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Artigos Originais

Treinamento em natação atenua a disfução contrátil de cardiomiócitos de ratos diabéticos

Silva

Márcia Ferreira da

Pelúzio

Maria do Carmo Gouveia

Amorim

Paulo Roberto dos Santos

Lavorato

Vitor Neiva

Santos

Natália Pereira do

Bozi

Luiz Henrique Marchesi

Penitente

Arlete Rita

Falkoski

Daniel Luciano

Berfort

Felipe Gomes

Natali

Antonio Jose

Viçosa

Minas Gerais

Universidade Federal de Viçosa Brazil

07 2011

97 1 33 39 29 10 2010 06 08 2010 21 12 2010

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: O diabete experimental promove disfunção contrátil em cardiomiócitos, mas os efeitos do treinamento em natação nesta disfunção não são conhecidos. OBJETIVO: Testar os efeitos de um programa de treino em natação (PTN) sobre a disfunção contrátil de cardiomiócitos de ratos com diabete experimental. MÉTODOS: Ratos Wistar (idade: 30 dias; peso corporal médio: 84,19 g) com diabete induzida por estreptozotocina (60 mg/kg de peso corporal; glicemia > 300 mg/dl) foram alocados em diabéticos sedentários (DS, n = 10) e diabéticos exercitados (DE, n = 13). Animais da mesma idade e peso serviram de controles sedentários (CS, n = 10) e controles exercitados (CE, n = 06). Os animais DE e CE foram submetidos a um PTN (05 dias/semana, 90 min/dia), por 08 semanas. Os miócitos do ventrículo esquerdo (VE) foram isolados e estimulados eletricamente a 3,0 Hz em temperatura ambiente (∼ 25º C). RESULTADOS: O diabete reduziu a função contrátil nos cardiomiócitos dos animais em relação aos controles (i.e., menor amplitude de contração, maior tempo de contração e relaxamento). O PTN atenuou a redução na amplitude de contração (CS, 11 ± 0,2% vs DE, 11,6 ± 0,2%), o tempo para o pico de contração (CS, 319 ± 5,8 ms vs DE, 333 ± 4,8 ms) e o tempo para 50% de relaxamento (CS, 619 ± 22,2 ms vs DE, 698 ± 18,6 ms) dos cardiomiócitos dos animais diabéticos. O diabete reduziu as dimensões dos cardiomiócitos, porém, o PTN minimizou a redução da largura e volume celular, sem alterar o comprimento. CONCLUSÃO: O programa de treino em natação atenuou a disfunção contrátil dos miócitos do VE de ratos com diabete experimental.

Natação esforço físico miócitos cardíacos ratos diabete melito

06 05 2011

Treinamento em natação atenua a disfução contrátil de cardiomiócitos de ratos diabéticos

Márcia Ferreira da Silva; Maria do Carmo Gouveia Pelúzio; Paulo Roberto dos Santos Amorim; Vitor Neiva Lavorato; Natália Pereira do Santos; Luiz Henrique Marchesi Bozi; Arlete Rita Penitente; Daniel Luciano Falkoski; Felipe Gomes Berfort; Antonio Jose Natali

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: O diabete experimental promove disfunção contrátil em cardiomiócitos, mas os efeitos do treinamento em natação nesta disfunção não são conhecidos.

OBJETIVO: Testar os efeitos de um programa de treino em natação (PTN) sobre a disfunção contrátil de cardiomiócitos de ratos com diabete experimental.

MÉTODOS: Ratos Wistar (idade: 30 dias; peso corporal médio: 84,19 g) com diabete induzida por estreptozotocina (60 mg/kg de peso corporal; glicemia > 300 mg/dl) foram alocados em diabéticos sedentários (DS, n = 10) e diabéticos exercitados (DE, n = 13). Animais da mesma idade e peso serviram de controles sedentários (CS, n = 10) e controles exercitados (CE, n = 06). Os animais DE e CE foram submetidos a um PTN (05 dias/semana, 90 min/dia), por 08 semanas. Os miócitos do ventrículo esquerdo (VE) foram isolados e estimulados eletricamente a 3,0 Hz em temperatura ambiente (∼ 25º C).

RESULTADOS: O diabete reduziu a função contrátil nos cardiomiócitos dos animais em relação aos controles (i.e., menor amplitude de contração, maior tempo de contração e relaxamento). O PTN atenuou a redução na amplitude de contração (CS, 11 ± 0,2% vs DE, 11,6 ± 0,2%), o tempo para o pico de contração (CS, 319 ± 5,8 ms vs DE, 333 ± 4,8 ms) e o tempo para 50% de relaxamento (CS, 619 ± 22,2 ms vs DE, 698 ± 18,6 ms) dos cardiomiócitos dos animais diabéticos. O diabete reduziu as dimensões dos cardiomiócitos, porém, o PTN minimizou a redução da largura e volume celular, sem alterar o comprimento.

CONCLUSÃO: O programa de treino em natação atenuou a disfunção contrátil dos miócitos do VE de ratos com diabete experimental.

Palavras-chave: Natação, esforço físico, miócitos cardíacos, ratos, diabete melito.

Introdução

O diabete melito do tipo 1 é um fator de risco para eventos cardiovasculares, incluindo o desenvolvimento da cardiomiopatia diabética. A incapacidade em manter a homeostase da glicose no miocárdio compromete a estrutura e a função cardíaca em humanos e em animais com diabete experimental^1-4. Em nível celular, foi demonstrado que o diabete prejudica a função contrátil dos cardiomiócitos, principalmente por provocar alterações estruturais e funcionais na regulação do cálcio (Ca²⁺) intracelular^5-7.

O exercício físico regular tem sido usado como um agente efetivo de proteção cardíaca para diabéticos, uma vez que as anormalidades estruturais e funcionais do coração diabético respondem favoravelmente ao exercício^8-10. Por exemplo, em animais diabéticos, o exercício crônico atenuou alterações na função ventricular esquerda, tais como redução nos volumes sistólico, diastólico final e de ejeção, no débito cardíaco e na fração de encurtamento^7,11,12.

Em nível celular, entretanto, poucos estudos sobre os efeitos do exercício crônico na função contrátil de cardiomiócitos de animais diabéticos foram realizados e, além de usarem exclusivamente a corrida em esteira, apresentaram resultados controversos. Por exemplo, programas de corrida contínua em esteira com intensidade leve (09 m/min, 0% de inclinação, 30 min/dia) ou moderada (18 m/min, 0% de inclinação) não afetaram a contração dos cardiomiócitos de ratos¹³. Outro programa de corrida contínua com intensidade alta (18 m/min, 5% de inclinação, 60 min/dia) provocou adaptações negativas, pois prolongou o tempo de contração celular e não alterou a amplitude de contração dos cardiomiócitos de ratos¹⁴. Entretanto, programas de corrida em esteira com intensidade mais alta (20-25 m/min, 5% de inclinação, 60 min/dia) foram capazes de restaurar a função contrátil dos cardiomiócitos de ratos e camundongos^7,15. Portanto, até o momento, os efeitos do exercício contínuo com duração superior a 60 minutos diários, especificamente a natação, sobre a função contrátil de cardiomiócitos de ratos diabéticos não são conhecidos.

Assim, este estudo tem como objetivo testar se um programa de natação, com duração diária de 90 minutos, altera a função contrátil de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de ratos com diabete experimental.

Métodos

Animais de experimentação e tratamentos

Ratos Wistar (idade 30 dias; peso corporal médio de 84,19 g) foram divididos em 04 grupos: Controle sedentário (CS, n = 10); Controle exercitado (CE, n = 10); Diabético sedentário (DS, n = 20); e Diabético exercitado (DE, n = 20) e foram mantidos em ambiente com temperatura média de 22º C e regime de luminosidade invertido de 12/12 horas claro/escuro com água e ração comercial ad libitum.

Foram seguidas as normas estabelecidas no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996) e respeitados os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética da Universidade Federal de Viçosa (processo nº 03/2009).

Indução do diabete

Após jejum de 12 horas, os animais dos grupos DE e DS receberam uma injeção intraperitoneal (60 mg/kg de peso corporal) de estreptozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, EUA), diluída em 1,0 ml de tampão citrato de sódio (0,1 M, pH 4,5). Os animais dos grupos CS e CE receberam a mesma dose de tampão citrato de sódio (0,1 M, pH 4,5) sem STZ. Sete dias após a aplicação de STZ e jejum de 12 horas, a glicose sanguínea de repouso foi aferida (One touch ultra - Johnson & Johnson, México). Animais com níveis de glicose sanguínea de jejum superior a 300 mg/dl foram considerados diabéticos (DS, n = 10; DE, n = 13). A glicose sanguínea de jejum e o peso corporal foram monitorados semanalmente durante o período experimental.

Programa de treino em natação

Após 45 dias de hiperglicemia, os animais do grupo DE e CE foram submetidos a um programa de treinamento em natação (adaptado de Medeiros e cols.¹⁶), por 8 semanas. Na primeira semana, os animais exercitaram-se na água, sem sobrecarga, durante 10-50 min, sendo a duração aumentada em 10 min/dia. Na segunda semana, os animais exercitaram com uma carga de 1% de seu peso corporal e a duração do exercício foi aumentada em 10 min/dia até atingir 90 min de natação ininterruptos. A partir da terceira semana, a carga foi aumentada semanalmente (0,5% do peso corporal) até atingir 4% do peso corporal na 8ª semana. Durante as sessões de natação, os animais dos grupos DS e CN eram colocados em uma caixa de polipropileno com água aquecida (28-30º C) e profundidade de 10 cm.

Quatro animais do grupo CE morreram por afogamento.

Isolamento dos cardiomiócitos

Após eutanásia, o coração foi removido e os miócitos do ventrículo esquerdo foram isolados conforme descrito por Natali e cols.¹⁷. Resumidamente, o coração foi canulado via artéria aorta em um sistema Langendorff e perfundido com solução de isolamento [composição (mM): 130 Na⁺; 5,4 K⁺; 1,4 Mg⁺; 140 Cl^-; 0,75 Ca²⁺; 5,0 Hepes; 10 glicose; 20 taurina; e 10 creatina; pH = 7,3 em temperatura ambiente]. Em seguida, o coração foi perfundido com solução livre de cálcio contendo 0,1 mM de ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA), por um período de 4-6 min. Na sequência, o coração foi perfundido com solução contendo 1,0 mg.ml^-1 de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) e 100,0 mM de CaCl₂ por 20 a 25 min. As soluções utilizadas foram oxigenadas (O₂ 100% - White Martins, Brasil) e mantidas em temperatura de 35º C. Após perfusões, os ventrículos foram separados dos átrios e pesados. Em seguida, o ventrículo esquerdo foi colocado em frasco contendo 5,0 ml da solução enzimática (colagenase) e albumina sérica bovina (10%). O frasco foi agitado moderadamente durante 05 min, em banho-maria a 37º C, após o qual o tecido foi retirado do frasco e o restante foi centrifugado (3.000 rpm) por 30 s. O sobrenadante foi removido e os cardiomiócitos foram suspendidos na solução de isolamento e armazenados em refrigerador (5º C) até serem utilizados.

