abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil ckchVpGzyrZyTyxPpCJgCsr 00008 S0066-782X2011000900008 S0066-782X(11)09700108 10.1590/S0066-782X2011005000066 Artigos Originais Exercício e restrição alimentar aumentam o RNAm de proteínas do trânsito de Ca2+ miocárdico em ratos Sugizaki Mário Mateus Leopoldo Ana Paula Lima Conde Sandro José Campos Dijon Salome Damato Ricardo Leopoldo André Soares Nascimento André Ferreira do Oliveira Júnior Silvio de Assis Cicogna Antonio Carlos Botucatu São Paulo Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina Brazil Cuiabá Mato Grosso Universidade Federal de Mato Grosso Instituto de Ciências da Saúde Brazil 07 2011 97 1 46 52 07 09 2010 09 09 2010 25 02 2011 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: Treinamento físico (TF) aumenta a sensibilidade dos hormônios tireoidianos (HT) e a expressão gênica de estruturas moleculares envolvidas no movimento intracelular de cálcio do miocárdio, enquanto a restrição alimentar (RIA) promove efeitos contrários ao TF. OBJETIVO: Avaliar os efeitos da associação TF e RIA sobre os níveis plasmáticos dos HT e a produção de mRNA dos receptores HT e estruturas moleculares do movimento de cálcio do miocárdio de ratos. MÉTODOS: Utilizaram-se ratos Wistar Kyoto divididos em: controle (C, n = 7), RIA (R50, n = 7), exercício físico (EX, n = 7) e exercício físico + RIA (EX50, n = 7). A RIA foi de 50% e o TF foi natação (1 hora/dia, cinco sessões/semana, 12 semanas consecutivas). Avaliaram-se as concentrações séricas de triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e hormônio tireotrófico (TSH). O mRNA da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), trocador Na+/Ca+2 (NCX), canal lento de cálcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) e receptor de HT (TRα1 e TRβ1) do miocárdio foram avaliados por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. RESULTADOS: RIA reduziu o T4, TSH e mRNA do TRα1 e aumentou a expressão da PLB, NCX e canal-L. TF aumentou a expressão do TRβ1, canal-L e NCX. A associação TF e RIA reduziu T4 e TSH e aumentou o mRNA do TRβ1, SERCA2a, NCX, PLB e correlação do TRβ1 com a CQS e NCX. CONCLUSÃO: Associação TF e RIA aumentou o mRNA das estruturas moleculares cálcio transiente, porém o eixo HT-receptor não parece participar da transcrição gênica dessas estruturas.

 Exercício restrição calórica hormônios tireoideanos miocárdio proteínas de transporte calcio 27 05 2011

Exercício e restrição alimentar aumentam o RNAm de proteínas do trânsito de Ca2+ miocárdico em ratos

Mário Mateus SugizakiI, II; Ana Paula Lima LeopoldoII; Sandro José CondeII; Dijon Salome CamposII; Ricardo DamatoII; André Soares LeopoldoII; André Ferreira do NascimentoII; Silvio de Assis Oliveira JúniorII; Antonio Carlos CicognaII

IInstituto de Ciências da Saúde - Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, Campus de Sinop, Cuiabá, MT

IIFaculdade de Medicina - Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus de Botucatu, Botucatu, SP - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: Treinamento físico (TF) aumenta a sensibilidade dos hormônios tireoidianos (HT) e a expressão gênica de estruturas moleculares envolvidas no movimento intracelular de cálcio do miocárdio, enquanto a restrição alimentar (RIA) promove efeitos contrários ao TF.

OBJETIVO: Avaliar os efeitos da associação TF e RIA sobre os níveis plasmáticos dos HT e a produção de mRNA dos receptores HT e estruturas moleculares do movimento de cálcio do miocárdio de ratos.

MÉTODOS: Utilizaram-se ratos Wistar Kyoto divididos em: controle (C, n = 7), RIA (R50, n = 7), exercício físico (EX, n = 7) e exercício físico + RIA (EX50, n = 7). A RIA foi de 50% e o TF foi natação (1 hora/dia, cinco sessões/semana, 12 semanas consecutivas). Avaliaram-se as concentrações séricas de triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e hormônio tireotrófico (TSH). O mRNA da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), trocador Na+/Ca+2 (NCX), canal lento de cálcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) e receptor de HT (TRα1 e TRβ1) do miocárdio foram avaliados por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.

RESULTADOS: RIA reduziu o T4, TSH e mRNA do TRα1 e aumentou a expressão da PLB, NCX e canal-L. TF aumentou a expressão do TRβ1, canal-L e NCX. A associação TF e RIA reduziu T4 e TSH e aumentou o mRNA do TRβ1, SERCA2a, NCX, PLB e correlação do TRβ1 com a CQS e NCX.

CONCLUSÃO: Associação TF e RIA aumentou o mRNA das estruturas moleculares cálcio transiente, porém o eixo HT-receptor não parece participar da transcrição gênica dessas estruturas.

Palavras-chave: Exercício, restrição calórica, hormônios tireoideanos, miocárdio, proteínas de transporte, calcio.

Introdução

Intervenções como atividade física e restrição alimentar (RIA) têm sido frequentemente utilizadas visando manutenção da saúde ou estética corporal. Entretanto, dependendo da intensidade, duração e frequência da RIA e da atividade física, podem ocorrer prejuízos ao organismo1-7. Pesquisas mostram que essa associação pode deprimir8 ou melhorar o desempenho cardíaco9,10.

Estruturas moleculares presentes no sarcolema, canal lento de cálcio tipo-L (canal-L) e o trocador sódio/potássio (NCX), e presentes no reticulo sarcoplasmático, canal de rianodina, a calsequestrina (CQS), a bomba de cálcio do reticulo sarcoplasmático (SERCA2a) e a fosfolambam, estão envolvidas no movimento intracelular de cálcio e participam no processo de contração e relaxamento do músculo cardíaco11. Trabalhos mostram que a RIA promove redução da expressão gênica de rianodina12, da SERCA213, de canal-L14, enquanto o treinamento físico (TF) aumenta o mRNA da SERCA215-17, da rianodina18,19 e do canal-L20. A transcrição das estruturas moleculares envolvidas no movimento intracelular de cálcio pode ser modulada pelos hormônios tireoidianos (HT), via receptores nucleares de HT21-23. Sabe-se que a restrição alimentar reduz a síntese e liberação dos hormônios HT13 e o exercício físico pode aumentar a liberação e/ou a sensibilidade desses hormônios21. Entretanto, a relação entre RIA, TF e os hormônios tireoidianos não está estabelecida.

Há escassa literatura que analisa a relação RIA, treinamento físico, hormônios tireoidianos e transcrição gênica de estruturas moleculares do trânsito cálcio miocárdico. Katzeff e cols.13 verificaram redução dos níveis plasmáticos dos hormônios HT e decréscimo da expressão gênica de SERCA2 de ratos restritos. Iemitsu e cols.22 mostraram que o treinamento físico aumentou na expressão de receptores TRα1 e TRβ1 e a transcrição gênica da SERCA2 no miocárdio de ratos idosos.

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da associação do treinamento físico e da RIA sobre as concentrações plasmáticas dos hormônios tireoidianos e o mRNA dos receptores HT, SERCA2a, canal-L, NCX, rianodina, calsequestrina e fosfolamban do miocárdio de ratos.

Métodos

Animais e protocolo experimental

No presente estudo foram utilizados 28 ratos Wistar-Kyoto (WKY), com 60 dias de idade, provenientes do Biotério do Laboratório Experimental do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu. Durante a fase experimental, os animais foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente com temperatura controlada (24 ± 2º C), ciclo claro-escuro (12:12 h) e alimentados com ração comercial e água. O projeto seguiu normas estabelecidas no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea) sendo aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp, sob protocolo de 575/2006.

Os ratos foram divididos em quatro grupos: controle com ração ad libitum (C); restrição alimentar de 50% (R50); exercício crônico com ração ad libitum (EX); exercício crônico com restrição alimentar de 50% (EX50).

Os animais dos grupos C e EX receberam ração comercial labina (Purina, Paulina, SP, Brasil) composta por 3,76% de gordura, 20,96% de proteína, 52,28% de carboidrato, 9,60% de cinzas e 13,40% de umidade. Os animais dos grupos R50 e EX50 receberam a mesma ração comercial, porém com uma redução de 50% da quantidade média consumida pelo grupo controle. O período de RIA foi de 90 dias. O consumo de ração foi controlado diariamente e o peso dos animais foi monitorado semanalmente.

O treinamento físico foi a natação com sobrecarga de peso de 5% do peso corporal. Para as sessões de natação, foram utilizados dois tanques de fibra de vidro com as seguintes dimensões: 100 cm de comprimento, 80 cm de largura e 80 cm de altura que continham água aquecida (32 ± 1º C), mantidos no nível de 60 cm. A sobrecarga de peso foi realizada por meio de chumbadas de pesca envolvidas em esparadrapo e fixada ao tórax do rato por meio de elástico. Foram mantidos no máximo seis animais por sessão de treinamento.

Os animais dos grupos EX e EX50 foram submetidos a cinco sessões de natação semanais, durante 12 semanas consecutivas. Nas primeira, segunda e terceira semanas, os animais nadaram durante 30, 45 e 60 minutos, respectivamente, sem carga adicional. A partir da quarta semana, as sessões de natação foram de 60 minutos e com sobrecarga. Os ratos desses grupos foram previamente submetidos a um período de adaptação à água. Durante uma semana, eles foram mantidos por 15 minutos no interior do tanque contendo água aquecida, cujo nível inicial de água era de 7,0 cm, sendo progressivamente aumentado, no decorrer da semana, até atingir a altura de 60 cm.

Dosagem sérica de T3, T4 e TSH

Previamente ao sacrifício, os animais foram mantidos em jejum de 12 horas e então foram mortos por decapitação, previamente anestesiados com pentobarbital sódico (0,1 ml/kg) e o sangue foi imediatamente transferido em tubos de ensaio. As dosagens de triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e hormônio tireotrófico (TSH) foram determinadas utilizando kit comercial especifico para rato, painel de tireoide (LINCOplex) no laboratório de análises clínicas da Gênese, São Paulo - Brasil.

Avaliação das características gerais dos animais

Após a coleta de sangue, o coração foi removido, foram dissecados o átrio, o ventrículo direito e o ventrículo esquerdo que foram pesados e congelados para as análises da expressão gênica. As variáveis morfológicas utilizadas para caracterizar cada grupo de animais foram: peso corpóreo inicial (PCI) e final (PCF), peso do ventrículo esquerdo (VE), relação entre o peso do ventrículo esquerdo e o peso corporal final (VE/PCF x 103), peso do ventrículo direito (VD), relação entre o peso do ventrículo direito e o peso corpóreo final (VD/PCF x 103).

