FUNDAMENTO: Mecanismos subjacentes a anormalidades vasculares na obesidade ainda não estão completamente esclarecidos. OBJETIVO: Foi avaliada a via do óxido nítrico/L-arginina na resposta vascular de ratos obesos por dieta rica em gordura, enfocando as células endoteliais e do músculo liso. MÉTODOS: Ratos com 30 dias de vida foram divididos em 2 grupos: controle (C) e obeso (OB, ratos sob dieta rica em gordura por 30 semanas). Após 30 semanas, foram registrados o peso corporal, índice de adiposidade, pressão arterial e perfis metabólicos e endócrinos dos animais. Foram obtidas curvas para noradrelanina na ausência e presença de inibidor de óxido nítrico sintase (L-NAME, 3x10-4M) em aorta torácica intacta e com desnudamento em ratos C e OB. RESULTADOS: As medidas de peso corporal, índice de adiposidade, leptina e insulina aumentaram nos ratos OB, enquanto a pressão arterial permaneceu inalterada. A obesidade também produziu tolerância à glicose e resistência à insulina. A reatividade à noradrenalina da aorta intacta foi similar em ratos C e OB. A presença de L-NAME produziu um aumento similar nas respostas máximas, mas um desvio maior à esquerda das respostas nas aortas intactas dos ratos C em relação aos ratos OB [EC50 (x10-7M): C = 1,84 (0,83-4,07), O = 2,49 (1,41-4,38); presença de L-NAME C = 0,02 (0,01-0,04)*, O = 0,21 (0,11-0,40)*†,*p < 0,05 vs controle respectivo,†p < 0,05 vs controle mais L-NAME, n = 6-7]. Nenhum dos protocolos alterou a reatividade à noradrenalina de aortas com desnudamento. CONCLUSÃO: A obesidade induzida por dieta rica em gordura promove alterações metabólicas e vasculares. A alteração vascular envolveu uma melhora da via endotelial L-arginina/NO provavelmente relacionada à hiperinsulinemia e hiperleptinemia induzidas por dieta. A maior resistência aos efeitos do L-NAME na aorta de ratos obesos diz respeito a menor vulnerabilidade de indivíduos obesos na presença de patologias associadas que causam danos à atividade do sistema NO.
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IIDepartamento de Medicina Clínica - UNESP
IIIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências - UNESP - Universidade Estadual Paulista, São Paulo, SP - Brasil
A obesidade pode ser definida como uma doença na qual o excesso acumulado de gordura corporal é tal que a saúde pode ser afetada de forma adversa. É considerada uma epidemia global, e constitui um dos principais problemas de saúde pública1,2. Embora a etiologia da obesidade seja complexa, diversos fatores foram envolvidos em seu desenvolvimento, especialmente a ingestão hipercalórica3. Neste contexto, existem diversos modelos experimentais de obesidade, contudo, a obesidade induzida por dieta é o modelo experimental mais relevante em relação à obesidade humana4.
Investigações recentes demonstraram que a obesidade diminui a expectativa de vida e está associada à complicações médicas, como a diabete melito tipo 2, aumento na incidência de certos tipos de câncer, complicações respiratórias (apneia obstrutiva do sono), dislipidemia, hipertensão, ateroscleroses e alterações vasculares1,5. As diretrizes atuais endossam fortemente a perda de peso para pacientes com sobrepeso ou obesos. Esta iniciativa, contudo, não distingue entre indivíduos saudáveis e aqueles com doenças crônicas, como insuficiência cardíaca e doença arterial coronariana aterosclerótica. Fazer a distinção entre estas populações pode ser importante porque há evidências que entre os pacientes com doenças crônicas, o excesso de peso está paradoxalmente associado com a diminuição de risco de desfechos adversos6-8.
Diversos estudos têm mostrado que mudanças na produção e/ou liberação de óxido nítrico (NO), um dos principais fatores endoteliais envolvido na regulação do tônus muscular9,10, estão envolvidos em várias respostas patofisiológicas. Embora existam algumas controvérsias em relação ao envolvimento da via do NO em distúrbios vasculares induzidos pela obesidade, há evidência que a piora na síntese de NO representa um defeito central, desencadeando muitas das anormalidades vasculares características dos estados de obesidade11,12.
Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto da obesidade induzida por dietas ricas em gordura na modulação da via do NO no tônus arterial, com enfoque nas células endoteliais e musculares lisas. Este estudo aumenta o entendimento dos mecanismos das alterações vasculares induzidas pela obesidade.
Ratos machos Wistar com trinta dias de vida (~150 g) foram , suplemento de proteína, vitaminas e minerais. A dieta rica em gordura era rica em calorias (dieta rica em gordura = 3,65 kcal/g
Todos os experimentos e procedimentos foram executados de acordo com o
Para analisar se a obesidade induzida por dieta rica em gordura estava associada com alterações no comportamento nutricional, o consumo de alimento foi medido diariamente. A ingestão de calorias por semana foi calculada pela média de consumo semanal de alimento x densidade energética dietética.
Como a obesidade é definida como uma quantidade excessiva de gordura corporal em relação à massa magra14, um índice de adiposidade foi considerado a partir da soma de diversas camadas adiposas. Após 12-15 h de jejum, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg) e sofreram eutanásia por decapitação. Os animais foram toracotomizados e a gordura corporal (GC) total medida pela soma dos pesos individuais das camadas adiposas: visceral, epididimal e retroperitoneal. O índice de adiposidade foi calculado pela razão: (gordura corporal total/peso corporal final) x 100.
