A farmacogenética é um dos campos mais promissores da medicina. A conclusão do Projeto Genoma permitiu que esse campo começasse a descobrir fatores complexos modulando a resposta às drogas, e novas tecnologias estão a poucos passos de permitir uma grande expansão da área. As doenças cardiovasculares estão atualmente entre as maiores causas de internações hospitalares e morte, e têm sido alvo de grande parte dos estudos genéticos de doenças complexas. Paralelamente à identificação de marcadores de suscetibilidade à doença, é necessária a investigação de como perfis genéticos diferentes podem alterar respostas aos fármacos atualmente empregados. O sistema biológico que controla a produção endotelial do óxido nítrico tem sido um dos grandes alvos nas respostas farmacológicas aos fármacos usados na terapia de doenças cardiovasculares. Esta revisão tem como objetivo abordar os conhecimentos correntes da interação entre as variações genéticas da eNOS e as respostas farmacológicas aos fármacos empregados no sistema cardiovascular.
IFaculdade de Ciências Médicas - Departamento de Farmacologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
IIFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Departamento de Farmacologia - Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - Brasil
A farmacogenética é um dos campos mais promissores da medicina. A conclusão do Projeto Genoma permitiu que esse campo começasse a descobrir fatores complexos modulando a resposta às drogas, e novas tecnologias estão a poucos passos de permitir uma grande expansão da área. As doenças cardiovasculares estão atualmente entre as maiores causas de internações hospitalares e morte, e têm sido alvo de grande parte dos estudos genéticos de doenças complexas. Paralelamente à identificação de marcadores de suscetibilidade à doença, é necessária a investigação de como perfis genéticos diferentes podem alterar respostas aos fármacos atualmente empregados. O sistema biológico que controla a produção endotelial do óxido nítrico tem sido um dos grandes alvos nas respostas farmacológicas aos fármacos usados na terapia de doenças cardiovasculares. Esta revisão tem como objetivo abordar os conhecimentos correntes da interação entre as variações genéticas da eNOS e as respostas farmacológicas aos fármacos empregados no sistema cardiovascular.
Os resultados iniciais do Projeto Genoma foram publicados em 20011 e, nestes últimos oito anos, houve um grande avanço no entendimento dos mecanismos moleculares que permeiam as influências genéticas no ser humano. Uma das principais implicações do conhecimento acumulado do genoma humano é a investigação de características genéticas e suas associações a fenômenos até então não explicados.
As características genéticas variáveis (polimorfismos) estudadas se dividem em três grandes grupos: polimorfismos de base única (
Recentemente foi disponibilizada a base de dados do
Inerentes a todos os tratamentos farmacológicos existem situações de não resposta e toxicidade a doses usuais de fármacos, que não podem ser explicados por comorbidades, situações fisiológicas específicas ou hábitos dos pacientes. A farmacogenética é o campo do conhecimento focado no estudo de interações de polimorfismos genéticos com a farmacologia, tratando tanto de alterações na cinética dos fármacos (absorção, transporte, metabolização e eliminação) como na dinâmica da interação dos fármacos com seus receptores3.
A farmacogenética visa detectar previamente características individuais dos pacientes que possam identificá-los como "bons respondedores", ou "maus respondedores", a cada tratamento farmacológico. Milhões de dólares são gastos anualmente em todo o mundo com tratamentos ineficazes (incapazes de tirar o paciente de uma situação de risco), ou com internações por intoxicações farmacológicas; situações que poderiam ser evitadas otimizando a prática da "tentativa e erro" usada na clínica4. Os dados são de fato alarmantes: em torno de 7% do total de internações nos Estados Unidos em 2006 e de 6,5% no Reino Unido em 2004 foram decorrentes de reações adversas a medicamentos5,6. Esses números mostram a grande importância da personalização e racionalização no uso dos medicamentos.
Basicamente, o objetivo maior da farmacogenética é individualizar os tratamentos farmacológicos de maneira racional, direcionada, e, sobretudo, com fortes bases científicas para reduzir os efeitos colaterais, a ineficácia terapêutica e seus desdobramentos.
Os avanços na biologia molecular e na bioquímica têm evidenciado o real desafio da farmacogenética: cada via fisiológica tem dezenas de proteínas que interagem entre si; cada proteína, codificada por seu gene (com polimorfismos), pode ter sua transcrição regulada por diversas outras proteínas, cujos genes também têm polimorfismos. Adicionando complexidade a isso, as vias bioquímicas interagem entre si de maneiras complexas (muitas delas ainda desconhecidas), de forma que às vezes o real causador de uma alteração na resposta ao fármaco não é, de forma alguma, óbvio.
Tal complexidade leva a duas correntes genéricas para o estudo da farmacogenética: os estudos baseados em
Por definição, GWAs testam apenas variantes comuns dos genes, ignorando completamente variantes raras (que podem, potencialmente, exercer grandes efeitos na resposta a fármacos)9,10; além disso, os chips atuais se baseiam nos painéis do
Outro desafio nos GWAs é a interpretação dos dados; em alguns casos, ocorrem relações que se demonstram nitidamente artefatos por flutuações estatísticas8. Até o momento, a maioria dos GWAs se concentrou nos polimorfismos para suscetibilidade a doenças, existindo apenas poucos estudos em farmacogenética, de forma que ainda existe um grande campo para a expansão desse tipo de estudo na resposta diferenciada aos fármacos6.
Existe uma outra abordagem, talvez tão eficiente quanto os GWAS, para se estudarem genes que participam de mecanismos fisiológicos já conhecidos8. Essa visão baseia-se na sugestão de que se um gene é implicado na causa de uma doença, ou é capaz de influenciar a resposta a um fármaco, provavelmente outros genes na mesma via também podem estar envolvidos8. Idealmente, estudos prévios determinam o efeito dos polimorfismos por ensaios moleculares de expressão e/ou atividade enzimática, e os resultados encontrados podem então ser verificados em seres humanos em estudos clínicos10. Nesses, a genotipagem é realizada por métodos comuns, e é acompanhada pela análise de marcadores bioquímicos relacionados à proteína afetada, e pela associação com o fenótipo final (doença ou resposta ao tratamento). Essa abordagem genótipo-bioquímica-fenótipo final é de grande valia, pois polimorfismos genéticos podem causar alteração na atividade ou expressão de proteínas. Essas, por sua vez, podem alterar as concentrações plasmáticas de algum produto bioquímico envolvido em um processo fisiopatológico. Dessa forma, tais polimorfismos podem ter grande valor preditivo na clínica médica. Dois exemplos recentes de estudos que podemos citar são: i) o estudo de polimorfismos no gene da aldosterona sintase, com posterior quantificação da concentração de aldosterona circulante, e avaliação da associação com hipertensão resistente12; ii) o estudo de polimorfismos na eNOS, quantificação de níveis plasmáticos de nitrito, e investigação da associação com pré-eclampsia13. Essa abordagem não necessita de recursos humanos e financeiros tão grandes e, por suas características, possui um grande potencial de gerar resultados mais focados nos problemas clínicos, com aplicabilidade em curto prazo.
Provavelmente, o ideal seria buscar a complementação de GWAs com estudos tradicionais, unindo a grande abrangência dos GWAS com as vantagens de se ter o foco em hipóteses de grande interesse. Essa combinação poderia levar a conclusões mais sólidas, sem negligenciar achados importantes7.
Enfim, a farmacogenética é uma ciência nova, que promete grandes impactos na maneira como as doenças serão tratadas. Esta revisão abordará os mecanismos da interação de polimorfismos no gene da sintase endotelial de óxido nítrico com as respostas farmacológicas às drogas cardiovasculares em uso corrente.
O endotélio tem um papel importante na regulação da homeostase vascular e na manutenção do tônus vascular, estando envolvido com vias fisiológicas importantes no controle da resistência arterial ao fluxo sanguíneo. Entre diversos mediadores liberados pelo endotélio, o óxido nítrico (NO) exerce papel fundamental na regulação do sistema cardiovascular. Após sua formação pelo endotélio, o NO difunde-se para o músculo liso e interage com o grupo heme da guanilato ciclase solúvel (sGC) tornando-a ativa. Essa enzima sintetiza guanosina monofosfato cíclica (GMPc) a partir da guanosina trifosfato (GTP), levando a um acúmulo de GMPc nessas células. Isso ativa vias de sinalização intracelulares que diminuem o grau de contração do músculo liso vascular, levando ao relaxamento do vaso14. Além desses efeitos vasculares, o NO também está envolvido na inibição da agregação e adesão plaquetária.
O NO é formado pelas enzimas NO-sintases (NOS), que catalisam a conversão de L-arginina em L-citrulina e NO. Existem três isoformas dessa enzima: neuronial (nNOS ou NOSI), induzida (iNOS ou NOSII) e endotelial (eNOS ou NOSIII)15. A nNOS é encontrada em uma variedade de células que incluem os neurônios e células endoteliais. Tanto a nNOS quanto a eNOS são isoformas constitutivas e são cálcio-dependentes, necessitando do aumento dos níveis de cálcio intracelular e consequente ligação desse com a calmodulina (CaM) para a ativação dessas enzimas. A iNOS não é constitutiva e é expressa em processos inflamatórios.
