abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil xprwmF5VBFWtPF6GJGz6mHJ 00002 S0066-782X2011000300002 S0066-782X(11)09600302 10.1590/S0066-782X2011005000015 Artigos Originais Investigação de variantes gênicas de canais iônicos em pacientes com síndrome do QT longo Curty Ernesto Cruz Fernando Eugênio dos Santos Lima Fabiane Santos Coutinho Jorge Luiz Albuquerque Silva Rosane Ürményi Turán Peter Carvalho Antônio Carlos Campos Rondinelli Edson Rio de Janeiro Rio de Janeiro Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Medicina Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Brazil Rio de Janeiro Instituto Nacional de Cardiologia Brazil 03 2011 96 3 172 178 23 08 2010 23 08 2010 24 09 2010 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A síndrome do QT longo (SQTL) é uma síndrome arrítmica herdada com aumento do intervalo QT e risco de morte súbita. Mutações nos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A respondem por 90% dos casos com genótipo determinado, e a genotipagem é informativa para aconselhamento genético e melhor manejo da doença. OBJETIVO: Investigação molecular e análise computacional de variantes gênicas de KCNQ1, KCNH2 e SCN5A associadas à SQTL em famílias portadoras da doença. MÉTODOS: As regiões codificantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A de pacientes com SQTL e familiares foram sequenciadas e analisadas utilizando o software Geneious ProTM. RESULTADOS: Foram investigadas duas famílias com critérios clínicos para SQTL. A probanda da Família A apresentava QTC = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. A genotipagem identificou a mutação G1714A no gene KCNH2. Foi observado QTC = 521 ± 42 ms nos familiares portadores da mutação contra QTC = 391 ± 21 ms de não portadores. A probanda da Família B apresentava QTc = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. A genotipagem identificou a mutação G1600T, no mesmo gene. A análise dos familiares revelou QTC = 497 ± 42 ms nos portadores da mutação, contra QTC = 404 ± 29 ms nos não portadores. CONCLUSÃO: Foram encontradas duas variantes gênicas previamente associadas à SQTL em duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL. Em todos os familiares portadores das mutações foi observado o prolongamento do intervalo QT. Foi desenvolvida uma estratégia para identificação de variantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A, possibilitando o treinamento de pessoal técnico para futura aplicação na rotina diagnóstica.

 Síndrome do QT longo canais iônicos mutação morte súbita cardíaca 04 02 2011

Investigação de variantes gênicas de canais iônicos em pacientes com síndrome do QT longo

Ernesto CurtyI; Fernando Eugênio dos Santos CruzII; Fabiane Santos LimaI; Jorge Luiz Albuquerque CoutinhoII; Rosane SilvaIII; Turán Peter ÜrményiIII; Antônio Carlos Campos CarvalhoII,III; Edson RondinelliI,III

IFaculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

IIInstituto Nacional de Cardiologia, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

IIIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A síndrome do QT longo (SQTL) é uma síndrome arrítmica herdada com aumento do intervalo QT e risco de morte súbita. Mutações nos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A respondem por 90% dos casos com genótipo determinado, e a genotipagem é informativa para aconselhamento genético e melhor manejo da doença.

OBJETIVO: Investigação molecular e análise computacional de variantes gênicas de KCNQ1, KCNH2 e SCN5A associadas à SQTL em famílias portadoras da doença.

MÉTODOS: As regiões codificantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A de pacientes com SQTL e familiares foram sequenciadas e analisadas utilizando o software Geneious ProTM.

RESULTADOS: Foram investigadas duas famílias com critérios clínicos para SQTL. A probanda da Família A apresentava QTC = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. A genotipagem identificou a mutação G1714A no gene KCNH2. Foi observado QTC = 521 ± 42 ms nos familiares portadores da mutação contra QTC = 391 ± 21 ms de não portadores. A probanda da Família B apresentava QTc = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. A genotipagem identificou a mutação G1600T, no mesmo gene. A análise dos familiares revelou QTC = 497 ± 42 ms nos portadores da mutação, contra QTC = 404 ± 29 ms nos não portadores.

CONCLUSÃO: Foram encontradas duas variantes gênicas previamente associadas à SQTL em duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL. Em todos os familiares portadores das mutações foi observado o prolongamento do intervalo QT. Foi desenvolvida uma estratégia para identificação de variantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A, possibilitando o treinamento de pessoal técnico para futura aplicação na rotina diagnóstica. (Arq Bras Cardiol. 2011; [online].ahead print, PP.0-0)

Palavras-chave: Síndrome do QT longo, canais iônicos, mutação, morte súbita cardíaca.

Introdução

A síndrome do QT longo (SQTL)1,2 é uma doença genética com prevalência de 1:20003 que cursa com risco de morte súbita por arritmias ventriculares em um coração estruturalmente normal4. O diagnóstico é feito através do escore de Schwartz5, que combina critérios eletrocardiográficos e da história clínica, classificando a probabilidade de SQTL em "baixa" (< 1) "intermediária" (2-3) e "alta" (> 4). Um escore de Schwartz > 4 tem especificidade > 99% para o diagnóstico da SQTL6.

Diferentes tipos de SQTL são provocados por variantes em genes de canais iônicos7,8 e no gene da ankirina9. Atualmente são descritos 12 tipos10, porém os tipos 1, 2 e 3 respondem por 90% dos casos com genótipo identificado11. Embora mais de 700 variantes tenham sido descritas12, em 29% dos casos a base genética não foi identificada13. Os vários tipos de SQTL diferem quanto ao risco de morte súbita14, aos gatilhos para os episódios de arritmia15,16 e a resposta ao tratamento farmacológico17,18. Além disso, a gravidade depende da região afetada do canal19, o que torna a identificação da mutação importante para o manejo da doença.

Apesar do grande número de variantes envolvidas, a pesquisa de variantes gênicas associadas à SQTL (genotipagem) está sendo cada vez mais utilizada na prática clínica. Que seja de nosso conhecimento, nenhuma unidade do Sistema Único de Saúde realiza atualmente a genotipagem da SQTL. Por esta razão, foram investigadas variantes gênicas associadas à SQTL em duas famílias com diagnóstico clínico da doença. As condições de genotipagem dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A foram estabelecidas, e foi utilizada análise computacional para a identificação facilitada de mutações já descritas e de novos variantes gênicas na população brasileira.

Métodos

Pacientes

Pacientes encaminhados ao Instituto Nacional de Cardiologia com suspeita clínica de SQTL foram submetidos a anamnese e exame físico por um cardiologista com experiência em SQTL (FESCFº). Os eletrocardiogramas foram analisados independentemente por dois pesquisadores (EC e FESCFº), e a medida do intervalo QT realizada pelo método da tangente20. Nenhum dos probandos apresentava sinais eletrocardiográficos de hipertrofia cardíaca, distúrbios da condução ou isquemia miocárdica. Probandos com escore de Schwartz > 4 e familiares em primeiro grau foram submetidos à análise molecular, num total de 29 indivíduos de duas famílias.

