abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil s35S4WxyN3nhFHxrPgm9KbR 00008 S0066-782X2011001300008 S0066-782X(11)09700408 10.1590/S0066-782X2011005000091 Artigos Originais Inibição da corrente de cálcio tipo L por tramadol e enantiômeros em miócitos cardíacos de ratos Medei Emiliano Raimundo Juliana M. Nascimento José Hamilton M. Trachez Margarete M. Sudo Roberto T. Zapata-Sudo Gisele Rio de Janeiro Rio de Janeiro Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Desenvolvimento de Fármacos Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Brazil Niterói Rio de Janeiro Universidade Federal Fluminense Serviço de Anestesiologia Brazil 10 2011 97 4 324 331 04 11 2010 04 11 2010 08 04 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: O tramadol é um analgésico de ação central cujo mecanismo de ação envolve a ativação de um receptor opioide. Anteriormente, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros apresentavam um efeito inotrópico negativo sobre o músculo papilar no qual o (+)-enantiômero era mais potente que (-)- e (±)-tramadol. OBJETIVO: No presente trabalho, investigamos os efeitos do tramadol e seus enantiômeros na corrente de cálcio tipo L (I Ca-L). MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em miócitos ventriculares isolados de ratos Wistar utilizando a técnica de patch-clamp com configuração de célula inteira. RESULTADOS: O tramadol (200 µM) reduziu a amplitude de pico do I Ca-L em potenciais de 0 a +50 mV. Em 0 mV, a I Ca-L foi reduzida em 33,7 ± 7,2%. (+)- e (-)-tramadol (200 µM) produziram uma inibição semelhante da I Ca-L, na qual a amplitude do pico foi reduzida em 64,4 ± 2,8% e 68,9 ± 5,8%, respectivamente a 0 mV (P > 0,05). O tramadol, (+)- e (-)-tramadol mudaram a inativação de estado estacionário de I Ca-L para potenciais de membrana mais negativos. Além disso, tramadol e (+)-tramadol alteraram significativamente a curva de recuperação dependente de tempo da I Ca-L para a direita e reduziram a recuperação de I Ca-L da inativação. A constante de tempo foi aumentada de 175,6 ± 18,6 a 305,0 ± 32,9 ms (P < 0,01) para o tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms para 359,0 ± 23,8 ms (P < 0,05) para o (+)-tramadol. O agonista do receptor µ-opioide (DAMGO) não tem nenhum efeito na I Ca-L. CONCLUSÃO: A inibição da I Ca-L induzida por tramadol e seus enantiômeros não teve relação com a ativação de receptores opioides e poderia explicar, pelo menos em parte, seu efeito inotrópico negativo cardíaco.

 Tramadol canais de cálcio tipo L miócitos cardíacos ratos 30 09 2011

Inibição da corrente de cálcio tipo L por tramadol e enantiômeros em miócitos cardíacos de ratos

Emiliano MedeiII; Juliana M. RaimundoI; José Hamilton M. NascimentoII; Margarete M. TrachezIII; Roberto T. SudoI; Gisele Zapata-SudoI

IPrograma de Desenvolvimento de Fármacos, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ

IIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ

IIIRio de Janeiro, RJ; Serviço de Anestesiologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: O tramadol é um analgésico de ação central cujo mecanismo de ação envolve a ativação de um receptor opioide. Anteriormente, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros apresentavam um efeito inotrópico negativo sobre o músculo papilar no qual o (+)-enantiômero era mais potente que (-)- e (±)-tramadol.

OBJETIVO: No presente trabalho, investigamos os efeitos do tramadol e seus enantiômeros na corrente de cálcio tipo L (ICa-L).

MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em miócitos ventriculares isolados de ratos Wistar utilizando a técnica de patch-clamp com configuração de célula inteira.

RESULTADOS: O tramadol (200 µM) reduziu a amplitude de pico do ICa-L em potenciais de 0 a +50 mV. Em 0 mV, a ICa-L foi reduzida em 33,7 ± 7,2%. (+)- e (-)-tramadol (200 µM) produziram uma inibição semelhante da ICa-L, na qual a amplitude do pico foi reduzida em 64,4 ± 2,8% e 68,9 ± 5,8%, respectivamente a 0 mV (P > 0,05). O tramadol, (+)- e (-)-tramadol mudaram a inativação de estado estacionário de ICa-L para potenciais de membrana mais negativos. Além disso, tramadol e (+)-tramadol alteraram significativamente a curva de recuperação dependente de tempo da ICa-L para a direita e reduziram a recuperação de ICa-L da inativação. A constante de tempo foi aumentada de 175,6 ± 18,6 a 305,0 ± 32,9 ms (P < 0,01) para o tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms para 359,0 ± 23,8 ms (P < 0,05) para o (+)-tramadol. O agonista do receptor µ-opioide (DAMGO) não tem nenhum efeito na ICa-L.

CONCLUSÃO: A inibição da ICa-L induzida por tramadol e seus enantiômeros não teve relação com a ativação de receptores opioides e poderia explicar, pelo menos em parte, seu efeito inotrópico negativo cardíaco.