No sistema cardiovascular, a eNOS é a principal responsável pela síntese de NO14,16. A eNOS localiza-se nas invaginações da membrana plasmática de células endoteliais, denominadas cavéolas. A interação da eNOS com uma proteína chamada caveolina resulta na inatividade da eNOS que se deve, em parte, pela ocupação do sítio de ligação da calmodulina17.
A redução da expressão ou da atividade da eNOS pode resultar em menor produção de NO. Diversos estudos têm sugerido que o desequilíbrio na biodisponibilidade do NO exerce papel significativo na disfunção endotelial. Várias doenças estão associadas com disfunção endotelial e redução da biodisponibilidade do NO, entre elas, hipertensão18, pré-eclampsia19 e síndrome metabólica20.
O estresse oxidativo está envolvido em processos fisiopatológicos de inúmeras doenças cardiovasculares, e existem evidencias que demonstram sua contribuição na disfunção endotelial. As espécies reativas do oxigênio (ROS), como o ânion superóxido, reagem com o NO resultando na formação de peroxinitrito. O aumento na produção de ROS leva, portanto, a uma redução da biodisponibilidade do NO21, podendo favorecer o surgimento de diversas doenças cardiovasculares. O aumento das ROS também pode levar à oxidação do cofator BH4 da eNOS, levando a um desacoplamento dessa enzima. Dessa forma, a eNOS passa a produzir ânion superóxido em vez de NO22, levando a um ciclo vicioso que aumenta cada vez mais o estresse oxidativo e reduz cada vez mais a disponibilidade de NO.
Diversos grupos de drogas usadas no tratamento de doenças cardiovasculares aumentam a biodisponibilidade do NO. Dentre elas, temos os inibidores da enzima conversora de Angiotensina (iECA), antagonistas dos receptores de Angiotensina II (Ang II) e os bloqueadores do canais de cálcio (BCC)23. Além desses anti-hipertensivos, diversos estudos têm evidenciado o aumento do NO causados por inibidores da 3-metilglutaril coenzima A redutase (estatinas), provavelmente de forma independente da redução dos níveis de lipídeos24,25.
Inibidores da ECA atuam reduzindo as concentrações de Ang II, um potente vasoconstritor endógeno. Paralelamente, ocorre um aumento das concentrações de cininas (cujo efeito predominante é oposto à AngII), e isso contribui para os efeitos cardiovasculares dessas drogas26. Os iECA parecem também estimular a expressão e atividade da eNOS27,28, provavelmente envolvendo a ligação das cininas aos seus receptores29-31. Esses efeitos são inibidos pelo tratamento concomitante com HOE-140, um antagonista do receptor B2 de cinina27,32.
Os inibidores dos receptores de Ang II são utilizados por inibirem competitivamente a ligação da Ang II ao receptor AT1, atenuando os efeitos vasoconstritores da Ang II. Essas drogas também atuam aumentando a biodisponibilidade de NO, provavelmente pelo aumento da expressão proteína eNOS ou ativação de outros receptores que levam à ativação da eNOS23,33.
Os bloqueadores de canais de cálcio (BCC) inibem a entrada de cálcio nas células musculares lisas, e dessa forma levam a uma menor contratibilidade e débito cardíaco. Existem evidências de que essa classe também aumenta a biodisponibilidade do NO23,34. Estudos clínicos evidenciaram significativa melhora da vasodilatação endotélio-dependente em pacientes hipertensos e hipercolesterolêmicos tratados com BCC, mostrando reversão da disfunção endotelial23. Provavelmente o aumento do NO é decorrente do aumento da atividade e expressão da eNOS associado a essas drogas35.
As estatinas estão entre as drogas mais amplamente usadas e efetivas para prevenção de doenças cardiovasculares36, especialmente quando se consideram suas ações sobre as concentrações circulantes de lipoproteínas e seus efeitos cardioprotetores de longo prazo. Alguns dos efeitos pleiotrópicos observados parecem estar associados ao aumento da produção endógena de NO37,38, possivelmente atribuídos ao aumento expressão e atividade da eNOS39,40.
A disfunção erétil é uma desordem de origem neuronial e vascular, e vem sendo vista como um fator de risco precoce para outras doenças cardiovasculares41. Os inibidores da fosfodiesterase 5 (IPDE-5) são fármacos empregados na disfunção erétil e na hipertensão pulmonar por agirem por meio da inibição da degradação de GMPc, levando a um relaxamento da musculatura lisa dos vasos. No caso da hipertensão pulmonar isso levaria a uma normalização da pressão, e na disfunção erétil facilitaria o intumescimento do pênis decorrente do estímulo neurogênico41. Síndromes em que a síntese de NO está comprometida, como diabetes e falência cardíaca, reduzem a eficácia dos IPDE-5 atuais em induzir vasodilatação42,43 e alterar a função cardíaca44.
O gene da eNOS (localizado na região 7q35-7q36) contém 26 exons, 25 introns e aproximadamente 21 a 22 Kb45,46. Desde a sua caracterização no início dos anos 1990, grande número de sítios polimórficos foi identificado, incluindo VNTRs, repetições de dinucleotídeos (CA)n e SNPs47. Vários desses polimorfismos têm sido associados a doenças cardiovasculares, tais como hipertensão, pré-eclampsia, entre outras47-49.
Um dos polimorfismos clinicamente relevantes mais estudados é um SNP na região promotora (T-786C), frequentemente associado ao desenvolvimento de doença coronariana50,51. Estudos
Outro polimorfismo no gene da eNOS amplamente estudado é um VNTR localizado no intron 4 (repetição de 27pb). Os alelos mais encontrados apresentam quatro cópias (variante a, mais rara) ou cinco cópias (variante b, mais comum). Os estudos de funcionalidade e de associação desse polimorfismo com eventos cardiovasculares têm demonstrado resultados conflitantes47,53,54. Recentemente tem sido proposto que esse polimorfismo regularia a expressão da eNOS pela formação de pequenos RNAs (sirRNA). Células endoteliais contendo cinco cópias apresentam quantidades maiores de sirRNA e menores níveis de mRNA da eNOS do que células contendo quatro cópias55,56 (
Um terceiro polimorfismo, um SNP localizado no exon 7 do gene da eNOS tem sido associado com risco cardiovascular47,57. Esse polimorfismo é caracterizado por uma conversão da guanina pela timina na posição 894 do gene, e consequente substituição da glutamina (alelo mais comum) pelo aspartato (alelo mais raro) no resíduo 298 da eNOS (Glu298Asp)45. Evidências apontam para menores formações de NO em indivíduos portadores do alelo Asp, levando a possíveis alterações funcionais58,59. Células endoteliais portadoras desse alelo parecem produzir menos NO, por uma diminuição na disponibilidade da eNOS na cavéola dessas células60 (
Apesar das evidências discutidas anteriormente, existe certa controvérsia na influência genética da eNOS sobre as doenças cardiovasculares47. Uma possível explicação para esses resultados discrepantes pode ser que simples associações clínicas feitas a partir da análise de um único marcador genético (genótipo) com um fenótipo clínico não tenham um poder suficiente para detecção de seus efeitos pequenos. Uma abordagem alternativa seria a análise da combinação de vários marcadores genéticos em paralelo (haplótipo)48,61. Por exemplo, Sandrim e cols. 62 avaliaram a influência dos genótipos/haplótipos da eNOS na elevação da pressão arterial utilizando os três polimorfismos mais comuns (T-786C; Glu298Asp e 4b/a). A análise de genótipos não evidenciou haver diferenças significativas entre normotensos e hipertensos. Entretanto, a análise haplotípica mostrou claramente a existência de diferenças significativas entre os dois grupos experimentais. Ainda, outros estudos mostraram associação de haplótipos da eNOS com diferentes concentrações circulantes de nitrito, o que sugere que esses haplótipos possam ter implicações funcionais que propiciem risco variado de desenvolvimento de doenças cardiovasculares63,64. Essa abordagem haplotípica parece ser mais promissora que a análise de apenas um polimorfismo por vez, especialmente no estudo de doenças complexas.
Estudos têm mostrado relações entre polimorfismos do gene da eNOS com respostas diferenciadas a diversas classes de drogas utilizadas no tratamento de doenças cardiovasculares.
Evidências recentes sugerem uma modulação dos efeitos das estatinas por polimorfismos genéticos da eNOS. Curiosamente, um estudo com células endoteliais em cultura, tratadas com estatinas, mostrou que esses fármacos induzem maiores aumentos dos níveis de mRNA da eNOS em células endoteliais com genótipo CC quando comparadas a células TT para o polimorfismo T-786C65. Isso se deve, provavelmente, à maior atividade transcricional, aumento da estabilidade do mRNA e diminuição da expressão de RPA165. Confirmando esses achados em culturas de células endoteliais, um estudo clínico mostrou efeitos similares com a atorvastatina66. Nesse estudo, demonstrou-se que o tratamento com estatina aumentou a biodisponibilidade do NO e diminuiu o estresse oxidativo apenas em indivíduos homozigotos CC para o polimorfismo T-786C66. Note-se que foram estudados indivíduos sadios, fazendo que a droga tivesse muito menos chance de produzir efeitos significativos66. Posteriormente, foi observado que os efeitos anti-inflamatórios da atorvastatina são modulados pelo mesmo polimorfismo, levando a uma redução significativa nas concentrações de citocinas inflamatórias (CD40L, VCAM-1, P-selectina e MMP-9) em indivíduos com genótipo CC, mas não nos indivíduos TT67. Estudos funcionais demonstraram subsequentemente que o tratamento de curto prazo com estatinas é capaz de reduzir a fluidez da membrana plasmática de hemácias em indivíduos com genótipo CC, mas não com genótipo TT, durante tratamento com atorvastatina68. Juntos, esses achados indicam que a atorvastatina poderia ser mais útil para a prevenção de eventos cardiovasculares em indivíduos com o genótipo CC (cujo risco cardiovascular tem se demonstrado aumentado) do que em indivíduos com genótipo TT.