Avaliação da expressão gênica por reação em cadeia da polimerase em tempo real após transcrição reversa

Extração de RNA

Fragmentos do ventrículo esquerdo foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80° C. A amostra congelada foi homogeneizada em aparelho Polytron (Ika Ultra Turrax® T25 Basic, Wilmington, USA) após adição de 1 ml de TRIzol® (Invitrogen Brasil, São Paulo) para cada 100 mg de tecido. O TRIzol®, solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato, tem como finalidade manter a integridade do RNA durante a lise celular que ocorre no processo de homogeneização24.

A amostra homogeneizada foi transferida para um tubo e incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, para permitir a completa dissociação do complexo núcleo-proteico. Em seguida, foi adicionado clorofórmio (Merck KGaA, Damstadt, Germany) na proporção de 0,2 ml/1 ml TRIzol®; a amostra foi agitada, manualmente, com vigor por 15 segundos e incubada por 3 minutos à temperatura ambiente. Após essa segunda incubação, o material foi centrifugado (Eppendorf 5804R, Hamburg, Germany), a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4° C. Nesse processo a amostra ficou separada em três fases: a) uma inferior, de fenol-clorofórmio e de coloração rosada, contendo DNA; b) uma interfase branca com proteínas; e c) uma fase superior, aquosa, incolor, contendo RNA.

A porção de RNA foi transferida para um tubo com 0,5 ml de álcool isopropílico (Merck KGaA, Damstadt, Germany). A amostra foi agitada manualmente 10 vezes por inversão, incubada por 10 minutos à temperatura ambiente e, posteriormente, centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4º C. O pellet foi lavado com álcool etílico 75% (Merck KGaA, Damstadt, Germany) na proporção de 1 ml/1 ml de TRIzol® e centrifugado a 7.500 rpm por 5 minutos a 4° C. Após o álcool etílico ser descartado, o pellet foi seco por 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de RNA foi diluído em 30 µl de água ultrapura e incubado por 10 minutos a 60° C em banho-maria (Fanem mod 100, São Paulo, Brasil); esse procedimento teve como finalidade inativar a possível presença de RNase.

O RNA foi analisado com auxílio de um espectrofotômetro (GeneQuant® RNA/DNA Calculator, Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, England) pela absorbância em 260 nm. A pureza do RNA foi constatada pela razão das absorbâncias em 260/280 nm. As amostras cujas razões foram inferiores a 1,6 foram descartadas por apresentarem contaminação por proteínas.

Verificação da integridade do RNA por eletroforese

Amostras de 1,0 µl de RNA total diluídas em 8,0 µl de água ultrapura e 1,0 µl de corante (Orange G, Acros Organics, New Jersey, USA), foram aplicadas em gel de agarose 1% (0,3 g agarose, 30 ml de TAE Buffer 1x, 3,0 µl de brometo de etídio) e submetidas a uma voltagem de 60 mV (Power Pac Basic® Bio-Rad) por 20 minutos. A integridade do RNA foi constatada pela visualização das bandas de RNA ribossômico, 28S e 18S, e ausência de rastros de RNA no gel. As amostras que se mostrarem íntegras foram utilizadas como substrato para a transcrição reversa.

Transcrição reversa do RNA (RT)

As amostras de RNA do músculo cardíaco foram submetidas à transcrição reversa pela ação da enzima transcriptase reversa, utilizando-se kit SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR® (Invitrogen, Brasil, São Paulo). As amostras utilizadas no experimento foram incubadas em um termociclador (Mastercycler Gradient Eppendorf® Hamburg, Germany). Inicialmente uma mistura contendo 1.000 ng/ml de RNA total, 1,0 ml de dNTP mix 10 mM, 1,0 ml de random hexamers (50 ng/ml) e 8,0 ml de H2O DEPC (dietil pirocarbonato) foi incubada durante 5 minutos a 65° C. A seguir, após adição 9,0 ml de uma solução contendo, 2,0 ml de tampão RT 10x, 4,0 ml de MgCl2 25 mM, 2,0ml de DTT 0.1 M e 1,0 ml de inibidor de RNase, RNaseOUT®, a mistura foi incubada por 2 minutos a 25° C. Após o acréscimo de 1,0 ml da enzima SuperScript II®, procedeu-se nova incubação por 10, 50 e 15 minutos a 25° C, 42° C e 70° C, respectivamente. Após adição 1,0 ml de RNase H a solução foi incubada por 20 minutos a 37° C.

Para checar a qualidade da transcrição reversa, foram empregados dois métodos:

1) Controle positivo - O kit contém um RNA transcrito a partir do gene da cloranfenicol acetiltransferase e primers controles A e B. Esses primers, na reação em cadeia da polimerase, geram um produto de 500 pares de base (pb);

2) Controle negativo - Para comprovar a ausência de DNA genômico residual uma amostra de RNA foi submetida à reação de RT, porém a enzima SuperScript II® foi substituída por 1,0 ml de H2O DEPC. Esse produto foi utilizado nas reações de PCR e a ausência de DNA genômico residual foi confirmada pela ausência de produtos de amplificação.

Reação em cadeia da polimerase em tempo real

Alíquotas da reação de RT contendo 2,0 µg de cDNA foram adicionadas a uma mistura contendo TaqMan®Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e ensaio customizado contendo primers "sense" e "anti-sense" e sonda Taqman® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) específicos para cada gene, e o volume completado para 25 ml com água tratada com DEPC. As reações foram realizadas em triplicatas para cada gene alvo no Sistema Real Time PCR 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada amostra foi plotado um gráfico de amplificação mostrando aumento do reporter dye fluorescente (ΔRn) em cada ciclo da PCR. A partir desse gráfico, foi determinado o ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (cycle threshold - CT), baseado na variabilidade dos dados da baseline obtidos a partir dos ciclos iniciais da PCR. Os primers para os genes analisados (Quadro 1) foram obtidos por meio do software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a partir de sequências publicadas no GenBank (www.pubmed.com). A quantificação relativa de cada gene, normalizada pela referência endógena (ciclofilina), foi realizada de acordo com o User Bulletin #2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Análise estatística

Os resultados experimentais foram expressos como média ± DP. As comparações entre os grupos foram realizadas por análise de variância (ANOVA) de dois fatores, exercício e dieta, seguida com o teste de Tukey. As relações entre o mRNA da SERCA2a, PLB, CQS, NCX, canal-L e RYR2 e receptores dos hormônios tireoidianos, TRβ1 e TRα1, foram medidas pelo coeficiente de correlação de Pearson. O nível de significância foi de 5%.

Resultados

As características gerais dos animais estão apresentadas na tabela 1. Os pesos corporais iniciais e as relações VD/PCF não foram diferentes entre os grupos. Os animais com restrição, R50 e EX50, apresentaram pesos corporais finais, do VE, VD, átrio e consumo de ração, significativamente inferiores aos respectivos controles (C vs R50 e EX vs EX50). Os animais treinados, EX e EX50, apresentaram redução nos pesos corporais finais em relação aos ratos C e R50 respectivamente. Os ratos EX aumentaram o peso do átrio em relação aos animais C. A relação VE/ PCF aumentou significativamente nos animais EX50 quando comparados aos animais EX.

A tabela 2 apresenta os resultados da avaliação do mRNA pela técnica de PCR em tempo real. Verificou-se que os animais R50 aumentaram a expressão do NCX, canal de cálcio-L e PLB e reduziram a expressão do TRα1 em relação aos ratos controles. Os animais do grupo EX aumentaram a expressão do NCX, canal-L e do receptor TRβ1 em relação aos animais controles. A associação do treinamento físico e RIA, grupo EX50, aumentou a expressão da SERCA2a, NCX e PLB em relação aos animais EX e R50. Além disso, os animais EX50 apresentaram aumento na expressão do TRβ1 quando comparados aos ratos R50.

As dosagens séricas de T3, T4 e TSH estão apresentadas na tabela 3. Não houve alteração na concentração sérica do T3 pela ação da RIA ou treinamento físico. Os ratos treinados, EX, não apresentaram alteração das concentrações séricas de T4 e TSH. Entretanto, verificou-se significativa redução do T4 e TSH nos grupos R50 e EX50 em relação aos respectivos controles (C vs R50 e EX vs EX50).

Os coeficientes de correlação e as significâncias entre mRNA das estruturas do trânsito cálcio e receptores de hormônios tireoidianos estão na tabela 4. Estão apresentadas somente as correlações positivas (r > 0,70) no grupo EX50, desde que o objetivo desse estudo foi avaliar a associação e treinamento físico e restrição alimentar sobre a transcrição gênica de estruturas moleculares envolvidas no trânsito de cálcio e a influência do eixo HT - receptor no miocárdio. Assim, os coeficientes de correlação para os grupos C, R50 e EX foram apresentados para definir as participações dos fatores exercício, restrição alimentar e associação entre os dois fatores.

Observou-se que o gene do TRβ1 apresenta mais correlações com as estruturas moleculares do trânsito de cálcio que o gene TRα1 (tab. 4). Embora os mRNA do canal-L e PLB tenham apresentado aumento significativo nos ratos EX50, esses genes não apresentaram correlação com os genes do TRα1 ou TRβ1. O mRNA da rianodina teve significante correlação com o mRNA do TRβ1 em todos grupos e ficou maior na associação da RIA com treinamento físico. O mRNA da SERCA2a também apresentou boa correlação com o mRNA do TRβ1 nos grupos R50, EX e EX50 apesar de não ser estatisticamente significante, o que pode ser decorrente do baixo número de amostras. Os genes calsequestrina e NCX apresentaram correlação com o mRNA TRβ1 e TRα1, respectivamente, somente no grupo EX50 indicando a dependência da associação dos dois fatores. Interessante ressaltar que o mRNA da CQS e RYR2 apresentaram forte correlação com TRβ1 nos animais EX50. Entretanto, não houve aumento de expressão gênica da CQS e RYR2 nesse grupo. Contrariamente, o gene NCX aumentou, mas apresentou correlação apenas com o gene TRα1. O gene da SERCA2a foi o único a apresentar correlação com o mRNA da TRβ1 e aumento na expressão gênica nos animais EX50.

Discussão

O objetivo deste estudo foi avaliar a participação dos hormônios tireoidianos na associação entre a severa restrição alimentar e treinamento físico e a correlação entre os receptores de HT e a expressão gênica das estruturas moleculares envolvidas no movimento de cálcio intracelular do miocárdio. Os resultados deste estudo mostraram que o treinamento físico associado à severa RIA promoveu aumento significante do mRNA da SERCA2a, do canal-L, da fosfolamban e do trocador Na+/Ca2+. Essas alterações foram acompanhadas por elevação na expressão dos receptores de hormônios tireoidianos (TRβ1 apesar dos níveis séricos de T3 estarem normais e T4 e TSH reduzidos.