Palavras-chave: Tramadol, canais de cálcio tipo L, miócitos cardíacos, ratos.

Introdução

O tramadol (1RS, 2RS), -2- [(dimetilamino) - metil] -1- (3-metoxifenil) - cloridrato de ciclohexanol é um analgésico sintético de ação central, com eficácia comparável a codeína, pentazocina ou dextropropoxifeno, quando utilizado para o alívio da dor1. O mecanismo de sua ação analgésica envolve uma combinação de ligação aos receptores µ-opioide. Esse duplo mecanismo de ação levou a uma descrição do tramadol como um agente opioide "atípico"2. O tramadol ((±)-tramadol) é formulado como uma mistura racêmica de (-)- e (+)-tramadol com diferentes ações farmacológicas. O (+)-tramadol possui alta afinidade com receptores µ-opioide, inibindo preferencialmente a recaptação da serotonina e promovendo um aumento na liberação de serotonina. No entanto, o (-)-tramadol possui baixa afinidade com receptor µ-opioide e inibe a recaptação de norepinefrina3. As ações complementares e sinérgicas dos dois enantiômeros melhoram o perfil analgésico da mistura racêmica4. O principal metabólito do tramadol, o O-desmetiltramadol contribui para o efeito analgésico porque possui uma afinidade 300 vezes maior com receptores µ-opioide que o tramadol5. Evidenciou-se que o tramadol afeta os receptores 5-HT6, muscarínico7,8, nicotínico9, NMDA e GABAA10. Além disso, os canais do K+ dependente de tensão e do Na+ estão envolvidos no efeito antinociceptivo e anestésico do tramadol, respectivamente11,12. Há informações limitadas sobre os efeitos do tramadol em sistemas que não sejam o sistema nervoso central. Ademais, poucos estudos compararam os efeitos do tramadol e seus enantiômeros. Em um estudo anterior, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros induziam o relaxamento da aorta pré-contraída de ratos, que foi estereosseletiva de (+)-tramadol13. Além disso, mostramos que o tramadol reduziu a contratilidade do músculo cardíaco de ratos13. O possível mecanismo envolvido no fenômeno poderia ser a inibição da corrente de cálcio tipo L (ICa-L), relacionada com a ativação de um receptor que modula a ICa-L e/ou com um efeito direto no canal.

Para avaliar o papel dos canais de Ca2+ tipo L na ação inotrópica negativa cardíaca do tramadol e seus enantiômeros, investigamos os seus efeitos sobre as corrente de Ca2+ tipo L (ICa-L) em miócitos ventriculares de ratos. As comparações entre esses compostos foram conduzidas utilizando a concentração (200 µM), que tinha induzido efeito inotrópico negativo em músculos cardíacos de ratos13.

Métodos

O Comitê de Cuidados e Usos de Animais na Universidade Federal do Rio de Janeiro aprovou os protocolos utilizados.

Isolamento de cardiomiócitos

Os corações de ratos Wistar machos (250-350 g) foram rapidamente removidos e montados em um sistema Langendorff modificado. Eles foram perfundidos retrogradamente através da aorta durante 5 min. a 10 ml.min-1 com solução de Tyrode oxigenada (em mM: 132,0 NaCl, 1,0 CaCl2, 1,2 MgCl2, 4,0 KCl, 10,0 HEPES, e 5,0 glicose; pH 7,3) a 33-35ºC. Os miócitos ventriculares foram enzimaticamente isolados após uma perfusão de 10 min. com solução nominalmente livre de Ca2+ contendo colagenase tipo II (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ; 150 U/mL). A enzima foi lavada por perfusão com solução de Tyrode livre de Ca2+-. Os miócitos isolados foram mantidos em solução de Kb (em mM: 1,0 de MgCl2, 30,0 de KCl, 10,0 de KH2PO4, 10,0 de HEPES, 10,0 de glicose, 70,0 de ácido glutâmico, 0,3 de EGTA, 20,0 de taurina; pH de 7,3) em temperatura ambiente até o uso. Eles foram colocados na câmara de registro montada sobre a mesa de um microscópio invertido (Axiovert 40 CFL, Zeiss) e perfundidos em 5 ml.min-1 com solução de Tyrode a 35ºC.