De qualquer forma, os resultados dos estudos com atorvastatina mencionados devem ser interpretados com cautela, pois não foram avaliados eventos clinicamente relevantes e a simples medida de marcadores bioquímicos pode não ser efetiva para indicar novos usos de drogas. Estudos clínicos enfocando eventos clinicamente relevantes deveriam ser feitos para comprovar os resultados discutidos antes.
Ainda que a maioria dos estudos farmacogenéticos das estatinas relacionados a eNOS centre-se no polimorfismo na região promotora da eNOS, o polimorfimo no íntron 4 também parece modular a resposta às estatinas. Kunnas e cols. 69 avaliaram a vasodilatação coronariana induzida por adenosina em indivíduos saudáveis após seis meses de tratamento com pravastatina. Os indivíduos portadores do alelo "a" mostraram significativa melhora da vasodilatação quando comparados aos indivíduos com genótipo "bb", possivelmente pelo maior aumento da produção endotelial de NO nos indivíduos com o alelo raro69.
Outro polimorfismo no gene da eNOS, Glu298Asp no exon 7, parece modular os efeitos do estradiol na função plaquetária. O pré-tratamento com 17β-estradiol aumentou de forma significativa a taxa de agregação plaquetária, acompanhada pela elevação da liberação de íons superóxido pelas plaquetas apenas em indivíduos homozigotos para o alelo Asp298. A liberação de NO derivado das plaquetas não foi alterada pelos polimorfimos Glu298Asp, T-786C e 4b/a após tratamento. Adicionalmente, o efeito do hormônio na função plaquetária não foi afetado pelos polimorfismos na região promotora e ínton 458.
Uma das classes de fármacos mais importantes no controle da hipertensão, especialmente no caso de excesso de volume, é a dos diuréticos tiazídicos. A hidroclorotiazida (HCTZ) é seu representante mais utilizado na clínica médica. Foi demonstrado que o polimorfismo Glu298Asp no gene da eNOS é capaz de modular a resposta à HCTZ, de maneira que indivíduos homozigotos para o alelo Glu tem uma redução nos níveis de pressão arterial significativamente maior do que indivíduos carreadores do alelo Asp70. Apesar do efeito ser significativo, ele é pequeno, o que evidencia que dificilmente um único polimorfismo será capaz de explicar todo o
Outras classes de anti-hipertensivos de grande importância são os betabloqueadores e os inibidores do receptor AT-1 de angiotensina 2. Um estudo usando técnicas análogas aos GWAS mostrou resultados promissores associando polimorfismos menos estudados da eNOS a variações nas respostas farmacológicas de propanolol e irbesartan (betabloqueador e inibidor do receptor AT-1 de angiotensina 2, respectivamente). O alelo G do polimorfismo A2996G foi associado com uma maior diminuição da pressão arterial decorrente do efeito do betabloqueador atenolol em relação ao alelo A71. O alelo A do polimorfismo G498A foi associado a uma melhor resposta tanto ante o betabloqueador quanto ante o irbersartan71. A presença dos alelos 2996G e do alelo 498A poderia incorrer em um benefício maior aos portadores desses alelos tratados com esses anti-hipertensivos. Esses resultados, apesar de promissores, ainda devem ser confirmados em estudos com maior número de pacientes, de diferentes populações.
A hipertensão normalmente é tratada com a adição de diferentes classes de anti-hipertensivos até a redução da pressão arterial aos níveis preconizados72. Hipertensos resistentes são indivíduos que mantêm seus níveis de pressão arterial acima de 140/90 mmHg apesar do uso de três classes diferentes de anti-hipertensivos, incluindo um diurético. Nesse contexto, foi demonstrada uma tendência não significativa de associação entre o alelo Asp (Glu298Asp) e hipertensão resistente73. Estudos posteriores analisando haplótipos da eNOS não confirmaram nenhuma associação com a resistência à terapia anti-hipertensiva62.
A disponibilidade de NO afeta a predisposição à disfunção erétil de forma análoga à hipertensão. A classes dos fármacos utilizados no tratamento da disfunção erétil, os IPE-5, também sofre influência de polimorfismos na sua resposta terapêutica. Como comentado anteriormente, a disponibilidade de NO é um fator determinante para a atividade dos IPDE-542. Foi demonstrado que homens homozigotos para o alelo Asp (associado à menor produção de NO) obtiveram menor resposta ao sildenafil quando comparados aos indivíduos com genótipo Glu/Glu74.
A farmacogenética é uma área da farmacologia bastante recente, e ainda tem muito a crescer. Os resultados do projeto genoma causaram uma promoção e popularização da área, e estamos vivendo atualmente um momento prestes a uma grande expansão, graças aos
É importante frisar que os avanços prometidos pela farmacogenética, infelizmente, ainda estão longe da prática clínica e do paciente.
O futuro da medicina caminha cada vez mais para a personalização das terapias, e para o uso racional de tratamentos farmacológicos. A farmacogenética tem um grande espaço nesse cenário hipotético. A ideia, levada a um extremo utópico, seria identificar os polimorfismos genéticos importantes logo ao nascimento, de modo a escolher
A hipertensão, um dos maiores males do mundo moderno, poderia ser tratada de maneira mais eficaz, possivelmente até prevenida, mediante a identificação precoce de marcadores de risco, e do tratamento profilático.
De maneira geral, os avanços genéticos prometem revolucionar a medicina nas próximas décadas; resta avaliar quais das grandes promessas do fim do século XX (terapia gênica, células tronco, farmacogenética) vão realmente dar frutos, e em que proporção.
Agradecemos o apoio financeiro da Fapesp, do CNPq e da Capes.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP, CAPES e CNPq.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
José Eduardo Tanus-Santos Av. Bandeirantes 3900 - Monte Alegre 14090-900 - Ribeirão Preto, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 08/07/09; revisado recebido em 08/07/09; aceito em 25/01/10.
The pharmacogenetics is one of the most promising fields of medicine. The conclusion of the Genome Project allowed this field to start discovering complex factors modulating the response to drugs, and new technologies are close a great expansion of the area. The cardiovascular diseases are currently among the major causes of hospitalizations and death, and have been the target of a large part of genetic studies of complex diseases. Parallel to the susceptibility to disease markers identification, it is necessary to investigate how different genetic profiles can change the responses to the currently used drugs. The biological system that controls the endothelial production of the nitric oxide has been one of the greatest targets in the pharmacological responses to the drugs used in the cardiovascular diseases therapy. This review aims at approaching the current knowledge on interaction among the genetic variations of eNOS and the pharmacological responses to the drugs used in the cardiovascular system.
IFaculdade de Ciências Médicas - Departamento de Farmacologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
IIFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Departamento de Farmacologia - Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - Brasil
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The pharmacogenetics is one of the most promising fields of medicine. The conclusion of the Genome Project allowed this field to start discovering complex factors modulating the response to drugs, and new technologies are close a great expansion of the area. The cardiovascular diseases are currently among the major causes of hospitalizations and death, and have been the target of a large part of genetic studies of complex diseases. Parallel to the susceptibility to disease markers identification, it is necessary to investigate how different genetic profiles can change the responses to the currently used drugs. The biological system that controls the endothelial production of the nitric oxide has been one of the greatest targets in the pharmacological responses to the drugs used in the cardiovascular diseases therapy. This review aims at approaching the current knowledge on interaction among the genetic variations of eNOS and the pharmacological responses to the drugs used in the cardiovascular system.
The initial results of the Genome Project were published in 20011 and, over these eight years, there was a great advance in the understanding of the molecular mechanisms that involve the genetic influences on the human being. One of the main implications of the accumulated human genome knowledge is the genetic characteristics investigation and its association to phenomena not explained so far.
The variable genetic characteristics (polymorphisms) studied are divided into three large groups: single nucleotide polymorphisms - SNPs, variation in the specific sequences of repeats number (micro satellites and variable number of tandem repeats), and insertions/deletion of specific genic sequences. To be characterized as polymorphisms, these characteristics may be one stable frequency in at least 1% of the population and, per se, may not be able to cause any genetic disease. These polymorphisms are responsible for the differences of the individual characteristics in each human being in our population.
