REVIEW ARTICLE

Nitric oxide and the cardiovascular system: cell activation, vascular reactivity and genetic variant

Rodrigo Gonçalves Dias^I,II; Carlos Eduardo Negrão^I; Marta Helena Krieger^II

^IInstituto do Coração - InCor (HCFMUSP), São Paulo, SP

^IILabcardio - Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP - Brazil

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SUMMARY

Nitric oxide (NO), primarily identified as an endothelium-derived relaxing factor, is a free radical that signals different biological processes. The identification of NO synthase (NOS) isoforms and the subsequent characterization of the mechanisms of cell activation of the enzymes permitted the partial understanding of both the physiological interactions and of the mechanisms of the diseases in which NO is involved. Mainly expressed in the vascular endothelium, the endothelial NOS isoform (eNOS) plays an important role in the regulation of vascular reactivity and in the development and progression of atherosclerosis. The purpose of this review is to contextualize the reader about the eNOS structure and its mechanisms of cell activation. In view of the advances in molecular biology, we will also address the known mechanisms of gene expression regulation and the role of variants on the genetic code of eNOS associated with cardiovascular phenotypes. Although the importance of NO as an atheroprotective molecule is recognized, our focus will be the review of the literature on NO and its participation in the modulation of the muscle vasodilatation phenotype.

Keywords: Nitric oxide; nitric oxide synthase type III; polymorphism, genetic.

Introduction

The primary evidence that the endothelium is an indispensable component in the regulation of the vascular tone emerged from experimental analyses demonstrating that, in the absence of this single layer of squamous epithelium, acetylcholine-induced vasodilatation did not occur. In that moment, Furchgott and Zawadzki¹ documented the fact that, when stimulated, the endothelium had the capacity to release a vasoactive substance, which was named endothelium-derived relaxing factor (EDRF). Some years later, EDRF was identified by Ignarro et al² as nitric oxide (NO), a compound characterized in 1977 by Ferid Murad which caused smooth muscle cell relaxation, when released by nitrates. For this finding, Robert F. Furchgott, Ferid Murad and Louis J. Ignarro were awarded the Nobel Prize of Physiology or Medicine in 1998 (Figure 1). A series of studies was responsible for the demonstration that the endothelium releases other EDRF such as prostacyclin (PGI₂), and the endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF), in addition to other endothelium-derived contracting factors (EDCF) such as endothelin (ET-1), cyclooxygenase pathway products such as thromboxane A₂ (TXA₂) and reactive oxygen species such as the superoxide anion (O₂^.-)³. In addition to characterizing the endothelium as a biological sensor capable of detecting any mechanical, physical or chemical stimulus - and respond to it - these findings raised the endothelium to the position of a multifunctional tissue that plays an important role in the homeostasis of all physiological systems.

Nitric oxide and the cardiovascular system

NO, a gaseous molecule that acts in the signaling of different biological processes, is a free radical presenting an unpaired electron in the last layer and a half-life of 4 to 8 seconds in oxygenated aqueous medium^4,5. It is described as a labile gas, capable of free diffusion across cell membranes, a characteristic that enhances its high biological activity⁶. The multiple NO actions were further broadened by the confirmation that the vascular endothelium is an active organ and that its integrity promotes beneficial effects, such as antioxidant, anti-inflammatory, anticoagulant, and pro-fibrinolytic actions; inhibition of leukocyte adhesion and migration; inhibition of smooth muscle cell migration and proliferation; and inhibition of platelet aggregation and adhesion⁷. Thus, this atheroprotective setting is characterized by a harmony between substances released by the endothelium, in which NO is cited as one of the most relevant vasoactive compounds. Characterized as a systemic disorder that precedes atherosclerosis and its complications, endothelial dysfunction in atherosclerotic coronary arteries was first described by Ludmer et al⁸ and later related to the change in NO bioavailability⁹.

In the current literature, it is agreed that the reduced NO biological activity, caused both by synthase reduction and by increased degradation due to oxidation stress, has been identified as the most relevant mechanism in the multifactorial process in endothelial dysfunction and in the participation in the main cardiovascular dysfunctions¹⁰. Thus, reductions in NO bioavailability and subsequent endothelial dysfunction trigger, in the vascular environment, events such as tone alterations, thrombotic dysfunctions, smooth muscle cell (SMC) proliferation and migration, as well as leukocyte adhesion¹¹. When endothelial dysfunction occurs, there is also an increased production of reactive oxygen species (ROS)¹², and these can reduce endothelial NO availability via different pathways: direct NO inactivation by superoxide with peroxynitrite (ONOO^-)¹³ formation; reduction in NO synthase expression and activity due to changes in their substrate or cofactors, and in the increase in asymmetric dimethylarginine (ADMA) levels¹⁴; and also endothelial NOS uncoupling caused by increased tetrahydrobiopterin (BH₄) oxidation¹⁵.