Os protocolos de RIA e treinamento físico promoveram importantes alterações morfológicas (tab. 1). As reduções do peso corporal, peso do VD e peso do VE induzidas pela RIA estão associadas ao grau de restrição calórica. Restrição alimentar, excesso de ingestão ou estado de jejum alteram o gasto energético e a composição corporal25. A redução do gasto energético durante a restrição alimentar tem sido documentada e representa um mecanismo de conservação de energia, que previne a perda de peso corporal em excesso25. As câmaras cardíacas foram reduzidas na mesma proporção da redução de peso corporal, como observado pelas relações VE/PC e VD/PC. A diminuição do peso corporal pelo treinamento físico está associada ao aumento do gasto energético decorrente das sessões de treinamento físico; as relações VE/PC e VD/PC foram mantidas em relação ao grupo controle. A associação do TF e RIA intensificou a redução de peso corporal, porém preservou a massa do VE e do VD e manteve as relações VE/PC e VD/PC quando comparados com os ratos R50. Assim, os resultados referentes às câmaras cardíacas indicam que a RIA promoveu significante redução da massa cardíaca e o treinamento físico, isolado ou associado a RIA, não promoveu hipertrofia cardíaca. Esses resultados foram semelhantes aos constatados em estudos anteriores10.

A RIA, isolada ou em ratos treinados, reduziu os níveis de T4 e TSH, enquanto o treinamento físico não alterou os níveis séricos dos hormônios tireoidianos. Apesar de a RIA reduzir o nível sérico de T3 em 29% em ambos os grupos (R50 e EX50), essa redução não foi de magnitude suficiente para mostrar diferença estatística entre os grupos. A ausência de alteração nos níveis de T3 pode ser decorrente da dosagem do T3 total e não do T3 livre, que é a forma ativa do hormônio. Dados de literatura indicam que, em estados de jejum e severa restrição calórica, ocorrem acentuado aumento de T3 reverso13. Assim é possível que a relação entre T3 livre e T3 reverso tenha sido reduzida nos animais submetidos à RIA. Acredita-se que a privação de energia pode modular a concentração sérica de T3 e reduzir a atividade ou concentração de iodotironina deiodinase que converte T4 em T326. A significante redução dos níveis séricos de T4 e TSH induzido pela RIA indica estado de hipotireoidismo, o que também foi observado em estudos experimentais8,13,27,28 e clínicos29. O mecanismo responsável pela redução dos níveis plasmáticos dos hormônios tireoidianos induzida pela RIA pode estar relacionado à própria redução no consumo energético. A redução dos níveis de hormônios tireoidianos está relacionada ao mecanismo de conservação de energia, uma vez que esses hormônios são os principais responsáveis pelo gasto energético25. Considerando que o gasto energético é reduzido na restrição alimentar, seria esperada redução dos níveis de HT. O treinamento físico não promoveu alterações nos níveis plasmáticos dos hormônios tireoidianos. Este resultado difere do observado por Iemitsu e cols.22 e Katzeff e cols.13, que verificaram aumento nos níveis sérios de T4. Essa discrepância de resultados pode ter sido decorrente do tipo, intensidade e volume de treinamento físico. Em conclusão, enquanto a RIA promoveu o estado de hipotiroidismo, o treinamento físico parece não ter efeito direto sobre a ação dos hormônios tireoidianos.

No coração de ratos, mais de 70% de todos os receptores HT são TRα1, com TRβ1 constituindo apenas 30%30. O hormônio tireoidiano liga-se à elementos responsivos de tireóide (receptores de HT) em regiões promotoras de vários genes, regulando a transcrição de genes alvo no coração incluindo trocador Na+/Ca2+, rianodina, canal de cálcio tipo-L e principalmente SERCA2a e fosfolambam30. Essa regulação pelo HT é um importante mecanismo no processo de contração e relaxamento do miocárdio31.

Os resultados deste estudo indicam que o estado de hipotireoidismo induzido pela RIA reduziu a expressão do gene TRα1, receptor predominante do miocárdio. Esse resultado era esperado, uma vez que a redução de HT acarreta feedback negativo no receptor HT. O treinamento físico, isolado ou associado a RIA, aumentou a expressão do TRβ1 sem alterar os níveis de TRα1. A escassa literatura sobre o papel dos receptores TRα1 e TRβ1 na transcrição gênica de proteínas do trânsito de cálcio do miocárdio. Kinugawa e cols.21 mostraram que o TRα1 está relacionado com transcrição da a-MHC e síntese proteica miocárdica, enquanto o TRβ1 está relacionado com SERCA2a, o próprio TRβ1 e inibição da b-MCH. Assim, nossos dados sugerem que a redução do gene TRα1 pela RIA poderia ser um mecanismo associado à perda de massa cardíaca; a ausência de hipertrofia nos animais treinados poderia ser decorrente da manutenção dos níveis de TRα1.

Os efeitos das intervenções, RIA e TF, resultaram em alterações no mRNA das estruturas moleculares reguladoras do transito de cálcio (tab. 2). O aumento da SERCA2a e PLB nos ratos EX50 observados neste estudo sugere que o processo de recaptura de cálcio pelo retículo sarcoplasmático (RS) pode estar facilitado. A explicação para essa hipótese baseia-se nos dados referentes aos efeitos da RIA que, isoladamente, promoveu somente aumento da PLB indicando piora no processo de recaptura de cálcio pelo RS. Como esse processo é dependente de ATP e, na severa restrição alimentar, necessita-se de economia de energia, o aumento da fosfolamban poderá acarretar redução da atividade da SERCA2a. Quando a RIA foi associada ao treinamento físico houve aumento proporcional da SERCA2a e da PLB, indicando que o treinamento físico protegeu o miocárdio dos prejuízos provocados pela RIA. A melhora no processo de recaptura de cálcio pelo RS induzido pelo treinamento físico está de acordo com estudos de Kemi e cols.32 que observaram aumento da recaptura de cálcio no miocárdio decorrente da elevação da SERCA2a e fosfolamban fosforilada (PLB-thr17) em ratos treinados. O aumento do canal de cálcio-L observado nos animais EX50 sugere um aumento do influxo de cálcio no sentido de melhorar a resposta contrátil. A elevação do gene NCX teria como finalidade compensar o aumento do influxo de cálcio pelos canais lentos de cálcio sarcolemal.

Neste estudo não foi possível relacionar os receptores HT com as estruturas moleculares do trânsito de cálcio no miocárdio de ratos treinados e submetidos a severa RIA, considerando que o teste de correlação não mostrou significância no mRNA da SERCA2a, PLB, NCX, canal-L com os receptores TRα1 ou TRβ1. Dados de literatura mostram associação das estruturas moleculares envolvidas no movimento de cálcio com receptores de HT induzidos pelo treinamento ou estado de hipotireoidismo; Iemitsu e cols.22 verificaram aumento significativo na expressão dos receptores TRα1 e TRβ1 acompanhado de aumento na expressão da SERCA2a pelo treinamento físico. Em condições de hipotireoidismo, a insuficiência da tireoide está associada a diminuição da SERCA2a e aumento da fosfolamban23, aumento na expressão do NCX33 e níveis de canal-L inalterados34 ou aumentados35.

Os mecanismos moleculares para o aumento da transcrição gênica da SERCA2, PLB e NCX no exercício isolado ou associado à RIA ainda não estão esclarecidos; como citado anteriormente, nossos achados sugerem que os HT e/ou receptores de HT não participam da transcrição gênica das estruturas moleculares do trânsito de cálcio nesse grupo de animais. O processo de remodelação cardíaca é consequente de estímulos extracelulares que ativam sinalizações citosólicas complexas, com inúmeros pontos de integração, e processos transcricionais nucleares. Dentre os estímulos extracelulares os agonistas de receptores acoplados a proteína G (angiotensina, endotelinas, catecolaminas), citocinas e fatores de crescimento (IGF, TGF, FGF) são os principais candidatos que poderiam, portanto, estimular a transcrição gênica de estruturas do movimento de cálcio36,37. Entretanto, não existe dados de literatura que permitam especular os mecanismos responsáveis pelo aumento da transcrição gênica da SERCA2, PLB e NCX na interação exercício e restrição alimentar.

Limitações do estudo

Nossos achados de expressão gênica de mRNA obtidos por meio de PCR quantitativo da SERCA2a, fosfolamban, trocador Na+/Ca2+, canal de cálcio tipo-L, calsequestrina e receptores de HT podem não se traduzir em formação de proteínas. Dados recentes obtidos em nosso laboratório verificaram significante redução da expressão proteica do canal tipo-L em ratos com severa RIA, contrariando nossos achados de aumento de mRNA da mesma proteína14. Portanto, a continuidade desses achados será a determinação da expressão proteica por Western Blot. Também não foi possível estabelecer uma relação entre causa-efeito dos hormônios tireoidianos e/ou receptores de HT com o mRNA do trânsito de cálcio; seriam necessários estudos com tratamento de HT ou utilizando animais monoclonais específicos para HT.

Em conclusão, os dados do trabalho mostraram aumento da expressão de mRNA das estruturas moleculares envolvidas no movimento intracelular de cálcio em animais submetidos a severa restrição e treinamento físico. Apesar de a associação TF e RIA induzir estado de hipotireoidismo, o eixo HT-receptor não parece participar da transcrição do mRNA das proteínas do transito de cálcio do miocárdio.

Correspondência:

Mário Mateus Sugizaki

Av. Brasília, 1200 - Setor Industrial

78550-000 - Sinop, MT - Brasil

E-mail:

mario@ufmt.br,

mario.sugizaki@ig.com.br

Artigo recebido em 07/09/10; revisado recebido em 09/09/10; aceito em 25/02/11.

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FUNDAMENTO: Entrenamiento físico (EF) aumenta la sensibilidad de las hormonas tiroideas (HT) y la expresión génica de estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio del miocardio, mientras que la restricción alimenticia (RA) promueve efectos contrarios al EF. OBJETIVO: Evaluar los efectos de la asociación EF y RA sobre los niveles plasmáticos de los HT y la producción de ARNm de los receptores HT y estructuras moleculares del movimiento de calcio del miocardio de ratones. MÉTODOS: Se utilizaron ratones Wistar Kyoto divididos en: control (C, n = 7), RA (R50, n = 7), ejercicio físico (EX, n = 7) y ejercicio físico + RA (EX50, n = 7). La RA fue de 50% y el EF fue natación (1 hora/día, cinco sesiones/semana, 12 semanas consecutivas). Se evaluaron las concentraciones séricas de triyodotironina (T3), tiroxina (T4) y hormona tireotrófico (TSH). El ARNm de la bomba de calcio del retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), intercambiador Na+/Ca+2 (NCX), canal lento de calcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) y receptor de HT (TRα1 y TRβ1) del miocardio fueron evaluados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. RESULTADOS: RA redujo el T4, TSH y ARNm del TRα1 y aumentó la expresión de la PLB, NCX y canal-L. EF aumentó la expresión del TRβ1, canal-L y NCX. La asociación EF y RA redujo T4 y TSH y aumentó el ARNm del TRβ1, SERCA2a, NCX, PLB y correlación del TRβ1 con la CQS y NCX. CONCLUSIÓN: Asociación EF y RA aumentó el ARNm de las estructuras moleculares calcio transiente, sin embargo el eje HT-receptor no parece participar de la transcripción génica de esas estructuras.