Estudos eletrofisiológicos

Os registros de correntes Ca2+ foram obtidos usando a configuração de célula inteira da técnica de patch-clamp14 através de um amplificador Axopatch de 200B (Axon Instruments, Cidade de Foster, CA). Os pulsos de tensão foram gerados pelo software pClamp e uma interface digital (Digidata 1200, Axon Instruments, Cidade de Foster, CA). As micropipetas foram preparadas com capilares de vidro borossilicato e apresentavam resistência de 4-7 MΩ, quando preenchidos com solução de pipeta (em mM: 110,0 CsCl, 5,0 ATP-Mg, 0,1 GTP, 10,0 EGTA, 10,0 HEPES e 30,0 TEA-Cl; pH de 7,1). As correntes foram filtradas com filtros de passagem baixa a 1 KHz e digitalizados a 2 KHz. As relações corrente-tensão foram determinadas através de degrau de tensão de 500 ms partindo de um potencial de membrana de -40 mV para potenciais de teste que variavam de -50 a +60 mV, em incrementos de 10 mV durante 500 ms 5 min. antes e depois da perfusão com tramadol de 200 µM. O valor de pico de ICa-L foi expresso relativamente à capacitância celular (pA/pF) e apresentado como uma média ± EPM. As curvas de ativação em estado estacionário (d) e inativação em estado estacionário (f) foram equipadas com uma função de Boltzmann: d (ou f) = 1/[1 + exp (Vm-V0.5)/k], na qual Vm era o potencial de membrana, V1/2 era o potencial de meia ativação/inativação máxima e k, o fator de inclinação.

Substâncias

O tramadol racêmico e seus enantiômeros foram generosamente doados pela Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos (Itapira, São Paulo, Brasil) e foram dissolvidos em água destilada a uma concentração de estoque de 50 mM. A colagenase tipo II, taurina, cloreto de tetraetilamônio (TEA-Cl), HEPES, ácido glutâmico, EGTA, CsCl, MgATP, GTP e tetrodotoxina (TTX) foram adquiridos da Sigma.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± SEM. As comparações entre grupos foram realizadas utilizando a ANOVA DE UM FATOR com o teste de comparação múltipla de Bonferroni (pares de coluna selecionados). Enquanto as comparações intragrupo foram realizadas utilizando medidas repetidas de ANOVA DE UM FATOR com o teste de comparação múltipla de Bonferroni (pares de coluna selecionados). As diferenças estatísticas foram consideradas significativas quando p < 0,05.

Resultados

Efeito do tramadol e enantiômeros na relação corrente-tensão de ICa-L

A figura 1A mostra um traçado representativo de correntes de Ca2+ internas registrado de miócitos ventriculares de ratos a 0 mV na ausência e presença de (±)-tramadol de 200 µM (Fig. 1 acima) e seus enantiômeros (Fig. 1 meio e abaixo). Os valores médios de ICa-L em diferentes potenciais (-50 a 60 mV) foram plotados em curvas I-V antes e depois do tratamento com (±)- (Fig. 1B acima), (+)- (Fig. 1B no meio) e (-)-tramadol (Fig. 1B abaixo). Após a perfusão de cada enantiômero, a amplitude do pico de ICa-L foi significativamente (p < 0,05) reduzida em potenciais mais despolarizados do que -20 mV, enquanto, com o (±)-tramadol, a redução foi significativa em potenciais mais positivos do que 0 mV (p <0.05). O (±)-tramadol inibiu significativamente a amplitude do pico de ICaL que foi reduzido em 33,7 ± 7,2% a 0 mV. Não houve diferença na inibição da corrente de pico induzida pela enantiômeros, (+)-tramadol (64,4 ± 2,8%) e (-)-tramadol (68,9 ± 5,8%). No entanto, a inibição da ICa-L induzida pelos dois enantiômeros foi significativamente maior do que a induzida pela (±)-tramadol (p < 0,01 vs (+)-tramadol; p < 0,001 (-)-tramadol). A redução foi parcialmente revertida após uma lavagem de 10 minutos.

Efeito do tramadol e enantiômeros na ativação de ICa-L

As curvas de ativação foram construídas com base na relação corrente-tensão, dividindo a amplitude da ICa-L em cada potencial pela força motriz (Fig. 2). O (±)-tramadol diminuiu o V1/2 da curva de ativação em estado estacionário da ICa-L, sem mudanças no valor de k. Na condição de controle, V1/2 era de -17,5 ± 2,1 mV e k era de 4,2 ± 0,2 mV e, na presença do (±)-tramadol, V1/2 era de -21,0 ± 2,2 mV (p < 0,05) e k era de 3,6 ± 0,3 mV (p > 0,05). Por outro lado, os enantiômeros não alteraram a curva de ativação em estado estacionário de ICa-L (Tab. 1).

*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005 comparado com o controle no mesmo grupo (medidas repetidas de ANOVA DE UM FATOR com pares de coluna selecionados comparados com o teste de Bonferroni). # p < 0,01, & p < 0,001 comparado com (±)-tramadol, comparação entre grupos (ANOVA DE UM FATOR com teste de comparação múltipla de Bonferroni de todos os pares de colunas). V1/2 - potencial de meia ativação/inativação máxima; k - fator de inclinação.

Efeito do tramadol e enantiômeros na ativação de ICa-L

A inativação em estado estacionário da ICa-L foi medida utilizando um protocolo de pulso duplo clássico. Foram aplicadas etapas de pré-condicionamento de 1600 ms, de -60 a +60 mV, em intervalos de 10 mV a partir de um potencial de membrana de -40 mV, seguidas de um pulso de teste de 600 ms a 0 mV. A corrente de pico induzida por pulsos de teste foi normalizada à corrente máxima e plotada relativamente ao potencial de pré-condicionamento. O (±)-tramadol e seus enantiômeros alteraram as curva de inativação em estado estacionário para potenciais mais negativos (Fig. 3) e mudou o V1/2 da inativação (Tab. 1).