Recently, the data base of the International HapMap Project was made available, presenting the so-called "tagSNPs" (SNPs that sign the presence of a specific set of alleles in other close polymorphisms). The polymorphisms located very close one to the other tend to segregate together from the parents to the children, forming haplotypes. The idea of the "tagSNPs" is to genotype only some polymorphisms representing these haplotypes and infers the others by probability. Each population has its own set of "tagSNPs", contemplated in a large part by the HapMap Project2.
Inherent to all the pharmacological treatments, there are situations of non-response and toxicity to usual doses of drugs, which can not be explained by comorbidities, specific physiological situation or patients' habits. The pharmacogenetics is the knowledge field focused on the study of the genetic polymorphism interactions with the pharmacology, treating the changes in the drug's kinetics (absorption, transport, metabolization and clearing), as well as on the dynamics of the drugs' interaction with their receptors3.
The pharmacogenetics aims at early detecting individual characteristics of the patients that can identify them as "good respondents", or "bad respondents", to each pharmacological treatment. Millions of dollars are spent every year, all over the world, in non-effective treatments (unable to remove the patient from a risk situation), or with hospitalizations due to pharmacological intoxications; such situations could be prevented optimizing the "trial and error" practice used in clinic4. The data are really alarming: around 7% of the total hospitalizations in the United States in 2006 and 6.5% in the United Kingdom in 2004 were due to adverse reactions to medications5,6. These numbers show the great importance of the personalization and rationalization of medication use.
Basically, the greatest objective of the pharmacogenetics is to individualize the pharmacological treatments in a rational, directed and, above all, with strong scientific basis way to reduce the side effects, the therapeutic inefficacy and their consequences.
The advances in molecular biology and biochemistry have been evidencing the actual challenge of the pharmacogenetics: each physiological pathway has dozens of proteins that interact among themselves; each protein, codified by its gene (with polymorphisms), can have its transcription regulated by several other proteins, whose genes also have polymorphisms. Adding complexity to the above, the biochemical pathways interact among themselves in complex ways (many of them still unknown) so sometimes the actual cause of a change in the response to the drug is not obvious at all.
Such complexity leads to two generic streams for the pharmacogenetics study: the studies based on Genome Wide Association Studies (GWAs), and the studies based on the physiological and physiopathological pathways of the biological systems.
Genome Wide Association Studies are large studies that use genotyping techniques in large scale, able to characterize thousands of polymorphisms all over the genome in a sole experiment. This kind of trial allows the generation of results without preconceived hypothesis. The idea behind the use of these studies in pharmacogenetics is that, many times, the response to drugs involves not known pathways yet, making difficult the generation of hypotheses
By definition, GWAs test only the common variants of the genes, completely ignoring the rare variants (which can, potentially, exercise large effects in the response to drugs)9,10; in addition, the current chips are based on the HapMap Project panels for covering almost the totality of common SNPs in the genome, so the populations not represented in these panels can have errors in the haplotype inferences, due to the differences in the "tagSNPs", not being included now in this kind of study11. There are also technical limitation in the studies by DNA chips. To have an idea, from 83 genic variants with great clinical importance studied by Peters7, only 45 are included in the HapMap Project panels due to the technical difficulties (making impossible to determine large insertions/deletions), showing that this technology can be far from being a definitive tool for pharmacogenetical studiAnother challenge in the GWAs is the data interpretation; in some cases, there are relations that are clearly artifacts by statistical fluctuations8. So far, the majority of the GWAs was concentrated in the polymorphisms for susceptibility to diseases, existing only few studies in pharmacogenetics, so there are still a broad field for expanding this kind of study in the differentiated response to the drugs6.
There is another approach, maybe as efficient as the GWAs, for studying the genes that participate in already known physiological mechanism8. This vision is based on the suggestion that if a gene is implicated in a disease cause or is able to influence the response to a drug, probably other genes in the same pathway may be involved8. Ideally, previous studies determined the effect of the polymorphisms by molecular trials of expression and/or enzymatic activity, and the results found may then be checked in human beings, in clinical trials10. In these studies, the genotyping is performed by common methods, and is followed by the biochemical markers analysis related to the affected protein and by the association with the final phenotype (disease or response to the treatment). This final genotype-biochemical-phenotype approach is very valuable, because genetic polymorphisms can cause change in the protein activity or expressions. These, in turn, can change the plasmatic concentrations of some biochemical products involved in a physiopathological process. Thus, such polymorphisms can have a great predictive value in the medical clinic. Two recent examples of studies that can be mentioned are: i) polymorphisms in the synthase aldosterone gene study, with posterior concentration quantification of circulating aldosterone, and evaluation of the association with resistant hypertension12; ii) polymorphisms in eNOS study, quantification of the plasmatic levels of nitrite, and investigation of the association with pre-eclampsia13. This approach does not need so large human and financial resources and, due to its characteristics, it has a large potential of generating results more focused on the clinical problems, with applicability in the short term.
Probably, the ideal would be to search a GWAs complementation with traditional studies, connecting the broad reach of the GWAs with the advantages of being focused on great interest hypothesis. This combination could lead to more solid conclusions, without neglecting important findings7.
Ultimately, the pharmacogenetics is a new science, which promises large impacts on the way the diseases will be treated. This review will approach the interaction mechanisms of polymorphisms in the endothelial synthase gene of nitric oxide with the pharmacological responses to the cardiovascular drugs currently in use.
The endothelium has an important role in the vascular homeostasis regulation and the maintenance of the vascular energy, being involved with physiologial pathways important for the arterial resistance control to the blood flow. Among several mediators released by the endothelium, the nitric oxide (NO) plays a fundamental role in the regulation of the cardiovascular system. After its formation by the endothelium, the NO is spread to the smooth muscle and interacts with the heme group of soluble guanylate cyclase (sGC) making it active. This enzyme synthetizes the cyclic guanosine monophosphate (GMPc) from the guanosine triphosphate (GTP), leading to an accumulation of GMPc in these cells. This activates intracellular signing pathways that decrease the vascular smooth muscle contraction grade, leading to vessel relaxation14. In addition to these vascular effects, the NO is also involved in the inhibition of platelets aggregation and adhesion.
The NO is formed by of the NO-synthase enzymes (NOS), which catalyze the L-arginine in L-citrulline and NO. There are three isoforms of this enzyme: neuronal (nNOS or NOSI), induced (iNOS or NOSII) and endothelial (eNOS or NOSIII)15. nNOS is found in a variety of cells that include the neurons and endothelial cells. Both, nNOS and eNOS, are contitutive isoforms and are calcium-dependent, needing an increase in the intracellular calcium levels and consequent binding with the calmodulin (CaM) for the activation of these enzymes. The iNOS is not contitutive and is expressed in inflammatory processes.
In the cardiovascular system, the eNOS is the main responsible for the NO synthesis14,16. eNOS is located in the invaginations of the plasmatic membrane of endothelial cells, denominated caveolae. The interaction of eNOS with a protein called caveolin results in the inactivity of eNOS, which may be, partially, by the occupation of the calmodulin binding site17.
The reduction of the expression or activity of eNOS may result in lower production of NO. Several studies have suggested that the unbalance in the NO bioavailability plays a significant role in the endothelial dysfunction. Several diseases are associated to the endothelial dysfunction and bioavailabilty of NO, among them, hypertension18, pre-eclampsia19 and metabolic syndrome20.
The oxidative stress is involved in physiopathological processes of several cardiovascular diseases, and there are evidences that show its contribution to the endothelial dysfunction. The reactive oxygen species (ROS), such as the superoxide anion, react with NO resulting in the formation of peroxynitrile. The increase in the mild ROS production leads, therefore, to a reduction of the bioavailability of NO21, being able to favor the appearance of several cardiovascular diseases. The increase of the ROS can also lead to the oxidation of the BH4 cofactor of eNOS, leading to a decoupling of this enzyme. This way, the eNOS starts producing superoxide anion instead of NO22, leading to a vicious cycle that increase more and more the oxidative stress and reduces more and more the NO availability.
Several drug groups used in the treatment of cardiovascular diseases increase the bioavailability of NO. Among them, we have the Angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEI), Angiotensin II receptors antagonists (Ang II) and the calcium channel blockers (CCB)23. In addition to these anti-hypertensives, several studies have evidenced the increased NO caused by 3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors (statins), probably in a way independent from the lipid levels reduction24,25.
ACE inhibitors act reducing Ang II concentrations, a powerful endogenous vasoconstrictor. In parallel, there is an increase of the kinin concentrations (which prevailing effect is opposite to Ang II), and this contributes to the cardiovascular effect of these drugs26. The ACEI seems to stimulate the expression and activity of eNOS27,28, probably involving the kinins binding to their receptors29-31. These effects are inhibited by the concurrent treatment with HOE-140, an antagonist of B2 receptor of kinin27,32.
The inhibitors of Ang II receptors are used because they inhibit competitive Ang II binding to AT1 receptor, attenuating the vasoconstrictor effects of Ang II. These drugs also act increasing the bioavailability of NO, probably due to the increase of the eNOS protein expression or activation of other receptors that lead to eNOS activation23,33.
The calcium channels blockers (CCB) inhibit the calcium entry into the smooth muscle cells, and then lead to a lower contractility and cardiac output. There are evidences that this class also increases the bioavailability of NO23,34. Clinical studies showed evidences of significant improvement of endothelium-dependent vasodilatation in hypertensive and hypercholesterolemic patients treated with CCB, showing the reversion of endothelium dysfunction23. Probably, the increase of NO derives from the increased activity and expression of eNOS associated to these drugs35.