A obesidade pode ser acompanhada por distúrbios metabólicos e endócrinos1, portanto foram analisadas a tolerância glicêmica, leptinemia e insulinemia. Em relação à tolerância glicêmica, após um jejum de 12-15 h, os ratos foram submetidos ao teste de tolerância à glicose (TTG). Amostras de sangue foram obtidas do rabo para medidas basais e após a administração de glicose (2 g/kg, i.p.)15,16. Amostras de sangue foram coletadas nos tempos 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos. Os níveis de glicose foram determinados usando o analisador ACCU-CHECK GO KIT (Roche Diagnostic Brazil Ltda., Brazil). A tolerância à glicose foi analisada a partir da área sob a curva de respostas glicêmicas. Para a análise bioquímica e hormonal, foi coletado sangue do tronco arterial em tubos heparinizados, centrifugados a 3.000 g por 15 min a 4º C. As concentrações de leptina sérica e insulina foram determinadas por ELISA, utilizando kits comerciais (Linco Research Inc.,EUA).
HOMA, um índice de resistência à insulina que emprega medidas em jejum de concentrações de plasma de glicose e insulina, foi calculado de acordo com o método descrito anteriormente17.
A pressão arterial sistólica foi determinada semanalmente usando o método da pletismografia de cauda (Narco Bio-Systems, Inc., Houston, TX) em ratos conscientes. Os ratos foram pré-aquecidos a 35 ± 2º C por 5 minutos e colocados em um aparelho de contenção para medida de pressão arterial. A média de três medidas consecutivas estáveis (com uma diferença de ~1min) foi registrada. A pressão do manguito foi controlada automaticamente e os pulsos sistólicos detectados pelo transdutor de pulso foram monitorados com o sinal de áudio. Precauções foram tomadas na seleção de um tamanho de manguito apropriado para os animais.
Após 30 semanas de dieta rica em gordura ou ração padrão para rato, os animais foram decapitados. A aorta torácica descendente foi excisada e liberada da gordura aderente e do tecido conectivo. Dois anéis transversos da mesma artéria, cada um com cerca de 4 mm de comprimento, foram cortados e montados no tamanho ótimo para o registro da tensão isométrica em câmaras dos órgãos. Um anel foi utilizado como controle, enquanto o endotélio foi mecanicamente removido do outro raspando-se gentilmente a superfície luminal18. As preparações foram montadas em banhos de órgãos contendo 7 ml solução de Krebs-Henseleit, com composição em mM: NaCl 113,0; KCl 4,7; CaCl2 2.5; KH2PO4 1,2; MgSO4 1,1; NaHCO3 25,0; Glucose 11,0; ácido ascórbico 0,11. O fluido do banho, mantido a 37,0 ± 0,5 ºC, foi saturado com uma mistura gasosa de 95% de O2 e 5% CO2. As preparações foram deixadas para atingirem equilíbrio por pelo menos 1 h sob uma tensão de repouso de 1,5 g, a qual é ótima na indução de contração máxima. A tensão foi registrada por um fisiógrafo (Ugo Basile).
As curvas cumulativas de concentração-efeito foram construídas a partir da resposta do tecido à noradrenalina, na ausência e presença de NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME 3 x 10-4 M, inibidor de NO sintase - NOS) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, EUA). No fim das curvas, doses únicas de acetilcolina (10-6 M) e nitroprussiato de sódio (10-4 M) foram usadas para testar a integridade das camadas endoteliais e de músculo liso, respectivamente.
A pressão arterial, o índice HOMA e os perfis nutricional, metabólico e endócrino foram expressos como médias ± desvios padrões. As comparações entre grupos foram feitas usando o teste
Foi calculada em cada experimento a concentração de agentes vasoativos que produziam uma resposta que era 50% do máximo (EC50) e respostas máximas. Os valores de EC50, apresentados como média com intervalos de confiança de 95% e respostas máximas (g de tensão), apresentados como médias ± EPM, foram comparados por ANOVA e teste post hoc de Tukey.
O nível de significância considerado foi de 5%.
A
A leptina plasmática C = 2,2 ± 1,9; Ob = 7,8 ± 3,3* ng/dl, n = 6-7), os níveis de glicose (C = 107,0 ± 22,1; Ob = 126,0 ± 19,3* mg/dl, n = 6-7), os níveis de insulina (C = 0,23 ± 0,08; Ob = 0,54 ± 0,07* ng/dl, n = 6-7) e o índice HOMA (C = 18.319 ± 3.500; Ob = 25.151 ± 4.100*, n = 6-7) foram significativamente maiores nos obesos em comparação ao grupo controle (*p < 0,05).
Na ausência do L-NAME, foi mostrado que a reatividade à noradrenalina da aorta intacta era similar nos ratos com dieta rica em gordura e nos ratos com dieta padrão (
A presença do L-NAME produziu um desvio à esquerda nas curvas da noradrenalina que foi menor nas aortas intactas de ratos em dieta rica em gordura do que nos ratos controle (
Independente da presença do L-NAME, a reatividade à noradrenalina não diferiu entre as aortas sem o endotélio (
Nesse estudo, os ratos com dieta rica em gordura desenvolveram obesidade caracterizada pelo aumento no peso corporal final e na massa de tecido adiposo. Embora o grupo obeso tenha ingerido menos comida, o maior ganho de peso exibido por esses animais ocorreu muito provavelmente devido ao aumento de ingestão de calorias e à eficiência da alimentação em relação aos controles. Além disso, os ratos obesos desenvolveram distúrbios metabólicos tais como intolerância à glicose, hiperinsulinemia e hiperleptinemia, características comumente relacionadas à obesidade humana15,19,20. A resistência à insulina, definida como diminuição da sensibilidade e/ou resposta às ações metabólicas da insulina, é uma característica cardinal da diabete, obesidade e dislipdemia21. Neste contexto, foi mostrado um índice HOMA aumentado nos ratos obesos, indicando o desenvolvimento de resistência à insulina nestes animais, conforme mostrado previamente por Naderalli e cols.22 em ratos alimentados com dieta específica.