 Ejercicio restricción calórica hormonas tiroideas miocardio proteínas de transporte calcio

ARTÍCULO ORIGINAL

Mário Mateus SugizakiI,II; Ana Paula Lima-LeopoldoII; Sandro José CondeII; Dijon Salome CamposII; Ricardo DamatoII; André Soares LeopoldoII; André Ferreira do NascimentoII; Silvio de Assis Oliveira JúniorII; Antonio Carlos CicognaII

IInstituto de Ciências da Saúde - Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, Campus de Sinop, Cuiabá, MT

IIFaculdade de Medicina - Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus de Botucatu, Botucatu, SP - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: Entrenamiento físico (EF) aumenta la sensibilidad de las hormonas tiroideas (HT) y la expresión génica de estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio del miocardio, mientras que la restricción alimenticia (RA) promueve efectos contrarios al EF.

OBJETIVO: Evaluar los efectos de la asociación EF y RA sobre los niveles plasmáticos de los HT y la producción de ARNm de los receptores HT y estructuras moleculares del movimiento de calcio del miocardio de ratones.

MÉTODOS: Se utilizaron ratones Wistar Kyoto divididos en: control (C, n = 7), RA (R50, n = 7), ejercicio físico (EX, n = 7) y ejercicio físico + RA (EX50, n = 7). La RA fue de 50% y el EF fue natación (1 hora/día, cinco sesiones/semana, 12 semanas consecutivas). Se evaluaron las concentraciones séricas de triyodotironina (T3), tiroxina (T4) y hormona tireotrófico (TSH). El ARNm de la bomba de calcio del retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), intercambiador Na+/Ca+2 (NCX), canal lento de calcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) y receptor de HT (TRα1 y TRβ1) del miocardio fueron evaluados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.

RESULTADOS: RA redujo el T4, TSH y ARNm del TRα1 y aumentó la expresión de la PLB, NCX y canal-L. EF aumentó la expresión del TRβ1, canal-L y NCX. La asociación EF y RA redujo T4 y TSH y aumentó el ARNm del TRβ1, SERCA2a, NCX, PLB y correlación del TRβ1 con la CQS y NCX.

CONCLUSIÓN: Asociación EF y RA aumentó el ARNm de las estructuras moleculares calcio transiente, sin embargo el eje HT-receptor no parece participar de la transcripción génica de esas estructuras.

Palabras clave: Ejercicio, restricción calórica, hormonas tiroideas, miocardio, proteínas de transporte, calcio.

Introducción

Intervenciones como actividad física y restricción alimenticia (RA) han sido frecuentemente utilizadas procurando manutención de la salud o estética corporal. Entre tanto, dependiendo de la intensidad, duración y frecuencia de la RA y de la actividad física, pueden ocurrir daños al organismo1-7. Investigaciones muestran que esa asociación puede deprimir8 o mejorar el desempeño cardíaco9,10.

Estructuras moleculares presentes en el sarcolema, canal lento de calcio tipo-L (canal-L) y el intercambiador Na+/Ca+2 sodio/potasio (NCX), y presentes en el retículo sarcoplasmático, canal de rianodina, la calsequestrina (CQS), la bomba de calcio del retículo sarcoplasmático (SERCA2a) y la fosfolamban, están envueltas en el movimiento intracelular de calcio y participan en el proceso de contracción y relajación del músculo cardíaco11. Trabajos muestran que la RA promueve reducción de la expresión génica de rianodina12, de la SERCA213, de canal-L14, mientras que el entrenamiento físico (EF) aumenta el ARNm de la SERCA215-17, de la rianodina18,19 y del canal-L20. La transcripción de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio puede ser modulada por las hormonas tiroideas (HT), vía receptores nucleares de HT21-23. Se sabe que la restricción alimenticia reduce la síntesis y liberación de las hormonas HT13 y el ejercicio físico puede aumentar la liberación y/o la sensibilidad de esas hormonas21. Entre tanto, la relación entre RA, EF y las hormonas tiroideas no está establecida.

Hay escasa literatura que analiza la relación RA, entrenamiento físico, hormonas tiroideas y transcripción génica de estructuras moleculares del tránsito calcio miocárdico. Katzeff et al13 verificaron reducción de los niveles plasmáticos de los hormonas HT y disminución de la expresión génica de SERCA2 de ratones restringidos. Iemitsu et al22 mostraron que el entrenamiento físico aumentó la expresión de receptores TRα1 y TRβ1 y la transcripción génica de la SERCA2 en el miocardio de ratones añosos.

El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de la asociación del entrenamiento físico y de la RA sobre las concentraciones plasmáticas de las hormonas tiroideas y el ARNm de los receptores HT, SERCA2a, canal-L, NCX, rianodina, calsequestrina y fosfolamban del miocardio de ratones.

Métodos

Animales y protocolo experimental

En el presente estudio fueron utilizados 28 ratones Wistar-Kyoto (WKY), con 60 días de edad, provenientes del Bioterio del Laboratorio Experimental del Departamento de Clínica Médica de la Facultad de Medicina de Botucatu. Durante la fase experimental, los animales fueron mantenidos en jaulas individuales, en ambiente con temperatura controlada (24 ± 2º C), ciclo claro-oscuro (12:12 h) y alimentados con ración comercial y agua. El proyecto siguió normas establecidas en el Guide for the Care and Use of Laboratory Animals y los Principios Éticos en Experimentación Animal del Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea) siendo aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Botucatu - Unesp, bajo protocolo 575/2006.

Los ratones fueron divididos en cuatro grupos: control con ración ad libitum (C); restricción alimenticia de 50% (R50); ejercicio crónico con ración ad libitum (EX); ejercicio crónico con restricción alimenticia de 50% (EX50).

Los animales de los grupos C y EX recibieron ración comercial labina (Purina, Paulina, SP, Brasil) compuesta por 3,76% de grasa, 20,96% de proteína, 52,28% de carbohidrato, 9,60% de cenizas y 13,40% de humedad. Los animales de los grupos R50 y EX50 recibieron la misma ración comercial, sin embargo con una reducción de 50% de la cantidad media consumida por el grupo control. El período de RA fue de 90 días. El consumo de ración fue controlado diariamente y el peso de los animales fue monitoreado semanalmente.

El entrenamiento físico fue natación con sobrecarga de peso de 5% del peso corporal. Para las sesiones de natación, fueron utilizados tanques de fibra de vidrio con las siguientes dimensiones: 100 cm de largo, 80 cm de ancho y 80 cm de altura que contenían agua caliente a (32 ± 1º C), mantenidos en el nivel de 60 cm. La sobrecarga de peso fue realizada por medio de plomadas de pesca envueltas en esparadrapo y fijadas al tórax del ratón por medio de elástico. Fueron mantenidos a lo máximo seis animales por sesión de entrenamiento.

Los animales de los grupos EX y EX50 fueron sometidos a cinco sesiones de natación semanales, durante 12 semanas consecutivas. En la primera, segunda y tercera semana, los animales nadaron durante 30, 45 y 60 minutos, respectivamente, sin carga adicional. A partir de la cuarta semana, las sesiones de natación fueron de 60 minutos y con sobrecarga. Los ratones de esos grupos fueron previamente sometidos a un período de adaptación al agua. Durante una semana, fueron mantenidos durante 15 minutos en el interior del tanque conteniendo agua caliente, cuyo nivel inicial de agua era de 7,0 cm, siendo progresivamente aumentado, en el transcurso de la semana, hasta alcanzar la altura de 60 cm.

Dosaje sérico de T3, T4 y TSH

Previamente al sacrificio, los animales fueron mantenidos en ayuno de 12 horas y entonces fueron muertos por decapitación, previamente anestesiados con pentobarbital sódico (0,1 ml/kg) y la sangre fue inmediatamente transferida a tubos de ensayo. Los dosajes de triyodotironina (T3), tiroxina (T4) y hormona tireotrófico (TSH) fueron determinados utilizando kit comercial especifico para ratón, panel de tiroides (LINCOplex) en el laboratorio de análisis clínicos de la Gênese, São Paulo - Brasil.

Evaluación de las características generales de los animales

Después de la colecta de sangre, el corazón fue removido, fueron disecados el atrio, el ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo que fueron pesados y congelados para análisis de la expresión génica. Las variables morfológicas utilizadas para caracterizar cada grupo de animales fueron: peso corporal inicial (PCI) y final (PCF), peso del ventrículo izquierdo (VI), relación entre el peso del ventrículo izquierdo y el peso corporal final (VI/PCF x 103), peso del ventrículo derecho (VD), relación entre el peso del ventrículo derecho y el peso corporal final (VD/PCF x 103).

Evaluación de la expresión génica por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real después de transcripción reversa

Extracción de ARN

Fragmentos del ventrículo izquierdo fueron rápidamente congelados en nitrógeno líquido y almacenados en freezer a -80º C. La muestra congelada fue homogeneizada en aparato Polytron (Ika Ultra Turrax® T25 Basic, Wilmington, USA) después de adición de 1 ml de TRIzol® (Invitrogen Brasil, São Paulo) para cada 100 mg de tejido. El TRIzol®, solución monofásica de fenol y guanidina isotiocianato, tiene como finalidad mantener la integridad del ARN durante la lisis celular que ocurre en el proceso de homogeneización24.

La muestra homogeneizada fue transferida a un tubo e incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos, para permitir la completa disociación del complejo núcleo-proteico. En seguida, fue adicionado cloroformo (Merck KGaA, Damstadt, Germany) en la proporción de 0,2 ml/1 ml TRIzol®; la muestra fue agitada, manualmente, con vigor por 15 segundos e incubada por 3 minutos a temperatura ambiente. Después de esa segunda incubación, el material fue centrifugado (Eppendorf 5804R, Hamburg, Germany), a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4º C. En ese proceso la muestra quedó separada en tres fases: a) una inferior, de fenol-cloroformo y de coloración rosada, conteniendo ADN; b) una interfase blanca con proteínas; y c) una fase superior, acuosa, incolora, conteniendo ARN.

La porción de ARN fue transferida a un tubo con 0,5 ml de alcohol isopropílico (Merck KGaA, Damstadt, Germany). La muestra fue agitada manualmente 10 veces por inversión, incubada durante 10 minutos a temperatura ambiente y, posteriormente, centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4º C. El pellet fue lavado con alcohol etílico 75% (Merck KGaA, Damstadt, Germany) en la proporción de 1 ml/1 ml de TRIzol® y centrifugado a 7.500 rpm por 5 minutos a 4º C. Después de que se descartó alcohol etílico, el pellet fue secado 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de ARN fue diluido en 30 µl de agua ultrapura e incubado 10 minutos a 60º C en baño María (Fanem mod 100, São Paulo, Brasil); ese procedimiento tuvo como finalidad inactivar la posible presencia de RNase.