The statins are among the most broadly used and effective drugs for preventing cardiovascular diseases36, specially when their action on the circulating concentration of lipoproteins and their long term cardioprotector effects are taken into consideration. Some of the pleiotropic effect observed seems to be associated to the increase of the endogenous production of NO37,38, possibly attributed to the increased expression and activity of eNOS39,40.The erectile dysfunction is a disorder with neuronal and vascular origin and has been considered as an early risk factor for other cardiovascular diseases41. The phosphodiesterase 5 inhibitors (PDEI-5) are drugs used in the erectile dysfunciton and in the pulmonary hypertension as they act by means of the GMPc degradation inhibition, leading to a relaxation of the vessel smooth muscles. In case of pulmonary hypertension, this would lead to a normalization of the pressure, and in the erectile dysfunction, it would make easy the penis tumescence from the neurogenic stimulation41. Syndromes where the NO synthesis is damaged, such as diabetes and heart failure, reduce the efficacy of the current PDEI-5 in inducing the vasodilatation42,43 and change the cardiac function44.
The eNOS gene (located in the 7q35-7q36 region) contains 26 exons, 25 introns and approximately 21 to 22 Kb45,46. Since its characterization in the beginning of the 1990's, a large number of polymorphic sites was identified, including VNTRs, dinucleotides repeats (CA)n and SNPs47. Several of these polymorphisms have been associated to cardiovascular diseases, such as hypertension, pre-eclampsia, among others47-49.
One of the most studied clinically relevant polymorphisms is a SNP in the promoter region (T-786C), frequently associated to the development of coronary disease50,51.
Another broadly studied polymorphism in the eNOS gene is a VNTR located in intron 4 (27 pb repeat). The mostly found alelos present four copies (variant a, rarer) or five copies (variant b, more common), The functionality and association studies of this polymorphism with cardiovascular events have demonstrated conflicting results47,53,54. Recently, it has been proposed that this polymorphism would regularize the eNOS expression by the formation of small RNAs (sirRNA). Endothelial cells containing five copies present higher quantities of sirRNA and lower levels of mRNa of eNOS than the cells containing four copies55,56 (
A third polymorphism, a SNP localized in exon 7 of eNOS gene has been associated to cardiovascular risk47,57. This polymorphism is characterized by a guanine conversion by thymin in pósition 894 of the gene, and consequent replacement of glutamine (most common alelo) by aspartate (rarest alelo) in residue 298 of eNOS (Glu298Asp)45. Evidences point out to smaller NO formations in individuals holding Asp alelo, leading to possible functional changes58,59. Endothelial cells holding this alelo seem to produce less NO by a decrease in the availability of eNOS in the caveolae of these cells60 (
Despite the previously discussed evidences, there is a certain controversy in the genetic influence of eNOS on the cardiovascular diseases47. A possible explanation for these discrepant results can be that the simple clinical associations performed from the analysis of a single genetic marker (genotype) with a clinical phenotype do not have enough power to detect its small effects. An alternative approach would be an analysis of the combination of several genetic markers in parallel (haplotype)48,61. For example, Sandrim et al62 evaluated the influence of genotypes/haloptypes of eNOS in the increase of the blood pressure using the three most common polymorphisms (T-786C; Glu298Asp and 4b/a). The genotype analysis did not evidence that there are significant differences between normotensives and hypertensives. However, the haplotypic analysis clearly showed the existence of significant differences between the two experimental groups. Also, other studies showed the association of haplotypes of eNOS with different circulating concentrations of nitrite, which suggests that these haplotypes can have functional implications that provide varied risk of cardiovascular diseases development63,64. This haplotypical approach seems to be more promising than the analysis of only a polymorphism at a time, specially in the study of complex diseases.
The studies have been showing relations between polymorphisms of the eNOS gene with differentiated responses to several classes of drugs used in the treatment of cardiovascular diseases.
Recent evidences suggest a modulation of statin effects by genetic polymorphisms of eNOS. Curiously, a study with endothelial cells ion culture, treated with statins, showed that these drugs induce high increases of the mRNA levels of eNOS in endothelial cells with CC genotype, when compared to TT cells for the T-786C polymorphism65. This is due, probably, to the higher transcriptional activity, increase of mRNA stability and decrease of RPA1 expression65. Confirming these findings in cultures of endothelial cells, a clinical study showed similar effects with atorvastatin66. In this study, it was demonstrated that the treatment with statin increased the bioavailabilty of NO and decreased the oxidative stress only in CC homozigous individuals for the T-786C polymorphism66. Note that healthy individuals were studied, making the drug have much less chance of producing significant effects66. Later, it was observed that the anti-inflammatory effects of the atorvastatin are modulated by the same polymorphism, leading to a significant reduction in the inflammatory cytosine concentrations (CD40L, VCAM-1, P-selectin and MMP-9) in individuals with CC genotype, but not in the TT individuals67. Functional studies demonstrated subsequently that the short term treatment with statins is able to reduce the fluidity of the plasmatic membrane of red blood cells in individuals with CC genotype, but not with the TT genotype, during the treatment with atorvastatin68. Together, these findings indicate that the atorvastatin could be more useful for the prevention of cardiovascular events in individuals with the CC genotype (which cardiovascular risk has been showed increased) than in individuals with TT genotype.In any way, the study results with atorvastatin mentioned may be interpreted cautiously, because there were not evaluated clinically relevant events and the simple measurement of the biochemical markers can not be effective to indicate new drug uses. Clinical studies focusing clinically relevant events may be performed to prove the previously discussed results.
While the majority of the pharmacogenetic studies of the statins related to eNOS are centered in the polymorphism in the promoter region of eNOS, the polymorphism in intro 4 also seems to modulate the response to the statins. Kunnas et al69 evaluated the coronary vasodilation induced by adenosin in healthy individuals after six months of treatment with pravastatin. The individuals holding the "a" alelo showed significant improvement of vasodilation when compared to the individuals with "bb" genotype, possibly by the higher increase if the endothelial production of NO in individuals with rare alelo69.
Other polymorphism in the eNOS gene, Glu298Asp in exon 7, seems to modulate the estradiol effects in the platelet function. The pre-treatment with 17β-estradiol increased in a significant way the platelet aggregation rate, together with the increased release of superoxide ions by platelet only in homozigous individuals for the Asp298 alelo. The release of NO derived from the platelets was not changed by the Glu298Asp, T-786C and 4b/a polymorphisms after the treatment. Additionally, the hormone effect on the platelet function was not affected by the polymorphisms in the promoter region and intron 458.
One of the most important drug classes on the hypertensive control, specially in the case of excessive volume, is the thiazide diuretics. The hydrochlorothiazide (HCTZ) is its most used representative in the medical clinic. It was demonstrated that the Glu298Asp polymorphism in the eNOS gene is able to modulate the response to HCTZ, so the homozigous individuals for the Glu alelo have a reduction in the blood pressure levels significantly higher than the individuals holding the alelo Asp70. Although the significant effect, it is small, which shows evidence that it is difficult a single polymorphism to be able to explain all the genetic background behind the variations in the pharmacological responses of a medication class.
Other anti-hypertensive classes of great importance are the betablockers and the AT-1 receptor inhibitors of angiotensin 2. A study using techniques analog to GWAs showed promising results associating less studied polymorphisms of eNOS to variations in the pharmacological responses of propanolol and irbesartan (betablocker and AT-1 receptor inhibitor of angiotensin 2, respectively). Alelo G of A2996G polymorphism was associated to a higher decrease of the blood pressure from the atenolol betablocker effect in relation to alelo A71. Alelo A of the G498A polymorphism was associated to a better response before betablocker and irbersartan71. The presence of the 2996G alelos and 498A alelo could provide a higher benefit for the holders of these alelos treated with these anti-hypertensives. These results, although promising, may have to be confirmed in studies with a higher number of patients from different populations.
The hypertension usually is treated with the addition of different classes of anti-hypertensives until the blood pressure decreases to the preconized levels72. Hypertensive resistant are the individuals who keep their blood pressure levels above 140/90 mmHg despite the use of three different classes of anti-hypertensives, including a diuretic. In this context, it was demonstrated a non significant trend of association between the Asp alelo (Glu298Asp) and hypertension resistant73. Later studies analyzing the haplotypes of eNOS did not confirmed any association with the resistance to the anti-hypertensive therapy62.
The NO availability affects the bias to erectile dysfunction similarly to the hypertension. The drug classes used in the erectile dysfunction treatment, the PEI-5. is also influenced by the polymorphisms in its therapeutical response. As previously commented, NO availability is a determining factor for the PDEI-542 activity. It was demonstrated that the homozigous men for Asp alelo (associated to a lower production on NO) obtained lower response to sildenafil when compared to individuals with genotype Glu/Glu74.