Na verdade, o V1/2 da inativação dos enantiômeros era significativamente diferente quando comparado com (±)-tramadol ((+)-tramadol p < 0,01 e (-)-tramadol p < 0,001 comparado com (±)-tramadol). No entanto, apenas o (-)-tramadol alterou o valor de k (controle, 3,8 ± 0,1 mV; (-)-Tramadol, 4,9 ± 0,3 mV; p < 0,01). Não foram observadas diferenças na média do valor de k entre os grupos.

Efeito do tramadol e enantiômeros na recuperação de ICa-L da inativação

Os efeitos do (±)-tramadol e seus enantiômeros na cinética de recuperação da ICa-L da inativação foram estudados utilizando um protocolo de pulso duplo que consiste em um pré-pulso de 500 ms a 0 mV, seguido de um pulso de teste de 500 ms a 0 mV, depois de um intervalo interpulsos variável (0 a 2.500 ms) de um potencial de membrana de -40 mV, a cada 10 s. O (±)- e (+)-tramadol alterou a curva de recuperação dependente do tempo para a direita e retardou a recuperação da inativação (Fig. 4). A recuperação da inativação poderia ser ajustada a um exponencial simples, onde a constante de tempo (t) era aumentada de 175,6 ± 18,6 ms a 305,0 ± 32,9 ms (p < 0,01) para (±)-tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms a 359,0 ± 23,8 ms(p < 0,05)para (+)-tramadol. O (-)-tramadol não modificou o período para a recuperação do ICa-L. Não foram observadas diferenças na média do valor da constante de tempo (t)entre os grupos.

Efeito do agonista do receptor µ-opióide (DAMGO) na ICa-L dos cardiomiócitos dos ratos

No presente trabalho, nossos resultados mostraram que o tramadol e seus enantiômeros inibem a ICa-L. O possível mecanismo envolvido nesse efeito poderia ser um resultado da ativação dos receptores µ-opioide. Para verificar essa hipótese, efetuamos testes para averiguar se o agonista do receptor µ-opióide (DAMGO) modulava a ICa-L em cardiomiócitos de ratos. Dessa forma, a figura 5 mostra que o DAMGO não tem nenhum efeito sobre as correntes de cálcio ativadas por pulsos despolarizantes a 0 mV (Controle: -449,7 ± 4,4 pA vs DAMGO: -416,9 ± 2,7 pA; n = 3; p > 0,05).

Discussão

No presente trabalho, nossos dados mostraram a diferença na eficácia dos enantiômeros tramadol para inibir a ICa-L (~ 60%) quando comparados com a mistura racêmica (~30%). Em contraste, no nosso trabalho anterior, o efeito inotrópico negativo sobre os músculos papilares de ratos observados a 200 µM apresentou a seguinte ordem de potência (IC50): (+)-tramadol > (-)-tramadol > (±)-tramadol13. Essa diferença entre as respostas da célula e do tecido poderia ser devida a uma possível inibição da recapturação de monoamina pelo tramadol e seus enantiômeros no músculo papilar estimulado eletricamente. Demonstrou-se que a liberação acionada eletricamente da noradrenalina pelas terminações nervosas simpáticas no músculo cardíaco isolado e a amplitude da contração são diminuídas por anestésicos locais15. Diferentes atividades do tramadol foram designadas como estereosseletivas, incluindo a ativação do receptor opioide3,16, a inibição da recapturação de monoamina17,18, o efeito analgésico3 e o relaxamento vascular13,19. No entanto, o presente estudo demonstrou que os enantiômeros do tramadol (200 µM) diminuíram ICa-L (~60%), indicando um bloqueio específico de um não enantiômero de canais de Ca2+ do tipo L. O tramadol racêmico produziu uma inibição de menor porte da ICa-L(~ 30%) quando comparado aos seus enantiômeros, o que poderia ser correlacionado com a pequena potência do racêmico na redução da contratilidade cardíaca13. O tramadol e os enantiômeros alteraram de maneira diferente a cinética do ICa-L. O (±)- e (+)-tramadol alterou a curva de inativação em estado estacionário da ICa-L para os potenciais de membrana mais negativos e retardou significativamente a recuperação de ICa-L da inativação. O (-)-tramadol alterou substancialmente apenas a inativação da ICa-L. Os efeitos do tramadol na ICa-L podem estar relacionados com a ativação de um receptor que modula a ICa-L e/ou a um efeito direto sobre o canal. No entanto, o efeito do tramadol na ICa-L parece não estar relacionado à ativação dos receptores opióides. O tramadol se liga preferencialmente a m-receptores, que foram demonstradas estar ausentes no coração de mamíferos20-23. De fato, os nossos resultados não mostraram efeito do antagonista de m-receptor DAMGO na ICa-L cardíaca. Além disso, foi demonstrado que os efeitos cardíacos dos opioides poderiam ser ou não dependentes de receptores opioides. Constatou-se que os efeitos da morfina sobre as correntes iônicas em miócitos cardíacos eram independentes do receptor opioide24 ou eram mediados por receptores de d e k25. No entanto, reconhece-se que o seu efeito cardioprotetor advém da ativação de receptores de d26,27. Estudos vêm mostrando que os opioides como o dextropropoxifeno, petidina e a leucina encefalina reduzem a ICa-L, mas que apenas a redução induzida pelo agonista do receptor de d (leucina encefalina) era bloqueada pela naxolona28,29. Os efeitos do tramadol em outras correntes iônicas também sugere um efeito direto nos canais de Ca2+ do tipo L. Haeseler e cols.12 mostraram que o tramadol, o sufentanil e o fentanil, mas não a morfina, bloqueiam os canais de Na+ neuronais expressos heterogeneamente por NaV1.2. É importante notar que a potência para bloquear a corrente de sódio era independente da potência do respectivo receptor opioide do composto. Também há relatos de que o tramadol bloqueia a corrente de K+ retificadora tardia (IK(DR) nas células neuronais NG108-15 de uma forma dependente de concentração30. Conforme observado em nosso estudo para a ICa-L, o tramadol alterou a curva de inativação em estado estacionário da IK IK(DR para potenciais mais negativos30.