Alguns estudos experimentais relataram desfechos prejudiciais de dietas altamente calóricas na reatividade vascular. Por exemplo, dieta rica em gordura danifica o vaso-relaxamento endotélio-dependente23,24. Isto pode, pelo menos em parte, explicar o aumento do risco de doença vascular em indivíduos e animais obesos. Além disso, a terapia antioxidante melhora a função endotelial25,26, sugerindo estresse oxidativo induzido por dieta na vasculatura. No presente estudo, os ratos com dieta rica em gordura tiveram alteração vascular significativa, em particular uma acentuada melhora endotelial que foi revelada na presença do L-NAME. Em outras palavras, a obesidade induzida pela dieta não alterou a reatividade da aorta à noradrenalina na ausência do L-NAME. Contudo, a presença deste inibidor produziu um desvio à esquerda das curvas de noradrenalina que foi menor na aorta dos ratos obesos em relação aos ratos controle. Além disso, a dieta rica em gordura não induziu qualquer mudança na reatividade do musculo liso da aorta à noradrenalina. Esta conclusão pode ser inferida da observação que, independentemente da presença do L-NAME, a reatividade das aortas com desnudamento não diferiu entre os grupos controle e de ratos obesos.
Já que a aorta de ratos obesos foi mais resistente aos efeitos do L-NAME, pode ser hipotetizado que a via endotelial L-arginina/NO é acentuada na vasculatura de ratos obesos. Além disso, este aumento da biodisponibilidade de NO em ratos sob dieta rica em gordura pode representar um mecanismo de adaptação para contrabalançar o desfecho prejudicial relatado de dietas calóricas na reatividade vascular na obesidade, principalmente o estresse oxidativo25,26. A melhora da via NO endotelial também pode ser explicada pela ausência de mudanças na pressão arterial dos ratos obesos, um parâmetro frequentemente aumentado na obesidade humana e animal27,28. Estes achados confirmam o "paradoxo da obesidade"6 e podem ajudar no entendimento dos mecanismos responsáveis por essa condição.
Finalmente, a literatura também relata que a vasodilatação levando à um aumento do fluxo sanguíneo é a principal consequência fisiológica da produção de NO estimulada pela insulina no endotélio vascular29. Além disso, o hormônio leptina é capaz de ativar diretamente a produção de NO em vasos e esta ativação é dependente da integridade endotelial30. Assim, a hiperinsulinemia e hiperleptinemia observadas em animais alimentados com dieta rica em gordura podem ser parcialmente responsáveis pelo aumento da produção e/ou liberação de NO endotelial na vasculatura de ratos obesos.
No geral, este estudo indica que a obesidade induzida por dieta rica em gordura promove alterações metabólicas e vasculares. A alteração vascular foi caracterizada por uma melhora na via endotelial L-arginina/NO, provavelmente relacionada às hiperinsulinemia e hiperleptinemia induzidas pela dieta. Finalmente, a maior resistência aos efeitos do L-NAME na aorta dos ratos obesos em relação aos ratos controle suscita questões sobre a menor vulnerabilidade cardiovascular de indivíduos obesos na presença de patologias associadas que causam danos à atividade do sistema NO.
Agradecemos à FAPESP, processo 07/57495-0 e 07/59747-7, pelo apoio financeiro.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Dijon Henrique Salomé Campos pela Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp.
Sandra Cordellini Rua João Carmelo, 145 - Jardim Paraíso 18610-290 - Botucatu, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 22/11/10; revisado recebido em 14/01/11; aceito em 26/01/11.
Full texts in English -
BACKGROUND: Mechanisms underlying vascular abnormalities in obesity remain to be completely clarified. OBJECTIVE: L-arginine/nitric oxide pathway was evaluated on vascular response of high-fat diet-obese rats, focusing on endothelial and smooth muscle cells. METHODS: 30-day-old rats were divided in two groups: control (C) and obese (OB, high-fat diet for 30 weeks). After 30 weeks, body weight, adiposity index, blood pressure, and metabolic and endocrine profiles of the animals were recorded. Curves to noradrenaline were obtained in absence and presence of nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME, 3x10-4M) on intact and denuded thoracic aorta from C and OB rats. RESULTS: Body weight, adiposity index, leptin and insulin levels were increased in OB, while blood pressure was unchanged. Obesity also produced glucose tolerance and insulin resistance. Reactivity to noradrenaline of intact aorta was similar in C and OB rats. L-NAME presence produced a similar increase in maximal responses, but a higher leftward shift of noradrenaline responses in intact aorta from C than in OB rats [EC50 (x10-7M): C = 1.84 (0.83-4.07), O = 2.49 (1.41-4.38); L-NAME presence C = 0.02 (0.01-0.04)*, O = 0.21 (0.11-0.40)*†,*p < 0.05 vs respective control, †p < 0.05 vs control plus L-NAME, n = 6-7]. None of the protocols altered the reactivity to noradrenaline of denuded aortas. CONCLUSION: High-fat diet-induced obesity promotes metabolic and vascular alterations. The vascular alteration involved an endothelial L-arginine/NO pathway improvement was probably correlated to diet-induced hyperinsulinemia and hyperleptinemia. The greater resistance to L-NAME effects in aorta of obese rats raises concerns about the lower cardiovascular vulnerability of obese individuals in the presence of associated pathologies that impair NO-system activity.