El ARN fue analizado con auxilio de un espectrofotómetro (GeneCuant® ARN/ADN Calculator, Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, England) por la absorbancia en 260 nm. La pureza del ARN fue constatada por la razón de las absorbancias en 260/280 nm. Las muestras cuyas razones fueron inferiores a 1,6 fueron descartadas por presentar contaminación por proteínas.

Verificación de la integridad del ARN por electroforesis

Muestras de 1,0 µl de ARN total diluidas en 8,0 µl de agua ultrapura y 1,0 µl de colorante (Orange G, Acros Organics, New Jersey, USA), fueron aplicadas en gel de agarosa 1% (0,3 g agarosa, 30 ml de TAE Buffer 1x, 3,0 µl de bromuro de etidio) y sometidas a un voltaje de 60 mV (Power Pac Basic® Bio-Rad) durante 20 minutos. La integridad del ARN fue constatada por la visualización de las bandas de ARN ribosómico, 28S y 18S, y ausencia de rastros de ARN en el gel. Las muestras que se mostraron íntegras fueron utilizadas como substrato para la transcripción reversa.

Transcripción reversa del ARN (RT)

Las muestras de ARN del músculo cardíaco fueron sometidas a transcripción reversa por la acción de la enzima transcriptasa reversa, utilizando kit SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR® (Invitrogen, Brasil, Son Paulo). Las muestras utilizadas en el experimento fueron incubadas en un termociclador (Mastercycler Gradient Eppendorf® Hamburg, Germany). Inicialmente una mezcla conteniendo 1.000 ng/ml de ARN total, 1,0 ml de dNTP mix 10 mM, 1,0 ml de random hexamers (50 ng/ml) y 8,0 ml de H2O DEPC (dietil pirocarbonato) fue incubada durante 5 minutos a 65º C. A continuación, después de adición de 9,0 ml de una solución conteniendo, 2,0 ml de tampón RT 10x, 4,0 ml de MgCl2 25 mM, 2,0ml de DTT 0.1 M y 1,0 ml de inhibidor de RNase, RNaseOUT ®, la mezcla fue incubada por 2 minutos a 25º C. Después del agregado de 1,0 ml de la enzima SuperScript II®, se procedió a nueva incubación de 10, 50 y 15 minutos a 25º C, 42º C y 70º C, respectivamente. Después de adición de 1,0 ml de RNase H la solución fue incubada 20 minutos a 37º C.

Para chequear la calidad de la transcripción reversa, fueron empleados los métodos:

1) Control positivo - El kit contiene un ARN transcrito a partir del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa y primers controles A y B. Esos primers, en la reacción en cadena de la polimerasa, generan un producto de 500 pares de base (pb);

2) Control negativo - Para comprobar la ausencia de ADN genómico residual una muestra de ARN fue sometida a la reacción de RT, sin embargo la enzima SuperScript II® fue substituida por 1,0 ml de H2O DEPC. Ese producto fue utilizado en las reacciones de PCR y la ausencia de ADN genómico residual fue confirmada por la ausencia de productos de amplificación.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Alícuotas de la reacción de RT conteniendo 2,0 µg de cADN fueron adicionadas a una mezcla conteniendo TaqMan®Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) y ensayo customizado conteniendo primers "sense" y "anti-sense" y sonda Taqman® (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA) específicos para cada gen, y el volumen completado para 25 ml con agua tratada con DEPC. Las reacciones fueron realizadas por triplicado para cada gen blanco en el Sistema Real Time PCR 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada muestra fue ploteado un gráfico de amplificación mostrando aumento del reporter dye fluorescente (ΔRn) en cada ciclo de la PCR. A partir de ese gráfico, fue determinado el ciclo donde la reacción cruza el umbral de detección (cycle threshold - CT), basado en la variabilidad de los datos de la baseline obtenidos a partir de los ciclos iniciales de la PCR. Los primers para los genes analizados (cuadro 1) fueron obtenidos por medio del software Primer Expres® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a partir de secuencias publicadas en el GenBank (www.pubmed.con). La cuantificación relativa de cada gen, normalizada por la referencia endógena (ciclofilina), fue realizada de acuerdo con el User Bulletin #2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Análisis estadístico

Los resultados experimentales fueron expresados como media ± DE. Las comparaciones entre los grupos fueron realizadas por análisis de varianza (ANOVA) de de los factores, ejercicio y dieta, seguida con el test de Tukey. Las relaciones entre el ARNm de la SERCA2a, PLB, CQS, NCX, canal-L y RYR2 y receptores de las hormonas tiroideas, TRβ1 y TR α1, fueron medidas por el coeficiente de correlación de Pearson. El nivel de significación fue de 5%.

Resultados

Las características generales de los animales están presentadas en la tabla 1. Los pesos corporales iniciales y las relaciones VD/PCF no fueron diferentes entre los grupos. Los animales con restricción, R50 y EX50, presentaron pesos corporales finales, del VI, VD, atrio y consumo de ración, significativamente inferiores a los respectivos controles (C vs R50 y EX vs EX50). Los animales entrenados, EX y EX50, presentaron reducción en los pesos corporales finales en relación a los ratones C y R50 respectivamente. Los ratones EX aumentaron el peso del atrio en relación a los animales C. La relación VI/ PCF aumentó significativamente en los animales EX50 cuando fueron comparados a los animales EX.

La tabla 2 presenta los resultados de la evaluación del ARNm por la técnica de PCR en tiempo real. Se verificó que los animales R50 aumentaron la expresión del NCX, canal de calcio-L y PLB y redujeron la expresión del TRα1 en relación a los ratones controles. Los animales del grupo EX aumentaron la expresión del NCX, canal-L y del receptor TRβ1 en relación a los animales controles. La asociación del entrenamiento físico y RA, grupo EX50, aumentó la expresión de la SERCA2a, NCX y PLB en relación a los animales EX y R50. Además de eso, los animales EX50 presentaron aumento en la expresión del TRβ1 cuando fueron comparados a los ratones R50.

Los dosajes séricos de T3, T4 y TSH están presentados en la tabla 3. No hubo alteración en la concentración sérica del T3 por la acción de la RA o entrenamiento físico. Los ratones entrenados, EX, no presentaron alteración de las concentraciones séricas de T4 y TSH. Entre tanto, se verificó significativa reducción del T4 y TSH en los grupos R50 y EX50 en relación a los respectivos controles (C vs R50 y EX vs EX50).

Los coeficientes de correlación y las significaciones entre ARNm de las estructuras del tránsito calcio y receptores de hormonas tiroideas están en la tabla 4. Están presentadas solamente las correlaciones positivas (r > 0,70) en el grupo EX50, ya que el objetivo de ese estudio fue evaluar la asociación y entrenamiento físico y restricción alimenticia sobre la transcripción génica de estructuras moleculares envueltas en el tránsito de calcio y la influencia del eje HT - receptor en el miocardio. Así, los coeficientes de correlación para los grupos C, R50 y EX fueron presentados para definir las participaciones de los factores ejercicio, restricción alimenticia y asociación entre los dos factores.

Se observó que el gen del TRβ1 presenta más correlaciones con las estructuras moleculares del tránsito de calcio que el gen TRα1 (tab. 4). Aunque los ARNm del canal-L y PLB hayan presentado aumento significativo en los ratones EX50, esos genes no presentaron correlación con los genes del TRα1 o TRβ1 El ARNm de la rianodina tuvo significativa correlación con el ARNm del TRβ1 en todos grupos y fue mayor en la asociación de la RA con entrenamiento físico. El ARNm de la SERCA2a también presentó buena correlación con el ARNm del TRβ1 en los grupos R50, EX y EX50 a pesar de no ser estadísticamente significativo, lo que puede ser decurrente del bajo número de muestras. Los genes calsequestrina y NCX presentaron correlación con el ARNm TRβ1 y TRα1, respectivamente, solamente en el grupo EX50 indicando la dependencia de la asociación de los dos factores. Es interesante resaltar que el ARNm de la CQS y RYR2 presentaron fuerte correlación con TRβ1 en los animales EX50. Entre tanto, no hubo aumento de expresión génica de la CQS y RYR2 en ese grupo. Contrariamente, el gen NCX aumentó, pero presentó correlación apenas con el gen TRα1. El gen de la SERCA2a fue el único que presentó correlación con el ARNm de la TRβ1 y aumento en la expresión génica en los animales EX50.

Discusión

El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de las hormonas tiroideas en la asociación entre la severa restricción alimenticia y entrenamiento físico y la correlación entre los receptores de HT y la expresión génica de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento de calcio intracelular del miocardio. Los resultados de este estudio mostraron que el entrenamiento físico asociado a la severa RA promovió aumento significativo del ARNm de la SERCA2a, del canal-L, de la fosfolamban y del intercambiador Na+/Ca+2. Esas alteraciones fueron acompañadas por elevación en la expresión de los receptores de hormonas tiroideas (TRβ1) a pesar de que los niveles séricos de T3 estaban normales y T4 y TSH reducidos.

Los protocolos de RA y entrenamiento físico promovieron importantes alteraciones morfológicas (tab. 1). Las reducciones del peso corporal, peso del VD y peso del VI inducidas por la RA están asociadas al grado de restricción calórica. Restricción alimenticia, exceso de ingestión o estado de ayuno alteran el gasto energético y la composición corporal25. La reducción del gasto energético durante la restricción alimenticia ha sido documentada y representa un mecanismo de conservación de energía, que previene la pérdida de peso corporal en exceso25. Las cámaras cardíacas fueron reducidas en la misma proporción de la reducción de peso corporal, como es observado por las relaciones VI/PC y VD/PC. La disminución del peso corporal por el entrenamiento físico está asociada al aumento del gasto energético decurrente de las sesiones de entrenamiento físico; las relaciones VI/PC y VD/PC fueron mantenidas en relación al grupo control. La asociación del EF y RA intensificó la reducción de peso corporal, sin embargo preservó la masa del VI y del VD y mantuvo las relaciones VI/PC y VD/PC cuando fueron comparados con los ratones R50. Así, los resultados referentes a las cámaras cardíacas indican que la RA promovió significativa reducción de la masa cardíaca y el entrenamiento físico, aislado o asociado a RA, no promovió hipertrofia cardíaca. Esos resultados fueron semejantes a los constatados en estudios anteriores10.