The pharmacogenetics is a very recent pharmacology area, and it still has to grow. The genome project results caused the promotion and the popularization of the area, and we are living presently a moment close to a large expansion, thanks to the Genome Wide Association Studies. After that, the majority of the studies still focus on the genetic base of complex diseases, without great attention to the pharmacological responses. In relation to the nitric oxide production systems, important initial steps were taken, and today there are strong evidences that the statins and estradiol in fact can experience modulation by the genetic background of the eNOS gene in their pharmacological functions. Deeper studies are still necessary in relation to anti-hypertensives, and other medications that act on the cardiovascular system.
It is important to emphasize that the advances promised by the pharmacogenetics unfortunately, are still far from the clinical practice and of the patient.
The future of the medicine goes more and more to the personalization of the therapies and for the national use of the pharmacological treatments. The pharmacogenetics has a great role in this hypothetic scenario. The idea led to an utopic extreme, would be to identify the major genetic polymorphisms at the birth, in order to choose,
The hypertension, one of the worse diseases of the modern world, could be treated more effectively, even prevented, by means of the early identification of risk markers, and prophylactic treatment.
In general, the genetic advances promise to revolutionize the medicine in the next decades; it is necessary to evaluate which of the great promises of the end of the 20th century (genic therapy, stem cells, pharmacogenetics) will really succeed, and in which proportion.
We thank the financial support of Fapesp, CNPq and Capes.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP, CAPES and CNPq.
This study is not associated with any post-graduation program.
La farmacogenética es uno de los campos más promisorios de la medicina. La conclusión del Proyecto Genoma permitió que ese campo comenzase a descubrir factores complejos modulando la respuesta a las drogas, y nuevas tecnologías están a pocos pasos de permitir una gran expansión del área. Las enfermedades cardiovasculares están actualmente entre las mayores causas de internaciones hospitalarias y muerte, y han sido objeto de gran parte de los estudios genéticos de enfermedades complejas. Paralelamente a la identificación de marcadores de susceptibilidad a la enfermedad, es necesaria la investigación sobre como perfiles genéticos diferentes pueden alterar respuestas a los fármacos actualmente empleados. El sistema biológico que controla la producción endotelial del óxido nítrico ha sido un de los grandes blancos en las respuestas farmacológicas a los fármacos usados en la terapia de enfermedades cardiovasculares. Esta revisión tiene como objetivo abordar los conocimientos corrientes de la interacción entre las variaciones genéticas de la eNOS y las respuestas farmacológicas a los fármacos empleados en el sistema cardiovascular.
IFaculdade de Ciências Médicas - Departamento de Farmacologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
IIFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Departamento de Farmacologia - Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - Brasil
Correspondencia
La farmacogenética es uno de los campos más promisorios de la medicina. La conclusión del Proyecto Genoma permitió que ese campo comenzase a descubrir factores complejos modulando la respuesta a las drogas, y nuevas tecnologías están a pocos pasos de permitir una gran expansión del área. Las enfermedades cardiovasculares están actualmente entre las mayores causas de internaciones hospitalarias y muerte, y han sido objeto de gran parte de los estudios genéticos de enfermedades complejas. Paralelamente a la identificación de marcadores de susceptibilidad a la enfermedad, es necesaria la investigación sobre como perfiles genéticos diferentes pueden alterar respuestas a los fármacos actualmente empleados. El sistema biológico que controla la producción endotelial del óxido nítrico ha sido un de los grandes blancos en las respuestas farmacológicas a los fármacos usados en la terapia de enfermedades cardiovasculares. Esta revisión tiene como objetivo abordar los conocimientos corrientes de la interacción entre las variaciones genéticas de la eNOS y las respuestas farmacológicas a los fármacos empleados en el sistema cardiovascular.
Los resultados iniciales del Proyecto Genoma fueron publicados en 20011 y, en estos últimos ocho años, hubo un gran avance en el entendimiento de los mecanismos moleculares que permean las influencias genéticas en el ser humano. Una de las principales implicaciones del conocimiento acumulado del genoma humano es la investigación de características genéticas y sus asociaciones a fenómenos hasta entonces no explicados.
Las características genéticas variables (polimorfismos) estudiadas se dividen en tres grandes grupos: polimorfismos de base única (
Recientemente fue disponibilizada la base de datos del International HapMap Project, que muestra los llamados "tagSNPs" (SNPs que señalan la presencia de un conjunto específico de alelos en otros polimorfismos próximos). Polimorfismos situados muy próximos entre sí tienden a segregar en conjunto de los padres a los hijos, formando haplotipos. La idea de los "tagSNPs" es genotipar apenas algunos polimorfismos representantes de esos haplotipos e inferir los demás por probabilidad. Cada población tiene su conjunto de "tagSNPs", contempladas en gran parte por el HapMap Project2.
Inherentes a todos los tratamientos farmacológicos existen situaciones de no respuesta y toxicidad a dosis usuales de fármacos, que no pueden ser explicados por comorbilidades, situaciones fisiológicas específicas o hábitos de los pacientes. La farmacogenética es el campo del conocimiento enfocado en el estudio de interacciones de polimorfismos genéticos con la farmacología, tratando tanto de alteraciones en la cinética de los fármacos (absorción, transporte, metabolización y eliminación) como en la dinámica de la interacción de los fármacos con sus receptores3.
La farmacogenética busca detectar previamente características individuales de los pacientes que puedan identificarlos como "buenos respondedores", o "malos respondedores", a cada tratamiento farmacológico. Millones de dólares son gastados anualmente en todo el mundo con tratamientos ineficaces (incapaces de sacar al paciente de una situación de riesgo), o con internaciones por intoxicaciones farmacológicas; situaciones que podrían ser evitadas optimizando la práctica de la "tentativa y error" usada en la clínica4. Los datos son de hecho alarmantes: alrededor de 7% del total de internaciones en los Estados Unidos en 2006 y de 6,5% en el Reino Unido en 2004 fueron decurrentes de reacciones adversas a medicamentos5,6. Esos números muestran la gran importancia de la personalización y racionalización en el uso de los medicamentos.
Básicamente, el objetivo mayor de la farmacogenética es individualizar los tratamientos farmacológicos de manera racional, dirigida, y, sobre todo, con fuertes bases científicas para reducir los efectos colaterales, la ineficacia terapéutica y sus desdoblamientos.
Los avances en la biología molecular y en la bioquímica han evidenciado el real desafío de la farmacogenética: cada vía fisiológica tiene decenas de proteínas que interactúan entre sí; cada proteína, codificada por su gen (con polimorfismos), puede tener su transcripción regulada por diversas otras proteínas, cuyos genes también tienen polimorfismos. Adicionando complejidad a eso, las vías bioquímicas interactúan entre sí de maneras complejas (muchas de ellas aun desconocidas), de forma que a veces el real causante de una alteración en la respuesta al fármaco no es, de forma alguna, obvio.
Tal complejidad lleva a dos corrientes genéricas para el estudio de la farmacogenética: los estudios basados en
Por definición, GWAs testean apenas variantes comunes de los genes, ignorando completamente variantes raras (que pueden, potencialmente, ejercer grandes efectos en la respuesta a fármacos)9,10; además de eso, los chips actuales se basan en los paneles del HapMap Project para cubrir prácticamente la totalidad de los SNPs comunes en el genoma, de modo que poblaciones no representadas en esos paneles pueden tener errores en las inferencias de los haplotipos, en razón de diferencias en los "
Otro desafío en los GWAs es la interpretación de los datos; en algunos casos, ocurren relaciones que se demuestran nítidamente artefactos por fluctuaciones estadísticas8. Hasta el momento, la mayoría de los GWAs se concentró en los polimorfismos para susceptibilidad a enfermedades, existiendo apenas pocos estudios en farmacogenética, de forma que aun existe un gran campo para la expansión de ese tipo de estudio en la respuesta diferenciada a los fármacos6.
Existe otro abordaje, talvez tan eficiente como los GWAS, para estudiar genes que participan de mecanismos fisiológicos ya conocidos8. Esa visión se basa en la sugestión de que si un gen está implicado en la causa de una enfermedad, o es capaz de influenciar la respuesta a un fármaco, probablemente otros genes en la misma vía también pueden estar envueltos8. Idealmente, estudios previos determinan el efecto de los polimorfismos por ensayos moleculares de expresión y/o actividad enzimática, y los resultados encontrados pueden entonces ser verificados en seres humanos en estudios clínicos10. En esos, el genotipaje es realizado por métodos comunes, y es controlado por el análisis de marcadores bioquímicos relacionados a la proteína afectada, y por la asociación con el fenotipo final (enfermedad o respuesta al tratamiento). Ese abordaje genotipo-bioquímica-fenotipo final es de gran valor, pues polimorfismos genéticos pueden causar alteración en la actividad o expresión de proteínas. Esas, a su vez, pueden alterar las concentraciones plasmáticas de algún producto bioquímico envuelto en un proceso fisiopatológico. De esa forma, tales polimorfismos pueden tener gran valor predictivo en la clínica médica. Dos ejemplos recientes de estudios que podemos citar son: (i) el estudio de polimorfismos en el gen de la aldosterona sintasa, con posterior cuantificación de la concentración de aldosterona circulante, y evaluación de la asociación con hipertensión resistente12; (ii) el estudio de polimorfismos en la eNOS, cuantificación de niveles plasmáticos de nitrito, e investigación de la asociación con preeclampsia13. Ese abordaje no necesita recursos humanos y financieros tan grandes y, por sus características, posee un gran potencial de generar resultados más enfocados en los problemas clínicos, con aplicabilidad a corto plazo.