Extração de DNA e reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA genômico era extraído de sangue periférico21. Os exons correspondentes às regiões codificantes dos 3 genes investigados eram amplificados por PCR utilizando os iniciadores previamente descritos22,23. Os exons dos genes KCNQ1 e KCNH2 eram amplificados utilizando, respectivamente, os programas "B" e "C" previamente publicados por Syrris e cols.24. Para amplificação dos exons 1A de KCNQ1 e 4 de KCNH2 era adicionado à reação o reagente PCRx Enhancer (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante. Os exons do gene SCN5A eram amplificados utilizando condições por nós estabelecidas: 0,2 mM dXTP, 3 mM MgCl2, 0,5 µM de iniciadores (senso+antissenso), 0,625 UI de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen), 200 ng de DNA molde, em um volume final de 50 µl. O programa consistia em 94ºC/10min; 30 ciclos de 94ºC/1 min, 58ºC/1 min., 72ºC/2 min.; extensão final a 72ºC/10 min.

Sequenciamento automático de DNA

O sequenciamento de produtos de PCR purificados em filtros Millipore PCR Cleanup era realizado utilizando iniciadores senso ou antissenso, em um equipamento MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) com reagentes DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare Life Systems) conforme as instruções do fabricante.

Análise das sequências obtidas para identificação das mutações

Foi utilizado o software Geneious ProTM25 para análise das sequências obtidas e geração de mapas de mutações já descritas para os genes estudados. Resumidamente, as sequências das regiões codificante e genômicas dos genes KCNQ1 (nº de acesso NM_000218 e NG_008935.1), KCNH2 (nº de acesso NM_000238 e NG_008916) e SCN5A (nº de acesso NM_000335 e NG_008934.1) foram importadas do GenBank e as mutações conhecidas (Inherited Arrhythmias Database12) adicionadas a estas no software com as respectivas referências bibliográficas. Em seguida foram assinalados os sítios de anelamento dos iniciadores, intrônicos em sua maioria, utilizados nas reações de amplificação e as porções centrais dos introns foram removidas para facilitar a análise. A comparação direta dos mapas de mutações com as sequências obtidas de pacientes permite visualizar simultaneamente a qualidade do sequenciamento e as mutações previamente descritas.

Considerações éticas

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Cardiologia (processo nº 0187/4.01.08). Os pacientes e familiares foram informados dos objetivos e riscos do estudo e concordaram em participar do mesmo através de assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.

Resultados

Foi realizada pesquisa de variantes gênicos de KCNQ1, KCNH2 e SCN5A em duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL, incluindo na análise dois probandos e seus respectivos familiares, perfazendo 11 indivíduos na Família A e 17 na Família B. A análise dos variantes foi otimizada mediante criação de mapas de mutação com o software Geneious ProTM (dados não mostrados).

A probanda da Família A (Figura 1A, paciente A2.21), de 36 anos, começou a sentir palpitações aos 15 anos; aos 24 anos passou a apresentar episódios de palpitações seguidas de síncope desencadeados por estresse emocional, ruídos súbitos e no despertar, sendo feito o diagnóstico de SQTL. A probanda da Família B (Figura 1B, paciente B2.1) apresentava 42 anos e episódios de pré-síncope durante esforços físicos. A mesma buscou atendimento médico e recebeu o diagnóstico de SQTL após sua prima (#B2.9) apresentar um episódio de morte súbita abortada (MSA) em ambiente hospitalar. Os ECGs com medidas do intervalo QT das probandas estão mostrados na Figura 2. A paciente A2.21 apresentava QTC = 560 ms (Figura 2A) e a paciente B2.1 QTC = 551 ms (Figura 2B). Na história familiar da probanda A2.21 era possível identificar 10 casos de morte súbita em idades precoces, compatíveis com SQTL. (Figura 1A, destacado em verde). Na Família B havia somente um caso de MSA (#B2.9).

 

 

Os dados clínicos e eletrocardiográficos dos indivíduos de ambas famílias estão apresentados na Tabela 1. A Família A totalizava 9 mulheres e 2 homens, com idade entre 14 e 80 anos. A Família B continha 17 indivíduos (7 do sexo masculino), com idades entre 5 meses e 69 anos. Podem ser identificados 8 indivíduos com Escore de Schwartz>4, quatro na Família A (A2.21, A2.23, A3.2, A3.3) e 4 na Família B (B1.1, B2.1, B2.9, B3.1). Dois desses indivíduos (A2.21 e B2.9) apresentaram episódios de morte súbita abortada (MSA) e foram tratados com CDI + betabloqueador. Os demais (A1.10, A2.23, A3.2, A3.3, B1.1) eram assintomáticos e foram tratados com betabloqueadores isoladamente. Um dos casos de MSA (B2.9) apresentava intervalo QTC=448ms, entretanto, este ECG foi registrado na vigência do tratamento com betabloqueador, que pode reduzir o intervalo QT. Apenas um indivíduo (A1.10) apresentava probabilidade intermediária de SQTL (Escore de Schwartz = 2.5) e QTC limítrofe (450 ms). A análise do heredograma sugeriu que esse indivíduo deveria ser portador de mutação causadora de SQTL, o que foi confirmado pela análise molecular. Apenas um indivíduo (A2.21) apresentava registro de Torsades de Pointes.

A análise molecular foi capaz de detectar variações previamente descritas do gene KCNH2 nas probandas de ambas famílias. Na probanda da Família A foram identificadas as variantes gênicas A1692G e G1714A, ambas no exon 8. Na probanda da Família B foram identificadas as variantes gênicas C1467T, C1600T, A1692G e T1956C. Todas as variantes encontradas são polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) e as pacientes são heterozigotas em todos os loci. Entretanto, as variantes gênicas G1714A (Família A) e C1600T (Família B), ambas no exon 8 do gene KCNH2, são SNPs do tipo não sinônimo (missence) e foram previamente descritas como associadas à SQTL. A identificação dessas variantes gênicas é destacada na Figura 3. As outras variantes encontradas são polimorfismos comuns e sem relevância clínica demonstrada12.

As variantes missence G1714A e C1600T foram pesquisadas nos familiares dos probandos A2.21 e B2.1, respectivamente. Os resultados dessa genotipagem estão apresentados nas Figuras 1A e 1B. Na Família A o QTC médio nos portadores da variante gênica era de 521 ± 42 ms, comparado a um QTC médio de 391 ± 21 ms nos não portadores. Na Família B a média do intervalo QTC nos portadores da variante era de 497 ± 42 ms, comparado com um QTC médio de 404 ± 29 ms nos não portadores. Observa-se, portanto, que todos os portadores dos alelos G1714A e C1600T apresentam prolongamento do intervalo QTC, confirmando a relevância clínica das variantes encontradas.

Discussão

Neste trabalho realizamos o sequenciamento completo das regiões codificantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A visando identificar as variantes gênicas associadas à SQTL em duas famílias contendo membros diagnosticados com a doença. A triagem de variantes gênicas na SQTL frequentemente é feita utilizando a técnica de SSCP (single strand conformation polymorphism), que requer maior trabalho manual e apresenta sensibilidade inferior à de sequenciamento.