La RA, aislada o en ratones entrenados, redujo los niveles de T4 y TSH, mientras que el entrenamiento físico no alteró los niveles séricos de los hormonas tiroideas. A pesar de que la RA redujo el nivel sérico de T3 en 29% en ambos grupos (R50 y EX50), esa reducción no fue de magnitud suficiente para mostrar diferencia estadística entre los grupos. La ausencia de alteración en los niveles de T3 puede ser decurrente del dosaje del T3 total y no del T3 libre, que es la forma activa de la hormona. Datos de literatura indican que, en estados de ayuno y severa restricción calórica, ocurren acentuado aumento de T3 reverso13. Así es posible que la relación entre T3 libre y T3 reverso haya sido reducida en los animales sometidos a RA. Se cree que la privación de energía puede modular la concentración sérica de T3 y reducir la actividad o concentración de yodotironina deiodinasa que convierte T4 en T326. La significativa reducción de los niveles séricos de T4 y TSH inducido por la RA indica estado de hipotiroidismo, lo que también fue observado en estudios experimentales8,13,27,28 y clínicos29. El mecanismo responsable por la reducción de los niveles plasmáticos de las hormonas tiroideas inducida por la RA puede estar relacionado a la propia reducción en el consumo energético. La reducción de los niveles de hormonas tiroideas está relacionada al mecanismo de conservación de energía, una vez que esas hormonas son los principales responsables por el gasto energético25. Considerando que el gasto energético es reducido en la restricción alimenticia, seria esperada reducción de los niveles de HT. El entrenamiento físico no promovió alteraciones en los niveles plasmáticos de las hormonas tiroideas. Este resultado difiere del observado por Iemitsu et al22 y Katzeff et al13, que verificaron aumento en los niveles séricos de T4. Esa discrepancia de resultados puede haber sido decurrente del tipo, intensidad y volumen de entrenamiento físico. En conclusión, mientras que la RA promovió el estado de hipotiroidismo, el entrenamiento físico parece no tener efecto directo sobre la acción de las hormonas tiroideas.

En el corazón de ratones, más de 70% de todos los receptores HT son TRα1, con TRβ1 constituyendo apenas 30%30. La hormona tiroidea se liga a elementos responsivos de tiroides (receptores de HT) en regiones promotoras de varios genes, regulando la transcripción de genes blanco en el corazón incluyendo intercambiador Na+/Ca+2, rianodina, canal de calcio tipo-L y principalmente SERCA2a y fosfolambam30. Esa regulación por el HT es un importante mecanismo en el proceso de contracción y relajación del miocardio31.

Los resultados de este estudio indican que el estado de hipotiroidismo inducido por la RA redujo la expresión del gen TRα1, receptor predominante del miocardio. Ese resultado era esperado, una vez que la reducción de HT acarrea feedback negativo en el receptor HT. El entrenamiento físico, aislado o asociado a RA, aumentó la expresión del TRβ1 sin alterar los niveles de TRα1. La escasa literatura sobre el papel de los receptores TRα1 y TRβ1 en la transcripción génica de proteínas del tránsito de calcio del miocardio. Kinugawa et al21 mostraron que el TRα1 está relacionado con transcripción de la a-MHC y síntesis proteica miocárdica, mientras que el TRβ1 está relacionado con SERCA2a, el propio TRβ1 e inhibición de la b-MCH. Así, nuestros datos sugieren que la reducción del gen TRα1 por la RA podría ser un mecanismo asociado a la pérdida de masa cardíaca; la ausencia de hipertrofia en los animales entrenados podría ser decurrente de la manutención de los niveles de TRα1.

Los efectos de las intervenciones, RA y EF, resultaron en alteraciones en el ARNm de las estructuras moleculares reguladoras del transito de calcio (tab. 2). El aumento de la SERCA2a y PLB en los ratones EX50 observados en este estudio sugiere que el proceso de recaptura de calcio por el retículo sarcoplasmático (RS) puede estar facilitado. La explicación para esa hipótesis se basa en los datos referentes a los efectos de la RA que, aisladamente, promovió solamente aumento de la PLB indicando empeoramiento en el proceso de recaptura de calcio por el RS. Como ese proceso es dependiente de ATP y, en la severa restricción alimenticia, se necesita economía de energía, el aumento de la fosfolamban podrá acarrear reducción de la actividad de la SERCA2a. Cuando la RA fue asociada al entrenamiento físico hubo aumento proporcional de la SERCA2a y de la PLB, indicando que el entrenamiento físico protegió al miocardio de los daños provocados por la RA. La mejora en el proceso de recaptura de calcio por el RS inducido por el entrenamiento físico está de acuerdo con estudios de Kemi et al32 que observaron aumento de la recaptura de calcio en el miocardio decurrente de la elevación de la SERCA2a y fosfolamban fosforilada (PLB-thr17) en ratones entrenados. El aumento del canal de calcio-L observado en los animales EX50 sugiere un aumento del influjo de calcio en el sentido de mejorar la respuesta contráctil. La elevación del gen NCX tendría como finalidad compensar el aumento del influjo de calcio por los canales lentos de calcio sarcolemal.

En este estudio no fue posible relacionar los receptores HT con las estructuras moleculares del tránsito de calcio en el miocardio de ratones entrenados y sometidos a severa RA, considerando que el test de correlación no mostró significación en el ARNm de la SERCA2a, PLB, NCX, canal-L con los receptores TRα1 o TRβ1. Datos de literatura muestran asociación de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento de calcio con receptores de HT inducidos por el entrenamiento o estado de hipotiroidismo; Iemitsu et al22 verificaron aumento significativo en la expresión de los receptores TRα1 y TRβ1 acompañado de aumento en la expresión de la SERCA2a por el entrenamiento físico. En condiciones de hipotiroidismo, la insuficiencia de la tiroides está asociada a disminución de la SERCA2a y aumento de la fosfolamban23, aumento en la expresión del NCX33 y niveles de canal-L inalterados34 o aumentados35.

Los mecanismos moleculares para el aumento de la transcripción génica de la SERCA2, PLB y NCX en el ejercicio aislado o asociado a la RA aun no están aclarados; como fue citado anteriormente, nuestros hallazgos sugieren que los HT y/o receptores de HT no participan en la transcripción génica de las estructuras moleculares del tránsito de calcio en ese grupo de animales. El proceso de remodelación cardíaca es consecuente de estímulos extracelulares que activan señales citosólicas complejas, con números puntos de integración, y procesos transcripcionales nucleares. Entre los estímulos extracelulares los agonistas de receptores acoplados a proteína G (angiotensina, endotelinas, catecolaminas), citocinas y factores de crecimiento (IGF, TGF, FGF) son los principales candidatos que podrían, por lo tanto, estimular la transcripción génica de estructuras del movimiento de calcio36,37. Entre tanto, no existen datos de literatura que permitan especular sobre los mecanismos responsables por el aumento de la transcripción génica de la SERCA2, PLB y NCX en la interacción ejercicio y restricción alimenticia.

Limitaciones del estudio

Nuestros hallazgos de expresión génica de ARNm obtenidos por medio de PCR cuantitativo de la SERCA2a, fosfolamban, intercambiador Na+/Ca+2, canal de calcio tipo-L, calsequestrina y receptores de HT pueden no traducirse en formación de proteínas. Datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio verificaron significativa reducción de la expresión proteica del canal tipo-L en ratones con severa RA, contrariando nuestros hallazgos de aumento de ARNm de la misma proteína14. Por lo tanto, la continuidad de esos hallazgos será la determinación de la expresión proteica por Western Blot. Tampoco fue posible establecer una relación de causa-efecto de los hormonas tiroideas y/o receptores de HT con el ARNm del tránsito de calcio; serían necesarios estudios con tratamiento de HT o utilizando animales monoclonales específicos para HT.

En conclusión, los datos del trabajo mostraron aumento de la expresión de ARNm de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio en animales sometidos a severa restricción y entrenamiento físico. A pesar de que la asociación EF y RA induce estado de hipotiroidismo, el eje HT-receptor no parece participar de la transcripción del ARNm de las proteínas del transito de calcio del miocardio.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

FAPESP financió el presente estudio.

Vinculación Académica

No hay vinculación de este estudio a programas de post grado.

Referencias

Original Articles Upregulation of mRNA myocardium calcium handling in rats submitted to exercise and food restriction

BACKGROUND: Chronic exercise and food restriction (FR) have directionally opposite changes in transcription of molecular structures of calcium handling and thyroid hormone (TH) status. OBJECTIVE: Evaluate the association of chronic exercise and FR on serum thyroid hormones and gene transcription of molecular structures of intracellular calcium transients and thyroid receptors in myocardium of rats. METHODS: Male Wistar Kyoto rats, divided into two groups: control (C, n = 7), FR (R50, n = 7), chronic exercise (EX, n = 7) and chronic exercise + FR (EX50, n = 7). FR was of 50% and exercise was swimming (1 hour/day, 5 days/week, during 12 weeks). Serum concentrations of T3, T4 and TSH were determined. The mRNA gene expression of the sarcoplasmatic reticulum calcium pump (SERCA2a), phospholamban (PLB), Na+/Ca+2 exchanger (NCX), calcium channel L-type (L-channel), ryanodine (RYR), calsequestrin (CQS) and HT receptor (TRα1 and TRβ1) of the myocardium was performed by PCR real-time. RESULTS: FR reduced serum levels of T4 and TSH and TRα1 mRNA and increased the expression of PLB, NCX and L-channel. Exercise increased the TRβ1 receptor, L-channel and NCX. The association of exercise and FR reduced plasma T4 and TSH, TRβ1 mRNA increase, SERCA2a, NCX and PLB, and there was a significant correlation of TRβ1 with CQS and NXC. CONCLUSION: Chronic exercise and food restriction increased the mRNA of transient Ca2+ proteins; however, TH-receptor axis cannot participate in the transcription of mRNA of myocardial calcium transient proteins.

 Exercise caloric restriction thyroid hormones myocardium carrier proteins calcium

Mário Mateus SugizakiI, II; Ana Paula Lima LeopoldoII; Sandro José CondeII; Dijon Salome CamposII; Ricardo DamatoII; André Soares LeopoldoII; André Ferreira do NascimentoII; Silvio de Assis Oliveira JúniorII; Antonio Carlos CicognaII

IInstituto de Ciências da Saúde - Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, Campus de Sinop, Cuiabá, MT

IIFaculdade de Medicina - Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus de Botucatu, Botucatu, SP - Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Chronic exercise and food restriction (FR) have directionally opposite changes in transcription of molecular structures of calcium handling and thyroid hormone (TH) status.

OBJECTIVE: Evaluate the association of chronic exercise and FR on serum thyroid hormones and gene transcription of molecular structures of intracellular calcium transients and thyroid receptors in myocardium of rats.

METHODS: Male Wistar Kyoto rats, divided into two groups: control (C, n = 7), FR (R50, n = 7), chronic exercise (EX, n = 7) and chronic exercise + FR (EX50, n = 7). FR was of 50% and exercise was swimming (1 hour/day, 5 days/week, during 12 weeks). Serum concentrations of T3, T4 and TSH were determined. The mRNA gene expression of the sarcoplasmatic reticulum calcium pump (SERCA2a), phospholamban (PLB), Na+/Ca+2 exchanger (NCX), calcium channel L-type (L-channel), ryanodine (RYR), calsequestrin (CQS) and HT receptor (TRα1 and TRβ1) of the myocardium was performed by PCR real-time.