Função contrátil dos cardiomiócitos

As contrações celulares foram medidas através da técnica de alteração do comprimento dos cardiomiócitos usando-se o sistema de detecção de bordas (Ionoptix, Milton, MA-EUA) montado num microscópio invertido (Nikon Eclipse - TS100, Japão), conforme descrito previamente¹⁸. Resumidamente, os miócitos foram acomodados em uma câmara experimental com a base de vidro e banhados por solução tampão com a seguinte composição (em mM): 136,9 NaCl; 5,4 KCl; 0,37 NaH₂PO₄; 0,57 MgCl₂; 5,0 Hepes = 5; 5,6 Glicose e 1,0 CaCl₂ (pH = 7,4 em temperatura ambiente). Os miócitos foram visualizados em um monitor através de uma câmera (Myocam, Ionoptix, frequência de 240 Hz) acoplada ao microscópio utilizando-se um programa de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix). Os cardiomiócitos foram estimulados externamente na frequência de 3,0 Hz (10 Volts, duração de 5 min) utilizando-se um par de eletrodos de aço e um estimulador elétrico de campo (Myopacer, Ionoptix). Os movimentos das bordas longitudinais dos miócitos foram capturados pelo sistema de detecção de bordas (Ionwizard, Ionoptix) e armazenados para análise posterior. Foram utilizados para as medidas de contração somente os cardiomiócitos que estavam em boas condições, com as bordas e as estriações sarcoméricas bem definidas, relaxados em repouso, sem apresentar contrações voluntárias. As contrações foram analisadas conforme descrito previamente¹⁹.

Dimensões dos cardiomiócitos

O comprimento e a largura dos miócitos foram medidos usando-se um sistema de captação de imagens, a partir das imagens dos cardiomiócitos visualizados horizontalmente no monitor de um microcomputador, conforme descrito¹⁷. O comprimento celular foi determinado medindo-se a imagem da célula gerada no monitor, desde a borda direita até a borda esquerda, no ponto médio da largura do cardiomiócito. A largura celular foi determinada medindo-se a imagem gerada no monitor, desde a borda superior até a borda inferior, no ponto médio do comprimento dos cardiomiócitos. O volume celular foi calculado usando-se a fórmula: [Volume (pL) = comprimento (mm) x largura (mm) x (7,59 x 10^{- 3} pL/mm²)], conforme Satoh e cols.²⁰.

Análise estatística

Para a comparação das médias das variáveis analisadas entre os 04 grupos (fatores exercício e diabete, dois grupos cada), utilizou-se a análise de variância de duas entradas (ANOVA two-way) e post hoc de Tukey para as comparações múltiplas. Essa análise foi feita através do software Sigma Stat, versão 3,0. Adotou-se o nível de significância de até 5% (p < 0,05).

Resultados

Antes da aplicação de STZ, não houve diferença estatística da glicose sanguínea entre os grupos experimentais (Tabela 1). Quarenta e cinco dias após a aplicação de STZ (início do exercício) e ao final do experimento, os animais diabéticos apresentaram glicose sanguínea superior a dos animais controle. Os níveis de glicose sanguínea não foram alterados pelo exercício, tanto nos animais diabéticos (DE vs DS) quanto nos controle (CE vs CS). Não houve interação entre os fatores exercício e diabete (ANOVA two-way, p > 0,05) para esta ou para as demais variáveis analisadas.

Os pesos corporais iniciais não foram diferentes entre os quatro grupos (Tabela 1). Quarenta e cinco dias após a aplicação de STZ, os animais dos grupos DS e DE apresentaram pesos corporais inferiores aos controles CS e CE. O mesmo ocorreu ao final do experimento. Da mesma forma, o programa de natação não alterou esses parâmetros nos animais tanto do grupo DE, quando comparados a DS, quanto nos CE comparados a CS.

Os animais DS apresentaram menores pesos ventriculares (p < 0,05) que os CS (Tabela 1). O programa de natação não alterou o peso ventricular dos animais diabéticos (DS vs DE). Entretanto, nos animais controles, o peso ventricular foi maior nos animais CE que nos CS. O peso dos ventrículos relativo ao peso corporal, índice de hipertrofia ventricular, foi maior no grupo DS que no CS. Entre os animais diabéticos, os DE apresentaram peso relativo dos ventrículos maior que os DS. Entre os controles, os animais CE exibiram maior peso relativo dos ventrículos que os CS.

De forma independente, o diabete reduziu o comprimento dos cardiomiócitos nos animais sedentários (DS vs CS) e treinados (DE vs CE; Tabela 2). Todavia, o programa de natação não alterou o comprimento dos cardiomiócitos nos animais diabéticos (DE vs DS) e nos não diabéticos (CS vs CE). O diabete reduziu a largura dos miócitos nos animais sedentários (DS vs CS) e treinados (DE vs CE). Todavia, o programa de natação aumentou a largura dos cardiomiócitos nos animais diabéticos (DE vs DS). Isso não ocorreu nos animais controles (CE vs CS). Houve redução do volume celular no grupo DS comparado ao grupo CS. O programa de natação aumentou o volume celular nos animais diabéticos (DE vs DS), mas não nos animais controles (CE vs CS). Observa-se que a razão comprimento/largura dos cardiomiócitos não foi afetada pelo diabete ou pelo programa de natação.

A análise da função contrátil dos cardiomiócitos mostrou que a amplitude de contração celular foi reduzida pelo diabete (CS, 11,0 ± 0,2% vs DS, 10,2 ± 0,2%, p < 0, 001) (Figura 1 A). O programa de natação aumentou a amplitude de contração dos cardiomiócitos em tais animais (DS, 10,2 ± 0,2% vs DE, 11,6 ± 0,2%, p < 0,001). Entre os animais controles, o programa de natação aumentou a amplitude de contração (CS, 11,0 ± 0,2% vs CE, 12,4 ± 0,2%, p < 0, 001).

Os cardiomiócitos dos animais do grupo DS apresentaram tempo para o pico de contração mais longo do que os do grupo CS (361 ± 5,7 ms vs 319,0 ± 5,8 ms, respectivamente, p < 0,001) (Figura 1 B). O programa de natação reduziu o tempo para o pico de contração nos animais diabéticos (DS, 361 ± 5,7 ms vs DE, 333,0 ± 4,8 ms, p < 0,001). O mesmo foi efeito observado nos cardiomiócitos dos animais controles (CE, 289,0 ± 6,8 ms vs CS, 319,0 ± 5,8 ms, p < 0,001).

Para 50% do relaxamento, o tempo foi maior nos cardiomiócitos dos animais diabéticos sedentários do que nos controles sedentários (DS, 756 ± 22,1 ms vs CS, 619,0 ± 22,2 ms, p < 0,001) (Figura 1 C). O programa de natação reduziu o tempo para 50% do relaxamento nos cardiomiócitos desses animais (DS, 756 ± 22,1 ms vs DE, 698 ± 18,6 ms, p = 0,044). O mesmo ocorreu nos cardiomiócitos dos animais controles (CE, 516,0 ± 26,1 ms vs CS, 619,0 ± 22,2 ms, p = 0,003).

Discussão

Nossos dados demonstram que a disfunção contrátil dos cardiomiócitos, provocada pelo diabete, foi atenuada pelo programa de treino em natação com duração de 90 minutos. Além disso, houve aumento da largura e do volume dos cardiomiócitos, sem alterar o comprimento celular, em resposta ao exercício crônico.

A redução na amplitude de contração observada aqui reflete alterações importantes no miocárdio de ratos diabéticos in vivo, tais como redução na fração de encurtamento, no diâmetro diastólico final, no diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo e no débito cardíaco^7,11. Apesar de não termos testado os mecanismos, sabe-se que a redução da sensibilidade dos miofilamentos contráteis ao Ca²⁺ e a redução da concentração intracelular de Ca²⁺ estão envolvidos²¹. Entretanto, cardiomiócitos de ratos Goto-Kakizaki apresentaram aumento da amplitude de contração associada à redução do transiente de Ca²⁺. Isto sugere que a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca²⁺ estava aumentada, o que poderia ser um mecanismo compensatório para preservar a função mecânica do coração no diabete²². Há evidências de que a concentração intracelular de Ca²⁺ apresenta-se reduzida em cardiomiócitos de animais com diabete experimental²³. Isto ocorre em função do aumento da atividade do trocador de sódio e cálcio (NCX) e da diminuição da recaptação de Ca²⁺ pelo retículo sarcoplasmático (RS), via cálcio ATPase do RS (SERCA2)¹⁵ e da redução da liberação de Ca²⁺ do RS, via receptores de rianodina (RyR2)²⁴. Além disso, é possível que a redução da densidade de túbulos transversos dos cardiomiócitos de animais diabéticos possa alterar o espaço entre os canais de cálcio tipo L e os RyR2, o que reduz a eficiência do acoplamento excitação-contração¹⁵.

Em contrapartida, o exercício crônico empregado aumentou a amplitude de contração nos animais diabéticos e controles. Para os animais diabéticos, tal fato indica que o exercício promoveu adaptações positivas nos cardiomiócitos que contribuem para atenuar algumas anormalidades mecânicas do miocárdio diabético observadas in vivo^7,11,12. Alguns mecanismos têm sido propostos como responsáveis pelo aumento da amplitude de contração dos cardiomiócitos de ratos diabéticos em resposta ao exercício crônico: há evidências que o exercício físico crônico pode normalizar o funcionamento do NCX e do cálcio calmodulina quinase II (CaMKII), reduzir o vazamento de Ca²⁺ do RS e aumentar o conteúdo de Ca²⁺ do RS^7,15.

O diabete experimental prolongou o tempo necessário para o pico de contração celular. Isso indica que cardiomiócitos de animais diabéticos contraiam mais lentamente do que os de seus controles. Essa alteração tem implicações negativas na função cardíaca desses animais. A velocidade de contração dos cardiomiócitos é controlada pelas proteínas reguladoras da movimentação de Ca²⁺ intracelular e pela taxa de hidrólise de ATP que, por sua vez, regula a taxa de formação de pontes cruzadas²¹. Cardiomiócitos de animais diabéticos apresentam redução na expressão de proteínas regulatórias, tais como CaMKII, NCX, RyR2, SERCA2 e fosfolambana (PLB)^5,7,15,24-26, o que pode retardar a disponibilidade de Ca²⁺ para a contração celular.

Entretanto, o programa de natação reduziu o tempo para o pico de contração nos animais diabéticos. As adaptações ao exercício regular, que aceleram a disponibilidade de Ca²⁺ no citosol e aumentam a taxa de hidrólise de ATP, contribuem para tal redução. A velocidade de disponibilidade de Ca²⁺ no citosol é regulada principalmente pela velocidade de saída de Ca²⁺ do RS, via RyR2²¹. Há evidências de que o exercício físico regular aumenta a expressão e/ou a atividade dos RyR2 e a sensibilidade dos RyR2 e dos miofilamentos contráteis ao Ca²⁺ em animais diabéticos⁷. Além disso, o exercício físico é capaz de aumentar a densidade e a responsividade dos receptores betadrenérgicos em ratos diabéticos¹², o que pode afetar a velocidade de contração celular.

Demonstramos também que o diabete experimental prolongou o tempo de relaxamento celular. O relaxamento dos cardiomiócitos depende da remoção do Ca²⁺ do citosol para o RS (via SERCA2, PLB), para o meio extracelular (via NCX, Ca²⁺ ATPase do sarcolema) e para a mitocôndria (via transporte de Ca²⁺ mitocondrial)²¹. A expressão e a função dessas estruturas celulares estão diminuídas nos cardiomiócitos de animais diabéticos^12,25-28. Tal fato diminui a velocidade com que o Ca²⁺ é removido do citosol. Essas alterações estão associadas ainda à depressão da proteína quinase A (PKA) e CaMKII, proteínas estas responsáveis pela fosforilação da PLB. Além disso, a não fosforilação de PLB por CaMKII diminui a afinidade de SERCA2 por Ca²⁺ e inibe a recaptação de Ca²⁺ pelo RS, o que contribui para tornar mais lento o relaxamento celular²⁶. Tais achados em nível celular são compatíveis com as disfunções diastólicas observadas em corações diabéticos in vivo^7,11.