Probablemente, lo ideal sería buscar la complementación de GWAs con estudios tradicionales, uniendo el gran alcance de los GWAS con las ventajas de tener el foco en hipótesis de gran interés. Esa combinación podría llevar a conclusiones más sólidas, sin descuidar hallazgos importantes7.
En fin, la farmacogenética es una ciencia nueva, que promete grandes impactos en la manera como las enfermedades serán tratadas. Esta revisión abordará los mecanismos de la interacción de polimorfismos en el gen de la sintasa endotelial de óxido nítrico con las respuestas farmacológicas a las drogas cardiovasculares en uso corriente.
El endotelio tiene un papel importante en la regulación de la homeostasis vascular y en la manutención del tono vascular, estando envuelto con vías fisiológicas importantes en el control de la resistencia arterial al flujo sanguíneo. Entre diversos mediadores liberados por el endotelio, el óxido nítrico (NO) ejerce papel fundamental en la regulación del sistema cardiovascular. Después de su formación por el endotelio, el NO se difunde al músculo liso y interactúa con el grupo heme de la guanilato ciclasa soluble (sGC) volviéndola activa. Esa enzima sintetiza guanosina monofosfato cíclica (GMPc) a partir de la guanosina trifosfato (GTP), llevando a una acumulación de GMPc en esas células. Eso activa vías de señalización intracelulares que disminuyen el grado de contracción del músculo liso vascular, llevando al relajamiento del vaso14. Además de esos efectos vasculares, el NO también está envuelto en la inhibición de la agregación y adhesión plaquetaria.
El NO es formado por las enzimas NO-sintasas (NOS), que catalizan la conversión de L-arginina en L-citrulina y NO. Existen tres isoformas de esa enzima: neuronal (nNOS o NOSI), inducida (iNOS o NOSII) y endotelial (eNOS o NOSIII)15. La nNOS es encontrada en una variedad de células que incluyen las neuronas y células endoteliales. Tanto la nNOS como la eNOS son isoformas constitutivas y son calcio-dependientes, necesitando el aumento de los niveles de calcio intracelular y consecuente ligazón de éste con la calmodulina (CaM) para la activación de esas enzimas. La iNOS no es constitutiva y es expresada en procesos inflamatorios.
En el sistema cardiovascular, la eNOS es la principal responsable por la síntesis de NO14,16. La eNOS se ubica en las invaginaciones de la membrana plasmática de células endoteliales, denominadas caveolas. La interacción de la eNOS con una proteína llamada caveolina resulta en la inactividad de la eNOS que se debe, en parte, a la ocupación del sitio de ligazón de la calmodulina17.
La reducción de la expresión o de la actividad de la eNOS puede resultar en menor producción de NO. Diversos estudios han sugerido que el desequilibrio en la biodisponibilidad del NO ejerce papel significativo en la disfunción endotelial. Varias enfermedades están asociadas a disfunción endotelial y reducción de la biodisponibilidad del NO, entre ellas, hipertensión18, preeclampsia19 y síndrome metabólico20.
El estrés oxidativo está envuelto en procesos fisiopatológicos de innúmeras enfermedades cardiovasculares, y existen evidencias que demuestran su contribución en la disfunción endotelial. Las especies reactivas del oxígeno (ROS), como el anión superóxido, reaccionan con el NO resultando en la formación de peroxinitrito. El aumento en la producción de ROS lleva, por lo tanto, a una reducción de la biodisponibilidad del NO21, pudiendo favorecer el surgimiento de diversas enfermedades cardiovasculares. El aumento de las ROS también puede llevar a la oxidación del cofactor BH4 de la eNOS, llevando a un desacoplamiento de esa enzima. De esa forma, la eNOS pasa a producir anión superóxido en vez de NO22, llevando a un ciclo vicioso que aumenta cada vez más el estrés oxidativo y reduce cada vez más la disponibilidad de NO.
Diversos grupos de drogas usadas en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares aumentan la biodisponibilidad de NO. Entre ellas, tenemos los inhibidores de la enzima conversora de Angiotensina (iECA), antagonistas de los receptores de Angiotensina II (Ang II) y los bloqueadores de canales de calcio (BCC)23. Además de esos antihipertensivos, diversos estudios han evidenciado el aumento del NO causado por inhibidores de la 3-metilglutaril coenzima A reductasa (estatinas), probablemente de forma independiente de la reducción de los niveles de lípidos24,25.
Inhibidores de la ECA actúan reduciendo las concentraciones de Ang II, un potente vasoconstrictor endógeno. Paralelamente, ocurre un aumento de las concentraciones de cininas (cuyo efecto predominante es opuesto a la AngII), y eso contribuye a los efectos cardiovasculares de esas drogas26. Los iECA parecen también estimular la expresión y actividad de la eNOS27,28, probablemente envolviendo la ligazón de las cininas a sus receptores29-31. Esos efectos son inhibidos por el tratamiento concomitante con HOE-140, un antagonista del receptor B2 de cinina27,32.
Los inhibidores de los receptores de Ang II son utilizados por inhibir competitivamente la ligazón de la Ang II al receptor AT1, atenuando los efectos vasoconstrictores de la Ang II. Esas drogas también actúan aumentando la biodisponibilidad de NO, probablemente por el aumento de la expresión proteína eNOS o activación de otros receptores que llevan a la activación de la eNOS23,33.
Los bloqueadores de canales de calcio (BCC) inhiben la entrada de calcio en las células musculares lisas, y de esa forma llevan a una menor contractibilidad y débito cardíaco. Existen evidencias de que esa clase también aumenta la biodisponibilidad del NO23,34. Estudios clínicos evidenciaron significativa mejora de la vasodilatación endotelio-dependiente en pacientes hipertensos e hipercolesterolémicos tratados con BCC, mostrando reversión de la disfunción endotelial23. Probablemente el aumento del NO es consecuencia del aumento de la actividad y expresión de la eNOS asociado a esas drogas35.
Las estatinas están entre las drogas más ampliamente usadas y efectivas para prevención de enfermedades cardiovasculares36, especialmente cuando se consideran sus acciones sobre las concentraciones circulantes de lipoproteínas y sus efectos cardioprotectores de largo plazo. Algunos de los efectos pleiotrópicos observados parecen estar asociados al aumento de la producción endógena de NO37,38, posiblemente atribuidos al aumento expresión y actividad de la eNOS39,40.
La disfunción eréctil es un desorden de origen neuronal y vascular, y está siendo vista como un factor de riesgo precoz para otras enfermedades cardiovasculares41. Los inhibidores de la fosfodiesterasa 5 (IPDE-5) son fármacos empleados en la disfunción eréctil y en la hipertensión pulmonar por actuar por medio de la inhibición de la degradación de GMPc, llevando a un relajamiento de la musculatura lisa de los vasos. En el caso de la hipertensión pulmonar eso llevaría a una normalización de la presión, y en la disfunción eréctil facilitaría el entumecimiento del pene a consecuencia del estímulo neurogénico41. Síndromes en que la síntesis de NO está comprometida, como diabetes e insuficiencia cardíaca, reducen la eficacia de los IPDE-5 actuales en inducir vasodilatación42,43 y alterar la función cardíaca44.
El gen de la eNOS (ubicado en la región 7q35-7q36) contiene 26 exones, 25 intrones y aproximadamente 21 a 22 Kb45,46. Desde su caracterización en el comienzo de los años 1990, gran número de sitios polimórficos fue identificado, incluyendo VNTRs, repeticiones de dinucleótidos (CA)n y SNPs47. Varios de esos polimorfismos han sido asociados a enfermedades cardiovasculares, tales como hipertensión, preeclampsia, entre otras47-49.