RESULTS: FR reduced serum levels of T4 and TSH and TRα1 mRNA and increased the expression of PLB, NCX and L-channel. Exercise increased the TRβ1 receptor, L-channel and NCX. The association of exercise and FR reduced plasma T4 and TSH, TRβ1 mRNA increase, SERCA2a, NCX and PLB, and there was a significant correlation of TRβ1 with CQS and NXC.

CONCLUSION: Chronic exercise and food restriction increased the mRNA of transient Ca2+ proteins; however, TH - receptor axis cannot participate in the transcription of mRNA of myocardial calcium transient proteins.

Keywords: Exercise; caloric restriction; thyroid hormones; myocardium; carrier proteins; calcium.

Introduction

Interventions such as physical activity and food restriction (FR) have often been used to maintain health or esthetics. However, depending on the intensity, duration and frequency of FR and physical activity, there may be damage to the organism1-7. Research shows that this association may depress8 or improve cardiac performance9,10.

Molecular structures found in the sarcolemma, slow L-type calcium channel (L-channel) and sodium/potassium exchanger (NCX), also found in the sarcoplasmic reticulum, ryanodine channel, the calsequestrin (CQS), the sarcoplasmic reticulum calcium pump (SERCA2a) and phospholamban, are involved in the intracellular calcium handling and participate in the cardiac muscle contraction and relaxation11. Studies show that FR decreases the gene expression of ryanodine12, SERCA213, L-channel14, while physical training (PT) increases the mRNA of SERCA215-17, ryanodine18,19 and L-channel20. The transcription of the molecular structures involved in the intracellular calcium handling can be modulated by thyroid hormones (TH), via nuclear receptors of HT21-23. It is known that food restriction reduces the synthesis and release of TH hormones13 and exercise can increase the release and/or the sensitivity of these hormones21. However, the relationship between FR, PT and thyroid hormones has not been established.

There is little literature that examines the relationship between FR, physical training, thyroid hormones and gene transcription of molecular structures of myocardial calcium handling. Katzeff et al13 found decreased plasma levels of TH hormones and decreased gene expression of SERCA2 in restricted rats. Iemitsu et al22 showed that exercise training increased the expression of TRα1 and TRβ1 receptors and the gene transcription of SERCA2 in the myocardium of aged rats.

The objective of this study was to evaluate the effects of the combination of physical training and FR on plasma of thyroid hormones and the mRNA of TH receptors, SERCA2a, L-channel, NCX, ryanodine, calsequestrin and phospholamban in the myocardium of rats.

Methods

Animal models and experimental protocol

This study used 28 Wistar-Kyoto (WKY) 60 day-old rats from the Experimental Animal Laboratory, Department of Clinical Medicine, Faculty of Medicine of Botucatu. During the experiment, the animals were kept in individual cages in a temperature-controlled environment (24 ± 2º C), light-dark cycle (12:12 h) and fed with commercial food and water. The project followed the guidelines established in Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and the Ethical Principles in Animal Experiments of the Brazilian College of Animal Experimentation (Cobea), and was approved by the Ethics Committee of the Faculty of Medicine of Botucatu - UNESP, under protocol 575/2006.

The rats were divided into four groups: control with ad libitum food (C); food restricted to 50% (R50); chronic exercise with ad libitum food (EX); chronic exercise with food restriction of 50% (EX50).

Animals in groups C and EX were fed with commercial food Labina (Purina, Paulina, SP, Brazil) consisting of 3.76% fat, 20.96% protein, 52.28% carbohydrate, 9.60% ash and 13.40% humidity. Animals in groups R50 and EX50 received the same commercial diet but with a 50% reduction of the average amount consumed by the control group. The FR period was 90 days. Food intake was monitored daily and the weight of the animals was monitored weekly.

Training was swimming with a load of 5% of body weight. For swimming sessions, we used two tanks of fiber glass with the following dimensions: 100 cm long, 80 cm wide and 80 cm high containing heated water (32 ± 1º C), maintained at the level of 60 cm. The weight overload was performed using fishing sinkers wrapped in bandages and attached to the thorax of the rats by means of elastic bands. Up to six animals per training session were maintained.

Animals in groups EX and EX50 underwent five weekly sessions of swimming for 12 consecutive weeks. In the first, second and third weeks, the animals swam for 30, 45 and 60 minutes, respectively, without any additional load. From the fourth week, the swimming sessions were 60 minutes and overloaded. The rats of these groups had been previously subjected to a period of adaptation to the water. During one week, they were kept for 15 minutes inside the tank containing heated water, whose initial level of water was 7.0 cm, and gradually increased throughout the week, reaching a height of 60 cm.

T3, T4 and TSH serum level

Prior to sacrifice, animals were fasted for 12 hours and then were killed by decapitation, anesthetized with sodium pentobarbital (0.1 ml/kg) and blood was immediately transferred into test tubes. The doses of triiodothyronine (T3), thyroxine (T4) and thyroid-stimulating hormone (TSH) were determined using a specific commercial kit for rats, thyroid panel (LINCOplex) at the Gênese clinical laboratory, São Paulo - Brazil.

Assessment of general characteristics of animals

After collecting blood, the heart was removed, and the atrium, right ventricle and left ventricle were dissected and then weighed and frozen for analyses of gene expression. The morphological variables used to characterize each group of animals were: initial body weight (IW) and final body weight (FW), left ventricular weight (LV), ratio of left ventricular weight and final body weight (LV/FW x 103), right ventricular weight (RV), ratio of right ventricular weight and final body weight (RV/FW x 103).

Evaluation of gene expression by real-time polymerase chain reaction after reverse transcription

RNA extraction

Left ventricular fragments were quickly frozen in liquid nitrogen and stored in a freezer at -80º C. The frozen sample was homogenized in Polytron apparatus (Ika Ultra Turrax™ T25 Basic, Wilmington, USA) after adding 1 ml of TRIzol™ (Invitrogen Brasil, São Paulo) for each 100 mg of tissue. The TRIzol™, monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate, is intended to maintain the integrity of RNA during the cell lysis that occurs in the process of homogenization24.

The homogenized sample was transferred to a tube and incubated at room temperature for 5 minutes to allow complete dissociation of core-protein. Then, chloroform was added (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) at a rate of 0.2 ml/1 ml TRIzol™; the sample was shaken by hand vigorously for 15 seconds and incubated for 3 minutes at room temperature. After this second incubation, the material were centrifuged (Eppendorf 5804R, Hamburg, Germany) at 14,000 rpm for 15 minutes at 4º C. In this process, the sample was separated into three phases: a) a lower, pinkish phase of phenol-chloroform, containing DNA; b) a white interphase protein; and c) an upper phase, aqueous, colorless, containing RNA.

The RNA portion was transferred to a tube containing 0.5 ml of isopropyl alcohol (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). The sample was manually shaken 10 times by inversion, incubated for 10 minutes at room temperature and then centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes at 4º C. The pellet was washed with 75% ethanol (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) at the rate of 1 ml/1 ml of TRIzol™ and centrifuged at 7,500 rpm for 5 min at 4º C. After ethanol was disposed of, the pellet was dried for 10 minutes at room temperature. The RNA pellet was dissolved in 30 µl of ultrapure water and incubated for 10 minutes at 60º C water bath (Fanem mod 100, São Paulo, Brazil); but this procedure aimed to inactivate the possible presence of RNase.

The RNA was analyzed with the aid of a spectrophotometer (GeneQuant™ RNA/DNA Calculator, Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, England) by absorbance at 260 nm. The purity of RNA was verified by absorbance ratio at 260/280 nm. The samples whose ratios were below 1.6 were disposed of due to their contamination by protein.

Testing the integrity of RNA by electrophoresis

Samples of 1.0 µl of total RNA diluted in 8.0 µl of ultrapure water and 1.0 µl of dye (Orange G, Acros Organics, New Jersey, USA) were applied in agarose gel 1% (0.3 g agarose, 30 ml of 1x TAE Buffer, 3.0 ml of ethidium bromide) and subjected to a voltage of 60 mV (Power Pac Basic™ Bio-Rad) for 20 minutes. The integrity of RNA was verified by visualization of rRNA bands, 28S and 18S, and no traces of RNA in the gel. The samples that remained intact were used as substrates for reverse transcription.

RNA reverse transcription (RT)

The RNA samples of the heart muscle were subjected to reverse transcription by the action of the enzyme reverse transcriptase, using the kit SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR™ (Invitrogen, Brazil, São Paulo). The samples used in the experiment were incubated in a thermocycler (Mastercycler Gradient Eppendorf™ Hamburg, Germany). Initially, a mixture containing 1,000 ng/ml total RNA, 1.0 ml l dNTP mix 10 mM, 1.0 ml of random hexamers (50 ng/ml) and 8.0 ml of H2O DEPC (diethyl pyrocarbonate) was incubated for 5 minutes at 65° C. Then, after adding 9.0 ml of a solution containing 2.0 ml of RT 10x buffer, 4.0 ml of MgCl2 25 mM , 2.0 ml of DTT 0.1 M and 1.0 ml of RNase inhibitor, RNaseOUT™, the mixture was incubated for 2 minutes at 25° C. After adding 1.0 ml of the enzyme SuperScript II™, we proceeded to further incubation for 10, 50 and 15 minutes at 25° C, 42° C and 70° C, respectively. After adding 1.0 ml of RNase H, the solution was incubated for 20 minutes at 37° C.

To check the quality of reverse transcription, we employed two methods:

1) Positive control - The kit contains an RNA transcribed from the gene of chloramphenicol acetyltransferase and control primers A and B. These primers in polymerase chain reaction generate a product of 500 base pairs (bp);

2) Negative control - To prove the absence of a residual genomic DNA, a sample of RNA was subjected to RT reaction, but the enzyme SuperScript II™ was replaced with 1.0 ml of H2O DEPC. This product was used in the PCR reactions and the absence of residual genomic DNA was confirmed by the absence of amplification products.

Real-time polymerase chain reaction

Aliquots of RT reaction containing 2.0 µg of cDNA were added to a mixture containing TaqMan™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) and custom assay containing sense and anti-sense primers and Taqman™ probe (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) specific for each gene, and the volume completed to 25ml with water treated with DEPC. The reactions were performed in triplicates for each target gene in the Real Time PCR System 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. For each specimen, an amplification graph showing increased fluorescent reporter dye (ΔRn) was plotted in each cycle of PCR. From this graph, we determined the cycle in which the reaction crosses the threshold of detection (cycle threshold - CT) based on the variability of baseline data obtained from the initial cycles of PCR. The primers for the genes analyzed (Box 1) were obtained using the software Primer Express™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) from published sequences in the GenBank (www.pubmed.com). The relative quantification of each gene normalized by endogenous reference (cyclophilin) was performed according to the User Bulletin # 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Statistical analysis

The experimental results were expressed as mean ± SD. Comparisons between groups were performed by two-way analysis of variance (ANOVA), exercise and diet, followed by the Tukey's test. Relations between the mRNA of SERCA2a, PLB, CQS, NCX, L-channel and RYR2 and thyroid hormone receptors, TRβ1 and TRα1, were measured by Pearson's correlation coefficient. The significance level was 5%.

