Neves LAA Almeida AP Klosla MC Santos RA 10. Pfeffer MA, Braunwald E, Moyé LA, Basta L, Brown EJ Jr, Cuddy TE, et al. Effect of captopril on mortality and morbidity in patients with left ventricular dysfunction after myocardial infarction: results of the Survival and Ventricular Enlargement Trial. N Engl J Med. 1992;327(10):669-77. Effect of captopril on mortality and morbidity in patients with left ventricular dysfunction after myocardial infarction: results of the Survival and Ventricular Enlargement Trial N Engl J Med 1992 669 77 10 327 Pfeffer MA Braunwald E Moyé LA Basta L Brown Jr EJ Cuddy TE 11. Garg R, Yusuf S. Overview of randomized trials of angiotensin-converting enzyme inhibitors on mortality and morbidity in patients with heart failure. Collaborative Group on ACE Inhibitor Trials. JAMA. 1995;273(18):1450-6. Overview of randomized trials of angiotensin-converting enzyme inhibitors on mortality and morbidity in patients with heart failure: Collaborative Group on ACE Inhibitor Trials JAMA 1995 1450 6 18 273 Garg R Yusuf S 12. de Lannoy LM, Danser AHJ, Bouhuizen AMB, Saxena PR, Schalekamp MADH. Localization and production of angiotensin II in isolated perfused rat heart. Hypertension. 1998;31(5):1111-7. Localization and production of angiotensin II in isolated perfused rat heart Hypertension 1998 1111 7 5 31 de Lannoy LM Danser AHJ Bouhuizen AMB Saxena PR Schalekamp MADH 13. de Lannoy LM, Schuijt MP, Saxena PR, Schalekamp MA, Danser AH. Angiotensin converting enzyme is the main contributor to angiotensin I-II conversion in the interstitium of the isolated perfused rat heart. J Hypertens. 2001;19(5):959-65. Angiotensin converting enzyme is the main contributor to angiotensin I-II conversion in the interstitium of the isolated perfused rat heart J Hypertens 2001 959 65 5 19 de Lannoy LM Schuijt MP Saxena PR Schalekamp MA Danser AH 14. Müller DN, Fischli W, Clozel JP, Hilgers KF, Bohlender J, Ménard J, et al. Local angiotensin II generation in the rat heart: role of renin uptake. Circ Res. 1998;82(1):13-20. Local angiotensin II generation in the rat heart: role of renin uptake Circ Res 1998 13 20 1 82 Müller DN Fischli W Clozel JP Hilgers KF Bohlender J Ménard J 15. Traquandi C, Riva E. Cardiac effects of angiotensin I and angiotensin II: dose-response studies in the isolated perfused rat heart. Pharmacol Res. 1998;37(1):57-65. Cardiac effects of angiotensin I and angiotensin II: dose-response studies in the isolated perfused rat heart Pharmacol Res 1998 57 65 1 37 Traquandi C Riva E 16. Palmer BS, Hadziahmetovic M, Veci T, Angelos MG. Global ischemic duration and reperfusion function in the isolated perfused rat heart. Resuscitation. 2004;62(1):97-106. Global ischemic duration and reperfusion function in the isolated perfused rat heart Resuscitation 2004 97 106 1 62 Palmer BS Hadziahmetovic M Veci T Angelos MG 17. Chocron S, Alwan K, Toubin G, Kantelip B, Clement F, Kantelip JP, et al. Effects of myocardial ischemia on the release of cardiac troponin I in isolated rat hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 1996;112(2):508-13. Effects of myocardial ischemia on the release of cardiac troponin I in isolated rat hearts J Thorac Cardiovasc Surg 1996 508 13 2 112 Chocron S Alwan K Toubin G Kantelip B Clement F Kantelip JP 18. Bertinchant JP, Polge A, Robert E, Sabbah N, Fabbro-Peray P, Poirey S, et al. Time-course of troponin I release from isolated perfused rat hearts during hypoxia/reoxygenation and ischemia/reperfusion. Clin Chim Acta. 1999;283(1-2):43-56. Time-course of troponin I release from isolated perfused rat hearts during hypoxia/reoxygenation and ischemia/reperfusion Clin Chim Acta 1999 43 56 1-2 283 Bertinchant JP Polge A Robert E Sabbah N Fabbro-Peray P Poirey S 19. Langendorff O. Untersuchungen am uberlebenden saugetierherzen. Pflügers Arch Ges Physiol. 1895;61:291-332. Untersuchungen am uberlebenden saugetierherzen Pflügers Arch Ges Physiol 1895 291 332 61 Langendorff O 20. Poston JM, Parenteau GL. Biochemical effects of ischemia on isolated, perfused rat heart tissues. Arch Biochem Biophys. 1992;295(1):35-41. Biochemical effects of ischemia on isolated, perfused rat heart tissues Arch Biochem Biophys 1992 35 41 1 295 Poston JM Parenteau GL 21. Wang QD, Swardh A, Sjoquist PO. Relationship between ischaemic time and ischaemia/reperfusion injury in isolated Langendorff-perfused mouse hearts. Acta Physiol Scand. 2001;171(2):123-8. Relationship between ischaemic time and ischaemia/reperfusion injury in isolated Langendorff-perfused mouse hearts Acta Physiol Scand 2001 123 8 2 171 Wang QD Swardh A Sjoquist PO 22. Angelos MG, Murray HN, Gorsline RT, Klawitter PF. Glucose, insulin and potassium (GIK) during reperfusion mediates improved myocardial bioenergetics. Resuscitation. 