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Obesity can be defined as a disease in which excess body fat has accumulated so that health may be adversely affected. It is considered to be a global epidemic and constitutes a major public health problem1,2. Although the etiology of obesity is complex, several factors have been implicated in its development, especially hypercaloric intake3. In this context, a variety of experimental models of obesity exist, however, dietary-induced obesity is the most relevant experimental model regarding human obesity4.
Recent investigations have demonstrated that obesity decreases life expectancy and is associated with medical complications, such as type 2 diabetes mellitus, increased incidence of certain forms of cancer, respiratory complications (obstructive sleep apnea), dyslipidemia, hypertension, atherosclerosis and vascular alterations1,5. Current guidelines strongly endorse weight loss for patients who are overweight or obese. This initiative, however, do not distinguish between healthy individuals and those with chronic diseases such as heart failure and atherosclerotic coronary artery disease. Making the distinction between these populations may be important as there is evidence that in patients with chronic diseases, excess weight is paradoxically associated with a decreased risk of adverse outcomes6-8.
Several studies have shown that changes in the production and/or release of nitric oxide (NO), a major endothelial factor involved in the regulation of vascular tone9,10, are implicated in a variety of pathophysiological responses. Although some controversy exists as to the involvement of NO-pathway on vascular disorders induced by obesity, there is evidence that impairment of NO synthesis represent a central defect triggering many of the vascular abnormalities characteristic of obesity states11,12.
Thus, the aim of the present study was to evaluate the impact of high-fat diet-induced obesity on NO-pathway modulation of arterial tone, focusing on endothelial and smooth muscle cells. This study increases the understanding on the mechanisms of vascular alterations induced by obesity.
Thirty-day-old male Wistar rats (~150 g) were randomly assigned to one of two groups: control (C) and obese (Ob). The control group was fed a standard rat chow containing 4% fat, 42.7% carbohydrate, and 22% protein; whereas the obese animals received a high-fat diet containing 20% fat, 26.4% carbohydrate, and 20% protein. Each group was fed the diet for 30 weeks (C and Ob; n = 22). The high-fat diet was designed in our laboratory and contained powdered commercial Agroceres™ Animal Chow (Rio Claro, SP, Brazil), industrialized feed, protein supplement, vitamins and minerals. The high-fat diet was calorically rich (high-fat diet = 3.65 kcal/g versus standard diet = 2.95 kcal/g) due to the higher fat composition, made with saturated (20%) and unsaturated fatty acids (80%). All rats were housed in individual cages in an environmentally-controlled clean-air room at 23 ± 3º C with a 12-h light/dark cycle and 60 ± 5% relative humidity.
All experiments and procedures were performed in accordance with the
To analyze if dietary-induced obesity was associated with alterations in the nutritional behavior, food consumption was measured daily. Weekly calorie intake was calculated by average weekly food consumption
As obesity is defined as an excessive amount of body fat in relation to lean mass14, an adiposity index was calculated from the sum of several fat pads. After 12-15 h fasting, animals were anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg) and euthanized by decapitation. Animals were thoracotomized and the total body fat (BF) was measured from the sum of the individual fat pad weights: visceral, epididymal and retroperitoneal. The adiposity index was calculated by the ratio: (total body fat/final body weight) x 100.
Obesity can be accompanied by metabolic and endocrine disturbances1, thus glycemic tolerance, leptinemia and insulinemia were analyzed. Related to glycemic tolerance, after fasting for 12-15 h, rats were submitted to a glucose tolerance test (GTT). Blood samples were drawn from the tail at baseline and after administration of glucose (2 g/kg, i.p.)15,16. Blood samples were collected at 0, 15, 30, 60, 90 and 120 minutes. Glucose levels were determined using the ACCU-CHEK GO KIT glucose analyzer (Roche Diagnostic Brazil Ltda., Brazil). Glucose tolerance was analyzed from the area under curve of glycemic responses. For biochemical and hormonal analysis, trunk blood was collected in heparinized tubes, centrifuged at 3,000 g for 15 min at 4º C. Serum leptin and insulin concentrations were determined by ELISA using commercial kits (Linco Research Inc., USA).
HOMA, an index of insulin resistance, which employs measures of fasting plasma concentrations of glucose and insulin, was calculated according to the previously described method17.
Systolic blood pressure was weekly determined by using the non-invasive tail-cuff plethysmographic method (Narco Bio-Systems, Inc., Houston, TX) in conscious rats. The rats were prewarmed at 35 ± 2º C for 5 min and placed in a restrainer for blood pressure measurement. The mean of the three stable consecutive measures taken (~1 min apart) was recorded. The cuff pressure was controlled automatically and the systolic pulses detected by the pulse transducer were monitored with the audio signal. Care was taken in selecting an appropriate cuff size for the animal.