Results

The general characteristics of the animals are shown in Table 1. The initial body weights and the LV/FW were not different between the groups. The animals restricted, R50 and EX50, had final body weights, LV, RV, atrium and feed consumption significantly lower than their respective controls (C vs R50 and EX vs EX50). The trained animals, EX and EX50, showed a reduction in final body weights compared to C and R50 rats, respectively. The EX rats increased their atrium weight in relation to animals C. The LV/FW ratio significantly increased in EX50 animals compared to EX animals.

Table 2 presents the results of the evaluation of mRNA by the real-time PCR technique. It was found that R50 animals increased the expression of NCX, L-calcium channel and PLB, and reduced the expression of TRα1 compared to control rats. Animals in the EX group increased the expression of NCX, L-channel and TRβ1 receptor compared to control animals. The association of physical training and FR, in the EX50 group, increased expression of SERCA2a, NCX and PLB over animals EX and R50. Moreover, the EX50 animals showed increased expression of TRβ1 compared to R50 rats.

Serum levels of T3, T4 and TSH are presented in Table 3. There was no change in serum concentration of T3 by the action of FR or physical training. The trained rats, EX, showed no change in serum concentrations of T4 and TSH. However, there was significant reduction of T4 and TSH in the groups R50 and EX50 compared to respective controls (C vs R50 and EX vs EX50).

The correlation coefficients and significances between mRNA of calcium handling structures and thyroid hormone receptors are shown in table 4. Only the positive correlations (r > 0.70) in group EX50 are presented, since the objective of this study was to evaluate the association and physical training and food restriction on the gene transcription of molecular structures involved in the calcium handling and the influence of the TH receptor in the myocardium. Thus, the correlation coefficients for the groups C, R50 and EX were presented to define the participations of the factors exercise, food restriction and association between two factors.

It was observed that the TRβ1 gene has more correlations with the molecular structures of the calcium handling than the TRα1 gene (Table 4). Although the L-channel mRNA and PLB have shown significant increase in EX50 rats, these genes did not show any correlation with the genes TRα1 or TRβ1. The mRNA of ryanodine was significantly correlated with mRNA of TRβ1 in all groups and was higher in the combination of FR with physical training. The SERCA2a mRNA also showed a good correlation with the mRNA of TRβ1 in the groups R50, EX and EX50 although it is not statistically significant, which may be due to the low number of samples. Calsequestrin and NCX genes correlated well with the mRNA TRβ1 and TRα1, respectively, only in the group EX50 indicating the dependence of the association of both factors. It is interesting to note that the mRNA of CQS and RYR2 were strongly correlated with TRβ1 in EX50 animals. However, there was no significant increase in gene expression of CQS and RYR2 in this group. Conversely, the NCX gene increased but correlated only with the gene TRα1. The SERCA2a gene was the only one to correlate with the mRNA of TRβ1 and increase in gene expression in animals EX50.

Discussion

The objective of this study was to evaluate the participation of thyroid hormones in the association between severe food restriction and physical training and the correlation between TH receptors and gene expression of the molecular structures involved in myocardial intracellular calcium handling. The results of this study showed that physical training associated with severe FR promoted a significant increase of mRNA of SERCA2a, L-channel, phospholamban and Na+/Ca2+ exchanger. These changes were accompanied by an increase in the expression of thyroid hormone receptors (TRβ1 despite normal serum levels of T3 and reduced serum levels of T4 and TSH.

FR and physical training protocols promoted significant morphological changes (Table 1). The reductions in body weight, RV weight and LV weight induced by FR are associated with the degree of caloric restriction. Food restriction, excessive intake or fasting state, change energy expenditure and body composition25. The reduction in energy expenditure during food restriction has been documented and represents a mechanism of energy conservation, which prevents excessive loss of body weight25. The heart chambers were reduced in proportion to the reduction of body weight, as observed by the relations LV/BW and RV/BW. The decrease in body weight by exercise training is associated with increased energy expenditure resulting from physical training sessions; the LV/BW and RV/BW ratios were maintained compared to the control group. The association of PT and FR enhanced reduction in body weight, but kept the LV and RV mass and maintained the LV/BW and RV/BW ratios compared with R50 rats. Thus, the results related to the cardiac chambers indicate that the FR promoted a significant reduction of cardiac mass and physical training, alone or combined with FR, did not cause cardiac hypertrophy. These results were similar to those observed in previous studies10.

FR, alone or in trained rats, reduced levels of T4 and TSH, while physical training did not change serum levels of thyroid hormones. Although FR reduces the serum level of T3 by 29% in both groups (R50 and EX50), this reduction was not of sufficient magnitude to show a statistical difference between groups. The lack of change in T3 levels may be due to total T3 rather than free T3, which is the active form of the hormone. Literature data indicate that in states of fasting and severe calorie restriction, there is marked increase of reverse T313. So it is possible that the free T3/reverse T3 ratio was reduced in animals subjected to FR. It is believed that energy deprivation may modulate serum concentration of T3 and reduce the activity or concentration of iodothyronine deiodinase that converts T4 into T326. The significant reduction of serum levels of T4 and TSH induced by FR indicates state of hypothyroidism, which was also observed in experimental8,13,27,28 and clinical studies29. The mechanism responsible for decreased plasma levels of thyroid hormones induced by FR may be related to the actual reduction in energy consumption. Reduced levels of thyroid hormones relate to the mechanism of energy conservation, since these hormones are mainly responsible for the energy expenditure25. Considering that energy expenditure is reduced in the food restriction, reduced levels of TH would be expected. Physical training did not promote changes in plasma levels of thyroid hormones. This result differs from that reported by Iemitsu et al22 and Katzeff et al13, who found an increase in serum levels of T4. This discrepancy in results may have been due to the type, intensity and volume of physical training. In conclusion, while the FR promoted the state of hypothyroidism, physical training seems to have no direct effect on the action of thyroid hormones.

In the heart of rats, over 70% of all TH receptors are TRα1, with TRβ1 accounting for only 30%30. The thyroid hormone binds to thyroid response elements (TH receptors) in regions that promote many genes, regulating transcription of target genes in the heart including Na+/Ca2+ exchanger, ryanodine, L-type calcium channel and mainly SERCA2a and fosfolambam30. This regulation by TH is an important mechanism in the process of myocardial contraction and relaxation31.

The results of this study indicate that the state of hypothyroidism induced by FR decreased the expression of the gene TRα1, a receptor prevalent in the myocardium. This result was expected since the reduction of TH causes a negative feedback in the TH receptor. Exercise training, alone or combined with FR, increased expression of TRβ1 without changing the levels of TRα1. There is limited literature on the role of TRα1 and TRβ1 receptors on the gene transcription of proteins of the myocardial calcium handling. Kinugawa et al21 showed that the TRα1 relates to the transcription of a-MHC and myocardial protein synthesis, while TRβ1 relates to SERCA2a, TRb1 itself and inhibition of b-MCH. Thus, our data suggest that the reduction of the TRα1 gene by FR could be a mechanism associated with loss of heart mass; absence of hypertrophy in trained animals could be due to maintenance of TRα1 levels.

The effects of interventions, FR and PT, resulted in changes in the mRNA of molecular structures that regulate the calcium handling (Table 2). The increase in SERCA2a and PLB in EX50 rats observed in this study suggests that the process of calcium reuptake by the sarcoplasmic reticulum (SR) can be facilitated. The explanation for this hypothesis is based on data on the effects of FR which, alone, caused only an increase in PLB indicating a worsening in the process of reuptake of calcium by the SR. Because this process is dependent on ATP and, under severe food restriction, it requires energy savings, increased phospholamban may lead to reduced activity of SERCA2a. When FR was associated with physical training there was a proportional increase of SERCA2a and PLB, indicating that exercise training protected the myocardium from damage caused by the FR. The improvement in the process of reuptake of calcium by the SR induced by physical training is consistent with studies by Kemi et al32 who reported an increase in the reuptake of calcium in the myocardium derived from the increase of SERCA2a and phosphorylated phospholamban (PLB-thr17) in trained rats. The increased L-channel observed in EX50 animals suggests an increased influx of calcium to improve the contractile response. The increase in the NCX gene would aim to offset the increased influx of calcium through sarcolemal slow calcium channels.

In this study, we could not relate TH receptors with the molecular structures of the myocardial calcium handling in rats trained and subjected to severe FR, considering that the correlation test showed no significant difference in the mRNA of SERCA2a, PLB, NCX, L-channel with TRα1 or TRβ1 receptors. Literature data show an association of the molecular structures involved in calcium handling with TH receptors induced by training or state of hypothyroidism; Iemitsu et al22 found a significantly increased expression of TRα1 and TRβ1 receptors accompanied by increased expression of SERCA2a by physical training. In conditions of hypothyroidism, thyroid failure is associated with decreased SERCA2a and increased phospholamban23, increased expression of NCX33 and unchanged34 or increased35 levels of L-channel.

The molecular mechanisms for increasing gene transcription of SERCA2, PLB and NCX in the exercise alone or combined with FR remain unclear; as previously mentioned, our findings suggest that TH and/or TH receptors do not participate in the gene transcription of molecular structures of calcium handling in this group of animals. The process of cardiac remodeling derives from extracellular stimuli that activate complex cytosolic signals with a number of integration points, and nuclear transcriptional processes. Among the extracellular stimuli, agonists of G protein-coupled receptors (angiotensin, endothelin, catecholamines), cytokines and growth factors (IGF, TGF, FGF) are the main candidates that could therefore stimulate the gene transcription of calcium handling structures36,37. However, there is no literature data that allow speculating the mechanisms responsible for increased gene transcription of SERCA2, PLB and NCX in the interaction between exercise and food restriction.

Study limitations

Our findings of gene expression of mRNA obtained by quantitative PCR of SERCA2a, phospholamban, Na+/Ca2+ exchanger, L-type calcium channel, and calsequestrin and TH receptors may not be reflected in protein formation. Recent data obtained in our laboratory found a significant reduction of protein expression of L-type channel in rats with severe FR, which is contrary to our findings of increased mRNA in the same protein14. Therefore, the continuity of these findings will be the determination of the protein expression by Western blot. Nor was it possible to establish a cause-effect relationship between thyroid hormone and/or TH receptors with the mRNA of the calcium handling; studies with TH treatment or others using specific monoclonal animals for TH would be required.

In conclusion, the findings of the study showed increased mRNA expression of the molecular structures involved in the intracellular calcium handling in animals subjected to severe restriction and physical training. Although the association between PT and FR induces a state of hypothyroidism, the TH-receptor axis does not seem to participate in the transcription of mRNA of myocardial calcium handling proteins.

References