2002;55(3):329-36. Glucose, insulin and potassium (GIK) during reperfusion mediates improved myocardial bioenergetics Resuscitation 2002 329 36 3 55 Angelos MG Murray HN Gorsline RT Klawitter PF 23. Klawitter PF, Murray HN, Clanton TL, Palmer BS, Angelos MG. Low flow after global ischemia to improve postischemic myocardial function and bioenergetics. Crit Care Med. 2002;30(11):2542-7. Low flow after global ischemia to improve postischemic myocardial function and bioenergetics Crit Care Med 2002 2542 7 11 30 Klawitter PF Murray HN Clanton TL Palmer BS Angelos MG 24. Bes S, Roussel P, Laubriet A, Vandroux D, Tissier C, Rochette L, et al. Influence of deep hypothermia on the tolerance of the isolated cardiomyocyte to ischemia-reperfusion. J Mol Cell Cardiol. 2001;33(11):1973-88. Influence of deep hypothermia on the tolerance of the isolated cardiomyocyte to ischemia-reperfusion J Mol Cell Cardiol 2001 1973 88 11 33 Bes S Roussel P Laubriet A Vandroux D Tissier C Rochette L 25. Meulemans AL, Andries LJ, Brutsaert DL. Does endocardial endothelium mediate positive inotropic response to angiotensin I and angiotensin II? Circ Res. 1990;66(6):1591-601. Does endocardial endothelium mediate positive inotropic response to angiotensin I and angiotensin II Circ Res 1990 1591 601 6 66 Meulemans AL Andries LJ Brutsaert DL 26. Ford WR, Clanachan AS, Hiley CR, Jugdutt BI. Angiotensin II reduces infarct size and has no effect on post-ischaemic contractile dysfunction in isolated rat hearts. Br J Pharmacol. 2001;134(1):38-45. Angiotensin II reduces infarct size and has no effect on post-ischaemic contractile dysfunction in isolated rat hearts Br J Pharmacol 2001 38 45 1 134 Ford WR Clanachan AS Hiley CR Jugdutt BI 27. Li JM, Shah AM. Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004;287(5):R1014-30. Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004 R1014 30 5 287 Li JM Shah AM 28. Ferrari R, Pepi P, Nesta F, Benigno M, Visioli O. Metabolic derangement in ischemic heart disease and its therapeutic control. Am J Cardiol. 1998;82(5A):2k-13k. Metabolic derangement in ischemic heart disease and its therapeutic control Am J Cardiol 1998 2k 13k 5A 82 Ferrari R Pepi P Nesta F Benigno M Visioli O 29. Peng H, Carretero OA, Liao TD, Peterson EL, Rhaleb NE. Role of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline in the antifibrotic and anti-inflammatory effects of the angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril in hypertension. Hypertension. 2007;49(3):695-703. Role of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline in the antifibrotic and anti-inflammatory effects of the angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril in hypertension Hypertension 2007 695 703 3 49 Peng H Carretero OA Liao TD Peterson EL Rhaleb NE 30. Anderson B, Khaper N, Dhalla AK. Anti free radical mechanism in captopril protection against reperfusion injury in isolated rat hearts. Can J Cardiol. 1996;12(10):1099-104. Anti free radical mechanism in captopril protection against reperfusion injury in isolated rat hearts Can J Cardiol 1996 1099 104 10 12 Anderson B Khaper N Dhalla AK 31. Ehring T, Baumgart D, Krajcard M, Hümmelgen M, Kompa S, Heusch G. Attenuation of myocardial stunning by ACE inhibitor ramiprilat through a signal cascade of bradykinin and prostaglandins but not nitric oxide. Circulation. 1994;90(3):1368-85. Attenuation of myocardial stunning by ACE inhibitor ramiprilat through a signal cascade of bradykinin and prostaglandins but not nitric oxide Circulation 1994 1368 85 3 90 Ehring T Baumgart D Krajcard M Hümmelgen M Kompa S Heusch G 32. Iyer SN, Ferrario CM, Chappell MC. Angiotensin-(1-7) contributes to the antihypertensive effects of blockade of the renin-angiotensin system. Hypertension. 1998;31(1 Pt 2):356-61. Angiotensin-(1-7) contributes to the antihypertensive effects of blockade of the renin-angiotensin system Hypertension 1998 356 61 1 Pt 2 31 Iyer SN Ferrario CM Chappell MC 33. Almeida AP, Fabregas BC, Madureira MM, Santos RJ, Campagnole-Santos MJ, Santos RA. Angiotensin-(1-7) potentiates the coronary vasodilatatory effect of bradykinin in the isolated rat heart. Braz J Med Biol Res. 2000;33(6):709-13. Angiotensin-(1-7) potentiates the coronary vasodilatatory effect of bradykinin in the isolated rat heart Braz J Med Biol Res 2000 709 13 6 33 Almeida AP Fabregas BC Madureira MM Santos RJ Campagnole-Santos MJ Santos RA 34. Oudot A, Vergely C, Ecarnot-Laubriet A, Rochette L. Pharmacological concentration of angiotensin-(1-7) activates NADPH oxidase after ischemia-reperfusion in rat heart through AT1 receptor stimulation. Regulatory Peptides. 2005;127(1-3):101-10. Pharmacological concentration of angiotensin-(1-7) activates NADPH oxidase after ischemia-reperfusion in rat heart through AT1 receptor stimulation Regulatory Peptides 2005 101 10 1-3 127 Oudot A Vergely C Ecarnot-Laubriet A Rochette L 35. Arakawa K, Urata H. Hypothesis regarding the pathophysiological role of alternative pathways of angiotensin II formation in atherosclerosis. Hypertension. 2000;36 Hypothesis regarding the pathophysiological role of alternative pathways of angiotensin II formation in atherosclerosis Hypertension 2000 36 Arakawa K Urata H Original Articles Effects of angiotensin-I and ischemia on functional recovery in isolated hearts