As dificuldades de implementação em rotina de um método diagnóstico molecular de alta complexidade como a do SQTL nos levaram a desenvolver, utilizando o software Geneious ProTM, uma sequência de passos para identificar com precisão mutações novas e já descritas. Os recursos de manipulação e anotação de sequências desse software foram explorados para a construção de mapas de mutação indicando os locais com mutações descritas, permitindo o alinhamento das sequências dos diferentes genes obtidas dos pacientes com os mapas dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A construídos, facilitando a identificação de diferenças entre ambas sequências. O alinhamento realizado nesse programa permite, ainda, eliminar artefatos de sequenciamento. Caso uma variante gênica encontrada tenha sido previamente descrita como associada à SQTL, a referência bibliográfica da mesma estará prontamente disponível nas marcações do mapa. Além disso, o programa organiza os arquivos internamente em um sistema de pastas, de modo que os diversos arquivos de sequência originais ficam centralizados e indexados, o que é crucial quando se leva em conta o enorme volume de informação gerada para cada paciente. Dessa forma, a metodologia desenvolvida permite a análise das sequências de maneira eficiente e de fácil manuseio, reduzindo a chance de erros de interpretação e possibilitando o treinamento técnico de pessoal para a futura implementação de rotina dessa metodologia para a rede SUS.

A metodologia de análise molecular por nós estabelecida foi capaz de identificar variantes gênicas previamente associadas à doença em duas famílias selecionadas pelos critérios clínicos já definidos. Ambas as famílias investigadas apresentaram variantes associadas à SQTL no gene KCNH2, o que permitiu classificar ambas as pacientes como portadoras de SQTL tipo 2. Esse gene codifica a sub-unidade alfa do canal de potássio KV11.1, responsável pela corrente IKr no potencial de ação cardíaco26. A variante G1714A encontrada na Família A já foi previamente descrita27 como associada à SQTL, e provoca a substituição do aminoácido glicina por serina na posição 572 da proteína, correspondente ao poro. Entretanto, as consequências eletrofisiológicas da mutação na atividade do canal iônico ainda não foram investigadas. A presença da variante gênica G1714A na família aqui descrita reforça a evidência em favor da patogenicidade dessa alteração. A variante gênica C1600T, encontrada na Família B, provoca a troca do aminoácido arginina por cisteína na posição 534 do polipeptídeo, correspondente ao sensor de voltagem do mesmo canal iônico28. Além disso, em contraste à variante anterior, os efeitos dessa alteração foram investigados eletrofisiologicamente por Nakajima e cols.29, que demonstraram redução do limiar de ativação do canal, aceleração da ativação e inativação, e redução da inativação do canal em repouso.

Curiosamente, o genótipo identificado foi o do subtipo 2 - o segundo mais frequente, respondendo por cerca de 30% dos casos. Por outro lado, embora essas famílias fossem portadoras do mesmo subtipo, e das variantes gênicas estarem bastante próximas (no mesmo exon, inclusive), a apresentação clínica da doença diferia entre as mesmas, talvez devido a alterações em diferentes regiões do canal iônico. A associação entre a região alterada na estrutura da proteína, e a gravidade da doença foi investigada por Moss e cols.19. Os autores demonstraram que as mutações na região do poro do canal codificado pelo gene KCNH2 estão associadas a um risco muito aumentado - cerca de 3 vezes maior - de eventos arritmogênicos. Um estudo de Shimizu e cols.30 obteve resultados similares. Em conformidade com esses trabalhos, observamos uma gravidade muito maior da doença na Família A (mutação na região S5-Poro) que na Família B (mutação no segmento transmembrana S4 - sensor de voltagem). Entretanto, outro fator descrito que resulta em maior gravidade na apresentação clínica é a presença de mais de uma mutação causadora de SQTL (compound mutations), que ocorre em cerca de 2% dos casos31. Como não foram pesquisadas as variantes gênicas nos genes menos frequentemente associados à SQTL (SQTL tipos 4-12), não podemos excluir a possibilidade da Família A ser um caso desse tipo.

Foram encontrados portadores assintomáticos, mas não portadores silenciosos com ECG normal. Portadores silenciosos são descritos na SQTL4,5,32, sendo mais comuns na SQTL114. O indivíduo A1.10 é ilustrativo da complexidade da doença: embora seja portador da variante associada à doença, seu eletrocardiograma mostra um prolongamento apenas limítrofe do intervalo QTC (450 ms) e seu Escore de Schwartz é igual a 2,5. Diversos fatores podem influenciar o intervalo QT - algumas doenças, as concentrações séricas de íons cálcio e potássio e diversos medicamentos - e dessa forma podem influenciar na apresentação da SQTL. Além disso, alguns trabalhos recentes demonstraram que polimorfismos comuns em genes de receptores adrenérgicos cardíacos são capazes de modular a duração do intervalo QT e a gravidade da apresentação clínica entre portadores da mesma mutação no gene KCNQ133. Portanto, a pesquisa de variantes gênicas na SQTL pode auxiliar na identificação de portadores assintomáticos com o intervalo QT limítrofe, e pode ser útil ao aconselhamento genético.

Conclusão

Foi realizada a investigação molecular de duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL, tendo sido encontradas duas variantes gênicas distintas previamente associadas à doença. Foi implementada metodologia de amplificação e sequenciamento da região codificante completa dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A, e desenvolvido método computacional simplificado de análise das sequências para a pesquisa das variantes gênicas utilizando recursos do software Geneious ProTM, que facilita o treinamento de pessoal técnico para a futura aplicação dessa metodologia na rotina diagnóstica.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq e parcialmente financiado pela FAPERJ.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Ernesto Curty pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Ernesto Curty

Rua Evaristo da Veiga, 83/509 - Centro

20031-040 - Rio de Janeiro, RJ - Brasil

E-mail:

ernestocurty@biof.ufrj.br,

ernestocurty@gmail.com

Artigo recebido em 23/08/10; revisado recebido em 23/08/10; aceito em 24/09/10.

Full texts in English - http://www.arquivosonline.com.br

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BACKGROUND: The long QT syndrome (LQTS) is an inherited arrhythmia syndrome with increased QT interval and risk of sudden death. Mutations in genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A account for 90% of cases with genotype determined, and genotyping is informative for genetic counseling and better disease management. OBJECTIVE: Molecular investigation and computational analysis of gene variants of KCNQ1, KCNH2 and SCN5A associated with LQTS, in families with the disease. METHODS: The coding regions of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A in patients with LQTS and their family members were sequenced and analyzed using Geneious ProTM software. RESULTS: Two families with clinical criteria for LQTS were investigated. The proband of Family A had QTC = 562 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1714A mutation in the KCNH2 gene. QTC = 521 ± 42 ms was observed in family members carrying the mutation against QTC = 391 ± 21 ms for non-carriers. The proband of Family B had QTc = 551 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1600T mutation, in the same gene. The analysis of family members revealed QTC = 497 ± 42 ms in mutation carriers, compared with QTC = 404 ± 29 ms in non-carriers. CONCLUSION: Two gene variants previously associated with LQTS were found in two families clinically diagnosed with LQTS. The prolongation of the QT interval was observed in all family members carrying the mutations. A strategy was developed to identify variants of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, making it possible to train technical staff for future application to diagnosis routine.