After 30 weeks of high-fat diet or standard rat chow exposure the animals were decapitated. The descending thoracic aorta was excised and trimmed free of adhering fat and connective tissue. Two transverse rings of the same artery, each about 4 mm in length, were cut and mounted at the optimal length for isometric tension recording in organ chambers. One ring served as control, while the endothelium was mechanically removed from the other by gently rubbing the luminal surface18. The preparations were mounted in organ baths containing 7 ml of Krebs-Henseleit solution, with composition in mM: NaCl 113.0; KCl 4.7; CaCl2 2.5; KH2PO4 1.2; MgSO4 1.1; NaHCO3 25.0; Glucose 11.0; ascorbic acid 0.11. The bathing fluid, kept at 37.0 ± 0.5º C, was saturated with a gas mixture of 95% O2, 5% CO2. The preparations were allowed to equilibrate for at least 1 h under a resting tension of 1.5 g, which is optimal in inducing the maximum contraction. Tension was recorded by a physiograph (Ugo Basile).
Cumulative concentration-effect curves were constructed from the response of the tissue to noradrenaline, in the absence and presence of NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME 3 x 10-4 M, inhibitor of NO synthase - NOS) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA). At the end of the curves, single doses of acetylcholine (10-6 M) and sodium nitroprusside (10-4 M) were used to test the integrity of endothelial and smooth muscle layers, respectively.
Blood pressure, HOMA index and nutritional, metabolic and endocrine profileswere expressed as means ± standard deviation. Comparisons between groups were performed using the Student
The concentration of vasoactive agents producing a response that was 50% of the maximum (EC50) and maximal responses were calculated in each experiment. The EC50 values, presented as mean with 95% confidence intervals and maximum responses (g of tension), presented as mean ± SEM, were compared by ANOVA and post hoc Tukey's test.
The level of significance was considered to be 5%.
The plasma leptin (C = 2.2 ± 1.9; Ob = 7.8 ± 3.3* ng/dl, n = 6-7), glucose levels (C = 107.0 ± 22.1; Ob = 126.0 ± 19.3* mg/dl, n = 6-7), insulin levels (C = 0.23 ± 0.08; Ob = 0.54 ± 0.07* ng/dl, n = 6-7), HOMA index (C = 18,319 ± 3,500; Ob = 25,151 ± 4,100*, n = 6-7) were significantly higher in the obese compared to the control group (*p < 0.05).
In the absence of L-NAME, the reactivity to noradrenaline of intact aorta was shown to be similar between high-fat and standard diet rats (
The presence of L-NAME produced a leftward shift of the noradrenaline curves that was lower in intact aortas from high-fat diet obese than control rats (
Independently of L-NAME presence, the reactivity to noradrenaline did not differ among aortas without endothelium (
In this study, high-fat diet rats developed obesity characterized by increase in final body weight and fat-pad mass. Although the obese group ingested less food, the higher weight gain exhibited by these animals was most likely due to the increased calorie intake and feed efficiency in relation to controls. In addition, the obese rats developed metabolic disorders such as glucose intolerance, hyperinsulinemia and hyperleptinemia, characteristics commonly related to human obesity15,19,20. Insulin-resistance, defined as decreased sensitivity and/or responsiveness to metabolic actions of insulin, is a cardinal feature of diabetes, obesity and dyslipidemia21. In this context, HOMA index was shown to be increased in obese rats indicating insulin-resistance development in these animals as previously reported by Naderalli et al22 in diet-fed rats.
A number of experimental studies have reported a detrimental outcome of excessive high-energy diet on vascular reactivity. For example, high-fat diet impairs endothelium-dependent vasorelaxation23,24. This may, at least in part, explain the increased risk of vascular disease in obese subject and animals. Moreover, antioxidant therapy improves endothelial function25,26, suggesting a diet-induced oxidative stress in vasculature. In the present study, diet-fed obese rats had significant vascular alteration, particularly a marked endothelial improvement that was unveiled in the presence of L-NAME. In other words, diet-induced obesity did not alter the aorta reactivity to noradrenaline in the absence of L-NAME. However, the presence of this inhibitor produced a leftward shift of noradrenaline curves that was lower in the aorta of obese in relation to control rats. Moreover, the high-fat diet did not induce any changes in the aorta smooth muscle reactivity to noradrenaline. This conclusion could be inferred from the observation that, regardless of L-NAME presence, the reactivity of denuded aortas did not differ between control and obese rats.
As the aorta from diet-fed obese rats was more resistant to the effects of L-NAME, it can be hypothesized that the endothelial L-arginine/NO pathway is improved in the vasculature of obese rats. Moreover, this increased NO bioavailability in high-fat diet rats could represent an adaptive mechanism to counteract the reported detrimental outcome of excessive high-energy diet on vascular reactivity in obesity, mainly oxidative stress25,26. The improvement in endothelial NO pathway could also explain the absence of changes in blood pressure of obese rats, a parameter often reported to be increased in human and animal obesity27,28. These findings confirm the "obesity paradox"6 and could help to understand the mechanisms responsible for this condition.
Finally, the literature also reported that vasodilation leading to increased blood flow is a major physiological consequence of insulin-stimulated production of NO in vascular endothelium29. Moreover, leptin hormone is able to directly activate NO production in vessels and this activation is dependent on endothelium integrity30. Thus, the hyperinsulinemia and hyperleptinemia observed in high-fat diet animals could be partially responsible for the increased endothelial NO production and/or release in the vasculature of obese rats.
Overall, this study indicates that high-fat diet-induced obesity promotes metabolic and vascular alterations. The vascular alteration was characterized by an endothelial L-arginine/NO pathway improvement, probably correlated to diet-induced hyperinsulinemia and hyperleptinemia. Finally, the greater resistance to L-NAME effects in the aorta of obese rats in relation to controls raises concerns about the lower cardiovascular vulnerability of obese individuals in the presence of associated pathologies that impair NO-system activity.