BACKGROUND: Cardiac arrest resuscitation can present myocardial dysfunction determined by ischemic time, and inhibition of the angiotensin-converting enzyme (ACE) can reduce cardiac dysfunction during reperfusion. OBJECTIVE: To investigate the effects of angiotensin-I and different periods of ischemia on functional recovery in isolated rat hearts. METHODS: Isolated hearts from Wistar rats (n=45; 250-300 g) were submitted to different periods of global ischemia (20, 25 or 30 min) and reperfused (30 min) with Krebs-Henseleit buffer alone or with the addition of 400 nmol/L angiotensin-I, or 400 nmol/L angiotensin-I + 100 mmol/L captopril along the reperfusion period. RESULTS: The maximal positive derivative of pressure (+dP/dt max) and rate-pressure product were reduced in hearts exposed to 25 min ischemia (~73%) and 30 min ischemia (~80%) vs. 20 min ischemia. Left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and perfusion pressure (PP) were increased in hearts exposed to 25 min ischemia (5.5 and 1.08 fold, respectively) and 30 min ischemia (6 and 1.10 fold, respectively) vs. 20 min ischemia. Angiotensin-I caused a decrease in +dP/dt max and rate-pressure product (~85-94%) in all ischemic periods and an increase in LVEDP and PP (6.9 and 1.25 fold, respectively) only at 20 min ischemia. Captopril was able to partially or completely reverse the effects of angiotensin-I on functional recovery in 20 min and 25 min ischemia. CONCLUSION: These data suggest that angiotensin-II directly or indirectly participates in the post-ischemic damage, and the ability of an ACE inhibitor to attenuate this damage depends on ischemic time.