Conclusão

A eficácia dos enantiômeros do tramadol na inibição da ICa-L foi o dobro do observado com o (±)-tramadol e esse efeito parece não estar relacionado com a ativação de receptores opioides.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda. (BR), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, BR), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes, BR), Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB, BR), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (Faperj, BR) pelo apoio financeiro e pelas bolsas de estudos da Capes (para JMR) e CNPq (para GZS, RTS). Nenhum dos autores possui qualquer conflito de interesse ou interesse financeiro na divulgação.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq, CAPES e FAPERJ.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Doutorado de Juliana M. Raimundo pela Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Gisele Zapata-Sudo

Programa de Desenvolvimento de Fármacos, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Instituto de Ciências Biomédicas

Bloco J, Sala 14

21941-590 - Rio de Janeiro, Brasil

E-mail:

gsudo@farmaco.ufrj.br

Artigo recebido em 04/11/10, revisado recebido em 04/11/10; aceito em 08/04/11.

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BACKGROUND: Tramadol is a centrally acting analgesic, whose mechanism of action involves opioid-receptor activation. Previously, we have shown that tramadol and its enantiomers had a negative inotropic effect on the papillary muscle in which the (+)-enantiomer is more potent than (-)- and (±)-tramadol. OBJECTIVE: In this study, we investigated the effects of tramadol and its enantiomers on L-type calcium current (I Ca-L). RESULTS: Tramadol (200 µM) reduced the peak amplitude of I Ca-L at potentials from 0 to +50 mV. At 0 mV, I Ca-L was reduced by 33.7 ± 7.2%. (+)- and (-)-tramadol (200 µM) produced a similar inhibition of I Ca-L, in which the peak amplitude was reduced by 64.4 ± 2.8% and 68.9 ± 5.8%, respectively at 0 mV (p > 0.05). Tramadol, (+)- and (-)-tramadol shifted the steady-state inactivation of I Ca-L to more negative membrane potentials. Also, tramadol and (+)-tramadol markedly shifted the time-dependent recovery curve of I Ca-L to the right and slowed down the recovery of I Ca-L from inactivation. The time constant was increased from 175.6 ± 18.6 to 305.0 ± 32.9 ms (p < 0.01) for tramadol and from 248.1 ± 28.1 ms to 359.0 ± 23.8 ms (p < 0.05) for (+)-tramadol. The agonist of µ-opioid receptor DAMGO had no effect on the I Ca-L. CONCLUSION: The inhibition of I Ca-L induced by tramadol and its enantiomers was unrelated to the activation of opioid receptors and could explain, at least in part, their negative cardiac inotropic effect.

 Tramadol calcium channels, L-type myocytes, cardiac rats

Emiliano MedeiII; Juliana M. RaimundoI; José Hamilton M. NascimentoII; Margarete M. TrachezIII; Roberto T. SudoI; Gisele Zapata-SudoI

IPrograma de Desenvolvimento de Fármacos, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ

IIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ

IIIServiço de Anestesiologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Tramadol is a centrally acting analgesic, whose mechanism of action involves opioid-receptor activation. Previously, we have shown that tramadol and its enantiomers had a negative inotropic effect on the papillary muscle in which the (+)-enantiomer is more potent than (-)- and (±)-tramadol.

OBJECTIVE: In this study, we investigated the effects of tramadol and its enantiomers on L-type calcium current (ICa-L).

METHODS: The experiments were carried out in isolated Wistar rat ventricular myocytes by using the whole cell patch clamp technique.