We are grateful to FAPESP, process 07/57495-0 and 07/59747-7, for financial support.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP.
This article is part of the thesis of master submitted by Dijon Henrique Salomé Campos, from
FUNDAMENTO: Los mecanismos subyacentes a las anormalidades vasculares en la obesidad todavía no están completamente aclarados. OBJETIVO: Se evaluó la vía del óxido nítrico/L-arginina en la respuesta vascular de ratones obesos por dieta rica en grasa, concentrándonos en las células endoteliales y en el músculo liso. MÉTODOS: Ratones con 30 días de vida que fueron divididos en 2 grupos: control (C) y obeso (OB, ratones bajo dieta rica en grasa durante 30 semanas). Después de 30 semanas, fueron registrados el peso corporal, el índice de adiposidad, la presión arterial y los perfiles metabólicos y endocrinos de los animales. Fueron obtenidas las curvas para noradrelanina en ausencia y en presencia del inhibidor de óxido nítrico sintasa (L-NAME, 3x10-4M), en la aorta torácica intacta y con denudación de los ratones C y OB. RESULTADOS: Las medidas de peso corporal, índice de adiposidad, leptina e insulina aumentaron en los ratones OB, mientras que la presión arterial permaneció inalterada. La obesidad también produjo una tolerancia a la glucosa y una resistencia a la insulina. La reactividad a la noradrenalina de la aorta intacta fue similar en los ratones C y OB. La presencia de L-NAME generó un aumento similar en las respuestas máximas, pero una desviación mayor a la izquierda de las respuestas en las aortas intactas de los ratones C con relación a los ratones OB [EC50 (x10-7M): C = 1,84 (0,83-4,07), O = 2,49 (1,41-4,38); presencia de L-NAME C = 0,02 (0,01-0,04)*, O = 0,21 (0,11-0,40)*†,*p < 0,05 vs control respectivo, †p < 0,05 vs control más L-NAME, n = 6-7]. Ninguno de los protocolos alteró la reactividad a la noradrenalina de las aortas con denudación. CONCLUSIÓN: La obesidad inducida por dieta rica en grasa genera alteraciones metabólicas y vasculares. La alteración vascular conllevó a una mejoría de la vía endotelial L-arginina/NO tal vez relacionada con la hiperinsulinemia e hiperleptinemia inducidas por dieta. La mayor resistencia a los efectos del L-NAME en la aorta de ratones obesos, se refiere a una menor vulnerabilidad de individuos obesos en presencia de patologías asociadas que causan daños a la actividad del sistema NO.
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Correspondencia
La obesidad puede ser definida como una enfermedad en la cual el exceso acumulado de grasa corporal es tal que la salud puede verse muy afectada. Se le considera una epidemia global, y constituye uno de los principales problemas de salud pública1,2. Aunque la etiología de la obesidad sea compleja, diversos factores están vinculados a su desarrollo, especialmente la ingestión hipercalórica3. En ese sentido, existen diversos modelos experimentales de obesidad, pero la obesidad inducida por dieta es el modelo experimental más relevante con relación a la obesidad humana4.
Las investigaciones recientes han venido demostrando que la obesidad reduce la expectativa de vida y que está asociada a complicaciones médicas, como la diabetes mellitus tipo 2, el aumento en la incidencia de ciertos tipos de cáncer, complicaciones respiratorias (apnea obstructiva del sueño), dislipidemia, hipertensión, arterosclerosis y alteraciones vasculares1,5. Las actuales directrices respaldan con firmeza la pérdida de peso en pacientes con sobrepeso u obesos. Esa iniciativa, sin embargo, no hace distinción entre los individuos sanos y los que tienen enfermedades crónicas, como la insuficiencia cardíaca y la enfermedad arterial coronaria arterosclerótica. Hacer la distinción entre esas poblaciones puede ser importante porque existen evidencias que demuestran que entre los pacientes con enfermedades crónicas, el exceso de peso está paradójicamente asociado a una reducción en el riesgo de los desenlaces adversos6-8.
Diversos estudios han mostrado que los cambios en la producción y/o liberación de óxido nítrico (NO), uno de los principales factores endoteliales que está involucrado en la regulación del tono muscular9,10, están involucrados en varias respuestas patofisiológicas. Aunque existan algunas controversias con relación a la involucración de la vía del NO en disturbios vasculares inducidos por la obesidad, hay pruebas de que el empeoramiento en la síntesis de NO representa una alteración importante en el desarrollo de muchas de las anormalidades vasculares características de los estados de obesidad11,12.
Por tanto, el objetivo del presente estudio, fue evaluar el impacto de la obesidad inducida por dietas ricas en grasa en la modulación de la vía del NO en el tono arterial, concentrándonos en las células endoteliales y musculares lisas. Este estudio aumenta la comprensión de los mecanismos de las alteraciones vasculares inducidas por la obesidad.
Ratones machos Wistar con treinta días de vida (~150 g), que fueron divididos aleatoriamente en dos grupos: control (C) y obeso (Ob). Al grupo control se le alimentó con pienso estándar para ratones que contenía un 4% de grasa, un 42,7% de carbohidratos y 22% de proteínas; mientras que los animales obesos recibieron una dieta rica en grasa conteniendo un 20% de grasa, 26,4% de carbohidratos y 20% de proteínas. Cada grupo fue alimentado con esas dietas por 30 semanas (C y Ob; n = 22). La dieta rica en grasa fue elaborada en nuestro laboratorio con un Pienso Animal en polvo AgroceresÒ (Rio Claro, SP, Brasil), alimento industrializado, suplemento de proteína, vitaminas y minerales. La dieta rica en grasa era rica en calorías (dieta rica en grasa = 3,65 kcal/g
Todos los experimentos y procedimientos se ejecutaron respetando el
Para analizar si la obesidad inducida por dieta rica en grasa estaba asociada a las alteraciones en el comportamiento nutricional, el consumo de alimento fue medido diariamente. La ingestión de calorías por semana se calculó a través del promedio del consumo semanal de alimento x la densidad energética dietética.