 Angiotensin I ischemia rats ventricular function

Effects of angiotensin-i and ischemia on functional recovery in isolated hearts

Ubirajara Oliveira de OliveiraI,II; Álvaro Reischak de OliveiraI; Luiz Carlos KucharskiI; Ubiratan Fabres MachadoIII; Maria Claudia IrigoyenI,III; Beatriz D'Agord SchaanI,II

IUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS

IIInstituto de Cardiologia - Fundação Universitária de Cardiologia, Porto Alegre, RS

IIIUniversidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil

Mailing Adress

ABSTRACT

BACKGROUND: Cardiac arrest resuscitation can present myocardial dysfunction determined by ischemic time, and inhibition of the angiotensin-converting enzyme (ACE) can reduce cardiac dysfunction during reperfusion.

OBJECTIVE: Investigar los efectos de la angiotensina-I y los diferentes períodos de la isquemia en la recuperación funcional en los corazones de ratones aislados.

METHODS: Isolated hearts from Wistar rats (n=45; 250-300 g) were submitted to different periods of global ischemia (20, 25 or 30 min) and reperfused (30 min) with Krebs-Henseleit buffer alone or with the addition of 400 nmol/L angiotensin-I, or 400 nmol/L angiotensin-I + 100 µmol/L captopril along the reperfusion period.

RESULTS: The maximal positive derivative of pressure (+dP/dtmax) and rate-pressure product were reduced in hearts exposed to 25 min ischemia (~73%) and 30 min ischemia (~80%) vs. 20 min ischemia. Left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and perfusion pressure (PP) were increased in hearts exposed to 25 min ischemia (5.5 and 1.08 fold, respectively) and 30 min ischemia (6 and 1.10 fold, respectively) vs. 20 min ischemia. Angiotensin-I caused a decrease in +dP/dtmax and rate-pressure product (~85-94%) in all ischemic periods and an increase in LVEDP and PP (6.9 and 1.25 fold, respectively) only at 20 min ischemia. Captopril was able to partially or completely reverse the effects of angiotensin-I on functional recovery in 20 min and 25 min ischemia.

CONCLUSIONS: These data suggest that angiotensin-II directly or indirectly participates in the post-ischemic damage, and the ability of an ACE inhibitor to attenuate this damage depends on ischemic time.

Keywords: Angiotensin I/drug effects; ischemia/complications; rats; ventricular function/drug effects.

Introduction

Cardiac arrest resuscitation has important clinical implications, mainly related to myocardial dysfunction, caused by the duration of the ischemia1,2 or by the stunning heart when the ischemia does not result in cell death3,4. However, when the duration of the myocardial ischemia increases, the contractile dysfunction may be due to combinations of reversible and irreversible processes (including apoptosis and/or necrosis)1,5. Paradoxically, reperfusion of the ischemic area can result in greater tissue injury, which is mainly mediated by reactive oxygen species that are toxic and can lead to oxidative damage of proteins, lipids, and DNA6,7.

In ischemic myocardium, the local inhibition of angiotensin-converting enzyme (ACE) can improve cardiac function and reduce the biochemical markers of cell necrosis8,9, thus suggesting the participation of angiotensin-II in tissue damage. Captopril is the most extensively studied ACE inhibitor, and can effectively reduce the extent of contractile dysfunction after myocardial infarction10,11.

The discovery of the local renin-angiotensin system has led to the search of new experimental approaches to evaluate the activity of this system. Angiotensin-I has been used to estimate the activity of ACE in tissue and in circulation, because it requires their conversion to angiotensin-II to determine a response12-14. In an isolated rat heart model, the release of angiotensin-II can only be maintained by adding renin and angiotensinogen12, or angiotensin-I12-14 to the perfusion buffer.