RESULTS: Tramadol (200 µM) reduced the peak amplitude of ICa-L at potentials from 0 to +50 mV. At 0 mV, ICa-L was reduced by 33.7 ± 7.2%. (+)- and (-)-tramadol (200 µM) produced a similar inhibition of ICa-L, in which the peak amplitude was reduced by 64.4 ± 2.8% and 68.9 ± 5.8%, respectively at 0 mV (p > 0.05). Tramadol, (+)- and (-)-tramadol shifted the steady-state inactivation of ICa-L to more negative membrane potentials. Also, tramadol and (+)-tramadol markedly shifted the time-dependent recovery curve of ICa-L to the right and slowed down the recovery of ICa-L from inactivation. The time constant was increased from 175.6 ± 18.6 to 305.0 ± 32.9 ms (p < 0.01) for tramadol and from 248.1 ± 28.1 ms to 359.0 ± 23.8 ms (p < 0.05) for (+)-tramadol. The agonist of µ-opioid receptor DAMGO had no effect on the ICa-L.

CONCLUSIONS: The inhibition of ICa-L induced by tramadol and its enantiomers was unrelated to the activation of opioid receptors and could explain, at least in part, their negative cardiac inotropic effect.

Keywords: Tramadol; calcium channels, l-Type; myocytes, cardiac; rats.

Introduction

Tramadol (1RS, 2RS), -2- [(dimethylamino) - methyl] -1- (3-methoxyphenyl) - cyclohexanol hydrochloride, is a synthetic, centrally acting analgesic with effectiveness comparable to codeine, pentazocine or dextropropoxyphene when used for pain relief1. The mechanism of its analgesic action involves a combination of binding to µ-opioid receptors and the inhibition of the reuptake of serotonin and noradrenaline in pain pathways of the central nervous system (CNS). This dual mechanism of action has led to a description of tramadol as an "atypical" opioid agent2. Tramadol ((±)-tramadol) is formulated as a racemic mixture of (-)- and (+)-tramadol with different pharmacological actions. (+)-Tramadol has high affinity with µ-opioid receptors, inhibits preferentially serotonin uptake and promotes an increase of serotonin release. Nevertheless, (-)-tramadol has low affinity with µ-opioid receptors and inhibits norepinephrine uptake3. The complementary and synergistic actions of both enantiomers improve the analgesic profile of the racemate4. The main metabolite of tramadol, O-desmethyltramadol, seems to contribute to the analgesic effect because it has approximately a 300-fold greater affinity with µ-opioid receptors than tramadol5. Tramadol has been shown to affect 5-HT6, muscarinic7,8, nicotinic9, NMDA and GABAA10 receptors. Also, voltage-dependent K+ and Na+ channels are involved in the antinociceptive and anesthetic effect of tramadol, respectively11,12. Limited information about the effects of tramadol on systems other than the central nervous system is available and few studies have compared the effects of tramadol and its enantiomers. In a previous study, we showed that tramadol and its enantiomers induced relaxation of precontracted rat aorta, which was stereoselective to (+)-tramadol13. Also, we have shown that tramadol reduced the contractility of rat cardiac muscle13. The possible mechanism involved in this phenomenon could be the inhibition of L-type calcium current (ICa-L), related to the activation of a receptor that modulates ICa-L and/or to a direct effect on the channel.

In order to evaluate the role of L-type Ca2+ channels on the negative cardiac inotropic action of tramadol and its enantiomers, we investigated their effects on the L-type Ca2+ currents (ICa-L) of rat ventricular myocytes. Comparisons among these compounds were done using the concentration (200 µM) that had induced negative inotropic effect on rat cardiac muscle13.

Methods

The Animal Care and Use Committee at Universidade Federal do Rio de Janeiro approved the protocols used.

Isolation of Cardiomyocytes

Hearts from male Wistar rats (250-350 g) were rapidly removed and mounted on a modified Langendorff system. They were retrogressively perfused through the aorta for 5 min at 10 ml.min-1 with oxygenated Tyrode solution (in mM: 132.0 NaCl, 1.0 CaCl2, 1.2 MgCl2, 4.0 KCl, 10.0 HEPES, and 5.0 glucose; pH 7.3) at 33-35ºC. Ventricular myocytes were enzymatically isolated after 10 min perfusion with nominally Ca2+-free solution containing collagenase type II (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ; 150 U/ml). The enzyme was washed out by perfusion with Ca2+-free Tyrode solution. Isolated myocytes were maintained in Kb solution (in mM: 1.0 MgCl2, 30.0 KCl, 10.0 KH2PO4, 10.0 HEPES, 10.0 glucose, 70.0 glutamic acid, 0.3 EGTA, 20.0 taurine; pH 7.3) at room temperature until use. They were placed in the recording chamber mounted on the stage of an inverted microscope (Axiovert 40 CFL, Zeiss) and perfused at 5 ml.min-1 with Tyrode solution at 35ºC.