Uno de los polimorfismos clínicamente relevantes más estudiados es un SNP en la región promotora (T-786C), frecuentemente asociado al desarrollo de enfermedad coronaria50,51. Estudios
Otro polimorfismo en el gen de la eNOS ampliamente estudiado es un VNTR ubicado en el intrón 4 (repetición de 27pb). Los alelos más encontrados presentan cuatro copias (variante a, más rara) o cinco copias (variante b, más común). Los estudios de funcionalidad y de asociación de ese polimorfismo con eventos cardiovasculares han demostrado resultados conflictivos47,53,54. Recientemente ha sido propuesto que ese polimorfismo regularía la expresión de la eNOS por la formación de pequeños RNAs (sirRNA). Células endoteliales conteniendo cinco copias presentan cantidades mayores de sirRNA y menores niveles de mRNA de la eNOS que células conteniendo cuatro copias55,56 (
Un tercer polimorfismo, un SNP ubicado en el exón 7 del gen de la eNOS ha sido asociado a riesgo cardiovascular47,57. Ese polimorfismo es caracterizado por una conversión de la guanina por la timina en la posición 894 del gen, y consecuente sustitución de la glutamina (alelo más común) por el aspartato (alelo más raro) en el residuo 298 de la eNOS (Glu298Asp)45. Evidencias apuntan a menores formaciones de NO en individuos portadores del alelo Asp, llevando a posibles alteraciones funcionales58,59. Células endoteliales portadoras de ese alelo parecen producir menos NO, por una disminución en la disponibilidad de la eNOS en la caveola de esas células60 (
Apesar de las evidencias discutidas anteriormente, existe cierta controversia en la influencia genética de la eNOS sobre las enfermedades cardiovasculares47. Una posible explicación para esos resultados discrepantes puede ser que simples asociaciones clínicas hechas a partir del análisis de un único marcador genético (genotipo) con un fenotipo clínico no tengan un poder suficiente para detección de sus efectos pequeños. Un abordaje alternativo sería el análisis de la combinación de varios marcadores genéticos en paralelo (haplotipo)48,61. Por ejemplo, Sandrim et al. 62 evaluaron la influencia de los genotipos/haplotipos de la eNOS en la elevación de la presión arterial utilizando los tres polimorfismos más comunes (T-786C; Glu298Asp y 4b/la). El análisis de genotipos no evidenció que haya diferencias significativas entre normotensos e hipertensos. Entre tanto, el análisis haplotípico mostró claramente la existencia de diferencias significativas entre los dos grupos experimentales. Aun, otros estudios mostraron asociación de haplotipos de la eNOS con diferentes concentraciones circulantes de nitrito, lo que sugiere que esos haplotipos puedan tener implicaciones funcionales que propicien riesgo variado de desarrollo de enfermedades cardiovasculares63,64. Ese abordaje haplotípico parece ser más promisorio que el análisis de apenas un polimorfismo por vez, especialmente en el estudio de enfermedades complejas.
Estudios han mostrado relaciones entre polimorfismos del gen de la eNOS con respuestas diferenciadas a diversas clases de drogas utilizadas en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Evidencias recientes sugieren una modulación de los efectos de las estatinas por polimorfismos genéticos de la eNOS. Curiosamente, un estudio con células endoteliales en cultivo, tratadas con estatinas, mostró que esos fármacos inducen mayores aumentos de los niveles de mRNA de la eNOS en células endoteliales con genotipo CC cuando son comparadas a células TT para el polimorfismo T-786C65. Eso se debe, probablemente, a la mayor actividad transcripcional, aumento de la estabilidad del mRNA y disminución de la expresión de RPA165. Confirmando esos hallazgos en cultivos de células endoteliales, un estudio clínico mostró efectos similares con la atorvastatina66. En ese estudio, se demostró que el tratamiento con estatina aumentó la biodisponibilidad del NO y disminuyó el estrés oxidativo apenas en individuos homocigotos CC para el polimorfismo T-786C66. Nótese que fueron estudiados individuos sanos, haciendo que la droga tuviese mucho menos posibilidad de producir efectos significativos66. Posteriormente, fue observado que los efectos antiinflamatorios de la atorvastatina son modulados por el mismo polimorfismo, llevando a una reducción significativa en las concentraciones de citocinas inflamatorias (CD40L, VCAM-1, P-selectina y MMP-9) en individuos con genotipo CC, pero no en los individuos TT67. Estudios funcionales demostraron subsecuentemente que el tratamiento a corto plazo con estatinas es capaz de reducir la fluidez de la membrana plasmática de hematíes en individuos con genotipo CC, pero no con genotipo TT, durante tratamiento con atorvastatina68. Juntos, esos hallazgos indican que la atorvastatina podría ser más útil para la prevención de eventos cardiovasculares en individuos con el genotipo CC (cuyo riesgo cardiovascular se ha demostrado aumentado) que en individuos con genotipo TT.
De cualquier forma, los resultados de los estudios con atorvastatina mencionados deben ser interpretados con cautela, pues no fueron evaluados eventos clínicamente relevantes y la simple medida de marcadores bioquímicos puede no ser efectiva para indicar nuevos usos de drogas. Estudios clínicos enfocando eventos clínicamente relevantes deberían ser hechos para comprobar los resultados discutidos antes.
Aunque la mayoría de los estudios farmacogenéticos de las estatinas relacionados a eNOS se centre en el polimorfismo en la región promotora de la eNOS, el polimorfimo en el intrón 4 también parece modular la respuesta a las estatinas. Kunnas et al. 69 evaluaron la vasodilatación coronaria inducida por adenosina en individuos sanos después de seis meses de tratamiento con pravastatina. Los individuos portadores del alelo "a" mostraron significativa mejora de la vasodilatación cuando fueron comparados a los individuos con genotipo "bb", posiblemente por el mayor aumento de la producción endotelial de NO en los individuos con el alelo raro69.
Otro polimorfismo en el gen de la eNOS, Glu298Asp en el exón 7, parece modular los efectos del estradiol en la función plaquetaria. El pretratamiento con 17β-estradiol aumentó de forma significativa la tasa de agregación plaquetaria, acompañada por la elevación de la liberación de iones superóxido por las plaquetas apenas en individuos homocigotos para el alelo Asp298. La liberación de NO derivado de las plaquetas no fue alterada por los polimorfismos Glu298Asp, T-786C y 4b/la después de tratamiento. Adicionalmente, el efecto del hormona en la función plaquetaria no fue afectado por los polimorfismos en la región promotora e intrón 458.
Una de las clases de fármacos más importantes en el control de la hipertensión, especialmente en el caso de exceso de volumen, es la de los diuréticos tiazídicos. La hidroclorotiazida (HCTZ) es su representante más utilizado en la clínica médica. Fue demostrado que el polimorfismo Glu298Asp en el gen de la eNOS es capaz de modular la respuesta a la HCTZ, de manera que individuos homocigotos para el alelo Glu tienen una reducción en los niveles de presión arterial significativamente mayor que individuos poseedores del alelo Asp70. A pesar de que el efecto es significativo, es pequeño, lo que evidencia que difícilmente un único polimorfismo será capaz de explicar todo el
Otras clases de antihipertensivos de gran importancia son los betabloqueantes y los inhibidores del receptor AT-1 de angiotensina 2. Un estudio usando técnicas análogas a los GWAS mostró resultados promisorios asociando polimorfismos menos estudiados de la eNOS a variaciones en las respuestas farmacológicas de propanolol y irbesartan (betabloqueante e inhibidor del receptor AT-1 de angiotensina 2, respectivamente). El alelo G del polimorfismo A2996G fue asociado con una mayor disminución de la presión arterial consecuencia del efecto del betabloqueante atenolol en relación al alelo A71. El alelo A del polimorfismo G498A fue asociado a una mejor respuesta tanto ante el betabloqueante como ante el irbersartan71. La presencia de los alelos 2996G y del alelo 498A podría incurrir en un beneficio mayor a los portadores de esos alelos tratados con esos antihipertensivos. Esos resultados, a pesar de promisorios, aun deben ser confirmados en estudios con mayor número de pacientes, de diferentes poblaciones.
La hipertensión normalmente es tratada con la adición de diferentes clases de antihipertensivos hasta la reducción de la presión arterial a los niveles preconizados72. Hipertensos resistentes son individuos que mantienen sus niveles de presión arterial encima de 140/90 mmHg a pesar del uso de tres clases diferentes de antihipertensivos, incluyendo un diurético. En ese contexto, fue demostrada una tendencia no significativa de asociación entre el alelo Asp (Glu298Asp) e hipertensión resistente73. Estudios posteriores analizando haplotipos de la eNOS no confirmaron ninguna asociación con la resistencia a la terapia antihipertensiva62.
La disponibilidad de NO afecta la predisposición a la disfunción eréctil de forma análoga a la hipertensión. La clase de los fármacos utilizados en el tratamiento de la disfunción eréctil, los IPE-5, también sufre influencia de polimorfismos en su respuesta terapéutica. Como fue comentado anteriormente, la disponibilidad de NO es un factor determinante para la actividad de los IPDE-542. Fue demostrado que hombres homocigoto para el alelo Asp (asociado a la menor producción de NO) obtuvieron menor respuesta al sildenafil cuando comparados a los individuos con genotipo Glu/Glu74.
La farmacogenética es un área de la farmacología bastante reciente, y aun tiene mucho para crecer. Los resultados del proyecto genoma causaron una promoción y popularización del área, y estamos viviendo actualmente un momento previo a una gran expansión, gracias a los
Es importante destacar que los avances prometidos por la farmacogenética, infelizmente, aun están lejos de la práctica clínica y del paciente.
El futuro de la medicina camina cada vez más hacia la personalización de las terapias, y hacia el uso racional de tratamientos farmacológicos. La farmacogenética tiene un gran espacio en ese escenario hipotético. La idea, llevada a un extremo utópico, seria identificar los polimorfismos genéticos importantes en el nacimiento, de modo de escoger
La hipertensión, un de los mayores males del mundo moderno, podría ser tratada de manera más eficaz, posiblemente hasta prevenida, mediante la identificación precoz de marcadores de riesgo, y del tratamiento profiláctico.
De manera general, los avances genéticos prometen revolucionar la medicina en las próximas décadas; resta evaluar cuales de las grandes promesas del fin del siglo XX (terapia génica, células tronco, farmacogenética) van realmente a dar frutos, y en que proporción.
Agradecemos el apoyo financiero de la Fapesp, del CNPq y de la Capes.