Despite the popularity of the use of isolated rat heart preparations in studies of ischemia-reperfusion injury, many different protocols have been employed with variations in the duration of ischemia15,16 and the degree of the metabolic disturbance17,18, making it difficult to compare the severity of the protocols. Additionally, most of these studies did not use angiotensin-I in the perfusate, hindering any conclusions about the effects of ACE inhibition. Since the rennin-angiotensin system is closely related to the aggravation of reperfusion injury11, the addition of angiotensin in the perfusate is required to obtain a good model in the investigation of pharmacological approaches that could really improve cardiac function after ischemia-reperfusion. Thus, this study investigated the effects of angiotensin-I and different periods of ischemia on functional recovery in isolated rat hearts.

Methods

Animals and Isolated Heart Preparation

Male Wistar rats (n=45; 250-300 g) were obtained from the Central Animal House of Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brazil. They were maintained on a 12 h/12 h light/dark cycle (lights on from 7 a.m. to 7 p.m.) in an air-conditioned colony room at constant temperature (22ºC), and had free access to commercial chow and water. Animal care followed the government guidelines in compliance with the COBEA (Brazilian College of Animal Experimentation) and was approved (nº 2004313) by the Ethics committee of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brazil.

Animals were killed by cervical dislocation, the hearts were excised quickly and perfused via aorta (Langendorff technique) by using an isolated heart apparatus - size 3 (Hugo Sachs Elektronik, Germany)19. The hearts were perfused with a modified Krebs-Henseleit buffer (composition in mmol/L: NaCl 120, KCl 5.4, MgCl2 1.8, NaHCO3 27, Na2SO4 1.8, NaH2PO4 2, glucose 5.5 and CaCl2 1.4), bubbled with 95% O2-5% CO2 (pH of 7.4), warmed to 37ºC and maintained a constant flow of 10 mL/min with a peristaltic pump (Miniplus-2, Gilson Medical Electronics, France). The perfusion buffer was previously filtered through a 0.45 mm membrane (Omnipore, Millipore) to remove any contaminant particles. A latex balloon connected to a pressure transducer (TPS-2 Incor, São Paulo, Brazil) through a cannula was inserted into the left ventricle (LV) to measure the contractile function. The balloon volume was adjusted to maintain an end-diastolic pressure of 8-10 mmHg at the beginning of the experiment. The hearts were immersed in a glass chamber kept at 37ºC by a water pump with a heater (M3 Lauda, Hugo Sachs Elektronik, Germany). Left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), heart rate (HR), maximal positive derivative of LV pressure (+dP/dtmax) and maximal negative derivative of LV pressure (-dP/dtmax) were measured throughout the experiment. Developed pressure (LVDP = systolic - diastolic pressure) and rate-pressure product (heart rate x developed pressure) were calculated. The perfusion pressure (PP) was measured continuously using a pressure transducer (TPS-2 Incor) connected to a side arm of the aortic cannula. The signals from the transducers were transmitted to a data acquisition and analysis system (Isoheart, Hugo Sachs Elektronik, Germany), where the data were continuously recorded for later analysis.

Reperfusion Protocol

After a stabilization period of 25 min, the hearts were submitted to different periods of global ischemia (20, 25 or 30 min) by stopping the perfusion flow. Then, they were reperfused for 30 min with Krebs-Henseleit alone (KH) or with addition of either 400 nmol/L angiotensin-I (Angio) or 400 nmol/L angiotensin-I + 100 µmol/L captopril (AC), by reestablishment of the perfusion flow. In order to ensure the physiologic functioning, the hearts that did not display a HR of at least 210 beats/min and an LVSP or PP of at least 60 mmHg at the end of the stabilization period were excluded.

Statistical Analysis

All parameters measured were expressed as a ratio of the baseline values (comparisons between data obtained before and after ischemia). Data are presented as means ± SEM. The groups were compared using two-way ANOVA for repeated measures followed by Tukey's post hoc test (Sigma Stat version 3.1 for Windows). A value of P < 0.05 was considered statistically significant.

RESULTS

All the isolated perfused hearts presented a similar baseline cardiovascular function (LVSP, LVEDP, LVDP, RPP, HR, PP, +dP/dtmax, and -dP/dtmax) prior to ischemia (Table 1). Hemodynamic data recorded after ischemic times are shown in Figure 1.