 Long QT syndrome ion channels mutation death sudden cardiac

Ernesto CurtyI; Fernando Eugênio dos Santos CruzII; Fabiane Santos LimaI; Jorge Luiz Albuquerque CoutinhoII; Rosane SilvaIII; Turán Peter ÜrményiIII; Antônio Carlos Campos CarvalhoII,III; Edson RondinelliI,III

IFaculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ - Brazil

IIInstituto Nacional de Cardiologia, Rio de Janeiro, RJ - Brazil

IIIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ - Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: The long QT syndrome (LQTS) is an inherited arrhythmia syndrome with increased QT interval and risk of sudden death. Mutations in genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A account for 90% of cases with genotype determined, and genotyping is informative for genetic counseling and better disease management.

OBJECTIVE: Molecular investigation and computational analysis of gene variants of KCNQ1, KCNH2 and SCN5A associated with LQTS, in families with the disease.

METHODS: The coding regions of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A in patients with LQTS and their family members were sequenced and analyzed using Geneious ProTM software.

RESULTS: Two families with clinical criteria for LQTS were investigated. The proband of Family A had QTC = 562 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1714A mutation in the KCNH2 gene. QTC = 521 ± 42 ms was observed in family members carrying the mutation against QTC = 391 ± 21 ms for non-carriers. The proband of Family B had QTc = 551 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1600T mutation, in the same gene. The analysis of family members revealed QTC = 497 ± 42 ms in mutation carriers, compared with QTC = 404 ± 29 ms in non-carriers.

CONCLUSION: Two gene variants previously associated with LQTS were found in two families clinically diagnosed with LQTS. The prolongation of the QT interval was observed in all family members carrying the mutations. A strategy was developed to identify variants of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, making it possible to train technical staff for future application to diagnosis routine. (Arq Bras Cardiol. 2011; [online].ahead print, PP.0-0)

Keywords: Long QT syndrome; ion channels; mutation; death sudden cardiac.

Introduction

The long QT syndrome (LQTS)1,2 is a genetic disease with prevalence of 1:20003, which involves risk of sudden death from ventricular arrhythmias in a structurally normal heart4. The diagnosis is made through the Schwartz score5, which combines the clinical history and ECG criteria and the clinical history, rating the probability of LQTS as "low" (< 1) "intermediate" (2-3) and "high" (> 4). A Schwartz score > 4 has specificity > 99% for the diagnosis of LQTS6.

Different types of LQTS are caused by variations in ion channel genes7,8 and in the ankyrin gene9. Currently, 12 types have been described10, but types 1, 2 and 3 account for 90% of cases with identified genotype11. Although more than 700 variants have been described12, the genetic basis was not identified in 29% of the cases13. Various types of LQTS differ with respect to risk of sudden death14, triggers for arrhythmia episodes15,16 and response to drug treatment17,18. Furthermore, the severity depends on the affected region of the channel19. That is why the identification of the mutation is important for managing the disease.

Despite the large number of variants involved, the search for gene variants associated with LQTS (genotyping) is being increasingly used in clinical practice. To the best of our knowledge, no unit of the National Health System is currently conducting the genotyping of LQTS. For this reason, the gene variants associated with LQTS were investigated in two families clinically diagnosed with the disease. The conditions for the genotyping of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A were established, and a computational analysis was used to facilitate the identification of mutations previously described and novel gene variants in the Brazilian population.

Methods

Patients

Patients referred to the National Institute of Cardiology with clinical suspicion of LQTS had their medical history taken and were physically examined by a cardiologist with expertise in LQTS (FESCFº). The electrocardiograms were independently analyzed by two researchers (EC and FESCFº), and the QT interval was measured by the tangent method20. None of the probands had electrocardiographic signs of cardiac hypertrophy, conduction disturbances or myocardial ischemia. Molecular analyses were carried out with probands with Schwartz score > 4 and first-degree relatives, with a total of 29 individuals from two families.

DNA extraction and polymerase chain reaction (PCR)

Genomic DNA was extracted from peripheral blood21. The exons corresponding to coding regions of the three genes investigated were amplified by PCR using the primers previously described22,23. Exons of genes KCNQ1 and KCNH2 were amplified using, respectively, the programs "B" and "C" previously published by Syrris et al24 To amplify exons 1A of KCNQ1 and 4 of KCNH2, the PCRx Enhancer reagent (Invitrogen) was added to the reaction, according to manufacturer's instructions. The exons of the SCN5A gene were amplified using conditions that we established: 0.2 mM dXTP, 3 mM MgCl2, 0.5 µM of primers (sense + antisense), 0.625 IU of recombinant Taq DNA polymerase (Invitrogen), 200 ng of DNA template, in a final volume of 50 ml. The program consisted in 94ºC/10 min; 30 cycles of 94ºC/1 min; 58ºC/1 min; 72ºC/2 min; final extension at 72ºC/10 min.

Automated DNA sequencing

The sequencing of PCR products purified by Millipore's PCR Cleanup filters was performed using sense or antisense primers, or in a MegaBACE 1000 device (Amersham Biosciences) with DYEnamic ET Dye Terminator Kit reagents (GE Healthcare Life Systems), according to manufacturer's instructions.

Analysis of sequences obtained for identification of mutations

The Geneious ProTM25 software was used to analyze the sequences obtained and to generate maps of mutations already described for the genes studied. In a nutshell, the sequences of the genomic and coding regions of genes KCNQ1 (access number NM_000218 and NG_008935.1), KCNH2 (access number NM_000238 and NG_008916) and SCN5A (access number NM_000335 and NG_008934.1) were imported from GenBank and known mutations (Inherited Arrhythmias Database12) were added to these in the software, with the respective references. Then, we marked the annealing sites for primers, intronic mostly, used in amplification reactions and the central portions of the introns were removed to facilitate the analysis. The direct comparison between mutation maps and the sequences obtained from patients allows viewing both the quality of sequencing and the mutations previously described.

Ethical considerations

This study was approved by the Research Ethics Committee of the National Institute of Cardiology (case number 0187/4.01.08). Patients and relatives were informed about the objectives and risks of the study and agreed to participate in it by signing the consent form.

Results

Research on gene variants of KCNQ1, KCNH2 and SCN5A was conducted in two families clinically diagnosed with LQTS, including the analysis of two probands and their families, totaling 11 individuals in family A and 17 in Family B. The analysis of the variants was optimized by creating mutation maps with Geneious ProTM software (data not shown).