Electrophysiological studies

Recordings of Ca2+ currents were obtained by using the whole-cell configuration of the patch-clamp technique14 through an Axopatch 200B amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA). Voltage pulses were generated by pClamp software and a digital interface (Digidata 1200, Axon Instruments, Foster City, CA). Micropipettes were prepared with borosilicate glass capillaries and had a resistance of 4-7 MΩ when filled with pipette solution (in mM: 110.0 CsCl, 5.0 ATP-Mg, 0.1 GTP, 10.0 EGTA, 10.0 HEPES, and 30.0 TEA-Cl; pH 7.1). Currents were low-pass filtered at 1 KHz and digitized at 2 KHz. Current-voltage relationships were determined through 500ms voltage step from a holding potential of -40 mV to test potentials ranging from -50 to +60 mV, in 10 mV increments during 500 ms before and after 5 min of perfusion with 200 µM tramadol. Peak ICa-L value was expressed as relative to cell capacitance (pA/pF) and presented as mean ± SEM. Steady-state activation (d) and steady-state inactivation (f) curves were fitted with a Boltzmann function: d (or f) = 1/[1 + exp (Vm-V0.5)/k], where Vm was the membrane potential, V1/2 was the potential of half maximum activation/inactivation and k the slope factor.

Substances

Racemic tramadol and its enantiomers were generously donated by Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos (Itapira, São Paulo, Brazil) and were dissolved in distilled water at a stock concentration of 50 mM. Collagenase type II, taurine, tetraethylammonium chloride (TEA-Cl), HEPES, glutamic acid, EGTA, CsCl, MgATP, GTP and tetrodotoxin (TTX) were purchased from Sigma.

Statistical analysis

Data were presented as mean ± SEM. Intergroup comparisons were performed using ONE-WAY ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (selected pairs of column). While, intragroup comparisons were performed using repeated measures ONE-WAY ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (compare selected pairs of column). Statistical differences were considered significant when p < 0.05.

Results

Effect of tramadol and enantiomers on current-voltage relationship of ICa-L

Figure 1A shows a representative tracing of the inward Ca2+ currents recorded from rat ventricular myocytes at 0 mV in the absence and presence of 200 µM (±)-tramadol (Figure-1 top) and its enantiomers (Figure-1 middle and bottom). Mean values of ICa-L at different potentials (-50 to 60 mV) were plotted in I-V curves before and after treatment with (±)- (Figure-1B top), (+)- (Figure-1B middle) and (-)-tramadol (Figure-1B bottom). Upon perfusion of each enantiomer, the peak amplitude of ICa-L was significantly (p < 0.05) reduced at potentials more depolarized than -20 mV, while with (±)-tramadol the reduction was significant at potentials more positive t4han 0 mV (p < 0.05). (±)-Tramadol significantly inhibited the peak amplitude of ICaL which was reduced by 33.7 ± 7.2% at 0 mV. There was no difference in the peak current inhibition induced by the enantiomers, (+)-tramadol (64.4 ± 2.8%) and (-)-tramadol (68.9 ± 5.8%). However, the inhibition of ICa-L induced by both enantiomers was significantly greater than that induced by (±)-tramadol (p < 0.01 vs (+)-tramadol; p < 0.001 (-)-tramadol). The reduction was partially reversed after a 10 min washout.

Effect of tramadol and enantiomers on activation of ICa-L

Activation curves were constructed from the current-voltage relationship by dividing the amplitude of ICa-L at each potential by the driving force (Figure 2). (±)-Tramadol decreased the V1/2 of the steady-state activation curve of ICa-L, with no changes in k value. In the control condition, V1/2 was -17.5 ± 2.1 mV and k was 4.2 ± 0.2 mV and in the presence of (±)-tramadol, V1/2 was -21.0 ± 2.2 mV (p < 0.05) and k was 3.6 ± 0.3 mV (p > 0.05).On the other hand, the enantiomers did not change the steady-state activation curve of ICa-L (Table 1).

Effect of tramadol and enantiomers on inactivation of ICa-L

Steady-state inactivation of ICa-L was measured using a classic double-pulse protocol. Preconditioning steps of 1600 ms, from -60 to +60 mV, in 10 mV intervals from a holding potential of -40 mV were applied, followed by a 600ms test pulse to 0 mV. The peak current elicited by test pulses was normalized to maximum current and plotted relatively to the preconditioning potential. (±)-Tramadol and its enantiomers shifted the steady-state inactivation curves to more negative potentials (Figure 3) and changed the V1/2 of inactivation (Table 1).

In fact, the V1/2 of inactivation of enantiomers was significant different when compared to (±)-Tramadol ((+)-tramadol p < 0.01 and (-)-tramadol p < 0.001 compared with (±)-tramadol). However, only (-)-tramadol altered the k value (control, 3.8 ± 0.1 mV; (-)-Tramadol, 4.9 ± 0.3 mV; p < 0.01). No differences were observed in the mean of the k value among groups.