 

Changes in +/- dP/dtmax recovery are shown in Figure 1A: +/- dP/dtmax recovery was significantly reduced in the KH groups submitted to 25 and 30 min of ischemia (74 and 80%, respectively), as compared to the KH group submitted to 20 min of ischemia. Angiotensin-I caused a reduction of 87-94% in +/- dP/dtmax recovery in all ischemic periods as compared to baseline values. These effects of angiotensin-I were completely reverted by captopril in the protocol of 20 min of ischemia. However, after 25 min of ischemia, captopril was only able to reverse the effect of angiotensin-I on the -dP/dtmax recovery. After 30 min of ischemia, captopril did not reverse the effects of angiotensin-I.

Because the LVDP and rate-pressure product recoveries were almost identical, only the rate-pressure product recovery is presented (Figure 1B). The rate-pressure product was significantly reduced in the KH groups submitted to 25 and 30 min of ischemia (73 and 78%, respectively), as compared to the KH group submitted to 20 min of ischemia. Angiotensin-I caused a reduction of 85-93% in the rate-pressure product recovery in all ischemic periods as compared to baseline values. This effect of angiotensin-I was reverted by captopril in the groups submitted to 20 min and 25 min of ischemia (85% and 29%, respectively, from baseline values), but not in the protocol of 30 min of ischemia.

Figure 1C represents the LVEDP, which was significantly increased during reperfusion in the KH groups submitted to 25 and 30 min of ischemia (5.5 and 6 fold, respectively), as compared to the KH group submitted to 20 min of ischemia. Angiotensin-I caused an approximate 6.9 fold increase in LVEDP recovery as compared to the KH group submitted to 20 min of ischemia; this effect was reverted by captopril. However, in groups submitted to 25 and 30 min of ischemia, neither angiotensin-I nor captopril had any significant effect on LVEDP.

The PP, depicted in Figure 1D, was significantly increased during reperfusion in the KH groups submitted to 25 and 30 min of ischemia (1.08 and 1.10 fold, respectively) as compared to the KH group submitted to 20 min of ischemia. Angiotensin-I caused an approximate 1.25 fold increase in PP recovery as compared to the KH group submitted to 20 min of ischemia; this effect was partially reverted by captopril. However, in the groups submitted to 25 and 30 min of ischemia, neither angiotensin-I nor captopril had any significant effect on PP.

There were no significant differences in LVSP or HR (data not shown) among the groups, in different protocols of ischemia. There was no interaction between the factors analyzed (treatments and time of reperfusion).

Discussion

This study showed that, in the isolated rat heart model, twenty minutes of global ischemia results in mild/moderate contractile dysfunction, while longer periods of ischemia can lead to severe contractile dysfunction. Moreover, the effects of angiotensin-I and captopril on functional recovery were better demonstrated when hearts were submitted to 20 min of ischemia. This is the first study evaluating the functional recovery and responsiveness of ACE in rat hearts submitted to three different ischemic periods.

In the isolated heart model, both ischemia and reperfusion induce the release of cardiac enzymes16-18,20. However, though important, the results shown are inconsistent and illustrate the lack of standardization between different assays and/or sensitivity of the methods used. Furthermore, data are frequently expressed in various different units (unit/mg protein, unit/g dry wt, etc), making it difficult to compare the results. Because of this, we preferred to use multiple functional indices to assess the extent of tissue injury in the ischemic heart, as we considered that this approach would be more reproducible.

The time-course of cardiovascular changes induced by global ischemia (20, 25 and 30 min) in the isolated rat heart model showed that when the hearts were exposed to 20 min of ischemia, the functional recovery was reduced in the early phase of reperfusion, but not at the end of reperfusion (30 min), suggesting that the degree of tissue damage was mild to moderate. However, when the ischemic period was increased to 25 or 30 min, a marked decrease in functional recovery was observed, as indicated by the lower +/- dP/dtmax and rate-pressure product and by the higher LVEDP and PP along the reperfusion period. Thus, when the ischemic time exceeds 20 min, the consequence is myocardial contracture, suggesting a high degree of tissue damage. This is probably the cause of the lower responsiveness demonstrated by the cardiac tissue when the period of ischemia was increased from 25 to 30 min.