The proband of Family A (Figure 1A, patient A2.21), 36 years of age, began experiencing palpitations at the age of 15; at the age of 24, this patient began experiencing palpitations followed by syncope triggered by emotional stress, sudden noise and upon awakening, being diagnosed with LQTS. The proband of Family B (Figure 1B, patient B2.1) was 42 years-old and experienced episodes of pre-syncope during physical exertion. The same patient sought medical attention and was diagnosed with LQTS after his cousin (#B2.9) experienced an episode of aborted sudden death (ASD) in a hospital environment. ECGs with measurements of the QT interval of the probands are shown in Figure 2. Patient A2.21 had QTC = 560 ms (Figure 2A) and patient B2.1 had QTC = 551 ms (Figure 2B). In the family history of proband A2.21, it was possible to identify 10 cases of sudden death at early ages, which is consistent with LQTS. (Figure 1A, highlighted in green). In Family B, there was only one case of aborted sudden death (#B2.9).

 

 

Clinical and electrocardiographic data of individuals from both families are presented in Table 1. Family A had a total of 9 women and 2 men, between 14 and 80 years of age. Family B comprised 17 individuals (7 males), between 5 months and 69 years of age. It was possible to identify 8 individuals with Schwartz score > 4, four in Family A (A2.21, A2.23, A3.2, A3.3) and 4 in Family B (B1.1, B2.1, B2.9, B3.1). Two of these individuals (A2.21 and B2.9) had episodes of aborted sudden death (ASD) and were treated with ICD + beta-blocker. The others (A1.10, A2.23, A3.2, A3.3, B1.1) were asymptomatic and were treated with beta blockers alone. One case of ASD (B2.9) had QTc = 448 ms. However, this ECG was recorded during treatment with beta-blockers, which can reduce the QT interval. Only one individual (A1.10) showed intermediate probability of LQTS (Schwartz score = 2.5) and borderline QTC (450 ms). The analysis of the pedigree chart suggested that this individual would be carrying a mutation that causes LQTS, which was confirmed by a molecular analysis. Only one individual (A2.21) had a record of Torsades de Pointes.

A molecular analysis was capable of detecting variations previously described of gene KCNH2 in probands of both families. In the proband of Family A, gene variants A1692G and G1714A were found, both in exon 8. In the proband of Family B, gene variants C1467T, C1600T, A1692G and T1956C were found. All variants found are single nucleotide polymorphisms (SNPs) and the patients are heterozygous at all loci. However, gene variants G1714A (Family A) and C1600T (Family B), both in exon 8 of the KCNH2 gene, are non-synonymous (missense) SNPs and were previously described as associated with LQTS. The identification of these gene variants is highlighted in Figure 3. The other variants found are common polymorphisms and their clinical relevance has not been demonstrated12.

Missense variants C1600T and G1714A were investigated in the relatives of probands A2.21 and B2.1, respectively. The results of this genotyping are shown in Figures 1A and 1B. In Family A, the average QTC in patients carrying the gene variant was 521 ± 42 ms, compared to an average QTC of 391 ± 21 ms in non-carriers. In Family B, the average QTC interval in patients carrying the gene variant was 497 ± 42 ms, compared to an average QTC of 404 ± 29 ms in non-carriers. Therefore, it is possible to see that all carriers of the C1600T and G1714A alleles have a prolongation of the QTC interval, confirming the clinical relevance of the variants found.

Discussion

In this work we sequenced all the coding regions of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, to identify the gene variants associated with LQTS in two families containing members diagnosed with the disease. The gene variants in LQTS are often screened using the SSCP (single strand conformation polymorphism) technique, which requires more manual work and is less sensitive than sequencing.

The difficulties in implementing, in a routine, a highly complex molecular diagnostic method, such as the LQTS, led us to develop, by using the Geneious ProTM software, a sequence of steps to accurately identify new and already described mutations. The sequence manipulation and annotation features of this software were used to develop mutation maps indicating the locations with mutations described, allowing the alignment of sequences of different genes obtained from patients with built maps of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, facilitating the identification of differences between both sequences. The alignment performed in this program also allows eliminating sequencing artifacts. If a gene variant found was previously described as associated with LQTS, bibliographic references of the same will be readily available in the markings on the map. In addition, the program organizes the files internally in a folder system, in order for the several original sequence files to be centralized and indexed, which is crucial when one takes into account the enormous volume of information generated for each patient. Thus, the methodology developed allows analyzing the sequences in a way that is efficient and easy to use, reducing the chance of misinterpretation and allowing the technical training of personnel for future implementation of a routine of this methodology in the public health system.

The molecular analysis methodology established by us was capable of identifying gene variants previously associated with the disease, in two families selected by the clinical criteria already defined. Both families investigated had variants associated with LQTS in the KCNH2 gene, which allowed classifying both patients as having type-2 LQTS. This gene encodes the alpha subunit of potassium channel KV11.1, which is responsible for the IKr current in the cardiac action potential26. The G1714A variant found in Family A has been previously described as associated with LQTS27, and it causes the substitution of glycine for serine at position 572 of the protein, which corresponds to the pore. However, the electrophysiological consequences of the mutation for the ion channel activity have not been investigated. The presence of gene variant G1714A in the family described here strengthens the evidence in favor of the pathogenicity of this change. Gene variant C1600T, found in Family B, causes the substitution of arginine for cysteine, at position 534 of the polypeptide that corresponds to the voltage sensor of the same ion channel28. Moreover, in contrast to the previous variant, the effects of this change were electrophysiologically investigated by Nakajima et al29, who demonstrated a reduction in the threshold of channel activation, accelerated activation and inactivation, and reduced inactivation of the channel at rest.

Interestingly, the genotype identified was a subtype 2 - the second most frequent one, accounting for about 30% of cases. Moreover, although these families were carriers of the same subtype, and the gene variants were fairly close (in the same exon, by the way), the clinical presentation of the disease differed between them, perhaps due to changes in different regions of the ion channel. The association between the region changed in the protein structure and the severity of the disease was investigated by Moss et al19. The authors demonstrated that mutations in the pore region of the channel encoded by the KCNH2 gene are associated with a much higher risk - about three times higher - of arrhythmogenic events. A study by Shimizu et al30 found similar results. In accordance with such studies, we observed much greater severity of the illness in Family A (mutation in the S5-pore region) than in Family B (mutation in the S4 transmembrane segment - voltage sensor). However, another factor described that results in greater severity in the clinical presentation is the presence of more than one mutation causing LQTS (compound mutations), which occurs in about 2% of cases31. Since the gene variants in genes less commonly associated with LQTS (LQTS types 4-12) were not investigated, we cannot exclude the possibility of Family A being a case of this type.