Effect of tramadol and enantiomers on recovery of ICa-L from inactivation

The effects of (±)-tramadol and its enantiomers on the kinetics of recovery of ICa-L from inactivation were studied using a double-pulse protocol consisting of a 500 ms prepulse to 0 mV followed by a 500 ms test pulse to 0 mV, after a variable inter-pulse interval (0 to 2500 ms) from a holding potential of -40 mV, every 10 s. (±)- and (+)-tramadol shifted the time-dependent recovery curve to the right and slowed down the recovery from inactivation (Figure 4). The recovery from inactivation could be fitted by a single exponential, where the time constant (t) was increased from 175.6 ± 18.6 ms to 305.0 ± 32.9 ms (p < 0.01) for (±)-tramadol and from 248.1 ± 28.1 ms to 359.0 ± 23.8 ms (p < 0.05) for (+)-tramadol. (-)-Tramadol did not modify the time course for recovery of ICa-L. No differences were observed in the mean of the time constant (t) value among groups.

Effect of the agonist of µ-opioid receptor (DAMGO) on the ICa-L of rat cardiomyocites

In this study, our results have shown that tramadol and its enantiomers inhibit the ICa-L. The possible mechanism involved in this effect could be due to the activation of µ-opioid receptors. To verify this hypothesis, we tested whether the agonist of the µ-opioid receptor (DAMGO) modulates the ICa-L in rat cardiomyocytes. Thus, figure 5 shows that DAMGO has no effect on the calcium currents activated by depolarizing pulses to 0 mV (Control: -449.7 ± 4.4 pA vs DAMGO: -416.9 ± 2.7 pA; n=3; p > 0.05).

Discussion

In this study, our data have shown different effectiveness of tramadol enantiomers to inhibit ICa-L (~60%) when compared to racemic mixture (~30 %). In contrast, in our previous study, the negative inotropic effect on rat papillary muscles observed at 200 µM presented the following order of potency (IC50): (+)-tramadol > (-)-tramadol > (±)-tramadol13. This difference between cell and tissue responses could be due to a possible inhibition of monoamine reuptake by tramadol and their enantiomers on the electrically-stimulated papillary muscle. It has been demonstrated that the electrically evoked release of noradrenaline by sympathetic nerve endings in isolated cardiac muscle and the amplitude of contraction are decreased by local anesthetics15. Different activities of tramadol have shown to be stereoselective, including opioid receptor activation3,16, inhibition of monoamine reuptake17,18, analgesic effect3 and vascular relaxation13,19. However, this study demonstrated that tramadol enantiomers (200 µM) decreased ICa-L (~60%), indicating a non-enantiomer-specific blockade of L-type Ca2+ channels. The racemic tramadol produced a minor inhibition of ICa-L (~30%) when compared to its enantiomers which could be correlated to the small potency of racemic to reduce cardiac contractility13. Tramadol and enantiomers differently altered the kinectics of ICa-L. (±)- and (+)-tramadol shifted the steady-state inactivation curve for ICa-L to more negative membrane potentials and markedly slowed the recovery of ICa-L from inactivation. (-)-Tramadol significantly altered only the inactivation of ICa-L. The effects of tramadol on ICa-L may be related to the activation of a receptor that modulates ICa-L and/or to a direct effect on the channel. However, the effect of tramadol on ICa-L seems not to be related to the activation of opioid receptors. Tramadol binds preferentially to m-receptors, which have been demonstrated not to be present in the mammalian heart20-23. Indeed, our results showed no effect of the m-receptor agonist DAMGO on the cardiac ICa-L. Moreover, it has been shown that the cardiac effects of opioids could be or not be dependent on opioid receptors. The effects of morphine on ionic currents in cardiac myocytes have shown not to depend on opioid receptor24 or to be mediated via d- and k-receptors25. However, its cardioprotective effect is known to be due to the activation of d-receptors26,27. Studies have shown that opioids like dextropropoxiphene, pethidine and leucine enkephalin reduce ICa-L but only the inhibition induced by d-receptor agonist (leucine enkephalin) was blocked by naloxone28,29. The effects of tramadol on other ionic currents also suggest a direct effect on L-type Ca2+ channels. Haeseler et al12 showed that tramadol, sufentanil and fentanil but not morphine blocked sodium currents of heterologously expressed NaV1.2 neuronal Na+ channels. It is important to note that the potency to block sodium current was irrespective of the relevant opioid receptor potency of the compound. Tramadol has also been reported to block delayed rectifier K+ current (IK(DR) in NG108-15 neuronal cells in a concentration-dependent manner30. As observed in our study for ICa-L, tramadol shifted the steady-state inactivation curve of IK(DR to more negative potentials30.

Conclusion

The effectiveness of tramadol enantiomers to inhibit ICa-L was twice the one observed with (±)-tramadol and such effect seems unrelated to the activation of opioid receptors.

Acknowledgements

The authors thank Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda. (BR), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq, BR), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, BR), Fundação Universitária Jose Bonifácio (FUJB, BR), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, BR) for finantial support and fellowships from CAPES (to JMR) and CNPq (to GZS, RTS). None of the authors have any conflict of interest or financial interest to disclose.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was partially funded by CNPq, CAPES and FAPERJ.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Juliana M. Raimundo, from Universidade Federal do Rio de Janeiro.

References