Como la obesidad está definida como una cantidad excesiva de grasa corporal con relación a la masa corporal libre de grasa14, un indicador de adiposidad fue considerado a partir de la suma de diversas capas adiposas. Después de 12-15 h de ayuno, los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (50 mg/kg) y sufrieron eutanasia por decapitación. Los animales fueron toracotomizados y la grasa corporal (GC), total fue medida por la suma de los pesos individuales de las capas adiposas, a saber: visceral, epididimal y retroperitoneal. El índice de adiposidad fue calculado por la razón: (grasa corporal total/peso corporal final) x 100.
La obesidad puede venir acompañada de disturbios metabólicos y endocrinos1, por tanto, se analizaron la tolerancia glucémica, la leptinemia y la insulinemia. Con relación a la tolerancia glucémica, después del ayuno de 12-15 h, los ratones se sometieron al test de tolerancia a la glucosa (TTG). Muestras de sangre se obtuvieron del rabo para medidas basales y después de la administración de la glucosa (2 g/kg, i.p.)15,16. Se recolectaron también muestras de sangre en los tiempos 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos. Los niveles de glucosa fueron determinados usando el analizador ACCU-CHECK GO KIT (Roche Diagnostic Brazil Ltda., Brazil). La tolerancia a la glucosa se analizó a partir del área bajo la curva de respuestas glucémicas. Para el análisis bioquímico y hormonal, se recolectó sangre del tronco arterial en tubos heparinizados, centrifugados a 3000 g por 15 min a 4º C. Las concentraciones de leptina sérica e insulina fueron determinadas por ELISA, utilizando kits comerciales (Linco Research Inc., EUA).
HOMA, es un índice de resistencia a la insulina que utiliza medidas en ayunas de concentraciones de glucosa e insulina en plasma. Fue calculado de acuerdo con el método descrito anteriormente17.
La presión arterial sistólica se determinó semanalmente usando el método de la pletismografía de cola (Narco Bio-Systems, Inc., Houston, TX), en ratones conscientes. Los ratones se precalentaron a 35 ± 2º C por 5 minutos y fueron puestos en un aparato de contención para la medida de la presión arterial. Se registró el promedio de tres medidas consecutivas estables (con una diferencia de ~1 min). La presión del manguito fue controlada automáticamente y los pulsos sistólicos detectados por el transductor de pulso fueron monitorizados con la señal de audio. Se tomaron precauciones en la selección de un tamaño de manguito apropiado para los animales.
Después de 30 semanas de dieta rica en grasa o pienso estándar para ratones, los animales se decapitaron. La aorta torácica descendente fue retirada y liberada de la grasa adherente y del tejido conectivo. Dos anillos transversos de la misma arteria, cada uno con cerca de 4 mm de largura, se cortaron y se colocaron en el tamaño adecuado para el registro de la tensión isométrica en cámaras de órgano aislado. Un anillo se usó como control, mientras que el endotelio fue mecánicamente retirado del otro raspándose suavemente la superficie luminal18. Las preparaciones se montaron en cámaras que contenían 7 ml de solución de Krebs-Henseleit, con una composición en mM: NaCl 113,0; KCl 4,7; CaCl2 2.5; KH2PO4 1,2; MgSO4 1,1; NaHCO3 25,0; Glucosa 11,0; y ácido ascórbico al 0,11. El fluido del baño se mantuvo a 37,0 ± 0,5º C, y fue saturado con la mezcla gaseosa de un 95% de O2 y un 5% CO2. Las preparaciones se dejaron hasta que alcanzasen el equilibrio de por lo menos 1 h bajo una tensión de reposo de 1,5 g, la cual es excelente en la inducción de la contracción máxima. Variaciones de tensión se registraron por un fisiógrafo (Ugo Basile).
Las curvas de concentración-efecto acumulativas se construyeron a partir de la respuesta del tejido a la noradrenalina, en ausencia y presencia de NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME 3 x 10-4 M, inhibidor de NO sintasa - NOS) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, EUA). Al final de las curvas, dosis únicas de acetilcolina (10-6 M) y nitroprusiato de sodio (10-4 M), se usaron para testar la integridad de las capas endoteliales y del músculo liso, respectivamente.
La presión arterial, el índice HOMA y los perfiles nutricional, metabólico y endocrino, fueron expresados como promedios ± desviaciones estándar. Las comparaciones entre los grupos fueron hechas usando el test
La concentración de agentes vasoactivos que producían una respuesta que era 50% del máximo (EC50) y las respuestas máximas, se calcularon en cada experimento. Los valores de EC50, presentados como promedio con intervalos de confianza de un 95% y las respuestas máximas (g de tensión), presentadas como promedios ± EPM, fueron comparados por ANOVA y el test
El nivel de significancia considerado fue de un 5%.