Asymptomatic carriers were found, but it was not possible to find silent carriers with normal ECG. Silent carriers are described in LQTS4,5,32, being more common in LQTS14. Individual A1.10 illustrates the complexity of the disease: although he carries the variant associated with disease, his electrocardiogram shows only a borderline prolongation of the QTC interval (450 ms) and its Schwartz Score is equal to 2.5. Several factors may influence the QT interval - some diseases, the serum concentrations of calcium and potassium ions and several drugs -, thereby influencing the LQTS presentation. Furthermore, some recent studies have demonstrated that common polymorphisms in genes of cardiac adrenergic receptors can modulate the duration of the QT interval, and the severity of the clinical presentation, among patients with the same mutation in the KCNQ1 gene33. Therefore, the investigation of genetic variants in LQTS may help identify asymptomatic carriers with borderline QTc, and it may be useful in genetic counseling.

Conclusion

The molecular investigation of two families clinically diagnosed with LQTS was undertaken, and two distinct genetic variants previously associated with the disease were found. A methodology was implemented to amplify and sequence the complete coding region of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, and a simplified computer method was developed to analyze the sequences, with the purpose of investigating the gene variants, by using features of the Geneious ProTM software, which facilitates the training of technical personnel for future application of this methodology to the diagnosis routine.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq and partially funded by CAPES.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Ernesto Curty, from Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

References

Investigación de variantes génicas de canales iónicos en pacientes con síndrome del QT largo

FUNDAMENTO: El síndrome del QT largo (SQTL) es un síndrome arrítmico heredado con aumento del intervalo QT y riesgo de muerte súbita. Mutaciones en los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A responden por 90% de los casos con genotipo determinado, y el genotipaje es informativo para aconsejamiento genético y mejor manejo de la enfermedad. OBJETIVO: Investigación molecular y análisis computacional de variantes génicas de KCNQ1, KCNH2 y SCN5A asociadas a la SQTL en familias portadoras de la enfermedad. MÉTODOS: Las regiones codificantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A de pacientes con SQTL y familiares fueron secuenciadas y analizadas utilizando el software Geneious Pro®. RESULTADOS: Fueron investigadas dos familias con criterios clínicos para SQTL. La probanda de la Familia A presentaba QT C = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. El genotipaje identificó la mutación G1714A en el gen KCNH2. Fue observado QT C = 521 ± 42 ms en los familiares portadores de la mutación contra QT C = 391 ± 21 ms de no portadores. La probanda de la Familia B presentaba QT C = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. El genotipaje identificó la mutación G1600T, en el mismo gen. El análisis de los familiares reveló QT C = 497 ± 42 ms en los portadores de la mutación, contra QT C = 404 ± 29 ms en los no portadores. CONCLUSIÓN: Fueron encontradas dos variantes génicas previamente asociadas a la SQTL en dos familias con diagnóstico clínico de SQTL. En todos los familiares portadores de las mutaciones fue observada la prolongación del intervalo QT. Fue desarrollada una estrategia para identificación de variantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A, posibilitando el entrenamiento de personal técnico para futura aplicación en la rutina diagnóstica.

 Síndrome del QT largo canales iónicos mutación muerte súbita cardíaca

ARTÍCULO ORIGINAL

Ernesto CurtyI; Fernando Eugênio dos Santos CruzII; Fabiane Santos LimaI; Jorge Luiz Albuquerque CoutinhoII; Rosane SilvaIII; Turán Peter ÜrményiIII; Antônio Carlos Campos CarvalhoII,III; Edson RondinelliI,III

IFaculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro

IIIInstituto Nacional de Cardiologia

IIIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: El síndrome del QT largo (SQTL) es un síndrome arrítmico heredado con aumento del intervalo QT y riesgo de muerte súbita. Mutaciones en los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A responden por 90% de los casos con genotipo determinado, y el genotipaje es informativo para aconsejamiento genético y mejor manejo de la enfermedad.

OBJETIVO: Investigación molecular y análisis computacional de variantes génicas de KCNQ1, KCNH2 y SCN5A asociadas a la SQTL en familias portadoras de la enfermedad.

MÉTODOS: Las regiones codificantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A de pacientes con SQTL y familiares fueron secuenciadas y analizadas utilizando el software Geneious Pro®.

RESULTADOS: Fueron investigadas dos familias con criterios clínicos para SQTL. La probanda de la Familia A presentaba QTC = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. El genotipaje identificó la mutación G1714A en el gen KCNH2. Fue observado QTC = 521 ± 42 ms en los familiares portadores de la mutación contra QTC = 391 ± 21 ms de no portadores. La probanda de la Familia B presentaba QTC = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. El genotipaje identificó la mutación G1600T, en el mismo gen. El análisis de los familiares reveló QTC = 497 ± 42 ms en los portadores de la mutación, contra QTC = 404 ± 29 ms en los no portadores.

CONCLUSIÓN: Fueron encontradas dos variantes génicas previamente asociadas a la SQTL en dos familias con diagnóstico clínico de SQTL. En todos los familiares portadores de las mutaciones fue observada la prolongación del intervalo QT. Fue desarrollada una estrategia para identificación de variantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A, posibilitando el entrenamiento de personal técnico para futura aplicación en la rutina diagnóstica.

Palabras clave: Síndrome del QT largo, canales iónicos, mutación, muerte súbita cardíaca.

Introducción

El síndrome del QT largo (SQTL)1,2 es una enfermedad genética con prevalencia de 1:2.0003 que cursa con riesgo de muerte súbita por arritmias ventriculares en un corazón estructuralmente normal4. El diagnóstico es hecho a través del escore de Schwartz5, que combina criterios electrocardiográficos y de la historia clínica, clasificando la probabilidad de SQTL en "baja" (< 1) "intermedia" (2 y 3) y "alta" (> 4). Un escore de Schwartz > 4 tiene especificidad > 99% para el diagnóstico de la SQTL6.

Diferentes tipos de SQTL son provocados por variantes en genes de canales iónicos7,8 y en el gen de la ankirina9. Actualmente son descriptos 12 tipos10, sin embargo los tipos 1, 2 y 3 responden por 90% de los casos con genotipo identificado11. Aunque más de 700 variantes hayan sido descriptas12, en 29% de los casos la base genética no fue identificada13. Los varios tipos de SQTL difieren en cuanto al riesgo de muerte súbita14, a los gatillos para los episodios de arritmia15,16 y la respuesta al tratamiento farmacológico17,18. Además de eso, la gravedad depende de la región afectada del canal19, lo que vuelve la identificación de la mutación importante para el manejo de la enfermedad.

A pesar del gran número de variantes envueltas, la investigación de variantes génicas asociadas a la SQTL (genotipaje) está siendo cada vez más utilizada en la práctica clínica. Que sea de nuestro conocimiento, ninguna unidad del Sistema Único de Salud realiza actualmente el genotipaje de la SQTL. Por esta razón, fueron investigadas variantes génicas asociadas a la SQTL en dos familias con diagnóstico clínico de la enfermedad. Las condiciones de genotipaje de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A fueron establecidas, y fue utilizado análisis computacional para la identificación facilitada de mutaciones ya descriptas y de nuevas variantes génicas en la población brasileña.