These findings are in consistency with previous functional and metabolic data from Wang et al21 and Palmer et al16 who reported that mild post-ischemic dysfunction occurred when short periods of global ischemia (15-20 min) were employed, but observed a severe myocardial dysfunction with persistent increase of creatine kinase after 25 min of ischemia, suggesting irreversible myocardial injury. These results, together with those of this study, suggest that the transition from mild/moderate to severe tissue damage occurs after 20 min of global ischemia. However, changes in the perfusion buffer [e.g. substrate concentration and/or composition22, flow23, and temperature24] could modify this ischemic threshold.

Many reports confirm that ACE activity is present in the cardiac tissue and that the renin-angiotensin system can modulate cardiovascular homeostasis, via its local and systemic systems12-14,25. However, in the isolated rat heart model, the substrate (angiotensin-I) should be added in the perfusate to study the local ACE12-14. In this study, the addition of angiotensin-I to the perfusate resulted in a marked decrease in LV functional recovery, as indicated by the lower +/- dP/dtmax and rate-pressure product in all the tested periods of ischemia. This is also supported by the higher LVEDP and PP found in groups submitted to 20 min of ischemia. Earlier reports also showed that angiotensin-I and angiotensin-II reduced cardiac contractility and/or constrict coronary arteries9,15, but other authors did not observe any deleterious effect induced by these compounds26. The deleterious effects of angiotensin in cardiac function may involve increased ROS production, since studies indicate that angiotensin-II could stimulate NADPH oxidase27.

The effects of angiotensin-I on LV functional recovery were totally or partially reversed by captopril, in the groups submitted to 20 and 25 (but not to 30) min of ischemia, suggesting that they depend on the local conversion to angiotensin-II. Multiple factors are likely to have a role in the protective effect of ACE inhibitors in ischemia-reperfusion injury: they decrease leukocyte infiltration28, possess anti-inflammatory effects29 and free radical scavenging properties30, and effect mediated by increase the levels of bradykinin and prostaglandin31. Because ACE inhibition can increase circulating levels of angiotensin-(1-7)32, this may mediate some of these cardiovascular effects33,34. The inability of captopril to completely abolish the responses mediated by angiotensin is possibly due to the intrinsic activity of the angiotensin-I, since the formation of angiotensin-II in intact rat hearts is mainly ACE-dependent12,13. Nevertheless, many alternative pathways to form angiotensin-II (chymase, kallikrein and cathepsin G) could be activated in several pathological conditions such as ischemia, hypercholesterolemia, hypertension and inflammation35.

These results showed that the LV functional recovery was significantly depressed and proportionally less affected by angiotensin-I or captopril, when the heart was exposed to more than 20 min of ischemia. Thus, the low responsiveness of cardiac tissue to drugs is due to ischemic contracture rather than the possible exhaustion of cardiac ACE.

In conclusion, 20 min of global ischemia is probably the best period for the study of mild to moderate myocardial contractile dysfunction, at a level that can be alleviated or exacerbated by the drugs tested. Longer periods of ischemia lead to much more intense myocardial damage, with the development of ischemic contracture, which cannot be reversed by drugs tested during the reperfusion period. Thus, pharmacological approaches tested during these periods may have no effect for methodological reasons. Furthermore, these data suggest that angiotensin-II directly or indirectly participates in the post-ischemic damage, and the ability of an ACE inhibitor in attenuate it depends on the ischemic time.

Acknowledgements

The authors would like to thank Ms. Tania R.G. Fernandes (Instituto de Ciências Básicas da Saúde/Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICBS/UFRGS) for her technical assistance.

This research was supported by grants from CAPES, CNPq, FAPESP and FAPERGS, Brazilian Research Agencies.

The authors report no conflicts of interest related to the content of this manuscript.

References

Mailing Adress:

Ubirajara Oliveira de Oliveira

Av. Princesa Isabel, 370 - Unidade de Pesquisa - Santana

90620-001 - Porto Alegre, RS, Brazil

E-mail: biraoliveira@yahoo.com, biraoliva@gmail.com

Manuscript received December 22, 2010; revised manuscript received February 18, 2011; accepted February 25, 2011.