O programa de natação aplicado, por sua vez, reduziu o tempo de relaxamento dos cardiomiócitos dos animais diabéticos. Esse efeito tem sido atribuído à capacidade do exercício regular de aumentar a velocidade de remoção de Ca²⁺ do citosol via aumento da expressão de SERCA2 e PLB^7,15, normalização da expressão e função dos NCX, redução na fosforilação de CaMKII e restauração da densidade de túbulos transversos¹⁵.

O programa de natação aplicado não alterou a glicemia de jejum dos animais controles e diabéticos em repouso. Nos animais diabéticos, a STZ induz a apoptose das células β-pancreáticas²⁹, o que inibe a secreção de insulina. É possível também que tenha havido um aumento na secreção de glucagon em tais animais³⁰ e sua ação contrarregulatória tenha auxiliado na manutenção da hiperglicemia. Nossos resultados são coerentes com os de outros estudos^7,11-14,31, apesar destes terem utilizado protocolos de exercício diferentes (i.e., esteira rolante). Por outro lado, alguns estudos demonstraram que o exercício foi capaz de melhorar o metabolismo de glicose em ratos diabéticos^32,33. Provavelmente, a falta de consenso entre os resultados desses estudos é devida ao uso de diferentes procedimentos metodológicos.

Os animais diabéticos apresentaram poliúria e polidipsia características do diabete, mas, apesar de alimentarem-se normalmente, sem restrição alimentar [ex., consumo semanal de ração (diabéticos: 199,47 ± 3,55 g vs controles: 194,36 ± 4,4 g)], movimentarem-se livremente dentro da caixa de alojamento (grupo DS) e exercitarem-se (grupo DE), não ganharam tanto peso quanto os controles não diabéticos. Os menores pesos corporais e ventriculares dos animais diabéticos indicam que eles tiveram o crescimento prejudicado. Em ratos com diabete induzida por STZ, além da secreção de insulina, a secreção de hormônios, tais como o hormônio de crescimento, o glucagon, o polipeptídeo pancreático e, por consequência, o fator de crescimento similar à insulina, são alteradas e afetam o crescimento^34-36. Sabe-se também que o diabete induz o aumento da utilização de ácidos graxos e acelera o catabolismo proteico³⁷.

Ainda assim, o programa de natação aplicado não foi capaz de alterar significativamente o peso corporal dos animais diabéticos ou não diabéticos, mas aumentou o peso absoluto dos ventrículos nos animais não diabéticos. Entretanto, mais importante, tanto o diabete quanto o programa de natação aumentaram o peso relativo dos ventrículos nos animais diabéticos e o programa de natação aumentou este parâmetro nos animais controles não diabéticos, o que denota hipertrofia ventricular. Hipertrofia cardíaca induzida por diabete experimental (patológica) e por exercício crônico (fisiológica) já foram documentadas em estudos prévios^7,14,17,31.

A redução nas dimensões dos cardiomiócitos nos animais diabéticos em relação aos controles, observada no presente estudo, é coerente com o menor peso ventricular apresentado pelos animais diabéticos. Todavia, o programa de natação utilizado aumentou o volume dos cardiomiócitos dos ratos diabéticos. Tal fato sugere que a inibição do crescimento celular provocada pelo diabete foi afetada pelo exercício físico aplicado e denota hipertrofia celular. De fato, o aumento do peso relativo do ventrículo nos animais do grupo DE foi mais pronunciado que nos animais CE (33,3% vs 31,5%, respectivamente).

Conclusão

Concluímos que o programa de treinamento em natação aplicado atenuou a disfunção contrátil dos cardiomiócitos do VE de ratos com diabete experimental. Esses achados são relevantes para o conhecimento, em nível celular, dos benefícios do exercício físico na função contrátil do músculo cardíaco de indivíduos com diabete tipo I.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPEMIG.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Márcia Ferreira da Silva pela Universidade Federal de Viçosa.

Correspondência:

Antonio Jose Natali

Departamento de Educação Física - Campus Universitário da Universidade Federal de Viçosa

Av. PH Rolfs, s/n

36570-000 - Viçosa, MG - Brasil

E-mail:

anatali@ufv.br

Artigo recebido em 06/08/10; revisado recebido em 29/10/10; aceito em 21/12/10.

Full texts in English - http://www.arquivosonline.com.br

1. Fang ZY, Prins JB, Marwick TH. Diabetic cardiomyopathy: evidence, mechanisms, and therapeutic implications. Endocr Rev. 2004;25(4):543-67.

Diabetic cardiomyopathy: evidence, mechanisms, and therapeutic implications

Endocr Rev 2004 543 67 4 25

Fang

Prins

Marwick

2. Jweied EE, McKinney RD, Walker LA, Brodsky I, Geha AS, Massad MG, et al. Depressed cardiac myofilament function in human diabetes mellitus. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289(6):H2478-83.

Depressed cardiac myofilament function in human diabetes mellitus

Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005 H2478 83 6 289

Jweied

McKinney

Walker

Brodsky

Geha

Massad

3. Lacombe VA, Viatchenko-Karpinski S, Terentyev D, Sridhar A, Emani S, Bonagura JD, et al. Mechanisms of impaired calcium handling underlying subclinical diastolic dysfunction in diabetes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007;293(5):R1787-97.

Mechanisms of impaired calcium handling underlying subclinical diastolic dysfunction in diabetes

Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007 R1787 97 5 293

Lacombe

Viatchenko-Karpinski

Terentyev

Sridhar

Emani

Bonagura

4. Reuter H, Gronke S, Adam C, Ribati M, Brabender J, Zobel C, et al. Sarcoplasmic Ca2+ release is prolonged in nonfailing myocardium of diabetic patients. Mol Cell Biochem. 2008;308(1-2):141-9.

Sarcoplasmic Ca2+ release is prolonged in nonfailing myocardium of diabetic patients

Mol Cell Biochem 2008 141 9 1-2 308

Reuter

Gronke

Adam

Ribati

Brabender

Zobel

5. Kim HW, Ch YS, Lee HR, Park SY, Kim YH. Diabetic alterations in cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase and phospholamban protein expression. Life Sci. 2001;70(4):367-79.

Diabetic alterations in cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase and phospholamban protein expression

Life Sci 2001 367 79 4 70

Kim

Lee

Park

Kim

6. Bracken N, Howarth FC, Singh J. Effects of streptozotocin-induced diabetes on contraction and calcium transport in rat ventricular cardiomyocytes. Ann N Y Acad Sci. 2006;1084:208-22.

Effects of streptozotocin-induced diabetes on contraction and calcium transport in rat ventricular cardiomyocytes

Ann N Y Acad Sci 2006 208 22 1084

Bracken

Howarth

Singh

7. Shao CH, Wehrens XH, Wyatt TA, Parbhu S, Rozanski GJ, Patel KP, et al. Exercise training during diabetes attenuates cardiac ryanodine receptor dysregulation. J Appl Physiol. 2009;106(4):1280-92.

Exercise training during diabetes attenuates cardiac ryanodine receptor dysregulation

J Appl Physiol 2009 1280 92 4 106

Shao

Wehrens

Wyatt

Parbhu

Rozanski

Patel

8. Lehmann R, Kaplan V, Bingisser R, Bloch KE, Spinas GA. Impact of physical activity on cardiovascular risk factors in IDDM. Diabetes Care. 1997;20(10):1603-11.

Impact of physical activity on cardiovascular risk factors in IDDM

Diabetes Care 1997 1603 11 10 20

Lehmann

Kaplan

Bingisser

Bloch

Spinas

9. Searls YM, Smirnova IV, Fegley BR, Stehno-Bittel L. Exercise attenuates diabetes-induced ultrastructural changes in rat cardiac tissue. Med Sci Sports Exerc. 2004;36(11):1863-70.

Exercise attenuates diabetes-induced ultrastructural changes in rat cardiac tissue

Med Sci Sports Exerc 2004 1863 70 11 36

Searls

Smirnova

Fegley

Stehno-Bittel

10. Monteiro P, Gonçalves L, Providencia LA. Diabetes and cardiovascular disease: the road to cardioprotection. Heart. 2005;91(12):1621-5.

Diabetes and cardiovascular disease: the road to cardioprotection

Heart 2005 1621 5 12 91

Monteiro

Gonçalves

Providencia

11. Loganathan R, Bilgen M, Al-Hafez B, Zhero SV, Alenezy MD, Smirnova IV. Exercise training improves cardiac performance in diabetes: in vivo demonstration with quantitative cine-MRI analyses. J Appl Physiol. 2007;102(2):665-72.

Exercise training improves cardiac performance in diabetes: in vivo demonstration with quantitative cine-MRI analyses

J Appl Physiol 2007 665 72 2 102

Loganathan

Bilgen

Al-Hafez

Zhero

Alenezy

Smirnova

12. Bidasee KR, Zheng H, Shao CH, Parbhu SK, Rozanski GJ, Patel KP. Exercise training initiated after the onset of diabetes preserves myocardial function: effects on expression of beta-adrenoceptors. J Appl Physiol. 2008;105(3):907-14.

Exercise training initiated after the onset of diabetes preserves myocardial function: effects on expression of beta-adrenoceptors

J Appl Physiol 2008 907 14 3 105

Bidasee

Zheng

Shao

Parbhu

Rozanski

Patel

13. Howarth FC, Almugaddum FA, Qureshi MA, Ljubisavijevic M. Effects of varying intensity exercise on shortening and intracellular calcium in ventricular myocytes from streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. Mol Cell Biochem. 2008;317(1-2):161-7.

Effects of varying intensity exercise on shortening and intracellular calcium in ventricular myocytes from streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats

Mol Cell Biochem 2008 161 7 1-2 317

Howarth

Almugaddum

Qureshi

Ljubisavijevic

14. Howarth FC, Almugaddum FA, Qureshi MA, Ljubisavijevic M. The effects of heavy long-term exercise on ventricular myocyte shortening and intracellular Ca2+ in streptozotocin-induced diabetic rat. J Diabetes Complications. 2009;24(4):278-85.

The effects of heavy long-term exercise on ventricular myocyte shortening and intracellular Ca2+ in streptozotocin-induced diabetic rat

J Diabetes Complications 2009 278 85 4 24

Howarth

Almugaddum

Qureshi

Ljubisavijevic

15. Stolen TO, Hoydal MA, Kemi OJ, Catalucci D, Ceci M, Aasum E, et al. Interval training normalizes cardiomyocyte function, diastolic Ca2+ control, and SR Ca2+ release synchronicity in a mouse model of diabetic cardiomyopathy. Circ Res. 2009;105(6):527-36.

Interval training normalizes cardiomyocyte function, diastolic Ca2+ control, and SR Ca2+ release synchronicity in a mouse model of diabetic cardiomyopathy

Circ Res 2009 527 36 6 105

Stolen

Hoydal

Kemi

Catalucci

Ceci

Aasum

16. Medeiros A, Gianolla RM, Kalil LMP, Bacurau RFP, Rosa LFBC, Negrão CE, et al. Efeito do treinamento físico com natação sobre o sistema cardiovascular de ratos normotensos. Rev paul Educ Fís. 2000;14(1):7-15.

Efeito do treinamento físico com natação sobre o sistema cardiovascular de ratos normotensos

Rev paul Educ Fís 2000 7 15 1 14

Medeiros

Gianolla

Kalil

LMP

Bacurau

RFP

Rosa

LFBC

Negrão

17. Natali AJ, Wilson LA, Peckham M, Turner DL, Harrison SM, White E. Different regional effects of voluntary exercise on the mechanical and electrical properties of rat ventricular myocytes. J Physiol. 2002;541(Pt 3):863-75.

Different regional effects of voluntary exercise on the mechanical and electrical properties of rat ventricular myocytes

J Physiol 2002 863 75 3 541

Natali

Wilson

Peckham

Turner

Harrison

White

18. Prímola-Gomes TN, Campos LA, Lauton-Santos S, Balthazar CH, Guatimosim S, Capettini LS, et al. Exercise capacity is related to calcium transients in ventricular cardiomyocytes. J Appl Physiol. 2009;107(2):593-8.

Exercise capacity is related to calcium transients in ventricular cardiomyocytes

J Appl Physiol 2009 593 8 2 107

Prímola-Gomes

Campos

Lauton-Santos

Balthazar

Guatimosim

Capettini

19. Roman-Campos D, Duarte HL, Sales PA, Natali AJ, Ropert C, Gazzinelli RT, et al. Changes in cellular contractility and cytokines profile during Trypanosoma cruzi infection in mice. Basic Res Cardiol. 2009;104(3):238-46.

Changes in cellular contractility and cytokines profile during Trypanosoma cruzi infection in mice

Basic Res Cardiol 2009 238 46 3 104

Roman-Campos

Duarte

Sales

Natali

Ropert

Gazzinelli

20. Satoh H, Delbridge LM, Blatter LA, Bers DM. Surface:volume relationship in cardiac myocytes studied with confocal microscopy and membrane capacitance measurements: species-dependence and developmental effects. Biophys J. 1996;70(3):1494-504.

Surface: volume relationship in cardiac myocytes studied with confocal microscopy and membrane capacitance measurements: species-dependence and developmental effects

Biophys J 1996 1494 504 3 70

Satoh

Delbridge

Blatter

Bers

21. Bers DM. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 2008;70:23-49.

Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes

Annu Rev Physiol 2008 23 49 70

Bers

22. Howarth FC, Qureshi MA. Myofilament sensitivity to Ca2+ in ventricular myocytes from the Goto-Kakizaki diabetic rat. Mol Cell Biochem. 2008;315(1-2):69-74.

Myofilament sensitivity to Ca2+ in ventricular myocytes from the Goto-Kakizaki diabetic rat

Mol Cell Biochem 2008 69 74 1-2 315

Howarth

Qureshi

23. Ren J, Bode AM. Altered cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes from spontaneously diabetic BB rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000;279(1):H238-44.

Altered cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes from spontaneously diabetic BB rats

Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000 H238 44 1 279

Ren

Bode

24. Bidasee KR, Nallani K, Yu Y, Cocklin RR, Zhang Y, Wang M, et al. Chronic diabetes increases advanced glycation end products on cardiac ryanodine receptors/calcium-release channels. Diabetes. 2003;52(7):1825-36.

Chronic diabetes increases advanced glycation end products on cardiac ryanodine receptors/calcium-release channels

Diabetes 2003 1825 36 7 52

Bidasee

Nallani

Cocklin

Zhang

Wang

25. Bidasee KR, Zhang Y, Shao CH, Wang M, Patel KP, Dincer UD, et al. Diabetes increases formation of advanced glycation end products on Sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase. Diabetes. 2004;53(2):463-73.

Diabetes increases formation of advanced glycation end products on Sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase

Diabetes 2004 463 73 2 53

Bidasee

Zhang

Shao

Wang

Patel

Dincer

26. Choi KM, Zhong Y, Hoit BD, Grupp IL, Hahn H, Dilly KW, et al. Defective intracellular Ca2+ signaling contributes to cardiomyopathy in Type 1 diabetic rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002;283(4):H1398-408.

Defective intracellular Ca2+ signaling contributes to cardiomyopathy in Type 1 diabetic rats

Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002 H1398 408 4 283

Choi

Zhong

Hoit

Grupp

Hahn

Dilly

27. Hattori Y, Matsuda N, Kimura J, Ishitani T, Tamada A, Gando S, et al. Diminished function and expression of the cardiac Na+-Ca2+ exchanger in diabetic rats: implication in Ca2+ overload. J Physiol. 2000;527(Pt 1):85-94.

Diminished function and expression of the cardiac Na+-Ca2+ exchanger in diabetic rats: implication in Ca2+ overload

J Physiol 2000 85 94 1 527

Hattori

Matsuda

Kimura

Ishitani

Tamada

Gando

28. Vasanji Z, Cantor EJ, Juric D, Moyen M, Netticadan T. Alterations in cardiac contractile performance and sarcoplasmic reticulum function in sucrose-fed rats is associated with insulin resistance. Am J Physiol Cell Physiol. 2008;291(4):C772-80.

Alterations in cardiac contractile performance and sarcoplasmic reticulum function in sucrose-fed rats is associated with insulin resistance

Am J Physiol Cell Physiol 2008 C772 80 4 291

Vasanji

Cantor

Juric

Moyen

Netticadan

29. Konrad RJ, Mikolaenko I, Tolar JF, Liu K, Kudlow JE. The potential mechanism of the diabetogenic action of streptozotocin: inhibition of pancreatic beta-cell O-GlcNAc-selective N-acetyl-beta-D-glucosaminidase. Biochem J. 2001;356(1):31-41.

The potential mechanism of the diabetogenic action of streptozotocin: inhibition of pancreatic beta-cell O-GlcNAc-selective N-acetyl-beta-D-glucosaminidase

Biochem J 2001 31 41 1 356

Konrad

Mikolaenko

Tolar

Liu

Kudlow

30. Ponery AS, Adeghate E. Distribution of NPY and SP and their effects on glucagon secretion from the in vitro normal and diabetic pancreatic tissues. Peptides. 2000;21(10):1503-9.

Distribution of NPY and SP and their effects on glucagon secretion from the in vitro normal and diabetic pancreatic tissues

Peptides 2000 1503 9 10 21

Ponery

Adeghate

31. Howarth FC, Marzouqi FM, Al Saeedi AM, Hameed RS, Adeghate E. The effect of a heavy exercise program on the distribution of pancreatic hormones in the streptozotocin-induced diabetic rat. JOP. 2009;10(5):485-91.

The effect of a heavy exercise program on the distribution of pancreatic hormones in the streptozotocin-induced diabetic rat

JOP 2009 485 91 5 10

Howarth

Marzouqi

Al Saeedi

Hameed

Adeghate

32. Broderick TL, Poirier P, Gillis M. Exercise training restores abnormal myocardial glucose utilization and cardiac function in diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 2005;21(1):44-50.

Exercise training restores abnormal myocardial glucose utilization and cardiac function in diabetes

Diabetes Metab Res Rev 2005 44 50 1 21

Broderick

Poirier

Gillis

33. Hall JL, Sexton WL, Stanley WC. Exercise training attenuates the reduction in myocardial GLUT-4 in diabetic rats. J Appl Physiol. 1995;78(1):76-81.

Exercise training attenuates the reduction in myocardial GLUT-4 in diabetic rats

J Appl Physiol 1995 76 81 1 78

Hall

Sexton

Stanley

34. Gomes RJ, Leme JA, de Moura LP, de Araújo MB, Rogatto GP, de Moura RF, et al. Growth factors and glucose homeostasis in diabetic rats: effects of exercise training. Cell Biochem Funct. 2009;27(4):199-204.

Growth factors and glucose homeostasis in diabetic rats: effects of exercise training

Cell Biochem Funct 2009 199 204 4 27

Gomes

Leme

de Moura

de Araújo

Rogatto

de Moura

35. de Almeida Leme JA, de Araújo MB, de Moura LP, Gomes, RJ, de Moura RF, Rogatto GP, et al. Effects of physical training on serum and pituitary growth hormone contents in diabetic rats. Pituitary. 2009;12(4):304-8.

Effects of physical training on serum and pituitary growth hormone contents in diabetic rats

Pituitary 2009 304 8 4 12

de Almeida Leme

de Araújo

de Moura

Gomes

de Moura

Rogatto

36. Menon RK, Stephan DA, Rao RH, Shen-Orr Z, Downs LS, Roberts CT, et al. Tissue-specific regulation of the growth hormone receptor gene in streptozocin-induced diabetes in the rat. J Endocrinol. 1994;142(3):453-62.

Tissue-specific regulation of the growth hormone receptor gene in streptozocin-induced diabetes in the rat

J Endocrinol 1994 453 62 3 142

Menon

Stephan

Rao

Shen-Orr

Downs

Roberts

37. Howarth FC, Chandler NJ, Kharche S, Tellez JO, Greener ID, Yamanushi TT, et al. Effects of streptozotocin-induced diabetes on connexin43 mRNA and protein expression in ventricular muscle. Mol Cell Biochem. 2008;319(1-2):105-14.

Effects of streptozotocin-induced diabetes on connexin43 mRNA and protein expression in ventricular muscle

Mol Cell Biochem 2008 105 14 1-2 319

Howarth

Chandler

Kharche

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Greener

Yamanushi

Original Articles

Swimming training attenuates contractile dysfunction in diabetic rat cardiomyocytes

BACKGROUND: Experimental diabetes promotes contractile dysfunction in cardiomyocytes, but the effects of swimming in this disorder are not known. OBJECTIVE: To test the effects of a swimming training program (STP) on cardiomyocyte contractile dysfunction in rats with experimental diabetes. METHODS: Wistar rats (age: 30 days; mean body weight: 84.19 g) with diabetes induced by streptozotocin (60 mg/kg body weight; glucose > 300 mg/dl) were divided into sedentary diabetic rats (SD, n = 10) and exercised diabetic rats (ED, n = 13). Animals of same age and weight served as sedentary controls (SC, n = 10) and exercised controls (EC, n = 06). Animals and ED and EC underwent a STP (05 days/week, 90 min/day) for 08 weeks. Left ventricular (LV) myocytes were isolated and electrically stimulated at 3.0 Hz at room temperature (∼ 25º C). RESULTS: Diabetes reduced contractile function in cardiomyocytes of animals compared to controls (i.e., lower amplitude of contraction, longer duration of contraction and relaxation). The STP attenuated the reduced amplitude of contraction (SC, 11 ± 0.2% vs ED, 11.6 ± 0.2%), time to peak contraction (SC, 319 ± 5.8 ms vs ED, 333 ± 4.8 ms) and time to 50.0% of relaxation (SC, 619 ± 22.2 ms vs ED 698 ± 18.6 ms) of cardiomyocytes of diabetic rats. Diabetes reduced the size of cardiomyocytes, however, the STP minimized the reduction of cell volume and width, without changing length. CONCLUSION: The swimming training program attenuated the contractile dysfunction of the LV myocytes of rats with experimental diabetes.

Swimming physical exertion myocytes, cardiac rats diabetes mellitus

Swimming training attenuates contractile dysfunction in diabetic rat cardiomyocytes

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG - Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Experimental diabetes promotes contractile dysfunction in cardiomyocytes, but the effects of swimming in this disorder are not known.

OBJECTIVE: To test the effects of a swimming training program (STP) on cardiomyocyte contractile dysfunction in rats with experimental diabetes.

METHODS: Wistar rats (age: 30 days; mean body weight: 84.19 g) with diabetes induced by streptozotocin (60 mg/kg body weight; glucose > 300 mg/dl) were divided into sedentary diabetic rats (SD, n = 10) and exercised diabetic rats (ED, n = 13). Animals of same age and weight served as sedentary controls (SC, n = 10) and exercised controls (EC, n = 06). Animals and ED and EC underwent a STP (05 days/week, 90 min/day) for 08 weeks. Left ventricular (LV) myocytes were isolated and electrically stimulated at 3.0 Hz at room temperature (∼ 25º C).

RESULTS: Diabetes reduced contractile function in cardiomyocytes of animals compared to controls (i.e., lower amplitude of contraction, longer duration of contraction and relaxation). The STP attenuated the reduced amplitude of contraction (SC, 11 ± 0.2% vs ED, 11.6 ± 0.2%), time to peak contraction (SC, 319 ± 5.8 ms vs ED, 333 ± 4.8 ms) and time to 50.0% of relaxation (SC, 619 ± 22.2 ms vs ED 698 ± 18.6 ms) of cardiomyocytes of diabetic rats. Diabetes reduced the size of cardiomyocytes, however, the STP minimized the reduction of cell volume and width, without changing length.

CONCLUSION: The swimming training program attenuated the contractile dysfunction of the LV myocytes of rats with experimental diabetes.

Keywords: Swimming; physical exertion; myocytes, cardiac; rats; diabetes mellitus.

Introduction

Diabetes mellitus type 1 is a risk factor for cardiovascular events, including the development of diabetic cardiomyopathy. The inability to maintain glucose homeostasis in the myocardium compromises cardiac structure and function in humans and animals with experimental diabetes^1-4. At the cellular level, it was shown that diabetes impairs the contractile function of cardiomyocytes, mainly for causing structural and functional changes in the regulation of intracellular calcium (Ca²⁺)^5-7.

Regular exercise has been used as an effective agent for heart protection for diabetics, since the structural and functional abnormalities of the diabetic heart to respond favorably exercise^8-10. For example, in diabetic rats, chronic exercise attenuated changes in left ventricular function, such as reduction in systolic volume, end-diastolic volume and ejection fraction, cardiac output and fractional shortening^7,11,12.

At the cellular level, however, few studies on the effects of chronic exercise on the contractile function of cardiomyocytes of diabetic rats were performed and, in addition to using only the treadmill, showed controversial results. For example, continuous running programs on a treadmill with low intensity (09 m/min, 0.0% inclination, 30 min/day) or moderate intensity (18 m/min, 0.0% inclination) did not affect the contraction of rat cardiomyocytes¹³. Another program of continuous running with high intensity (18 m/min, 5.0% inclination, 60 min/day) led to negative changes, as it prolonged cell contraction time and did not alter the amplitude of contraction of rat cardiomyocytes¹⁴. However, running programs on a treadmill with higher intensity (20-25 m/min, 5.0% inclination, 60 min/day) were able to restore the contractile function of rat and mice cardiomyocytes^7,15. So far, the effects of continuous exercise lasting over 60 minutes daily, especially swimming on the contractile function of cardiomyocytes of diabetic rats are not known.

This study aims to test whether a swimming program, lasting 90 minutes daily, alters the contractile function of isolated cardiomyocytes of the left ventricle of rats with experimental diabetes.

Methods

Experimental animals and treatments

Wistar rats (age 30 days; mean body weight of 84.19 g) were divided into 04 groups: Sedentary controls (SC, n = 10); Exercised control (EC, n = 10); Sedentary diabetic (SD, n = 20); and Exercised diabetic (ED, n = 20) and were maintained at average temperature of 22º C and inversed lighting regime of 12/12h light/dark with water and commercial diet ad libitum.

This study followed the standards established in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996) and respected the Ethical Principles in Animal Experiments of the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). The study was approved by the Ethics Committee of Universidade Federal de Viçosa (proceeding No. 03/2009).

Induction of diabetes

After fasting for 12 hours, the animals in groups ED and SD received an intraperitoneal injection (60 mg/kg body weight) of streptozotocin (STZ, Sigma, St. Louis, USA), diluted in 1.0 ml of sodium citrate buffer (0.1 M, pH 4.5). Animals in groups SC and EC received the same dose of sodium citrate buffer (0.1 M, pH 4.5) without STZ. Seven days after application of STZ and fasting for 12 hours, blood glucose was measured at rest (One Touch Ultra - Johnson & Johnson, Mexico). Animals with levels of fasting blood glucose above 300 mg\dl were considered diabetic (SD, n = 10, ED, n = 13). Fasting blood glucose and body weight were monitored weekly over the experimental period.

Swimming training program

After 45 days of hyperglycemia, the animals in group ED and EC were subjected to a swimming training program (adapted from Medeiros et al¹⁶) for 8 weeks. In the first week, the animals exercised in the water, no overload, over 10-50 min, the duration increased by 10 min/day. In the second week, the animals exercised with a load of 1.0% of their body weight and exercise duration was increased by 10 min/day until 90 min of continuous swimming. From the third week, the load was increased weekly (0.5% of body weight) up to 4.0% of body weight in 8 weeks. During the swimming sessions, the animals in groups SD and NC were placed in a polypropylene box with warm water (28-30º C) and 10 cm depth.

Four animals in the group EC died from drowning.

Isolation of cardiomyocytes

After euthanasia, hearts were removed and left ventricular myocytes were isolated as described by Natali et al¹⁷. Briefly, hearts were cannulated via the aorta in a Langendorff system and perfused with isolation solution [composition (mM): 130 Na⁺; 5.4 K⁺; 1.4 Mg⁺; 140 Cl^-; 0.75 Ca²⁺; 5.0 Hepes; 10 glucose; 20 taurine; and 10 creatine; pH = 7.3 at room temperature]. Then the heart was perfused with calcium-free solution containing 0.1 mM ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA), for a period of 4 -6 min. Then, the heart was perfused with a solution containing 1.0 mg.ml^-1 collagenase type 2 (Worthington, USA) and 100.0 mM CaCl₂ for 20 to 25 min. The solutions were oxygenated (100% O₂ - White Martins, Brazil) and maintained at a temperature of 35º C. After perfusion, ventricles were separated from the atria and weighed. Then, the left ventricle was placed in a vial containing 5.0 ml of enzyme solution (collagenase) and bovine serum albumin (10.0%). The vial was shaken moderately for 05 min in a water bath at 37º C, after which the tissue was removed from the vial and the remainder was centrifuged (3.000 rpm) for 30 s. The supernatant was removed and the cardiomyocytes were suspended in isolation solution and stored in refrigerator (5º C) until use.

Contractile function of cardiomyocytes

Cell contractions were measured using the technique of changing the length of cardiomyocytes using the edge detection system (Ionoptix, Milton, MA, USA) mounted on an inverted microscope (Nikon Eclipse - TS100, Japan) as described previously¹⁸. Briefly, myocytes were accommodated in an experimental chamber with a glass base and bathed in buffer solution with the following composition (in mM): 136.9 NaCl; 5.4 KCl; 0.37 NaH₂PO₄; 0.57 MgCl₂; 5.0 Hepes = 5; 5.6 Glucose and 1.0 CaCl₂ (pH = 7.4 at room temperature). Myocytes were viewed on a monitor via a camera (Myocam, Ionoptix, frequency of 240 Hz) attached to the microscope using an image detection program (Ionwizard, Ionoptix). Cardiomyocytes were stimulated externally at a frequency of 3.0 Hz (10 Volts, lasting 5 min) using a pair of steel electrodes and an electric field (Myopacer, Ionoptix). The movements of the longitudinal edges of the myocytes were captured by the edge detection system (Ionwizard, Ionoptix) and stored for later analysis. Contraction measurements employed only those cardiomyocytes that were in good condition, with the edges and well-defined sarcomeric striations, at rest, with no voluntary contractions. The contractions were analyzed as described previously¹⁹.

Dimensions of cardiomyocytes

The length and width of myocytes were measured using a system for capturing images, from images of cardiomyocytes displayed horizontally on the monitor of a microcomputer, as described¹⁷. The cell length was determined by measuringthe cell image generated on the monitor from the right edge to the left edge, at the midpoint of the cardiomyocyte width. The width of cells was determined by measuring the image generated on the monitor, from the top edge to the bottom edge, at the midpoint of the length of cardiomyocytes. The cell volume was calculated using the formula: [Volume (pL) = Length (mm) x width (mm) x (7.59 x 10^{- 3} pL/mm²)], according to Satoh et al²⁰.

Statistical analysis

To compare the means of variables analyzed among the 04 groups (exercise and diabetes factors, two groups each), we used analysis of variance with two inputs (two-way ANOVA) and Tukey's post hoc for multiple comparisons. This analysis was performed using the Sigma Stat software, version 3.0. We adopted alevel of significance of up to 5.0% (p < 0.05).

Results

Before the application of STZ, there was no statistical difference in blood glucose between the groups (Table 1). Forty-five days after the application of STZ (beginning of the year) and at the end of the experiment, diabetic animals had blood glucose higher than control animals. The blood glucose levels were not altered by exercise in both diabetic animals (ED vs SD) as in control animals (EC vs SC). There was no interaction among exercise and diabetes (two-way ANOVA, p > 0.05) for this or for other variables analyzed.

The initial body weights were not different among the four groups (Table 1). Forty-five days after application of STZ, the animals in groups SD and ED had body weights lower than controls SC and EC. The same happened at the end of the experiment. Likewise, the swimming program did not alter these parameters in animals of both ED group as compared to SD, and in EC as compared to SC.

The SD animals had lower ventricular weights (p < 0.05) than SC (Table 1). The swimming program did not affect the ventricular weight of diabetic animals (SD vs ED). However, in control animals, ventricular weight was higher in EC than in SC animals. Ventricular weight related to body weight, ventricular hypertrophy index, was higher in the SD group than in the SC group. Among diabetic rats, those in the ED group presented higher relative ventricular weight than those in the SD group. Among controls, EC animals exhibited a higher relative ventricular weight than SC.

Independently, diabetes reduced the length of cardiomyocytes in sedentary animals (SD vs SC) and trained animals (ED vs CE; Table 2). However, the swimming program has not changed the length of cardiomyocytes in diabetic rats (ED vs SD) and in non-diabetic rats (SC vs CE). Diabetes reduced the width of myocytes in sedentary animals (SD vs SC) and trained animals (ED vs CE). However, the swimming program has increased the width of cardiomyocytes of diabetic rats (ED vs SD). This did not occur in control animals (EC vs SC). There was a reduction of cell volume in the SD group compared to the SC group. The swimming program increased the cell volume in diabetic animals (ED vs SD), but not in control animals (EC vs SC). It is observed that the length/width ratio of cardiomyocytes was not affected by diabetes or by the swimming program.

The analysis of the contractile function of cardiomyocytes showed that the amplitude of cell contraction was reduced by diabetes (SC, 11.0 ± 0.2% vs SD, 10.2 ± 0.2%, p < 0.001) (Figure 1 A). The swimming program increased the contraction amplitude of cardiomyocytes in these animals (SD, 10.2 ± 0.2% vs ED, 11.6 ± 0.2%, p < 0.001). Among the control animals, the swimming program increased the amplitude of contraction (SC, 11.0 ± 0.2% vs EC, 12.4 ± 0.2%, p < 0.001).

The cardiomyocytes of animals in the SD group had time to peak contraction longer than the SC group (361 ± 5.7 ms vs 319.0 ± 5.8 ms, respectively, p < 0.001) (Figure 1 B). The swimming program reduced the time to peak contraction in diabetic animals (SD, 361 ± 5.7 ms vs ED, 333.0 ± 4.8 ms, p < 0.001). The same effect was observed in cardiomyocytes of control animals (EC, 289.0 ± 6.8 ms vs SC, 319.0 ± 5.8 ms, p < 0.001).

For 50.0% of relaxation, the time was higher in cardiomyocytes of sedentary diabetic rats than in sedentary controls (SD, 756 ± 22.1 ms vs SC, 619.0 ± 22.2 ms, p < 0.001) (Figure 1C). The swimming program reduced the time for 50.0% of relaxation in the cardiomyocytes of these animals (SD, 756 ± 22.1 ms vs ED, 698 ± 18.6 ms, p = 0.044). The same effect was observed in cardiomyocytes of control animals (EC, 516.0 ± 26.1 ms vs SC, 619.0 ± 22.2 ms, p = 0.003).

Discussion

Our data demonstrate that the contractile dysfunction of cardiomyocytes caused by diabetes was moderated by swimming training program lasting 90 minutes. Furthermore, we found increased width and volume of cardiomyocytes, without altering the cell length in response to chronic exercise.

The reduced contraction amplitude observed in this study reflects important changes in the myocardium of diabetic rats in vivo, such as reduced fractional shortening in end diastolic diameter, left ventricular end systolic diameter and cardiac input^7,11. Although we have not tested mechanisms, it is knownthat the decreased sensitivity of contractile myofilaments to Ca²⁺ and reduced intracellular concentration of Ca²⁺ are involved²¹. However, cardiomyocytes of Goto-Kakizaki rat showed increased amplitude of contraction associated with transient reduction of Ca²⁺. This suggests that the sensitivity of myofilaments to Ca²⁺ was increased, which could be a compensatory mechanism to preserve the mechanical function of the heart in diabetes²². There is evidence that the intracellular concentration of Ca²⁺ is reduced in cardiomyocytes of animals with experimental diabetes²³. This occurs due to the increased activity of sodium and calcium exchanger (NCX) and decreased uptake of Ca²⁺ by the sarcoplasmic reticulum (SR) via calcium ATPase of the SR (SERCA2)¹⁵ and reduced release of Ca²⁺ of SR, via ryanodine receptors (RyR2)²⁴. Moreover, it is possible that the reduced density of transverse tubules in cardiomyocytes of diabetic animals can change the space between the L-type calcium channels and RyR2, which reduces the efficiency of excitation-contraction coupling¹⁵.

In contrast, chronic exercise increased the contraction amplitude in diabetic animals and controls. For diabetic animals, this fact indicates that exercise promoted positive changes in cardiomyocytes that contribute to alleviating some of the mechanical abnormalities of diabetic myocardium observed in vivo^7,11,12. Some mechanisms have been proposed as responsible for increasing the contraction amplitude of cardiomyocytes of diabetic rats in response to chronic exercise: there is evidence that chronic exercise can normalize the operation of NCX and calcium calmodulin kinase II (CaMKII), reduce the leakage of Ca²⁺ of SR and increase the content of Ca²⁺ of SR^7,15.

Experimental diabetes prolonged the time required for peak cell contraction. This indicates that cardiomyocytes of diabetic rats contract more slowly than their controls. This change has a negative impact on the cardiac function in these animals. The speed of contraction of cardiomyocytes is controlled by proteins that regulate intracellular Ca²⁺ movement and the rate of ATP hydrolysis which, in turn, regulates the rate of formation of crossed bridges²¹. Cardiomyocytes of diabetic animals reduce the expression of regulatory proteins such as CaMKII, NCX, RyR2, SERCA2 and phospholamban (PLB)^5,7,15,24-26, which may delay the availability of Ca²⁺ for cell contraction.

However, the swimming program reduced the time to peak contraction in diabetic animals. Adaptations to regular exercise, which accelerate the availability of cytosolic Ca²⁺ and increase the rate of ATP hydrolysis, contributed to this reduction. The speed of availability of cytosolic Ca²⁺ is regulated mainly by the output speed of SR Ca²⁺ via RyR2²¹. There is evidence that regular exercise increases the expression and/or the activity of RyR2 and sensitivity of RyR2 and contractile myofilaments to Ca²⁺ in diabetic animals⁷. Furthermore, exercise can increase the density and responsiveness of beta-adrenergic receptors in diabetic rats¹², which can affect the speed of cell contraction.

We have also demonstrated that experimental diabetes has prolonged cell relaxation time. The relaxation of cardiomyocytes depends on the removal of Ca²⁺ from the cytosol to the SR (via SERCA2, PLB) to the extracellular medium (via NCX, sarcolemmal Ca²⁺ ATPase) and to the mitochondria (via transport of mitochondrial Ca²⁺)²¹. The expression and function of these cellular structures are reduced in cardiomyocytes of diabetic animals^12,25-28. This fact reduces the rate at which Ca²⁺ is removed from the cytosol. These changes are also associated with depression of protein kinase A (PKA) and CaMKII, responsible for phosphorylation of PLB. Furthermore, non phosphorylation of PLB by CaMKII reduced the affinity of SERCA2 for Ca²⁺ and inhibits reuptake of Ca²⁺ by SR, which helps to slow down cell relaxation²⁶. These findings at the cellular level are consistent with the diastolic dysfunctions observed in diabetic hearts in vivo^7,11.

The swimming program applied, in turn, reduced the relaxation time of cardiomyocytes of diabetic animals. This effect has been attributed to the ability of regular exercise to increase the speed of removal of Ca²⁺ from cytosol via increased expression of SERCA2 and PLB^7,15, normalization of NCX expression and function, reduction in the phosphorylation of CaMKII and restoration of the density of transverse tubules¹⁵.

The swimming program applied did not affect fasting plasma glucose in diabetic and control animals at rest. In diabetic rats, STZ induces the apoptosis of ß-pancreatic cells²⁹, which inhibits the secretion of insulin. It is also possible that there has been an increase in glucagon secretion in such animals³⁰ and its counterregulatory action has helped in the maintenance of hyperglycemia. Our results are consistent with those of other studies^7,11-14,31, although these have used different exercise protocols (i.e., treadmill). On the other hand, some studies have shown that exercise was able to improve glucose metabolism in diabetic rats^32,33. Probably a lack of consensus between the results of these studies is due to the use of different methodological procedures.

Diabetic animals showed polyuria and polydipsia characteristic of diabetes, but despite feeding normally, without food restriction [e.g., weekly consumption of food (diabetics: 199.47 ± 3.55 g vs controls: 194.36 ± 4.4 g)], moving freely within the box housing (SD group) and exercising (ED group), they did not gain as much weight as non-diabetic controls. The lower body and ventricular weights of diabetic animals indicate that they had impaired growth. In rats with diabetes induced by STZ, in addition to insulin, the secretion of hormones such as the growth hormone, glucagon, pancreatic polypeptide and, consequently, growth factor similar to that of insulin, are altered and affect the growth^34-36. It is also known thatdiabetes induces increased use of fatty acids and accelerates protein catabolism³⁷.

Yet, the swimming program used was unable to significantly alter the body weight of diabetic or nondiabetic animals, but increased the absolute ventricular weight in non-diabetic animals. However, more importantly, both diabetes and the swimming program increased the relative ventricular weight of diabetic animals and the swimming program increased this parameter in nondiabetic control animals, which shows ventricular hypertrophy. Cardiac hypertrophy induced by experimental diabetes (pathological) and chronic exercise (physiological) have been documented in previous studies^7,14,17,31.

The reduction in the dimensions of cardiomyocytes of diabetic rats compared to controls, as observed in this study, is consistent with the smaller ventricular weight presented by the diabetic animals. However, the swimming program used increased the volume of cardiomyocytes of diabetic rats. This suggests that inhibition of cell growth caused by diabetes was affected by the exercise applied and denotes cell hypertrophy. In fact, the relative ventricular weight in animals of group ED was more pronounced than in animals of group EC (33.3% vs 31.5%, respectively).

Conclusion

We concluded that the swimming training program attenuated the contractile dysfunction of the LV cardiomyocytes of rats with experimental diabetes. These findings are relevant for the understanding, at the cellular level, of the benefits of exercise training on the contractile function of cardiac muscle of individuals with diabetes type I.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by FAPEMIG.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Márcia Ferreira da Silva, from Universidade Federal de Viçosa.

References

Entrenamiento en natación atenúa la disfunción contráctil de cardiomiocitos de ratones diabéticos

FUNDAMENTO: La diabetes experimental promueve el trastorno contráctil de los cardiomiocitos, pero los efectos del entrenamiento en natación en este trastorno no se conocen. OBJETIVO: Probar los efectos de un programa de capacitación en natación (PTN) sobre el trastorno contráctil de cardiomiocitos de ratas con diabetes experimental. MÉTODOS: Ratas Wistar (edad: 30 días, peso corporal medio: 84,19 g) con diabetes inducida por estreptozotocina (60 mg/kg de peso corporal, glucosa > 300 mg/dl) fueron divididos en diabéticos sedentarios (DS, n = 10) y diabéticos ejercitados (DE, n = 13). Animales de la misma edad y peso sirvieron de controles sedentarios (CS, n = 10) y controles ejercitados (CE, n = 06). Los animales DE y CE se sometieron a un PTN (05 días/semana, 90 min/día), por 08 semanas. Los miocitos del ventrículo izquierdo (VI) fueron aislados y estimulados eléctricamente a 3,0 Hz en temperatura ambiente (~ 25º C). RESULTADOS: La diabetes disminuyó la función contráctil de los cardiomiocitos de los animales en comparación con los controles (es decir, menor amplitud de la contracción, la duración de la contracción y relajación). El PTN atenuó la reducción de la amplitud de la contracción (CS, 11 ± 0,2% frente a la DE, 11,6 ± 0,2%), el tiempo para la contracción máxima (CS, 319 ± 5,8 ms vs DE, 333 ± 4,8 ms) y el tiempo para el 50% de relajación (CS, 619 ± 22,2 ms vs DE, 698 ± 18,6 ms) de los cardiomiocitos de los animales diabéticos. La diabetes redujo las dimensiones de los cardiomiocitos, sin embargo, el PTN minimizó la reducción de la anchura y volumen celular, sin cambiar la longitud. CONCLUSIÓN: El programa de entrenamiento de natación atenuó la disfunción contráctil de los miocitos del VI de las ratas con diabetes experimental.

Natación esfuerzo físico miocitos cardíacos ratones diabetes mellitus

ARTÍCULO ORIGINAL

Entrenamiento en natación atenúa la disfunción contráctil de cardiomiocitos de ratones diabéticos

Márcia Ferreira da Silva; Maria do Carmo Gouveia Pelúzio; Paulo Roberto dos Santos Amorim; Victor Neiva Lavorato; Natália Pereira do Santos; Luiz Henrique Marchesi Bozi; Arlete Rita Penitente; Daniel Luciano Falkoski; Felipe Gomes Berfort; Antonio Jose Natali

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: La diabetes experimental promueve el trastorno contráctil de los cardiomiocitos, pero los efectos del entrenamiento en natación en este trastorno no se conocen.

OBJETIVO: Probar los efectos de un programa de capacitación en natación (PTN) sobre el trastorno contráctil de cardiomiocitos de ratas con diabetes experimental.

MÉTODOS: Ratas Wistar (edad: 30 días, peso corporal medio: 84,19 g) con diabetes inducida por estreptozotocina (60 mg/kg de peso corporal, glucosa > 300 mg/dl) fueron divididos en diabéticos sedentarios (DS, n = 10) y diabéticos ejercitados (DE, n = 13). Animales de la misma edad y peso sirvieron de controles sedentarios (CS, n = 10) y controles ejercitados (CE, n = 06). Los animales DE y CE se sometieron a un PTN (05 días/semana, 90 min/día), por 08 semanas. Los miocitos del ventrículo izquierdo (VI) fueron aislados y estimulados eléctricamente a 3,0 Hz en temperatura ambiente (~ 25º C).

RESULTADOS: La diabetes disminuyó la función contráctil de los cardiomiocitos de los animales en comparación con los controles (es decir, menor amplitud de la contracción, la duración de la contracción y relajación). El PTN atenuó la reducción de la amplitud de la contracción (CS, 11 ± 0,2% frente a la DE, 11,6 ± 0,2%), el tiempo para la contracción máxima (CS, 319 ± 5,8 ms vs DE, 333 ± 4,8 ms) y el tiempo para el 50% de relajación (CS, 619 ± 22,2 ms vs DE, 698 ± 18,6 ms) de los cardiomiocitos de los animales diabéticos. La diabetes redujo las dimensiones de los cardiomiocitos, sin embargo, el PTN minimizó la reducción de la anchura y volumen celular, sin cambiar la longitud.

CONCLUSIÓN: El programa de entrenamiento de natación atenuó la disfunción contráctil de los miocitos del VI de las ratas con diabetes experimental. (Arq Bras Cardiol 2011; 97(1):33-39)

Palabras clave: Natación, esfuerzo físico, miocitos cardíacos, ratones, diabetes mellitus.

Introducción

La diabetes mellitus tipo 1 es un factor de riesgo para eventos cardiovasculares, incluyendo el desarrollo de la miocardiopatía diabética. La incapacidad para mantener la homeostasis de la glucosa en el miocardio compromete la estructura y la función cardíaca en humanos y animales con diabetes experimental^1-4. En nivel celular, se demostró que la diabetes perjudica la función contráctil de los cardiomiocitos, principalmente por provocar alteraciones estructurales y funcionales en la regulación del calcio (Ca²⁺) intracelular^5-7.

El ejercicio regular se viene utilizando como un agente eficaz para la protección cardíaca para los diabéticos, ya que las anormalidades estructurales y funcionales del corazón diabético responden favorablemente al ejercicio^8-10. Por ejemplo, en animales diabéticos, el ejercicio crónico atenuó alteraciones en la función ventricular izquierda, tales como la reducción en los volúmenes sistólico, diastólico final y de eyección, en el débito cardíaco y en la fracción de acortamiento^7,11,12.

A nivel celular, sin embargo, pocos estudios sobre los efectos del ejercicio crónico en la función contráctil de los cardiomiocitos de animales diabéticos se llevaron a cabo y, además de usar sólo la carrera en cinta, mostraron resultados contradictorios. Por ejemplo, los programas de carrera continua en cinta con intensidad baja (09 m/min, 0% mínimo de una inclinación de 30 min/día) o moderada (18 m/min, 0% de inclinación) no afectaron la contracción de los cardiomiocitos ratones¹³. Otro programa de carrera continua con intensidad alta (18 m/min, 5% de inclinación, 60 min/día) provocó adaptaciones negativas, ya que prolongó el tiempo de contracción celular y no alteró la amplitud de contracción de los cardiomiocitos de ratones¹⁴. Sin embargo, programas de corrida en cinta con intensidad más alta (20-25 m/min, 5% de inclinación, 60 min/dia) fueron capaces de restaurar la función contráctil de los cardiomiocitos de ratones y camundongos^7,15. Por tanto, hasta el momento, los efectos del ejercicio continuo con duración superior a 60 minutos diarios, específicamente la natación, sobre la función contráctil de cardiomiocitos de ratones diabéticos no se conocen.

Este estudio tiene como objetivo probar si un programa de natación, que dura 90 minutos diarios, altera la función contráctil de los cardiomiocitos aislados del ventrículo izquierdo de ratones con diabetes experimental.

Métodos

Animales de experimentación y los tratamientos

Ratones Wistar (a la edad de 30 días, el peso corporal medio de 84,19 g) se dividieron en 04 grupos: Controles sedentarios (CS, n = 10); Control ejercitado (CE, n = 10); Diabéticos sedentarios (DS, n = 20); y el Diabético ejercitado (DE, n = 20) se mantuvieron en ambiente a la temperatura promedio de 22º C y régimen de luminosidad invertido de 12/12 horas claro/oscuro con agua y ración comercial ad libitum.

Se siguieron las normas establecidas en el Guide for the Care and Use of Laboratory Animals( Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996) y respetados los Principios Éticos para la Experimentación Animal del Colegio Brasileño de Experimentación Animal (COBEA). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Federal de Viçosa (proceso Nº 03/2009).

Inducción de la diabetes

Después de ayunar por 12 horas, los animales de los grupos DE y DS recibieron una inyección intraperitoneal (60 mg/kg de peso corporal) de estreptozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, EE.UU.), diluida en 1,0 ml de tampón de citrato sódico (0,1 M, pH 4,5). Los animales de los grupos CS y CE recibieron la misma dosis de tampón citrato sódico (0,1 M pH 4,5) sin STZ. Siete días después de la aplicación de STZ y ayuno por 12 horas, la glucosa sanguínea en sangre se midió en reposo (One touch ultra - Johnson & Johnson, México). Los animales con niveles de glucosa en sangre en ayunas por encima de 300 mg/dl fueron considerados diabéticos (DS, n = 10; DE, n = 13). La glucosa sanguínea de ayunas y el peso corporal fueron monitoreados semanalmente durante el período experimental.

Programa de capacitación en natación

Después de 45 días de la hiperglucemia, los animales en el grupo DE y la CE se sometieron a un programa de entrenamiento de natación (adaptado de Medeiros et al¹⁶) durante 8 semanas. En la primera semana, los animales se ejercitaron en el agua, sin sobrecarga, más de 10-50 minutos, la duración aumentó en 10 minutos/día. En la segunda semana, los animales se ejercitaron con una carga del 1% de su peso corporal y la duración del ejercicio se incrementó en 10 min/día hasta alcanzar 90 minutos de natación continuada. Desde la tercera semana, la carga se incrementó semanalmente (0,5% del peso corporal) hasta alcanzar el 4% del peso corporal en la 8ª semana. Durante las sesiones de natación, los animales de los grupos DS y CS eran colocados en una caja de polipropileno con agua calentada (28-30º C) y una profundidad de 10 cm.

Cuatro animales del grupo CE se murieron por ahogamiento.

Aislamiento de los cardiomiocitos

Después de la eutanasia, se removió el corazón y los mocitos del ventrículo izquierdo fueron aislados según describieron Natali et al¹⁷. En resumen, una vez canulado el corazón vía arteria en un sistema Langendorff, se lo perfundió con solución de aislamiento [composición (mM): 130 Na⁺; 5,4 K⁺; 1,4 Mg⁺; 140 Cl^-; 0,75 Ca²⁺; 5,0 Hepes; 10 glucosa; 20 taurina; y 10 creatina; pH = 7,3 en temperatura ambiente]. A continuación, el corazón fue perfundido con solución libre de calcio conteniendo 0,1 mM de ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA), por un período de 4-6 min. En la secuencia, el corazón fue perfundido con solución conteniendo 1,0 mg.ml^-1 de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) y 100,0 mM de CaCl₂por 20 a 25 min. Las soluciones utilizadas se oxigenaron (O₂ 100% - White Martins, Brasil) y se mantuvieron en temperatura de 35º C. Tras perfusiones, los ventrículos fueron separados de las aurículas y pesados. Así que, el ventrículo izquierdo se colocó en un envase que contenía 5,0 ml de la solución enzimática (colagenasa) y albúmina de suero bovino (10%). El envase se agitó moderadamente durante 05 minutos en baño maría a 37º C, después del cual el tejido fue removido del envase y el resto fue centrifugado (3.000 rpm) durante 30 s. Se removió el sobrenadante y los cardiomiocitos se suspendieron en la solución de aislamiento y almacenados en refrigerador (5º C) hasta su utilización.

Función contráctil de los cardiomiocitos

Las contracciones de la célula se midieron utilizando la técnica de cambio de la longitud de los cardiomiocitos mediante el sistema de detección de bordes (Ionoptix, Milton, MA-EE.UU.) montado en un microscopio invertido (Nikon Eclipse - TS100, Japón), como se describe previamente¹⁸. En suma, los mocitos se agruparon en una cámara experimental con la base de cristal y bañados por solución tampón con la siguiente composición (en mM): 136,9 NaCl; 5,4 KCl; 0,37 NaH₂PO₄; 0,57 MgCl₂; 5,0 Hepes = 5; 5,6 Glucosa e 1,0 CaCl₂ (pH = 7,4 en temperatura ambiente). Los miócitos se ven en un monitor a través de una cámara (Myocam, Ionoptix, frecuencia de 240 Hz) unido al microscopio utilizando un programa de detección de imágenes (Ionwizard, Ionoptix). Los cardiomiocitos fueron estimulados externamente a una frecuencia de 3.0 Hz (10 Volts, con una duración de 5 minutos) con una dupla de electrodos de acero y un estimulante eléctrico de campo (Myopacer, Ionoptix). Los movimientos de los bordes longitudinales de los miocitos fueron capturados por el sistema de detección de bordes (Ionwizard, Ionoptix) y se almacena para su posterior análisis. Se utilizaron para las mediciones de contracción sólo los que se encontraban en buenas condiciones, con los bordes y las estriaciones sarcoméricas bien definidas, relajados en reposo, sin presentar contracciones voluntarias. Las contracciones se analizaron como se describe previamente¹⁹.

Dimensiones de los cardiomiocitos

La longitud y la anchura de los miocitos se midieron utilizando un sistema de captura de imágenes, a partir de imágenes de los cardiomiocitos que aparecen horizontalmente en la pantalla de una microcomputadora, como descrito¹⁷. La longitud celular se determinó con la medición de la imagen de la célula generada en el monitor, desde el borde derecho hasta el borde izquierdo, en el punto medio de la anchura del cardiomiocito. La anchura de las células se determinó mediante la medición de la imagen generada en el monitor, desde el borde superior hasta el borde inferior, en el punto medio de la longitud de los cardiomiocitos. El volumen celular se calculó mediante la fórmula: [Volumen (pL) = longitud (mm) x anchura (mm) x (7,59 x 10^-3 pL/mm²)], conforme Satoh et al²⁰.

Análisis estadístico

Para la comparación de la medias de las variables analizadas entre los 04 grupos (factores ejercicio y la diabetes, dos grupos cada uno), se utilizó el análisis de varianza con dos entradas (ANOVA two-way) y post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Este análisis se realizó a través del software Sigma Stat, versión 3,0. Se adoptó el nivel de significancia de hasta 5% (p < 0,05).

Resultados

Antes de la aplicación de STZ, no hubo diferencia estadística en la glucosa sanguínea entre los grupos (Tabla 1). Cuarenta y cinco días tras la aplicación de STZ (inicio del ejercicio) y al final del experimento, los animales diabéticos presentaron glucosa sanguínea superior a la de los animales. Los niveles de glucosa en la sangre no se alteraron por el ejercicio, tanto en animales diabéticos (DE vs DS) como en los control (CE vs CS). No hubo interacción entre los factores ejercicio y diabetes (ANOVA two-way, p > 0,05) para esta o para las demás variables analizadas.

Los pesos corporales iniciales no fueron distintos entre los cuatro grupos (Tabla 1). Cuarenta y cinco días después de la aplicación de STZ, los animales en dos grupos DS y DE presentaron pesos corporales inferiores a los controles CS y CE. Lo mismo ocurrió al final del experimento. Asimismo, el programa de natación no alteró los parámetros en los animales tanto del grupo DE, cuando comparados a DS, como en los CE comparados a CS.

Los animales DS presentaron menores pesos ventriculares (p < 0,05) que los CS (Tabla 1). El programa de natación no alteró el peso ventricular de los animales diabéticos (DS vs DE). Sin embargo, en los animales control, el peso ventricular fue mayor en los animales CE que en los CS. El peso de los ventrículos en relación con el índice de peso corporal, índice de hipertrofia ventricular, fue mayor en DS que en el CS. Entre los animales diabéticos, los DE presentaron peso relativo de los ventrículos mayor que los DS. Entre los controles, los animales CE mostraron un mayor peso relativo de los ventrículos que los CS.

Independientemente, la diabetes redujo la longitud de los cardiomiocitos en los animales sedentarios (DS vs CS) y entrenados (DE vs CE ; Tabla 2). Sin embargo, el programa de natación no ha cambiado la longitud de los cardiomiocitos en los ratones diabéticos (DE vs DS) y en los no diabéticos (CS vs CE). La diabetes reduzco la anchura de los miocitos en los animales sedentarios (DS vs CS) y entrenados (DE vs CE). Sin embargo, el programa de natación incrementó la anchura de los cardiomiocitos en los animales diabéticas (DE vs DS). Esto no ocurrió en los animales control (CE vs CS). Hubo una reducción del volumen celular en el grupo DS comparado con el grupo CS. El programa de natación incrementó el volumen de células en los animales diabéticos (DE vs DS), pero no en los animales control (CE vs CS). Se observa que la relación longitud/anchura de los cardiomiocitos no se vio afectada por la diabetes o por el programa de natación.

El análisis de la función contráctil de los cardiomiocitos mostró que la amplitud de la contracción celular se redujo por la diabetes (CS, 11.0 ± 0.2% vs DS, 10.2 ± 0.2%, p < 0,001) (Figura 1A). El programa de natación ha aumentado la amplitud de la contracción de los cardiomiocitos en estos animales (DS, 10,2 ± 0,2% vs DE, 11,6 ± 0,2%, p < 0,001). Entre los animales controles, el programa de natación aumentó la amplitud de contracción (CS, 11,0 ± 0,2% vs CE, 12,4 ± 0,2%, p < 0,001)

Los cardiomiocitos de los animales en el grupo DS, tenían tiempo hasta el pico de contracción más largo que el grupo CS (361 ± 5,7 ms vs 319,0 ± 5,8 ms, respectivamente, p < 0,001) (Figura 1 B). El programa de natación redujo el tiempo al pico de la contracción en los animales diabéticos (DS, 361 ± 5,7 ms vs DE, 333,0 ± 4,8 ms, p < 0,001). Igual efecto se observó en los cardiomiocitos de los animales control (CE, 289,0 ± 6,8 ms vs CS, 319,0 ± 5,8 ms, p < 0,001).

Para el 50% de la relajación, el tiempo fue mayor en los cardiomiocitos de animales diabéticos sedentarios que en los controles sedentarios (DS, 756 ± 22,1 ms vs CS, 619.0 ± 22.2 ms, p < 0,001) (Figura 1C). El programa de natación redujo el tiempo para el 50% de la relajación en los cardiomiocitos de estos animales (DS, 756 ± 22,1 ms vs DE, 698 ± 18,6 ms, p = 0,044). Igual efecto se observó en los cardiomiocitos de los animales control (CE, 516,0 ± 26,1 ms vs CS, 619,0 ± 22,2 ms, p = 0,003).

Discusión

Nuestros datos demuestran que la disfunción contráctil de los cardiomiocitos producida por la diabetes fue moderada por el programa de entrenamiento de natación de 90 minutos. Por otra parte, el aumento de la anchura y el volumen de los cardiomiocitos, sin alterar la longitud de la célula en respuesta al ejercicio crónico.

La reducción en la amplitud de la contracción observada aquí refleja cambios importantes en el miocardio de ratas diabéticas, in vivo, tales como la reducción en la fracción de acortamiento, en el diámetro diastólico final, el diámetro sistólico final del ventrículo izquierdo y en lo débito cardíaco^7,11. Aunque no probamos los mecanismos, se sabe que la reducción de la sensibilidad de los miofilamentos contráctiles al Ca²⁺ y la reducción de la concentración intracelular del Ca²⁺ están implicados²¹. Sin embargo, cardiomiócitos de ratones Goto-Kakizaki presentaron aumento de la amplitud de contracción asociada a la reducción del transiente de Ca²⁺. Esto sugiere que la sensibilidad de los miofilamientos al Ca²⁺ estaba aumentada, lo que podría ser uno mecanismo compensatorio para preservar la función mecánica del corazón en la diabetes²². Hay evidencias de que la concentración intracelular de Ca²⁺ se presenta reducida en cardiomiocitos de animales con diabetes experimental²³. Esto ocurre debido al aumento de la actividad del trocador de sodio y calcio (NCX) y de la disminución de la recaptación de Ca²⁺ por el retículo sarcoplasmático (RS), vía calcio ATPasa del RS (SERCA2)¹⁵ y de la reducción de la liberación de Ca²⁺ do RS, vía receptores de rianodina (RyR2)²⁴. Además de esto, es posible que la reducción de la densidad de túbulos transversos de los cardiomiocitos de animales diabéticos pueda alterar el espacio entre los canales de calcio tipo L y los RyR2, lo que reduce la eficiencia del acoplamiento excitación-contracción¹⁵.

Por el contrario, el ejercicio crónico empleado aumentó la amplitud de contracción en los animales diabéticos y controles. Para los animales diabéticos, este hecho indica que el ejercicio promueve adaptaciones positivas en los cardiomiocitos que contribuyen a aliviar algunas de las anormalidades mecánicas observadas en el miocardio diabéticos in vivo^7,11,12. Algunos mecanismos vienen siendo propuestos como responsables del aumento de la amplitud de contratación de los cardiomiocitos de ratones en respuesta al ejercicio crónico: hay evidencias que el ejercicio físico crónico puede normalizar el funcionamiento del NCX y del calcio calmodulina quinasa II (CaMKII), reducir la fuga de Ca²⁺ del RS y aumentar el contenido de Ca²⁺ del RS^7,15.

La diabetes experimental prolongó el tiempo necesario para el pico de contracción celular. Esto indica que los cardiomiocitos de ratones diabéticas se contraían más lentamente que los de sus controles. Esta alteración tiene implicaciones negativas en la función cardíaca de estos animales. La velocidad de la contracción de los cardiomiocitos es controlada por las proteínas reguladoras de la movimiento de Ca²⁺ intracelular y por la tasa de hidrólisis de ATP que, a su vez, regula la tasa de formación de puentes cruzados²¹. Cardiomiocitos de animales diabéticos presentan reducción en la expresión de proteínas regulatorias, tales como CaMKII, NCX, RyR2, SERCA2 y fosfolambana (PLB)^5,7,15,24-26, lo que puede retardar la disponibilidad de Ca²⁺ para la contracción celular.

Sin embargo, el programa de natación redujo el tiempo para el pico de contracción en los animales diabéticos. Las adaptaciones al ejercicio regular, que aceleran la disponibilidad de Ca²⁺ en el citosol y aumentan la tasa de hidrólisis de ATP, contribuyeron a esta reducción. La velocidad de la disponibilidad de Ca²⁺ en el citosol se rige principalmente por la velocidad de salida del Ca²⁺ del RS, vía RyR2²¹. Hay evidencias de que el ejercicio físico regular aumenta la expresión y/o la actividad de los RyR2 y la sensibilidad de los RyR2 y de los miofilamentos contráctiles al Ca²⁺ en animales diabéticos⁷. Además de esto, el ejercicio físico es capaz de aumentar la densidad y la responsividad de los receptores betaadrenérgicos en ratones diabéticos¹², lo que puede afectar la velocidad de contracción celular.

También demostramos que la diabetes experimental prolongó el tiempo de relajación celular. La relajación de los cardiomiocitos depende de la remoción del Ca²⁺ desde el citosol a la RS (a través de SERCA2, PLB) para el medio extracelular (a través de NCX, Ca²⁺ ATPasa sarcolema) y la mitocondria (a través del transporte de Ca²⁺mitocondrial)²¹. La expresión y la función de estas estructuras celulares están disminuidas en los cardiomiocitos de animales diabéticos^12,25-28. Tal hecho disminuye la velocidad de modo que el Ca²⁺ se remueve del citosol. Estos cambios también se asocian con la depresión de la proteína quinasa A (PKA) y CaMKII y estas proteínas son responsables de la fosforilación de PLB. Además, la no fosforilación de PLB por CaMKII reduce la afinidad de la SERCA2 de Ca²⁺ e inhibe la recaptación de Ca²⁺ por lo RS, lo que ayuda a retardar la relajación celular²⁶. Tales hallazgos en nivel celular son compatibles con las disfunciones diastólicas observadas en corazones diabéticos in vivo^7,11.

El programa de natación aplicada, a su vez, redujo el tiempo de relajación de los cardiomiocitos de los animales diabéticos. Este efecto ha estado siendo atribuido a la capacidad de ejercicio regular para aumentar la velocidad de eliminación de Ca²⁺ del citosol a través de una mayor expresión de SERCA2 y PLB^7,15, una normalización de la expresión y función de los NCX, una reducción en la fosforilación de la CaMKII y la restauración de la densidad de túbulos trasversos¹⁵.

El programa de natación aplicado no afectó a la glucosa de ayuno de los animales diabéticos en reposo. En ratones diabéticas, la STZ induce la apoptosis de las células ß-pancreáticas²⁹, lo que inhibe la secreción de insulina. También es posible que haya habido un aumento en la secreción de glucagón de dichos animales³⁰ y su acción contrarreguladoras haya ayudado en el mantenimiento de la hiperglucemia. Nuestros resultados son consistentes con los de otros estudios^7,11-14,31, aunque estos utilizaron diferentes protocolos de ejercicio (es decir, cinta de correr). Por otro lado, algunos estudios demostraron que el ejercicio fue capaz de mejorar el metabolismo de la glucosa en ratones diabéticos^32,33. Probablemente, la falta de consenso entre los resultados de estos estudios se debe al uso de diferentes procedimientos metodológicos.

Los animales diabéticos presentaron características poliuria y polidipsia, características de la diabetes, pero a pesar de la alimentación normal, sin restricciones de alimentos [por ejemplo, el consumo semanal de alimentos (diabéticos: 199,47 ± 3,55 g vs controles: 194,36 ± 4,4 g)], hubo libre circulación dentro de la caja de alojamiento (grupo DS) y se ejercitaron (grupo DE), no ganaron tanto peso como los controles no diabéticos. Los menores pesos corporales y ventriculares de los animales diabéticos indicaron que ellos tuvieron el crecimiento perjudicado. En ratones con diabetes inducida por STZ, además de la secreción de insulina, la secreción de hormonas tales como la hormona del crecimiento, el glucagón, el polipéptido pancreático y, en consecuencia, el factor de crecimiento similar a la insulina, se alteran y afectan al crecimiento^34-36. Se sabe también que la diabetes induce el aumento de la utilización de ácidos grasos y acelera el catabolismo proteico³⁷.

Sin embargo, el programa de natación utilizado fue incapaz de alterar significativamente el peso corporal de los pacientes diabéticos o no diabéticos, pero aumentó el peso absoluto de los ventrículos en los animales no diabéticos. Sin embargo, más importante, tanto la diabetes como el programa de natación aumentaron el peso relativo de los ventrículos en los animales diabéticos y el programa de natación aumentó este parámetro en los animales control no diabéticos, lo que demuestra la hipertrofia ventricular. La hipertrofia cardiaca inducida por la diabetes experimental (patológica) y por el ejercicio crónico (fisiológica) ha sido documentada en estudios prévios^{7, 14,17,31}.

La reducción en las dimensiones de los cardiomiocitos en los animales diabéticos con relación a los controles, observada en este estudio, es coherente con el menor peso del ventrículo presentado por los animales diabéticos. Sin embargo, el programa de natación utilizado aumentó el volumen de los cardiomiocitos de ratones diabéticos. Esto sugiere que la inhibición del crecimiento celular causada por la diabetes se vio afectada por el ejercicio físico aplicado y denota hipertrofia celular. De hecho, el aumento del peso relativo del ventrículo en los animales del grupo DE fue más pronunciado que en los animales CE (33,3% vs 31,5%, respectivamente).

Conclusión

Concluimos que el programa de entrenamiento de natación aplicado atenuó la disfunción contráctil de los cardiomiocitos del VI de los ratones con diabetes experimental. Estos resultados son relevantes para la comprensión a nivel celular, de los beneficios del ejercicio físico sobre la función contráctil del músculo cardíaco de las personas con diabetes tipo I.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

El presente estudio fue financiado por la FAPEMIG y por la Beca de productividad del CNPq (nivel 2).

Vinculación Académica

Este artículo forma parte de Disertación de Maestría de Márcia Ferreira da Silva, por la Universidade Federal de Viçosa.

Referencias