Métodos

Pacientes

Pacientes encaminados al Instituto Nacional de Cardiología con sospecha clínica de SQTL fueron sometidos a anamnesis y examen físico por un cardiólogo con experiencia en SQTL (FESCFº). Los electrocardiogramas fueron analizados independientemente por dos investigadores (EC y FESCFº), y la medida del intervalo QT realizada por el método de la tangente20. Ninguno de los probandos presentaba señales electrocardiográficos de hipertrofia cardíaca, disturbios de la conducción o isquemia miocárdica. Probandos con escore de Schwartz > 4 y familiares en primer grado fueron sometidos a análisis molecular, en un total de 29 individuos de dos familias.

Extracción de DNA y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El DNA genómico era extraído de sangre periférica21. Los exones correspondientes a las regiones codificantes de los 3 genes investigados eran amplificados por PCR utilizando los iniciadores previamente descriptos22,23. Los exones de los genes KCNQ1 y KCNH2 eran amplificados utilizando, respectivamente, los programas "B" y "C" previamente publicados por Syrris et al24. Para amplificación de los exones 1A de KCNQ1 y 4 de KCNH2 era agregado a la reacción el reactivo PCRx Enhancer (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Los exones del gen SCN5A eran amplificados utilizando condiciones establecidas por nosotros: 0,2 mM dXTP, 3 mM MgCl2, 0,5 µM de iniciadores (senso+antisenso), 0,625 UI de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen), 200 ng de DNA molde, en un volumen final de 50 µl. El programa consistía en 94º C/10 min; 30 ciclos de 94º C/1 min, 58º C/1 min. , 72º C/2 min. ; extensión final a 72º C/10 min.

Secuenciamiento automático de DNA

El secuenciamiento de productos de PCR purificados en filtros Millipore PCR Cleanup era realizado utilizando iniciadores senso o antisenso, en un equipamiento MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) con reactivos DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare Life Systems) según las instrucciones del fabricante.

Análisis de las secuencias obtenidas para identificación de las mutaciones.

Fue utilizado el software Geneious Pro®25 para análisis de las secuencias obtenidas y generación de mapas de mutaciones ya descriptas para los genes estudiados. Resumidamente, las secuencias de las regiones codificante y genómicas de los genes KCNQ1 (nº de acceso NM_000218 y NG_008935.1), KCNH2 (nº de acceso NM_000238 y NG_008916) y SCN5A (nº de acceso NM_000335 y NG_008934.1) fueron importadas del GenBank y las mutaciones conocidas (Inherited Arrhythmias Database12) agregadas a éstas en el software con las respectivas referencias bibliográficas. En seguida fueron señalados los lugares de anillamiento de los iniciadores, intrónicos en su mayoría, utilizados en las reacciones de amplificación y las porciones centrales de los intrones fueron removidas para facilitar el análisis. La comparación directa de los mapas de mutaciones con las secuencias obtenidas de pacientes permite visualizar simultáneamente la calidad del secuenciamiento y las mutaciones previamente descriptas.

Consideraciones éticas

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Instituto Nacional de Cardiología (proceso nº 0187/4.01.08). Los pacientes y familiares fueron informados de los objetivos y riesgos del estudio y concordaron en participar del mismo a través de firma del término de consentimiento libre y aclarado.

Resultados

Fue realizada investigación de variantes génicas de KCNQ1, KCNH2 y SCN5A en dos familias con diagnóstico clínico de SQTL, incluyendo en el análisis dos probandos y sus respectivos familiares, completando 11 individuos en la Familia A y 17 en la Familia B. El análisis de las variantes fue optimizada mediante creación de mapas de mutación con el software Geneious Pro® (datos no mostrados).

La probanda de la Familia A (Figura 1A, paciente A2.21), de 36 años, comenzó a sentir palpitaciones a los 15 años; a los 24 años empezó a presentar episodios de palpitaciones seguidas de síncope desencadenados por estrés emocional, ruidos súbitos y en el despertar, siendo hecho el diagnóstico de SQTL. La probanda de la Familia B (Figura 1B, paciente B2.1) presentaba 42 años y episodios de presíncope durante esfuerzos físicos. La misma buscó atención médica y recibió el diagnóstico de SQTL después de que su prima (#B2.9) presentó un episodio de muerte súbita abortada (MSA) en ambiente hospitalario. Los ECGs con medidas del intervalo QT de las probandas están mostrados en la Figura 2. La paciente A2.21 presentaba QTC = 560 ms (Figura 2A) y la paciente B2.1 QTC = 551 ms (Figura 2B). En la historia familiar de la probanda A2.21 era posible identificar 10 casos de muerte súbita en edades precoces, compatibles con SQTL. (Figura 1A, destacado en verde). En la Familia B había solamente un caso de MSA (#B2.9).

 

 

Los datos clínicos y electrocardiográficos de los individuos de ambas familias están presentados en la Tabla 1. La Familia A totalizaba 9 mujeres y 2 hombres, con edad entre 14 y 80 años. La Familia B contenía 17 individuos (7 del sexo masculino), con edades entre 5 meses y 69 años. Pueden ser identificados 8 individuos con Escore de Schwartz > 4, cuatro en la Familia A (A2.21, A2.23, A3.2, A3.3) y 4 en la Familia B (B1.1, B2.1, B2.9, B3.1). Dos de esos individuos (A2.21 y B2.9) presentaron episodios de muerte súbita abortada (MSA) y fueron tratados con CDI + betabloqueante. Los demás (A1.10, A2.23, A3.2, A3.3, B1.1) eran asintomáticos y fueron tratados con betabloqueantes aisladamente. Uno de los casos de MSA (B2.9) presentaba intervalo QTC = 448 ms, entre tanto, este ECG fue registrado en la vigencia del tratamiento con betabloqueante, que puede reducir el intervalo QT. Apenas un individuo (A1.10) presentaba probabilidad intermedia de SQTL (Escore de Schwartz = 2,5) y QTC limítrofe (450 ms). El análisis del heredograma sugirió que ese individuo debería ser portador de mutación causante de SQTL, lo que fue confirmado por el análisis molecular. Apenas un individuo (A2.21) presentaba registro de Torsades de Pointes.

El análisis molecular fue capaz de detectar variaciones previamente descriptas del gen KCNH2 en las probandas de ambas familias. En la probanda de la Familia A fueron identificadas las variantes génicas A1692G y G1714A, ambas en el exón 8. En la probanda de la Familia B fueron identificadas las variantes génicas C1467T, C1600T, A1692G y T1956C. Todas las variantes encontradas son polimorfismos de único nucleótido (SNPs) y las pacientes son heterocigotas en todos los loci. Entre tanto, las variantes génicas G1714A (Familia A) y C1600T (Familia B), ambas en el exón 8 del gen KCNH2, son SNPs del tipo no sinónimo (missence) y fueron previamente descriptas como asociadas a la SQTL. La identificación de esas variantes génicas es destacada en la Figura 3. Las otras variantes encontradas son polimorfismos comunes y sin relevancia clínica demostrada12.