La
La leptina plasmática C = 2,2 ± 1,9; Ob = 7,8 ± 3,3* ng/dl, n = 6-7), los niveles de glucosa (C = 107,0 ± 22,1; Ob = 126,0 ± 19,3* mg/dl, n = 6-7), los niveles de insulina (C = 0,23 ± 0,08; Ob = 0,54 ± 0,07* ng/dl, n = 6-7) y el índice HOMA (C = 18.319 ± 3.500; Ob = 25.151 ± 4.100*, n = 6-7), fueron significativamente mayores en los obesos en comparación con el grupo control (* p < 0,05).
En ausencia del L-NAME, quedó demostrado que la reactividad a la noradrenalina de la aorta intacta era similar en los ratones con dieta rica en grasa y en los ratones con dieta estándar (
La presencia del L-NAME generó una desviación hacia la izquierda en las curvas de la noradrenalina que fue menor en las aortas intactas de ratones con dieta rica en grasa que en los ratones control (
Independientemente de la presencia del L-NAME, la reactividad a la noradrenalina no fue diferente entre las aortas sin el endotelio (
En este estudio, los ratones con una dieta rica en grasa, desarrollaron una obesidad caracterizada por el aumento en el peso corporal final y en la masa de tejido adiposo. Aunque el grupo obeso haya ingerido menos comida, la mayor ganancia de peso exhibido por esos animales se dio muy probablemente, debido al aumento de la ingestión de calorías y a la eficiencia de la alimentación con relación a los controles. Además, los ratones obesos sufrieron disturbios metabólicos como la intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia e hiperleptinemia, características generalmente relacionadas con la obesidad humana15,19,20. La resistencia a la insulina, definida como la disminución de la sensibilidad y/o respuesta a las acciones metabólicas de la insulina, es una característica fundamental de la diabetes, obesidad y dislipdemia21. Es ese contexto, fue mostrado un índice HOMA aumentado en los ratones obesos, indicando el desarrollo de resistencia a la insulina en esos animales, conforme a lo que aparece previamente dicho por Naderalli et al22 en ratones alimentados con dieta específica.
Algunos estudios experimentales relataron desenlaces perjudiciales de dietas altamente calóricas en la reactividad vascular. Por ejemplo, una dieta rica en grasa perjudica el vaso-relajamiento endotelio-dependiente23,24. Y eso puede, por lo menos en parte, explicar el aumento del riesgo de enfermedad vascular en individuos y animales obesos. Además, la terapia antioxidante mejora la función endotelial25,26, sugiriendo un estrés oxidativo inducido por una dieta en la vasculatura. En el presente estudio, los ratones con una dieta rica en grasa, tuvieron una alteración vascular significativa, en particular una acentuada mejoría endotelial que fue revelada en presencia del L-NAME. En otras palabras, la obesidad inducida por la dieta, no alteró la reactividad de la aorta a la noradrenalina en ausencia del L-NAME. Sin embargo, la presencia de ese inhibidor generó una desviación hacia la izquierda de las curvas de noradrenalina que fue menor en la aorta de los ratones obesos con relación a los ratones control. Además, la dieta rica en grasa no indujo ningún cambio en la reactividad del músculo liso de la aorta a la noradrenalina. Esa conclusión puede deberse a la observación de que, independientemente de la presencia del L-NAME, la reactividad de las aortas con denudación no fue diferente entre los grupos control y el de los ratones obesos.
Ya que la aorta de ratones obesos fue más resistente a los efectos del L-NAME, podemos pensar hipotéticamente, que la vía L-arginina/NO endotelial es acentuada en la vasculatura de ratones obesos. Además de eso, ese aumento de la biodisponibilidad de NO en ratones bajo una dieta rica en grasa, puede representar un mecanismo de adaptación para equilibrar el desenlace prejudicial relatado para las dietas calóricas en la reactividad vascular en la obesidad, principalmente el estrés oxidativo25,26. La mejoría de la via NO endotelial también podría explicar la ausencia de cambios en la presión arterial de los ratones obesos, un parámetro frecuentemente aumentado en la obesidad humana y animal27,28. Esos hallazgos confirman la "paradoja de la obesidad"6 y pueden ayudar a la comprensión de los mecanismos responsables de esa condición.
Como colofón, la literatura también relata que la vasodilatación, que conlleva a un aumento en el flujo sanguíneo, es la principal consecuencia fisiológica de la producción de NO estimulada por la insulina en el endotelio vascular29. La hormona leptina también es capaz de activar directamente la producción de NO en vasos y esa activación depende de la integridad endotelial30. Por tanto, la hiperinsulinemia e hiperleptinemia observadas en animales alimentados con una dieta rica en grasa, pueden ser parcialmente responsables por el aumento de la producción y/o liberación de NO endotelial en la vasculatura de ratones obesos.
De manera general, este estudio indica que la obesidad inducida por una dieta rica en grasa genera alteraciones metabólicas y vasculares. La alteración vascular estuvo caracterizada por una mejoría en la vía L-arginina/NO endotelial, probablemente relacionada con las hiperinsulinemia e hiperleptinemia inducidas por la dieta. Finalmente, la mayor resistencia a los efectos del L-NAME en la aorta de los ratones obesos con relación a los ratones control, genera algunas consideraciones sobre la menor vulnerabilidad cardiovascular de individuos obesos en presencia de patologías asociadas, que perjudican la actividad del sistema NO.
Agradecemos a la FAPESP, proceso 07/57495-0 y 07/59747-7, por el apoyo financiero ofrecido.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
FAPESP financió el presente estudio.
Este artículo forma parte de Disertación de Maestría de Dijon Henrique Salomé Campos, por la Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp.