A titina é uma proteína sarcomérica gigante que se estende desde a linha Z até a linha M. Em razão de sua localização, representa um importante sensor biomecânico com um papel fundamental na manutenção da integridade estrutural do sarcômero. A titina funciona como uma "mola bidirecional" que regula o comprimento sarcomérico e realiza ajustes adequados da tensão passiva sempre que o comprimento varia. Dessa forma, não só determina a rigidez ventricular e a função diastólica, como também influencia a função cardíaca sistólica, modulando o mecanismo de Frank-Starling. O miocárdio expressa duas isoformas dessa macromolécula: a N2B, mais rígida, e a isoforma N2BA, mais complacente. As alterações na expressão relativa das duas isoformas da titina ou alterações do seu estado de fosforilação têm sido implicadas na fisiopatologia de várias doenças como a insuficiência cardíaca diastólica, a cardiomiopatia dilatada, a cardiomiopatia isquêmica e a estenose aórtica. Neste artigo pretende-se descrever sumariamente a estrutura e localização da titina, a sua relação com diferentes cardiomiopatias, e compreender de que forma as alterações dessa macromolécula influenciam a fisiopatologia da insuficiência cardíaca diastólica, salientando o potencial terapêutico da manipulação dessa macromolécula.
Serviço de Fisiologia Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal
A titina é uma proteína sarcomérica gigante que se estende desde a linha Z até a linha M. Em razão de sua localização, representa um importante sensor biomecânico com um papel fundamental na manutenção da integridade estrutural do sarcômero. A titina funciona como uma "mola bidirecional" que regula o comprimento sarcomérico e realiza ajustes adequados da tensão passiva sempre que o comprimento varia. Dessa forma, não só determina a rigidez ventricular e a função diastólica, como também influencia a função cardíaca sistólica, modulando o mecanismo de Frank-Starling.
O miocárdio expressa duas isoformas dessa macromolécula: a N2B, mais rígida, e a isoforma N2BA, mais complacente. As alterações na expressão relativa das duas isoformas da titina ou alterações do seu estado de fosforilação têm sido implicadas na fisiopatologia de várias doenças como a insuficiência cardíaca diastólica, a cardiomiopatia dilatada, a cardiomiopatia isquêmica e a estenose aórtica.
Neste artigo pretende-se descrever sumariamente a estrutura e localização da titina, a sua relação com diferentes cardiomiopatias, e compreender de que forma as alterações dessa macromolécula influenciam a fisiopatologia da insuficiência cardíaca diastólica, salientando o potencial terapêutico da manipulação dessa macromolécula.
A titina, descrita inicialmente como conectina, é uma proteína gigante com grande elasticidade e que pode ser encontrada apenas nos músculos cardíaco e esquelético. Estruturalmente, está localizada no interior dos sarcômeros, onde se liga a, e interage com, outras importantes proteínas miofilamentares, nomeadamente com a actina e a miosina.
Na última década, tem sido demonstrado que a titina é uma proteína estruturalmente complexa que desempenha um papel importante no funcionamento do músculo estriado, particularmente do músculo cardíaco. Entre as suas diversas ações destaca-se seu papel na manutenção da estrutura e arquitetura do sarcômero permitindo o correto alinhamento dos miofilamentos de actina e miosina, bem como sua função "elástica", que permite a regulação do comprimento e da distensibilidade do sarcômero, influenciando, desse modo, não só a função cardíaca diastólica, como também a função sistólica pela lei de Frank-Starling.
com este artigo de revisão pretendemos rever a estrutura e as principais ações fisiológicas da titina, nomeadamente a sua importância na determinação da função cardíaca diastólica e sistólica e as implicações das alterações nessa macromolécula na fisiopatologia da insuficiência cardíaca (IC).
A titina é a maior proteína encontrada nos mamíferos, variando entre 2970 e 3700 kD, dependendo da isoforma1. É codificada por um único gene, localizado no braço longo do cromossoma 2, na região 2q31, constituído por 363 exões. No coração, a titina possui duas isoformas, N2B e N2BA, que são geradas por
A titina é constituída majoritariamente por dois tipos de domínios: uns semelhantes à fibronectina-3 (chamados domínios Fn3), e outros semelhantes à imunoglobulina (domínios Ig). Além desses domínios, a titina contém ainda um domínio cínase, localizado próximo do terminal carboxilo, e várias regiões de sequência única1-3 (
A titina é uma proteína intrassarcomérica, com cerca de 1 µm de comprimento, que se estende desde a linha Z até à linha M2. Desse modo, a titina abrange quatro zonas do sarcômero, pelo que tradicionalmente é dividida em quatro regiões distintas designadas respectivamente de região da linha M, da banda A, da banda I e da linha Z (
A principal característica da titina é a sua elevada elasticidade, que lhe permite distender-se e encurtar-se regulando assim o comprimento do sarcômero e a função muscular. Para comprimentos sarcoméricos fisiológicos, a titina constitui o principal determinante da tensão passiva dos cardiomiócitos. E, para comprimentos suprafisiológicos, o colagênio da matriz extracelular adquire maior relevo2.
como foi referido anteriormente, as propriedades elásticas da titina devem-se sobretudo à região na banda I, já que, na banda A, a titina é praticamente inextensível7,8. A elasticidade da titina na região da banda I é conferida por uma estrutura molecular constituída por vários segmentos extensíveis, nomeadamente por um grande número de segmentos Ig, por um segmento PEVK e pela região N2 (
Na ausência de forças externas, os sarcômeros dos cardiomiócitos têm um tamanho de 1,9 µm, e nessas condições de repouso a titina está no seu estado contraído (
A titina é não só o principal determinante da tensão passiva em resposta ao estiramento, como funciona também como uma mola elástica bidirecional. Isso porque, pelo contrário, quando o comprimento do sarcômero é encurtado para valores inferiores ao comprimento de repouso, a titina também gera uma força elástica que tem uma direção contrária à da tensão passiva tradicional. Essa força, designada "força de restauração", permite o rápido restabelecimento do comprimento do sarcômero para os valores de repouso, empurrando o filamento grosso para longe da linha Z9.
No músculo cardíaco existem duas isoformas de titina: a isoforma N2B e a isoforma N2BA. A isoforma N2B é a mais pequena (2970 kDa) uma vez que na sub-região N2 é constituída apenas pelo elemento N2B. Por sua vez, a isoforma N2BA tem maiores dimensões (3200 a 3400 kDa) e contém ambos os elementos: N2B e N2A. No ser humano, em cada metade do sarcômero estão presentes as isoformas N2BA e N2B, numa razão aproximada de 30/7010.
A isoforma N2BA possui mais um elemento extensível na região da banda I, pelo que essa isoforma é mais distensível e menos rígida que a N2B (
Os principais determinantes da função cardíaca diastólica são o relaxamento do miocárdio e as propriedades passivas do ventrículo. Enquanto o relaxamento miocárdico é modulado pela carga, pela inativação (associada à cinética do cálcio e à dissociação dos miofilamentos) e pela não uniformidade da parede ventricular, as propriedades passivas miocárdicas são influenciadas pela rigidez miocárdica, pela espessura da parede do ventrículo esquerdo e pela geometria das câmaras cardíacas12.
A disfunção diastólica é causada por uma lentificação do relaxamento miocárdico e/ou por alterações das propriedades passivas do ventrículo, nomeadamente pelo aumento da rigidez ventricular12.
O aumento da rigidez ventricular pode ser causado por alterações das características intrínsecas dos próprios cardiomiócitos - como por modificações na constituição das proteínas do citosqueleto ou então das proteínas endosarcoméricas (como alterações na titina ou na alfa-actinina) - ou por alterações da constituição da matriz extracelular, nomeadamente pelo aumento da rede de colagêneo e fibrose extracelular12.
A titina é um importante determinante da função diastólica, uma vez que influencia a rigidez do cardiomiócito e, dessa forma, as propriedades passivas do ventrículo. como foi visto anteriormente, atendendo à sua localização estratégica no sarcômero, e às suas propriedades elásticas únicas, a titina é o principal determinante da tensão passiva do cardiomiócito, para comprimentos fisiológicos do sarcômero7,13, sendo a contribuição relativa dos filamentos intermédios e dos microtúbulos inferior a 10%14. Para comprimentos superiores a 2,3 mm, dificilmente atingidos no coração intato, a tensão passiva passa a ser determinada essencialmente pelo colagênio e pela matriz extracelular7,11.
A importância da titina na determinação da função diastólica tem impacto no nível fisiopatológico, uma vez que, como veremos mais à frente, foi demonstrado que doentes com IC diastólica apresentam uma alteração na proporção relativa das isoformas da titina, com aumento da isoforma N2B (mais rígida) o que parece explicar o aumento da rigidez ventricular observado nesses doentes15.
A titina não determina apenas a rigidez ventricular. como foi referido anteriormente, a titina possui propriedades elásticas que funcionam de forma bidirecional, ou seja, se por um lado gera tensão passiva quando o músculo é estirado, por outro, quando há encurtamento do sarcômero, a titina gera uma "força de restauração", que tem uma direção oposta à da tensão passiva e permite uma rápida recuperação do comprimento de repouso do sarcômero9.
Em termos hemodinâmicos, essa "força de restauração" gerada pela titina permite aumentar a velocidade de relaxamento ventricular e permite a formação de um fenômeno de "sucção ventricular". Essa força permite aumentar o enchimento ventricular, sobretudo na fase inicial da diástole, o que pode ser particularmente importante nas situações de exercício físico ou outras situações de taquicardia16.
Além disso, ainda antes do início da diástole, a titina intervém também na determinação do fim da contração miocárdica, um processo que também é dependente do comprimento do sarcômero. Na verdade, quando há o encurtamento do sarcômero para valores inferiores ao comprimento de repouso a titina vai facilitar o processo de desativação das pontes cruzadas, influenciando e determinando o fim da contração muscular9,16.
A titina é um importante determinante da função cardíaca diastólica mas influencia também a função sistólica, pelo efeito que exerce na modulação da relação de Frank-Starling17.
Segundo a Lei de Frank-Starling, o aumento da pré-carga, ou seja, o aumento do volume telediastólico melhora a função sistólica originando um aumento do volume de ejeção. A titina, como determinante da rigidez ventricular e das propriedades passivas do ventrículo, influencia a relação pressão-volume telediastólica e, assim, o enchimento ventricular e o volume telediastólico18.
Em nível celular, o mecanismo de Frank-Starling é explicado pela ocorrência de um aumento da sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+ em resposta ao aumento do comprimento do sarcômero19. A titina desempenha um papel fundamental na regulação desse mecanismo, uma vez que a tensão passiva exercida pela titina determina diretamente o aumento da sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio17,20,21. Além disso, a titina, como elemento estrutural do filamento grosso na região da banda A, é também capaz de influenciar diretamente a ligação entre os miofilamentos de actina e miosina, conforme o comprimento do sarcômero. Ou seja, quando aumenta o comprimento do sarcômero a titina parece potenciar a ligação entre os filamentos de actina e de miosina, com o consequente aumento da força de contração22. Desse modo, a titina é capaz de "potenciar" o ciclo das pontes cruzadas quando o sarcômero é estirado, e que quando ele é encurtado para dimensões abaixo do seu comprimento de repouso, a titina é também capaz de inibir a formação das pontes cruzadas16.
Além da sua função estrutural e elástica, a titina funciona também como um sensor biomecânico. Dada a sua capacidade de distender e encurtar, a titina é sensível ao grau de estiramento do cardiomiócito6,23 sendo depois capaz de transmitir esse sinal biomecânico pela ligação e interação que estabelece com várias proteínas estruturais e sinalizadoras. Essa sinalização ocorre sobretudo em três regiões principais: na linha Z, na parte central da banda I e na linha M1,6,23.
Na região da linha Z a titina liga-se à proteína teletonina (T-cap), que funciona como um local de interligação entre a titina e várias outras moléculas estruturais e de ligação23,24. Entre essas moléculas encontram-se proteínas presentes nos túbulos T e no retículo sarcoplasmático (RS), nomeadamente a anquirina 1 (sANK 1), a obscurina (RS) e canais de potássio (minK/isk). Dessa forma, a titina intervém não só na manutenção da estrutura do sarcômero, como também da estrutura e correta organização dos túbulos T e do retículo sarcoplasmático23,24.
Na região da linha Z formam-se complexos de proteínas que funcionam como sinalizadores de tensão e que respondem tanto à força passiva, gerada pelos filamentos de titina durante o estiramento, como à força ativa, transmitida pelos filamentos de actina23,24. Nesse nível, existem várias proteínas que ao interagirem com a titina participam em seguida em cascatas de sinalização intracelular, promovendo a expressão de genes envolvidos na remodelagem cardíaca. Uma dessas proteínas é a MLP (muscle LIM proteín - membro da família de proteínas LIM), tendo sido mesmo observado que mutações pontuais dessa proteína podem participar no desenvolvimento quer da cardiomiopatia hipertrófica, quer da cardiomiopatia dilatada24. Contudo, não está ainda estabelecido o mecanismo pelo qual a titina, interagindo com a MLP, é capaz de regular a transcrição genética. Aparentemente, quando durante o estiramento se geram tensões elevadas no nível da linha Z, ocorre a separação entre as ligações entre a titina e o MLP que, uma vez livre, migra para o núcleo, onde vai promover a transcrição de vários genes envolvidos na remodelagem cardíaca24.
No nível da região central da banda I, os elementos N2B e N2BA funcionam como os locais de ligação da titina a diversas proteínas sinalizadoras. A sequência única N2B, exclusiva do músculo cardíaco, liga-se, por intermédio de um membro da família de proteínas LIM (proteínas que contêm domínios LIM - arranjo de oito resíduos de cisteína e histidina na configuração (C-X2-C-X16/23-H-X2 -C-X2-C-X2-C-X16/21 -C-X2/3-C/D/H)) conhecido como DRAL/FHL 2, a diversas enzimas metabólicas. Em estados de maior necessidade energética a função do DRAL/FHL 2 como ponte de ligação entre a titina e enzimas como a creatinina cínase ou a cínase do adenilato adquire uma importância crescente aumentando o aporte de ATP24.
Os ligandos da titina na região da banda I, assim como as proteínas a eles associadas, também são encontrados no núcleo, onde funcionam como reguladores da transcrição e do ciclo celular, podendo também estar envolvidos nas alterações das propriedades passivas do cardiomiócito em longo prazo1. É o exemplo da interação com a obscurina, uma proteína com diversos domínios de sinalização. Esse complexo titina-obscurina responde ao estiramento do sarcômero, estando envolvido na reestruturação sarcométrica que ocorre por exemplo na adaptação muscular e na insuficiência cardíaca2.
A região da titina adjacente à linha M também possui locais potencialmente envolvidos na sensibilidade dos miofilamentos para o Ca2+ e participa extensamente nos mecanismos de sinalização intracelular2,23.
Para além das funções já referidas, começa a investigar-se o envolvimento da titina no processo de dobragem de proteínas, na regulação de expressão de genes e na regulação de vários canais iônicos23.
Além disso, a titina é ainda importante no processo de miofibrilogênese formando uma espécie de molde estrutural para a correta disposição e organização dos filamentos de actina e miosina25. A perda da titina origina uma organização anormal do sarcômero como foi demonstrado recentemente26.
A titina funciona no sarcômero como um elemento dinâmico, cujas funções podem ser moduladas, quer em curto, quer em longo prazos, por diversos fatores, o que permite ao miocárdio modificar a sua elasticidade em razão das diversas alterações hemodinâmicas a que está sujeito11,27.
como é demonstrado na
O segmento N2B da titina cardíaca pode ser fosforilado pela proteína cínase A (PKA) originando uma diminuição da sua tensão passiva (
A ativação da PKA que ocorre, por exemplo, após a estimulação beta-adrenérgica constitui um dos principais mecanismos de regulação fisiológica em curto prazo da distensibilidade da titina. É sabido que a estimulação simpática, para além dos seus efeitos cronotrópico e inotrópico positivo, é também capaz de melhorar a função diastólica, aumentando não só a velocidade de relaxamento ventricular, mas também a complacência ventricular. Este último efeito depende, entre outros fatores, da fosforilação da isoforma N2B da titina pela PKA27,32,33.
Os efeitos da fosforilação da isoforma N2B pela PKA também se repercutem no nível na fase final da sístole, uma vez que a diminuição da rigidez do cardiomiócito vai conduzir também a uma diminuição da força de restauração dos cardiomiócitos31. Esse efeito, teoricamente pouco benéfico, pode ser contraposto pelo fato de a PKA acelerar a velocidade de relaxamento do miocárdio, por meio da fosforilação simultânea do fosfolamban e da troponina34. São necessários mais estudos para compreender o papel da fosforilação da titina na função cardíaca.
Muito recentemente foi também demonstrado que quer a proteína cínase G (PKG)35,36, quer a isoforma alfa da proteína cínase C (PKC)37 promovem igualmente a fosforilação da titina. No caso da PKG a fosforilação dá-se no segmento PEVK da isoforma N2B, levando a uma diminuição da tensão passiva cardiomiócitária35. Já no caso da fosforilação pela PKC, essa ocorre no segmento PEVK tanto da isoforma N2B como da N2BA e o efeito global dessa fosforilação é o aumento da tensão passiva35-37.
Em resumo, a titina funciona como uma "mola ajustável" que, por meio da fosforilação/desfosforilação sobretudo do seu segmento N2B, permite a adaptação da função ventricular às necessidades do organismo.
O Ca2+ tem um papel importante como regulador da distensibilidade do cardiomiócito, sobretudo em razão da modulação da interação entre a titina e os filamentos finos. Estudos revelam que o domínio PEVK na região extensível da isoforma N2B se liga à F-actina e que essa interação poderá contribuir para a rigidez passiva dos cardiomiócitos38. Embora o Ca2+ isoladamente não interfira nessa ligação, quando esse íon se encontra ligado à proteína S100A1, existente em elevadas concentrações no miocárdio, essa interação é inibida, diminuindo a rigidez do cardiomiócito. A observação do aumento da rigidez do músculo cardíaco paralelamente ao declínio da concentração de Ca2+ durante a diástole suporta esse mecanismo1,2,23,39.
como foi anteriormente referido, os cardiomiócitos expressam as duas isoformas da titina, permitindo-lhes atingir um nível intermediário de tensão passiva (
É importante referir que, por meio da alteração da proporção relativa das isoformas da titina, apenas são modificadas as propriedades elásticas da titina, não sendo alteradas as suas propriedades estruturais, uma vez que dessa forma só a porção da titina presente na banda I (ou seja, o componente distensível) é que sofre alterações11.
Em resumo, a função cardíaca pode ser alterada por alterações das propriedades elásticas da titina, que podem ocorrer tanto em curto como em longo prazos. Tal como podemos ver na
As alterações da titina estão envolvidas na fisiopatologia de algumas doenças cardíacas, nomeadamente na insuficiência cardíaca diastólica (ICD) e na cardiomiopatia dilatada (CMD). Há cada vez maior evidência de que as alterações na razão de expressão das duas isoformas da titina, bem como a alteração do seu estado de fosforilação estão na base do desenvolvimento e progressão dessas doenças.
Na disfunção diastólica ocorre uma lentificação do relaxamento do miocárdio e/ou um aumento da rigidez ventricular. Num ventrículo mais rígido, o aumento do volume de sangue durante a diástole só é conseguido à custa de um aumento das pressões de enchimento ventricular, com aumento da relação pressão-volume telediastólica, o que pode originar um quadro clínico de IC diastólica.
A titina, como principal determinante da tensão passiva do cardiomiócito, determina a rigidez ventricular. como foi demonstrado recentemente, os cardiomiócitos extraídos de biopsias endomiocárdicas de doentes com ICD exibiam um aumento relativo da expressão da isoforma mais rígida da titina, N2B. Observou-se que, enquanto num coração humano saudável a razão N2BA/N2B normal é de cerca de 30/7010, nos doentes com ICD essa relação era de 17/83; e na IC sistólica a razão foi de 35/6515. Porém, esse mesmo grupo demonstrou recentemente que a hipofosforilação do segmento N2B da titina parece contribuir mais significativamente para o aumento da tensão passiva verificada nos casos de ICD41.
Em doentes com cardiomiopatia dilatada e remodelagem excêntrica foi observada uma alteração da relação entre as isoformas da titina, mas aqui com um aumento relativo da isoforma mais distensível, a N2BA10.
Numa fase inicial da insuficiência cardíaca sistólica, alterações das isoformas da titina podem funcionar como um mecanismo de adaptação, uma vez que o aumento da complacência ventricular permite um aumento do volume telediastólico, e consequentemente um aumento do débito cardíaco de acordo com o mecanismo de Frank-Starling32. Além disso, prevê-se que a menor força de restauração desenvolvida pelos cardiomiócitos durante a sístole (em razão do aumento da proporção da isoforma mais complacente) permitiria uma diminuição do volume telessistólico final para qualquer pós-carga. Essa diminuição ocorreria pelo decréscimo da resistência ao encurtamento do cardiomiócito, aumentando assim o volume de ejeção. De fato, está provado que indivíduos com maior proporção de N2BA têm melhor tolerância ao exercício em razão do aumento da pressão venosa de oxigênio10. Esse efeito teoricamente benéfico acaba por não ocorrer na prática, uma vez que, na IC sistólica, a relação de Frank-Strarling está alterada em consequência da diminuição da sensibilidade dos miofilamentos para o Ca2+, em razão, nomeadamente, do menor desenvolvimento de tensão passiva na presença de um aumento da isoforma N2BA10. Finalmente, no coração insuficiente pode ocorrer um aumento da degradação da titina, o que poderá igualmente contribuir para a atenuação do mecanismo de Frank-Starling42. Além disso, esse processo torna-se posteriormente desadaptativo, uma vez que o aumento do volume telediastólico do ventrículo origina mais estresse sobre as paredes ventriculares, estimulando e agravando o processo de remodelagem cardíaca13,32,43.
Também na cardiomiopatia isquêmica ocorre um aumento da razão N2BA/N2B, apesar de geralmente ocorrer um aumento da rigidez ventricular44. Essa observação, aparentemente paradoxal, pode ser explicada pelo fato de, nessa situação, o aumento da rigidez ventricular ser devido não a alterações a nível dos cardiomiócitos, mas a alterações na matriz extracelular com aumento da fibrose miocárdica. Aqui, o aumento da isoforma N2BA da titina (menos rígida) pode mesmo ser um mecanismo de compensação ao aumento da rigidez ventricular secundário ao processo de fibrose. Na verdade, na cardiomiopatia isquêmica ocorre mesmo uma diminuição da tensão passiva de cada cardiomiócito, provavelmente em razão do aumento da isoforma N2BA10.
como abordado anteriormente, a titina pode também sofrer modulação da sua rigidez mediante alterações pós-translacionais, nomeadamente pela fosforilação do segmento N2B29. A titina pode ser fosforilada pela proteína cínase A (PKA) e pela proteína cínase G (PKG), levando a uma diminuição da sua rigidez28,29,31,35, induzindo assim, e de forma aguda, alterações em curto prazo na rigidez ventricular.
Essas descobertas são particularmente relevantes, uma vez que podem inclusivamente ser alvo de intervenção terapêutica nos doentes com insuficiência cardíaca. Na verdade, o tratamento com PKA de cardiomiócitos extraídos de doentes com IC diastólica permitiu uma redução da sua tensão passiva, para valores semelhantes aos dos indivíduos controle30. Essa diminuição da tensão passiva foi diretamente proporcional à rigidez inicial dos cardiomiócitos, o que é concordante com a ideia de que o aumento da rigidez cardíaca está diretamente relacionado não só com alterações da expressão relativa das isoformas, como também do estado de hipofosforilação da isoforma rígida da titina. Tal como seria de esperar pela menor rigidez dos cardiomiócitos provenientes de doentes com IC sistólica, o mesmo tratamento com PKA não causou uma queda tão significativa da tensão passiva15.
Tanto a estenose aórtica como a cardiomiopatia hipertensiva apresentam disfunção diastólica, mas apenas na última se verifica um aumento substancial da rigidez miocárdica. Em ambas os casos, a expressão relativa das isoformas N2BA/N2B, assim como o seu grau de total de fosforilação são semelhantes. Contudo, na cardiomiopatia hipertensiva observou-se uma hipofosforilação relativa da isoforma mais rígida, a N2B, tendo sido proposto como o mecanismo subjacente ao aumento da rigidez miocárdica e disfunção diastólica nessa doença40,45.
Também na cardiomiopatia dilatada parecem ocorrer alterações na fosforilação da titina. Nesses doentes foi observada uma diminuição da atividade da PKA cardíaca, que poderá ser um mecanismo compensador, em resposta à elevada complacência observada nos cardiomiócitos desses doentes13.
Em resumo, a titina, por meio da modificação da expressão das suas isoformas e/ou do seu estado de fosforilação, parece ser um elemento-chave na fisiopatologia de várias doenças cardíacas. Além disso, a titina pode ainda ser um potencial alvo de manipulação farmacológica constituindo assim um novo alvo terapêutico, sobretudo na insuficiência cardíaca.
Os autores agradecem a preciosa ajuda de Pedro Daniel Miranda Couto na preparação das figuras.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi parcialmente financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Correspondência: Ricardo Luís Castro Silva Ferreira Serviço de Fisiologia, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Alameda Prof. Hernâni Monteiro - 4200-219 - Porto E-mail:
Artigo recebido em 16/09/09; revisado recebido em 05/11/09; aceito em 26/01/10.
Titin is a giant sarcomeric protein that extends from the Z-line to the M-line. Due to its location, it represents an important biomechanical sensor, which has a crucial role in the maintenance of the sarcomere structural integrity. Titin works as a "bidireactional spring" that regulates the sarcomeric length and performs adequate adjustments of passive tension whenever the length varies. Therefore, it determines not only ventricular rigidity and diastolic function, but also systolic cardiac function, modulating the Frank-Starling mechanism. The myocardium expresses two isoforms of this macromolecule: the N2B, more rigid and the isoform N2BA, more compliant. The alterations in the relative expression of the two titin isoforms or alterations in their state of phosphorylation have been implicated in the pathophysiology of several diseases, such as diastolic heart failure, dilated cardiomyopathy, ischemic cardiomyopathy and aortic stenosis. The aim of this study is to describe, in brief, the structure and location of titin, its association with different cardiomyopathies and understand how alterations in this macromolecule influence the pathophysiology of diastolic heart failure, emphasizing the therapeutic potential of the manipulation of this macromolecule.
Serviço de Fisiologia Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal
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Titin is a giant sarcomeric protein that extends from the Z-line to the M-line. Due to its location, it represents an important biomechanical sensor, which has a crucial role in the maintenance of the sarcomere structural integrity. Titin works as a "bidireactional spring" that regulates the sarcomeric length and performs adequate adjustments of passive tension whenever the length varies. Therefore, it determines not only ventricular rigidity and diastolic function, but also systolic cardiac function, modulating the Frank-Starling mechanism.
The myocardium expresses two isoforms of this macromolecule: the N2B, more rigid and the isoform N2BA, more compliant. The alterations in the relative expression of the two titin isoforms or alterations in their state of phosphorylation have been implicated in the pathophysiology of several diseases, such as diastolic heart failure, dilated cardiomyopathy, ischemic cardiomyopathy and aortic stenosis.
The aim of this study is to describe, in brief, the structure and location of titin, its association with different cardiomyopathies and understand how alterations in this macromolecule influence the pathophysiology of diastolic heart failure, emphasizing the therapeutic potential of the manipulation of this macromolecule.
Titin, initially described as connectin, is a giant protein of great elasticity that can be found only in the cardiac and skeletal muscles. Structurally, it is located within the sarcomeres, where it binds to and interacts with other important myofilament proteins, namely actin and myosin.
In the last decade, it has been demonstrated that titin is a structurally complex protein that has an important role in striated muscle action, particularly in the cardiac muscle. Among its several actions, its role in the maintenance of the structure and architecture of the sarcomere is emphasized, allowing the correct alignment of actin and myosin myofilaments, as well as its "elastic" function, which allows the regulation of the length and distensibility of the sarcomere, thus influencing not only the cardiac diastolic function, but also the systolic function by the Frank-Starling law.
The present review article intends to review the structure and main physiological actions of titin, namely its importance in determining the diastolic and systolic cardiac function and the implications of alterations in this macromolecule in the pathophysiology of heart failure (HF).
Titin is the largest protein found in mammalians, varying from 2970 and 3700 kD, depending on the isoform1. It is encoded by a single gene, located on the long arm of chromosome 2 in the 2q31 region, consisting of 363 exons. In the heart, titin has two isoforms, N2B and N2BA, which are generated by alternative splicing1.
Titin is constituted mostly by two types of domains: fibronectin type III-like (called Fn-3 domains) domains and immunoglobulin-like (Ig) domains (Ig domains). In addition to these domains, titin also contains a kinase domain, located close to the carboxyl-terminal and several unique-sequence regions1-3 (
Titin is an intrasarcomeric protein, around 1 µm in length, which extends from the Z-line to the M-line2. Thus, titin encompasses four sarcomere zones, due to which it is traditionally divided in distinct regions, called respectively M-line region, A-band region, I-band region and Z-line region (
As described next, titin interacts with other proteins in the Z-line region, being also involved in mechanisms of intracellular signaling, functioning as a biomechanical sensor4. The A-band region contains the majority of the titin molecule, which, in this region, is formed by single repeats of Ig and Fn3 domains and represents a component that constitutes the thick filament (
The main characteristic of titin is its high degree of elasticity, which allows it to stretch and shorten, thus regulating the sarcomere length and muscle function. Titin constitutes the main determinant of passive tension of cardiomyocytes for physiological sarcomeric lengths, whereas, for supraphysiological lengths, the extracellular matrix collagen becomes more important2.
As mentioned before, the elastic properties of titin are mainly due to the I-band region, as in the A-band region titin is practically inextensible7,8. The elasticity of titin in the I-band region is given by a molecular structure constituted by several extensible segments, namely by a large number of Ig segments, a PEVK segment and the N2 region (
In the absence of external forces, the cardiomyocyte sarcomeres are 1.9 µm in length and, in these resting conditions, titin is in the contracted state (
With the progressive stretching of the sarcomere, initially the Ig sequence stretches due to the elongation of the binding between the different Ig domains. The PEVK segments only start to elongate at 2.15 µm, and, subsequently, the N2 segments, especially due to the unfolding of its domains8. It is this complex behavior observed in the extensible region of titin that makes the passive tension-length curve of sarcomere non-linear, that is, as it can be observed in
Titin is not only the main determinant of passive tension in response to stretching, but also functions as a two-directional elastic coil. That happens because, on the contrary, when the sarcomere length is shortened to lengths that are lower than the resting length, titin also generates an elastic force that has a contrary direction to that of the traditional passive tension. This force, called "restoring force", allows the rapid re-establishment of the sarcomere length to the resting values, pushing the thick filament away from the Z-line9.
There are two titin isoforms in the cardiac muscle: the N2B isoform and the N2BA isoform. The N2B is the smaller of the two (2970 kDa) as in the N2 sub-region it is constituted only by the N2B element. In turn, the N2BA isoform is larger (3200 to 3400 kDa) and contains both elements: N2B and N2A. In humans, the N2BA and the N2B isoforms are present in each half of the sarcomere, at a ratio of approximately 30/7010.
The N2BA isoform has one more extensible element in the I-band region, and thus, this isoform is more distensible and less rigid than the N2B isoform (
The main determinants of diastolic cardiac function are the myocardial relaxation and passive ventricular properties. Whereas the myocardial relaxation is modulated by load, by inactivation (associated to calcium kinetics and myofilament dissociation) and by the non-uniformity of the ventricular wall, the myocardial passive properties are influenced by the myocardial rigidity, by the left ventricular wall thickness and by the geometry of the cardiac chambers12.
The diastolic dysfunction is caused by myocardial relaxation retardation and/or alterations in the passive properties of the ventricle, namely by the increase in the ventricular rigidity12.
The increase in ventricular rigidity can be caused by alterations in the intrinsic characteristics of the cardiomyocytes - such as modifications in the constitution of cytoskeleton proteins or the endosarcomeric proteins (such as alterations in titin or alpha-actinin) - or by alterations in the constitution of the extracellular matrix, namely by the increase in the collagen network and extracellular fibrosis12.
Titin is an important determinant of diastolic function, as it influences the cardiomyocyte rigidity, and thus, the passive properties of the ventricle. As seen before, due to its strategic location in the sarcomere and its unique elastic properties, titin is main determinant of passive tension of the cardiomyocyte, for physiological sarcomere lengths7,13, with the relative contribution of the intermedial filaments and microtubules being < 10%14. For lengths above 2.3 µm, which are rarely achieved in an intact heart, the passive tension starts to be determined essentially by collagen and the extracellular matrix7,11.
The importance of titin in determining the diastolic function has an impact at the pathophysiological level, considering that, as it will be shown next, it has been demonstrated that patients with diastolic HF present an alteration in the relative proportion of titin isoforms, with an increase in the N2B isoform (more rigid), which seems to explain the increase in the ventricular rigidity observed in these individuals15.
Titin does not only determine ventricular rigidity. As mentioned before, titin also has elastic properties that function in a two-directional fashion, that is, if on the one hand it generates passive tension when the muscle is stretched, on the other hand, when the sarcomere shortens, titin generates a "restoring force", which has an opposite direction to that of the passive tension and allows a rapid recovery of the resting length of the sarcomere9.
In hemodynamic terms, this "restoring force" generated by titin allows the increase in the velocity of the ventricular relaxation and the formation of a "ventricular suction" phenomenon. This force allows the increase in the ventricular filling, especially in the initial diastolic phase, which can be particularly important in situations of physical exertion or other tachycardic situations16.
Moreover, even before the start of the diastole, titin also has an effect by determining the end of the myocardial contraction, a process that is also dependent on the sarcomere length. In fact, when the sarcomere shortens to values lower than the resting length, titin will facilitate the process of deactivation of the cross-bridges, influencing and determining the end of the muscle contraction9,16.
Titin is an important determinant of the diastolic cardiac function, but it also influences the systolic function, through the effect it has on the Frank-Starling relationship17.
According to the Law of Frank-Starling, the increase in preload, i.e., the increase in the telediastolic volume improves the systolic function, originating an increase in the ejection volume. Titin, as a determinant of ventricular rigidity and of the passive ventricular properties, influences the telediastolic pressure-volume relationship and thus, the ventricular filling and telediastolic volume18.
At cellular level, the Frank-Starling mechanism is explained by the increase in the sensitivity of the Ca2+ filaments in response to the increase in sarcomere length19. Titin has a fundamental role in the regulation of this mechanism, as the passive tension exercised by titin directly determines the increase in the sensitivity of the calcium myofilaments17,20,21. Moreover, titin, as the structural element of the thick filament in the region of the A-band, is also capable of directly influencing the binding between the actin and myosin filaments, according to the sarcomere length. That is, when the sarcomere length increases, titin seems to potentiate the binding between the actin and the myosin filaments, with the consequent increase in the contraction force22. Therefore, titin is capable of potentiating the cycle of cross-bridges when the sarcomere is stretched and when it is shortened to lengths below that of the resting length, titin is also capable of inhibiting the formation of cross-bridges16.
In addition to its structural and elastic function, titin also functions as a biomechanical sensor. Given its capacity to stretch and shorten, titin is sensitive to the degree of stretching of the cardiomyocyte6,23, being then capable of transmitting this biomechanical signal by binding and interacting with several structural and signaling proteins. This signaling occurs mostly in three main regions: the Z-line, the central part of the I-band and the M-line1,6,23
In the region of the Z-line, titin binds to the protein teletonin (T-cap), which functions as a place of interconnection between titin and several other structural and binding molecules23,24. Among these molecules are the proteins present in the T tubules and the sarcoplasmic reticulum (SR), namely ankyrin-1 (sANK 1), obscurin (RS) and potassium channels (minK/isk). Therefore, titin influences not only the maintenance of the sarcomere structure, but also the structure and correct organization of T tubules and the sarcoplasmic reticulum23,24.
Protein complexes are formed in the Z-line region, which function as tension signalers and that respond both to the passive force, generated by the titin filaments during stretching and the active force, transmitted by the actin filaments23,24. At this level, there are several proteins that, by interacting with titin, participate in intracellular signaling cascades, promoting the expression of genes involved in cardiac remodeling. One of these proteins is the MLP (muscle LIM protein - a member of the LIM protein family) and it has been observed that point mutations of this protein can participate in the development of hypertrophic cardiomyopathy, as well as of dilated cardiomyopathy24. However, the mechanism by which titin, interacting with MLP, is capable of regulating genetic transcription has yet to be established. Apparently, when elevated tensions are generated at the level of the Z-line during the stretching, the separation between the titin and MLP binding occurs and the latter, once free, migrates to the nucleus, where it promotes the transcription of several genes involved in cardiac remodeling24.
At the level of the central region of the I-band, the N2B and N2BA elements function as titin binding sites for several signaling proteins. The N2B-unique sequence, which is found exclusively in the cardiac muscle, binds, through a member of the LIM protein family (proteins that contain the LIM domains - an arrangement of eight cysteine and histidine residues in the configuration (C-X2-C-X16/23-H-X2 -C-X2-C-X2-C-X16/21 -C-X2/3-C/D/H)) known as DRAL/FHL 2, to several metabolic enzymes. In states of increased energy need, the function of DRAL/FHL 2 as binding agent between titin and enzymes such as kinase or adenylate kinase becomes increasingly important, increasing the ATP supply24.
The titin ligands in the I-band region, as well as the proteins associated to them, are also found in the nucleus, where they function as transcription and cell-cycle regulators and they can also be involved in the long-term alterations of the passive properties of cardiomyocytes1. An example is the interaction with obscurin, a protein with several signaling domains. This titin-obscurin complex responds to the sarcomere stretching and it is involved in the sarcomeric restructuring that occurs, for instance, in muscular adaptation and heart failure2.
The titin region adjacent to the M-line also has sites potentially involved in the sensitivity of myofilaments for Ca2+ and participates extensively in the intracellular signaling mechanisms2,23.
In addition to the aforementioned functions, the participation of titin in the process of protein folding, gene expression regulation and several ion channel regulation has started to be investigated23.
Moreover, titin is also important in the process of myofibrillogenesis, forming a type of a structural mold for the correct disposition and organization of actin and myosin filaments25. The loss of titin originates an abnormal organization of the sarcomere, as recently demonstrated26.
Titin functions in the sarcomere as a dynamic element, which can be modulated, either at short or long-term, by several factors, allowing the myocardium to modify its compliance in response to the numerous hemodynamic alterations that it is subjected to11,27. As shown in
The N2B segment of cardiac titin can be phosphorylated by the protein kinase A (PKA), originating a decrease in its passive tension (
The activation of PKA that occurs, for instance, after the beta-adrenergic stimulation, constitutes one of the main mechanisms of short-term physiological regulation of titin distensibility. It is known that the sympathetic stimulation, in addition to its positive chronotropic and inotropic effects, is also capable of improving diastolic function, increasing not only the ventricular relaxation velocity, but also ventricular compliance. This latter effect depends, among other factors, on the phosphorylation of the titin N2B isoform by PKA27,32,33.
The effects of the phosphorylation of the N2B isoform by PKA are also present at the final phase of the systole, as the decrease in the cardiomyocyte rigidity will also lead to a decrease in the restoring force of cardiomyocytes31. This effect, which is, in theory, of little benefit, can be counterbalanced by the fact that PKA accelerates the myocardial relaxation velocity, through the simultaneous phosphorylation of phospholamban and troponin34. Further studies are necessary to understand the role of the phosphorylation of titin in cardiac function.
More recently, it has also been demonstrated that either the protein kinase G (PKG)35,36, or the alpha isoform of protein kinase C (PKC)37 equally promotes titin phosphorylation. In the case of PKG, the phosphorylation occurs in the PEVK segment of isoform N2B, leading to a decrease in the cardiomyocyte passive tension35. In the case of phosphorylation by PKC, that occurs in the PEVK segment of both N2B and N2BA isoforms and the global effect of this phosphorylation is the increase in passive tension35-37.
In summary, titin works as an "adjustable coil", which, through phosphorylation/dephosphorylation, especially of its N2B segment, allows the adaptation of ventricular function to the body's necessities.
The calcium ion (Ca2+) has an important role as regulator of cardiomyocyte distensibility, especially due to the modulation of the interaction between titin and the thin filaments. Studies have shown that the PEVK domain in the extensible region of the N2B isoform binds to F-actin and that this interaction can contribute to the passive rigidity of cardiomyocytes38. Although Ca2+ alone cannot interfere with this binding, when this ion binds to protein S100A1, which is found at high concentrations in the myocardium, this interaction is inhibited, decreasing the rigidity of the cardiomyocyte. The observation of the increase in rigidity of the cardiac muscle in parallel to the decrease in the concentration of Ca2+ during diastole supports this mechanism1,2,23,39.
As mentioned before, the cardiomyocytes express the two isoforms of titin, allowing them to reach an intermediate level of passive tension (
It is important to mention that the alteration in the relative proportion of titin isoforms only results in the modification of the elastic properties of titin, without altering its structural properties, as only the portion of titin present in the I-band (that is, the distensible component) undergoes alterations11.
In summary, cardiac function can be altered by alterations in the elastic properties of titin, which can occur in both short and long-term. As shown in
Titin alterations are involved in the pathophysiology of some cardiac diseases, namely diastolic heart failure (DHF) and dilated cardiomyopathy (DCM). There is increasing evidence that alterations in the expression ratio of the two titin isoforms, as well as the alteration in its phosphorylation status, are implicated in the development and progression of these diseases.
In diastolic dysfunction, myocardial relaxation retardation and/or an increase in ventricular rigidity occur. In a more rigid ventricle, the increase in blood volume during diastole is only achieved at the expense of an increase in the ventricular filling pressure, with an increase in the telediastolic pressure-volume relation, which can originate a clinical picture of diastolic HF.
Titin, as the main determinant of passive tension of the cardiomyocyte, determines ventricular rigidity. As recently demonstrated, the cardiomyocytes extracted from endomyocardial biopsies of patients with DHF exhibited a relative increase in the expression of the more rigid titin isoform, the N2B. It was observed that, whereas in a healthy heart the normal N2BA/N2B ratio is around 30/7010, in patients with DHF, this ratio was 17/83; and in systolic HF, the ratio was 35/6515. However, the same group has recently demonstrated that the hypophosphorylation of the N2B segment of titin seems to contribute more significantly for the increase in the passive tension verified in cases of DHF41.
An alteration in the ratio between titin isoforms was observed in patients with dilated cardiomyopathy and eccentric remodeling, but here with a relative increase in the expression of the more distensible isoform, N2BA10.
At the initial phase of systolic heart failure, alterations in the isoforms of titin can function as an adaptation mechanism, as the increase in the ventricular compliance allows an increase in the telediastolic volume, and, consequently, an increase in cardiac output, according to the Frank-Starling mechanism32. Moreover, it is predicted that the lower restoring force developed by the cardiomyocytes during systole (due to the increase in the proportion of the more compliant isoform) would allow a decrease in the final telesystolic volume for any afterload. This decrease would occur due to the reduction in the resistance to cardiomyocyte shortening, thus increasing the ejection volume. In fact, it has been demonstrated that individuals with a higher proportion of N2BA have better tolerance to exercise due to the increase in the oxygen venous pressure10. This effect, which is in theory beneficial, does not occur in practice, as in the systolic HF, the Frank-Starling mechanism is altered because of the decrease in the sensitivity of myofilaments for Ca2+, namely due to the lower development of passive tension in the presence of an increase in the N2BA isoform10. Finally, an increase in titin degradation can occur in the HF heart, which can equally contribute to the attenuation of the Frank-Starling mechanism42. Moreover, this process subsequently becomes deadaptive, as the increase in the ventricular telediastolic volume results in more stress on the ventricular walls, stimulating and aggravating the process of cardiac remodeling13,32,43.
An increase in the N2BA/N2B ratio also occurs in ischemic cardiomyopathy, although it generally occurs due to an increase in the ventricular rigidity44. This observation, apparently paradoxical, can be explained by the fact that, in this situation, the increase in ventricular rigidity is due not to alterations at the cardiomyocyte level, but to alterations in the extracellular matrix with an increase in myocardial fibrosis. Here, the increase in titin N2BA isoform (less rigid) can really be a mechanism of compensation to the increase in ventricular rigidity secondary to the fibrosis process. In fact, a decrease in the passive tension of each cardiomyocyte occurs even in ischemic cardiomyopathy, probably due to increase in the N2BA isoform10.
As mentioned before, titin can also undergo modulation of its rigidity in the presence of post-translational alterations, namely through the phosphorylation of the N2B segment29. Titin can be phosphorylated by the protein kinase A (PKA) and by the protein kinase G (PKG), leading to a decrease in its rigidity28,29,31,35, thus inducing short-term acute alterations in ventricular rigidity.
These findings are particularly relevant, as they can also be the target of therapeutic intervention in patients with HF. In fact, the treatment with PKA of cardiomyocytes extracted from patients with diastolic HF allowed a decrease in its passive tension to levels very similar to those found in control individuals30. This decrease in passive tension was directly proportional to the initial rigidity of the cardiomyocytes, which is in agreement with the idea that the increase in cardiac rigidity is directly related not only to alterations in the relative expression of the isoforms, but also to the state of hypophosphorylation of the rigid isoform of titin.
As expected, due to the lower rigidity of the cardiomyocytes from patients with systolic HF, the same treatment with PKA did not result in such a significant decrease in passive tension15.
Both aortic stenosis and hypertensive cardiomyopathy present diastolic dysfunction, but only the latter presents a substantial increase in myocardial rigidity. In both cases, the relative expression of the N2BA/N2B isoforms and their degree of total phosphorylation are similar. However, a relative hypophosphorylation of the more rigid isoform, N2B, was observed in hypertensive cardiomyopathy, which has been proposed as the underlying mechanism to the increase in myocardial rigidity and diastolic dysfunction in this disease40,45.
Alterations in titin phosphorylation seem to occur also in dilated cardiomyopathy. In these patients, a decrease in the cardiac PKA activity has been observed, which might be a compensating mechanism in response to the elevated compliance observed in the cardiomyocytes of these patients13.
In summary, titin, through the alteration in the expression of its isoforms and/or its phosphorylation state, seems to be a key element in the pathophysiology of several heart diseases. Moreover, titin can also be a potential target for pharmacological manipulation, thus constituting a new therapeutic target, mainly in heart failure.
The authors would like to thank the invaluable help of Pedro Daniel Miranda Couto in preparing the figures.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was partially funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia.
This study is not associated with any post-graduation program.
La titina es una proteína sarcomérica gigante que se extiende desde la línea Z hasta la línea M. En razón de su ubicación, representa un importante sensor biomecánico con un papel fundamental en la manutención de la integridad estructural del sarcómero. La titina funciona como un "resorte bidireccional" que regula el largo sarcomérico y realiza ajustes adecuados de la tensión pasiva siempre que ese largo varía. De esa forma, no sólo determina la rigidez ventricular y la función diastólica, sino también influye en la función cardíaca sistólica, modulando el mecanismo de Frank-Starling. El miocardio expresa dos isoformas de esa macromolécula: la N2B, más rígida, y la isoforma N2BA, más complaciente. Las alteraciones en la expresión relativa de las dos isoformas de la titina o alteraciones de su estado de fosforilación han sido implicadas en la fisiopatología de varias enfermedades como la insuficiencia cardíaca diastólica, la cardiomiopatía dilatada, la cardiomiopatía isquémica y la estenosis aórtica. Este artículo pretende describir sumariamente la estructura y ubicación de la titina, su relación con diferentes cardiomiopatías, y comprender de qué forma las alteraciones de esa macromolécula influyen en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca diastólica, destacando el potencial terapéutico de la manipulación de esa macromolécula.
Serviço de Fisiologia Faculdade de Medicina da Universidade do Porto - Portugal
Correspondencia
La titina es una proteína sarcomérica gigante que se extiende desde la línea Z hasta la línea M. En razón de su ubicación, representa un importante sensor biomecánico con un papel fundamental en la manutención de la integridad estructural del sarcómero. La titina funciona como un "resorte bidireccional" que regula el largo sarcomérico y realiza ajustes adecuados de la tensión pasiva siempre que ese largo varía. De esa forma, no sólo determina la rigidez ventricular y la función diastólica, sino también influye en la función cardíaca sistólica, modulando el mecanismo de Frank-Starling.
El miocardio expresa dos isoformas de esa macromolécula: la N2B, más rígida, y la isoforma N2BA, más complaciente. Las alteraciones en la expresión relativa de las dos isoformas de la titina o alteraciones de su estado de fosforilación han sido implicadas en la fisiopatología de varias enfermedades como la insuficiencia cardíaca diastólica, la cardiomiopatía dilatada, la cardiomiopatía isquémica y la estenosis aórtica.
Este artículo pretende describir sumariamente la estructura y ubicación de la titina, su relación con diferentes cardiomiopatías, y comprender de qué forma las alteraciones de esa macromolécula influyen en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca diastólica, destacando el potencial terapéutico de la manipulación de esa macromolécula.
La titina, descripta inicialmente como conectina, es una proteína gigante con gran elasticidad y que puede ser encontrada sólo en los músculos cardíaco y esquelético. Estructuralmente, está localizada en el interior de los sarcómeros, donde se une e interactúa con otras importantes proteínas miofilamentares, principalmente con la actina y la miosina.
En la última década, ha sido demostrado que la titina es una proteína estructuralmente compleja que desempeña un papel importante en el funcionamiento del músculo estriado, particularmente del músculo cardíaco. Entre sus diversas acciones se destaca su papel en la manutención de la estructura y arquitectura del sarcómero permitiendo el correcto alineamiento de los miofilamentos de actina y miosina, así como su función "elástica", que permite la regulación del largo y de la distensibilidad del sarcómero, influyendo, de ese modo, no sólo en la función cardíaca diastólica, sino también en la función sistólica por la ley de Frank-Starling.
Con este artículo de revisión pretendemos rever la estructura y las principales acciones fisiológicas de la titina, especialmente su importancia en la determinación de la función cardíaca diastólica y sistólica y las implicaciones de las alteraciones en esa macromolécula en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca (IC).
La titina es la mayor proteína encontrada en los mamíferos, variando entre 2970 y 3700 kD, dependiendo de la isoforma1. Es codificada por un único gen, ubicado en el brazo largo del cromosoma 2, en la región 2q31, constituido por 363 exones. En el corazón, la titina posee dos isoformas, N2B y N2BA, que son generadas por
La titina está constituida mayoritariamente por dos tipos de dominios: unos semejantes a la fibronectina-3 (llamados dominios Fn3), y otros semejantes a la inmunoglobulina (dominios Ig). Además de esos dominios, la titina contiene aun un dominio kinasa, ubicado próximo al terminal carboxilo, y varias regiones de secuencia única1-3 (
La titina es una proteína intrasarcomérica, con cerca de 1 μm de largo, que se extiende desde la línea Z hasta a la línea M2. De ese modo, la titina abarca cuatro zonas del sarcómero, por lo que tradicionalmente es dividida en cuatro regiones distintas designadas respectivamente de región de la línea M, de la banda A, de la banda I y de la línea Z (
La principal característica de la titina es su elevada elasticidad, que le permite distenderse y acortarse regulando así el largo del sarcómero y la función muscular. Para largos sarcoméricos fisiológicos, la titina constituye el principal determinante de la tensión pasiva de los cardiomiocitos. Y, para largos suprafisiológicos, el colágeno de la matriz extracelular adquiere mayor relieve2.
Como fue referido anteriormente, las propiedades elásticas de la titina se deben sobre todo a la región en la banda I, ya que, en la banda A, la titina es prácticamente inextensible7,8. La elasticidad de la titina en la región de la banda I es conferida por una estructura molecular constituida por varios segmentos extensibles, principalmente por un gran número de segmentos Ig, por un segmento PEVK y por la región N2 (
En ausencia de fuerzas externas, los sarcómeros de los cardiomiocitos tienen un tamaño de 1,9 μm, y en esas condiciones de reposo la titina está en su estado contraído (
La titina es, no sólo el principal determinante de la tensión pasiva en respuesta al estiramiento, sino que funciona también como un resorte elástico bidireccional. Esto es así, porque, por el contrario, cuando el largo del sarcómero es acortado a valores inferiores al largo de reposo, la titina también genera una fuerza elástica que tiene una dirección contraria a la de la tensión pasiva tradicional. Esa fuerza, designada "fuerza de restauración", permite el rápido restablecimiento del largo del sarcómero a los valores de reposo, empujando al filamento grueso lejos de la línea Z9.
En el músculo cardíaco existen dos isoformas de titina: la isoforma N2B y la isoforma N2BA. La isoforma N2B es la más pequeña (2.970 kDa) una vez que en la subregión N2 es constituida apenas por el elemento N2B. A su vez, la isoforma N2BA tiene mayores dimensiones (3.200 a 3.400 kDa) y contiene ambos elementos: N2B y N2A. En el ser humano, en cada mitad del sarcómero están presentes las isoformas N2BA y N2B, en una razón aproximada de 30/7010.
La isoforma N2BA posee un elemento extensible más en la región de la banda I, por lo que esa isoforma es más distensible y menos rígida que la N2B (
Los principales determinantes de la función cardíaca diastólica son el relajamiento del miocardio y las propiedades pasivas del ventrículo. Mientras que el relajamiento miocárdico es modulado por la carga, por la inactivación (asociada a la cinética del calcio y a la disociación de los miofilamentos) y por la no uniformidad de la pared ventricular, las propiedades pasivas miocárdicas son influenciadas por la rigidez miocárdica, por el espesor de la pared del ventrículo izquierdo y por la geometría de las cámaras cardíacas12.
La disfunción diastólica es causada por una lentificación del relajamiento miocárdico y/o por alteraciones de las propiedades pasivas del ventrículo, principalmente por el aumento de la rigidez ventricular12.
El aumento de la rigidez ventricular puede ser causado por alteraciones de las características intrínsecas de los propios cardiomiocitos - como por modificaciones en la constitución de las proteínas del citoesqueleto o de las proteínas endosarcoméricas (como alteraciones en la titina o en la alfa-actinina) - o por alteraciones de la constitución de la matriz extracelular, principalmente por el aumento de la red de colágeno y fibrosis extracelular12.
La titina es un importante determinante de la función diastólica, una vez que influye la rigidez del cardiomiocito y, de esa forma, las propiedades pasivas del ventrículo. Como fue visto anteriormente, considerando su ubicación estratégica en el sarcómero, y sus propiedades elásticas únicas, la titina es el principal determinante de la tensión pasiva del cardiomiocito, para largos fisiológicos del sarcómero7,13, siendo la contribución relativa de los filamentos intermedios y de los microtúbulos inferior a 10%14. Para largos superiores a 2,3 mm, difícilmente alcanzados en el corazón intacto, la tensión pasiva pasa a ser determinada esencialmente por el colágeno y por la matriz extracelular7,11.
La importancia de la titina en la determinación de la función diastólica tiene impacto en el nivel fisiopatológico, una vez que, como veremos más adelante, fue demostrado que enfermos con IC diastólica presentan una alteración en la proporción relativa de las isoformas de la titina, con aumento de la isoforma N2B (más rígida) lo que parece explicar el aumento de la rigidez ventricular observado en esos enfermos15.
La titina no determina apenas la rigidez ventricular. Como fue referido anteriormente, la titina posee propiedades elásticas que funcionan de forma bidireccional, o sea, si por un lado genera tensión pasiva cuando el músculo es estirado, por el otro, cuando hay acortamiento del sarcómero, la titina genera una "fuerza de restauración", que tiene una dirección opuesta a la de la tensión pasiva y permite una rápida recuperación del largo de reposo del sarcómero9.
En términos hemodinámicos, esa "fuerza de restauración" generada por la titina permite aumentar la velocidad de relajamiento ventricular y permite la formación de un fenómeno de "succión ventricular". Esa fuerza permite aumentar el llenado ventricular, sobre todo en la fase inicial de la diástole, lo que puede ser particularmente importante en las situaciones de ejercicio físico u otras situaciones de taquicardia16.
Además de eso, aun antes del inicio de la diástole, la titina interviene también en la determinación del fin de la contracción miocárdica, un proceso que también es dependiente del largo del sarcómero. En verdad, cuando existe el acortamiento del sarcómero a valores inferiores al largo de reposo la titina facilitará el proceso de desactivación de los puentes cruzados, influyendo y determinando el fin de la contracción muscular9,16.
La titina es un importante determinante de la función cardíaca diastólica pero influye también la función sistólica, por el efecto que ejerce en la modulación de la relación de Frank-Starling17.
Según la Ley de Frank-Starling, el aumento de la precarga, o sea, el aumento del volumen telediastólico mejora la función sistólica originando un aumento del volumen de eyección. La titina, como determinante de la rigidez ventricular y de las propiedades pasivas del ventrículo, influye en la relación presión-volumen telediastólica y, así, el llenado ventricular y el volumen telediastólico18.
A nivel celular, el mecanismo de Frank-Starling es explicado por la ocurrencia de un aumento de la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2+ en respuesta al aumento del largo del sarcómero19. La titina desempeña un papel fundamental en la regulación de ese mecanismo, una vez que la tensión pasiva ejercida por la titina determina directamente el aumento de la sensibilidad de los miofilamentos al calcio17,20,21. Además de eso, la titina, como elemento estructural del filamento grueso en la región de la banda A, es también capaz de influenciar directamente la unión entre los miofilamentos de actina y miosina, según el largo del sarcómero. O sea, cuando aumenta el largo del sarcómero la titina parece potenciar la unión entre los filamentos de actina y de miosina, con el consecuente aumento de la fuerza de contracción22. De ese modo, la titina es capaz de "potenciar" el ciclo de los puentes cruzados cuando el sarcómero es estirado, y e cuando éste es acortado a dimensiones por debajo de su largo de reposo, la titina es también capaz de inhibir la formación de los puentes cruzados16.
Además de su función estructural y elástica, la titina funciona también como un sensor biomecánico. Dada su capacidad de distenderse y acortarse, la titina es sensible al grado de estiramiento del cardiomiocito6,23 siendo después capaz de transmitir esa señal biomecánica por la unión e interacción que establece con varias proteínas estructurales y señalizadoras. Esa señalización ocurre sobre todo en tres regiones principales: en la línea Z, en la parte central de la banda I y en la línea M 1,6,23.
En la región de la línea Z la titina se une a la proteína teletonina (T-cap), que funciona como un lugar de interligación entre la titina y varias otras moléculas estructurales y de enlace23,24. Entre esas moléculas se encuentran proteínas presentes en los túbulos T y en el retículo sarcoplasmático (RS), principalmente la anquirina 1 (sANK 1), la obscurina (RS) y canales de potasio (minK/isk). De esa forma, la titina interviene no sólo en la manutención de la estructura del sarcómero, como también de la estructura y correcta organización de los túbulos T y del retículo sarcoplasmático23,24.
En la región de la línea Z se forman complejos de proteínas que funcionan como señalizadores de tensión y que responden tanto a la fuerza pasiva, generada por los filamentos de titina durante el estiramiento, como a la fuerza activa, transmitida por los filamentos de actina23,24. En ese nivel, existen varias proteínas que al interactuar con la titina participan en seguida en cascadas de señalización intracelular, promoviendo la expresión de genes envueltos en el remodelado cardíaco. Una de esas proteínas es la MLP (
A nivel de la región central de la banda I, los elementos N2B y N2BA funcionan como los lugares de unión de la titina a diversas proteínas señalizadoras. La secuencia única N2B, exclusiva del músculo cardíaco, se une, por intermedio de un miembro de la familia de proteínas LIM (proteínas que contienen dominios LIM - agrupamiento de ocho residuos de cisteína y histidina en la configuración (C-X2-C-X16/23-H-X2-C-X2-C-X2-C-X16/21-C-X2/3-C/D/H)) conocido como DRAL/FHL 2, a diversas enzimas metabólicas. En estados de mayor necesidad energética la función del DRAL/FHL 2 como puente de unión entre la titina y enzimas como la creatinina kinasa o la kinasa del adenilato adquiere una importancia creciente aumentando el aporte de ATP24.
Los ligandos de la titina en la región de la banda I, así como las proteínas a ellos asociadas, también son encontrados en el núcleo, donde funcionan como reguladores de la transcripción y del ciclo celular, pudiendo también estar envueltos en las alteraciones de las propiedades pasivas del cardiomiocito a largo plazo1. Es el ejemplo de la interacción con la obscurina, una proteína con diversos dominios de señalización. Ese complejo titina-obscurina responde al estiramiento del sarcómero, estando envuelto en la reestructuración sarcométrica que ocurre por ejemplo en la adaptación muscular y en la insuficiencia cardíaca2.
La región de la titina adyacente a la línea M también posee lugares potencialmente envueltos en la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2+ y participa extensamente en los mecanismos de señalización intracelular2,23.
Además de las funciones ya referidas, comienza a investigarse el envolvimiento de la titina en el proceso de doblaje de proteínas, en la regulación de expresión de genes y en la regulación de varios canales iónicos23.
Además de eso, la titina es aun importante en el proceso de miofibrilogénesis formando una especie de molde estructural para la correcta disposición y organización de los filamentos de actina y miosina25. La pérdida de la titina origina una organización anormal del sarcómero como fue demostrado recentemente26.
La titina funciona en el sarcómero como un elemento dinámico, cuyas funciones pueden ser moduladas, ya sea a corto o largo plazo, por diversos factores, lo que le permite al miocardio modificar su elasticidad en razón de las diversas alteraciones hemodinámicas a que está sujeito11,27.
Como es demostrado en la
El segmento N2B de la titina cardíaca puede ser fosforilado por la proteína kinasa A (PKA) originando una disminución de su tensión pasiva (
La activación de la PKA que ocurre, por ejemplo, después de la estimulación betaadrenérgica constituye uno de los principales mecanismos de regulación fisiológica a corto plazo de la distensibilidad de la titina. Es sabido que la estimulación simpática, más allá de sus efectos cronotrópico e inotrópico positivo, es también capaz de mejorar la función diastólica, aumentando no sólo la velocidad de relajamiento ventricular, sino también la complacencia ventricular. Este último efecto depende, entre otros factores, de la fosforilación de la isoforma N2B de la titina por la PKA27,32,33.
Los efectos de la fosforilación de la isoforma N2B por la PKA también repercuten en el nivel en la fase final de la sístole, una vez que la disminución de la rigidez del cardiomiocito conducirá también a una disminución de la fuerza de restauración de los cardiomiocitos31. Ese efecto, teóricamente poco benéfico, puede ser contrapuesto por el hecho de que la PKA acelera la velocidad de relajamiento del miocardio, por medio de la fosforilación simultánea del fosfolamban y de la troponina34. Son necesarios más estudios para comprender el papel de la fosforilación de la titina en la función cardíaca.
Muy recientemente fue también demostrado que tanto la proteína kinasa G (PKG)35,36, como la isoforma alfa de la proteína kinasa C (PKC)37 promueven igualmente la fosforilación de la titina. En el caso de la PKG la fosforilación se da en el segmento PEVK de la isoforma N2B, llevando a una disminución de la tensión pasiva cardiomiocitaria35. Ya en el caso de la fosforilación por la PKC, ésta ocurre en el segmento PEVK tanto de la isoforma N2B como de la N2BA y el efecto global de esa fosforilación es el aumento de la tensión pasiva35-37.
En resumen, la titina funciona como un "resorte ajustable" que, por medio de la fosforilación/desfosforilación sobre todo de su segmento N2B, permite la adaptación de la función ventricular a las necesidades del organismo.
El Ca2+ tiene un papel importante como regulador de la distensibilidad del cardiomiocito, sobre todo en razón de la modulación de la interacción entre la titina y los filamentos finos. Estudios revelan que el dominio PEVK en la región extensible de la isoforma N2B se une a la F-actina y que esa interacción podrá contribuir a la rigidez pasiva de los cardiomiocitos38. Aunque el Ca2+ aisladamente no interfiera en esa unión, cuando ese ión se encuentra unido a la proteína S100A1, existente en elevadas concentraciones en el miocardio, esa interacción es inhibida, disminuyendo la rigidez del cardiomiocito. La observación del aumento de la rigidez del músculo cardíaco paralelamente a la declinación de la concentración de Ca2+ durante la diástole apoya ese mecanismo1,2,23,39.
Como fue anteriormente referido, los cardiomiocitos expresan las dos isoformas de la titina, permitiéndoles alcanzar un nivel intermedio de tensión pasiva (
Es importante referir que, por medio de la alteración de la proporción relativa de las isoformas de la titina, apenas son modificadas las propiedades elásticas de la titina, no siendo alteradas sus propiedades estructurales, una vez que de esa forma sólo la porción de la titina presente en la banda I (o sea, el componente distensible) es el que sufre alteraciones11.
En resumen, la función cardíaca puede ser modificada por alteraciones de las propiedades elásticas de la titina, que pueden ocurrir tanto a corto como a largo plazo. Tal como podemos ver en la
Las alteraciones de la titina están envueltas en la fisiopatología de algunas enfermedades cardíacas, principalmente en la insuficiencia cardíaca diastólica (ICD) y en la cardiomiopatía dilatada (CMD). Hay cada vez mayor evidencia de que las alteraciones en la razón de expresión de las dos isoformas de la titina, así como la alteración de su estado de fosforilación están en la base del desarrollo y progresión de esas enfermedades.
En la disfunción diastólica ocurre una lentificación del relajamiento del miocardio y/o un aumento de la rigidez ventricular. En un ventrículo más rígido, el aumento del volumen de sangre durante la diástole sólo es conseguido a costa de un aumento de las presiones de llenado ventricular, con aumento de la relación presión-volumen telediastólica, lo que puede originar un cuadro clínico de IC diastólica.
La titina, como principal determinante de la tensión pasiva del cardiomiocito, determina la rigidez ventricular. Como fue demostrado recientemente, los cardiomiocitos extraídos de biopsias endomiocárdicas de enfermos con ICD exhibían un aumento relativo de la expresión de la isoforma más rígida de la titina, N2B. Se observó que, mientras que en un corazón humano sano la razón N2BA/N2B normal es de cerca de 30/7010, en los enfermos con ICD esa relación era de 17/83; y en la IC sistólica la razón fue de 35/6515. Sin embargo, ese mismo grupo demostró recientemente que la hipofosforilación del segmento N2B de la titina parece contribuir más significativamente al aumento de la tensión pasiva verificada en los casos de ICD41.
En enfermos con cardiomiopatía dilatada y remodelado excéntrico fue observada una alteración de la relación entre las isoformas de la titina, pero aquí con un aumento relativo de la isoforma más distensible, la N2BA10.
En una fase inicial de la insuficiencia cardíaca sistólica, alteraciones de las isoformas de la titina pueden funcionar como un mecanismo de adaptación, una vez que el aumento de la complacencia ventricular permite un aumento del volumen telediastólico, y consecuentemente un aumento del débito cardíaco de acuerdo con el mecanismo de Frank-Starling32. Además de eso, se prevé que la menor fuerza de restauración desarrollada por los cardiomiocitos durante la sístole (en razón del aumento de la proporción de la isoforma más complaciente) permitiría una disminución del volumen telesistólico final para cualquier post carga. Esa disminución ocurriría por la declinación de la resistencia al acortamiento del cardiomiocito, aumentando así el volumen de eyección. De hecho, está probado que individuos con mayor proporción de N2BA tienen mejor tolerancia al ejercicio en razón del aumento de la presión venosa de oxígeno10. Ese efecto teóricamente benéfico acaba por no ocurrir en la práctica, una vez que, en la IC sistólica, la relación de Frank-Strarling está alterada a consecuencia de la disminución de la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2+, en razón, principalmente, del menor desarrollo de tensión pasiva en presencia de un aumento de la isoforma N2BA10. Finalmente, en el corazón insuficiente puede ocurrir un aumento de la degradación de la titina, lo que podrá igualmente contribuir a la atenuación del mecanismo de Frank-Starling42. Además de eso, ese proceso se vuelve posteriormente desadaptativo, una vez que el aumento del volumen telediastólico del ventrículo origina más estrés sobre las paredes ventriculares, estimulando y agravando el proceso de remodelado cardíaca13,32,43.
También en la cardiomiopatía isquémica ocurre un aumento de la razón N2BA/N2B, a pesar de que generalmente ocurre un aumento de la rigidez ventricular44. Esa observación, aparentemente paradojal, puede ser explicada por el hecho de que, en esa situación, el aumento de la rigidez ventricular sea debido no a alteraciones a nivel de los cardiomiocitos, sino a alteraciones en la matriz extracelular con aumento de la fibrosis miocárdica. Aquí, el aumento de la isoforma N2BA de la titina (menos rígida) puede ser un mecanismo de compensación al aumento de la rigidez ventricular secundario al proceso de fibrosis. En verdad, en la cardiomiopatía isquémica ocurre una disminución de la tensión pasiva de cada cardiomiocito, probablemente en razón del aumento de la isoforma N2BA10.
Como fue abordado anteriormente, la titina puede también sufrir modulación de su rigidez mediante alteraciones post translacionales, principalmente por la fosforilación del segmento N2B29. La titina puede ser fosforilada por la proteína kinasa A (PKA) y por la proteína kinasa G (PKG), llevando a una disminución de su rigidez28,29,31,35, induciendo así, y de forma aguda, alteraciones a corto plazo en la rigidez ventricular.
Esos descubrimientos son particularmente relevantes, una vez que pueden incluso ser blanco de intervención terapéutica en los enfermos con insuficiencia cardíaca. En verdad, el tratamiento con PKA de cardiomiocitos extraídos de enfermos con IC diastólica permitió una reducción de su tensión pasiva, a valores semejantes a los de los individuos control30. Esa disminución de la tensión pasiva fue directamente proporcional a la rigidez inicial de los cardiomiocitos, lo que es concordante con la idea de que el aumento de la rigidez cardíaca está directamente relacionado no sólo a alteraciones de la expresión relativa de las isoformas, como también del estado de hipofosforilación de la isoforma rígida de la titina. Tal como sería de esperar por la menor rigidez de los cardiomiocitos provenientes de enfermos con IC sistólica, el mismo tratamiento con PKA no causó una caída tan significativa de la tensión pasiva15.
Tanto la estenosis aórtica como la cardiomiopatía hipertensiva presentan disfunción diastólica, pero apenas en la última se verifica un aumento sustancial de la rigidez miocárdica. En ambos casos, la expresión relativa de las isoformas N2BA/N2B, así como su grado de total de fosforilación son semejantes. Con todo, en la cardiomiopatía hipertensiva se observó una hipofosforilación relativa de la isoforma más rígida, la N2B, habiendo sido propuesto como el mecanismo subyacente al aumento de la rigidez miocárdica y disfunción diastólica en esa enfermedad40,45.
También en la cardiomiopatía dilatada parecen ocurrir alteraciones en la fosforilación de la titina. En esos enfermos fue observada una disminución de la actividad de la PKA cardíaca, que podrá ser un mecanismo compensador, en respuesta a la elevada complacencia observada en los cardiomiocitos de esos enfermos13.
En resumen, la titina, por medio de la modificación de la expresión de sus isoformas y/o de su estado de fosforilación, parece ser un elemento clave en la fisiopatología de varias enfermedades cardíacas. Además de eso, la titina puede aun ser un potencial blanco de manipulación farmacológica constituyendo así un nuevo blanco terapéutico, sobre todo en la insuficiencia cardíaca.
Los autores agradecen la preciosa ayuda de Pedro Daniel Miranda Couto en la preparación de las figuras.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue parcialmente financiado por la Fundação para a Ciência e Tecnologia.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.