Las variantes missence G1714A y C1600T fueron investigadas en los familiares de los probandos A2.21 y B2.1, respectivamente. Los resultados de ese genotipaje están presentados en las Figuras 1A y 1B. En la Familia A el QTC medio en los portadores de la variante génica era de 521 ± 42 ms, comparado a un QTC medio de 391 ± 21 ms en los no portadores. En la Familia B la media del intervalo QTC en los portadores de la variante era de 497 ± 42 ms, comparado con un QTC medio de 404 ± 29 ms en los no portadores. Se observa, por lo tanto, que todos los portadores de los alelos G1714A y C1600T presentan prolongación del intervalo QTC, confirmando la relevancia clínica de las variantes encontradas.

Discusión

En este trabajo realizamos el secuenciamiento completo de las regiones codificantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A buscando identificar las variantes génicas asociadas a la SQTL en dos familias conteniendo miembros diagnosticados con la enfermedad. A pesar de que la selección de variantes génicas en la SQTL frecuentemente es hecha utilizando la técnica de SSCP (single strand conformation polymorphism), que requiere mayor trabajo manual y presenta sensibilidad inferior a la de secuenciamiento.

Las dificultades de implementación en rutina de un método diagnóstico molecular de alta complejidad como la del SQTL nos llevaron a desarrollar, utilizando el software Geneious Pro®, una secuencia de pasos para identificar con precisión mutaciones nuevas y ya descriptas. Los recursos de manipulación y anotación de secuencias de ese software fueron explorados para la construcción de mapas de mutación indicando los lugares con mutaciones descriptas, permitiendo el alineamiento de las secuencias de los diferentes genes obtenidas de los pacientes con los mapas de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A construidos, facilitando la identificación de diferencias entre ambas secuencias. El alineamiento realizado en ese programa permite, aun, eliminar artefactos de secuenciamiento. En el caso de que una variante génica encontrada haya sido previamente descripta como asociada a la SQTL, la referencia bibliográfica de la misma estará prontamente disponible en las marcaciones del mapa. Además de eso, el programa organiza los archivos internamente en un sistema de carpetas, de modo que los diversos archivos de secuencia originales quedan centralizados e indexados, lo que es crucial cuando se toma en cuenta el enorme volumen de información generada para cada paciente. De esa forma, la metodología desarrollada permite el análisis de las secuencias de manera eficiente y de fácil manejo, reduciendo la posibilidad de errores de interpretación y posibilitando el entrenamiento técnico de personal para la futura implementación de rutina de esa metodología para la red SUS.

La metodología de análisis molecular por nosotros establecida fue capaz de identificar variantes génicas previamente asociadas a la enfermedad en dos familias seleccionadas por los criterios clínicos ya definidos. Ambas familias investigadas presentaron variantes asociadas a la SQTL en el gen KCNH2, lo que permitió clasificar ambas pacientes como portadoras de SQTL tipo 2. Ese gen codifica la subunidad alfa del canal de potasio KV11.1, responsable por la corriente IKr en el potencial de acción cardíaco26. La variante G1714A encontrada en la Familia A ya fue previamente descripta27 como asociada a la SQTL, y provoca la substitución del aminoácido glicina por serina en la posición 572 de la proteína, correspondiente al poro. Entre tanto, las consecuencias electrofisiológicas de la mutación en la actividad del canal iónico aun no fueron investigadas. La presencia de la variante génica G1714A en la familia aquí descripta refuerza la evidencia en favor de la patogenicidad de esa alteración. La variante génica C1600T, encontrada en la Familia B, provoca el intercambio del aminoácido arginina por cisteína en la posición 534 del polipéptido, correspondiente al sensor de voltaje del mismo canal iónico28. Además de eso, en contraste a la variante anterior, los efectos de esa alteración fueron investigados electrofisiológicamente por Nakajima et al29, que demostraron reducción del umbral de activación del canal, aceleración de la activación e inactivación, y reducción de la inactivación del canal en reposo.

Curiosamente, el genotipo identificado fue el del subtipo 2 - el segundo más frecuente, respondiendo por cerca de 30% de los casos. Por otro lado, aunque esas familias fuesen portadoras del mismo subtipo, y de que las variantes génicas están bastante próximas (en el mismo exón, inclusive), la presentación clínica de la enfermedad difería entre las mismas, tal vez debido a alteraciones en diferentes regiones del canal iónico. La asociación entre la región alterada en la estructura de la proteína, y la gravedad de la enfermedad fue investigada por Moss et al19. Los autores demostraron que las mutaciones en la región del poro del canal codificado por el gen KCNH2 están asociadas a un riesgo muy aumentado - cerca de 3 veces mayor - de eventos arritmogénicos. Un estudio de Shimizu et al30 obtuvo resultados similares. En conformidad con esos trabajos, observamos una gravedad mucho mayor de la enfermedad en la Familia A (mutación en la región S5-Poro) que en la Familia B (mutación en el segmento transmembrana S4 - sensor de voltaje). Entre tanto, otro factor descripto que resulta en mayor gravedad en la presentación clínica es la presencia de más de una mutación causante de SQTL (compound mutations), que ocurre en cerca de 2% de los casos31. Como no fueron investigadas las variantes génicas en los genes menos frecuentemente asociados a la SQTL (SQTL tipos 4-12), no podemos excluir la posibilidad de que la Familia A sea un caso de ese tipo.

Fueron encontrados portadores asintomáticos, pero no portadores silenciosos con ECG normal. Portadores silenciosos son descriptos en la SQTL4,5,32, siendo más comunes en la SQTL114. El individuo A1.10 es ilustrativo de la complejidad de la enfermedad: aunque sea portador de la variante asociada a la enfermedad, su electrocardiograma muestra una prolongación apenas limítrofe del intervalo QTC (450 ms) y su Escore de Schwartz es igual a 2,5. Diversos factores pueden influenciar el intervalo QT - algunas enfermedades, las concentraciones séricas de iones calcio y potasio y diversos medicamentos - y de esa forma pueden influenciar en la presentación de la SQTL. Además de eso, algunos trabajos recientes demostraron que polimorfismos comunes en genes de receptores adrenérgicos cardíacos son capaces de modular la duración del intervalo QT y la gravedad de la presentación clínica entre portadores de la misma mutación en el gen KCNQ133. Por lo tanto, la investigación de variantes génicas en la SQTL puede auxiliar en la identificación de portadores asintomáticos con el intervalo QT limítrofe, y puede ser útil al aconsejamiento genético.

Conclusión

Fue realizada la investigación molecular de dos familias con diagnóstico clínico de SQTL, han sido encontradas dos variantes génicas distintas previamente asociadas a la enfermedad. Fue implementada metodología de amplificación y secuenciamiento de la región codificante completa de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A, y desarrollado método computacional simplificado de análisis de las secuencias para la investigación de las variantes génicas utilizando recursos del software Geneious Pro®, que facilita el entrenamiento de personal técnico para la futura aplicación de esa metodología en la rutina diagnóstica.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

CNPq financió el presente estudio y FAPERJ financió parcialmente.

Vinculación Académica

Este artículo forma parte de Disertación de Maestría de Ernesto Curty, por la Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Referencias