The understanding of the complexity of endothelial function has improved, and the difficulty in studying each one of its components separately has been overcome. In this context, animal models able to reproduce endothelial dysfunction have been developed, thus enabling the system to work under conditions of low or high NO bioavailability, for instance. Additionally, studies in vivo in humans, using intra-arterial infusion of compounds with the potential of modulating endothelial-dependent or independent function, permitted the investigation of modulatory mechanisms on the vascular function under different physiological conditions and more prevalent diseases.

Nitric oxide synthases

NO enzymatic production from the amino acid L-arginine is mediated by a family of three nitric oxide synthases (NOS) codified by distinct genes¹⁶. The isoforms share 50%-60% homology in the amino acid sequence in the oxidase and reductase domains¹⁷. These isoforms have distinct characteristics that reflect their specific functions in vivo¹⁸.

Endothelial NO synthase (eNOS or NOS III; 7q35-36) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS or NOS I; 12q24.2) have a mechanism of constitutive activation (cNOS). The inducible isoform (iNOS or NOS II; 17cen-q12) is expressed in abnormal cell processes such as heart failure¹⁹, after induction by cytokines and other inflammatory agents, which results in a high NO flow^20,21. Endothelial NOS is mainly located in endothelial cell compartments named caveolae²², and is essential for keeping the baseline vascular tone. This tone is partly mediated by NO synthesis, a vasoactive compound that participates in blood flow regulation in the different vascular beds and, particularly, in the coronary blood flow²³. The subcellular location of NO synthesis has a great influence on its biological activity. In the 1990's, the initial identification of eNOS location in the caveolae in the cell plasma membrane provided the structural basis for the recognition of compartmentalization in the mechanisms of cell signaling promoted by NO. The subsequent observation that eNOS interacts directly with structural proteins of the caveola - the caveolins, provided biochemical evidence of the interaction between eNOS and caveola and its implication with numerous signaling molecules concentrated in this environment of the cell membrane²⁴. A great number of evidences revealed that the caveolae are capable of recruiting numerous signaling molecules and to regulate their activities instead of acting as a simple support for cell exchange and transportation²⁵. Thus, it has been described that eNOS is located inside the caveolae and is kept in a less active state via its interaction with caveolin-1²⁶.

eNOS structure

eNOS functions as a dimer consisting of two identical monomers, which, in turn, can be functionally and structurally divided into two major domains: a C-terminal reductase domain, homologous to cytochrome P450 which contains binding sites for NADPH, flavine mononucleotide (FMN) and flavine adenine dinucleotide (FAD); and an N-terminal oxidase, which subtracts one electron from the L-arginine substrate and has binding sites for heme iron, for the tetrahydrobiopterin cofactor (BH₄) and for L-arginine^20,21,27 (Figure 2). The catalysis reaction of constitutive NOS involves two oxidation stages: L-arginine hydroxylation into N^G-hydroxy-L-arginine, followed by oxidation of this intermediate compound with utilization of one NADPH electron, thus forming L-citrulline and NO²⁸. This reaction consumes 1.5 mol of NADPH and 2 moles of oxygen per mol of L-citrulline formed^16,29,30. Cofactors such as heme iron, BH₄ and L-arginine have been studied in depth, and their low bioavailability induces the phenomenon of dysfunctional eNOS^31-33. Heme iron is essential for dimerization of the three isoforms³⁴: low concentrations or absence of L-arginine catalyze oxygen reduction in superoxide (O₂^.-)³⁵, and decreased levels of BH₄ lead to the simultaneous production of NO e O₂^.-, products that react with each other forming peroxynitrite (ONOO^-)³⁶.

Regulation of eNOS activity and gene expression

Ever since it was verified that the endothelial cells contain a baseline concentration of eNOS protein, the eNOS gene was considered constitutively expressed. Interestingly, further studies demonstrated that stable mRNA concentrations are subject to a modest level of regulation³⁷. The eNOS gene promoter was cloned, and it was demonstrated that it has a complex regulatory mechanisms of gene expression. Like the promoter of constitutively expressed genes, the eNOS gene promoter does not contain the TATA box sequence. However, it has multiple cis-regulatory DNA sequences, including CCAT box, Sp1 sites, GATA motifs, CACCC box, AP-1 and AP-2 sites, p53 binding sites, and NF-1 elements, in addition to sequences responsive to sterol elements and shear stress³⁸. Bovine and human promoter sequences have a homology of 75%, thus suggesting a high evolutionary preservation of the gene transcriptional regulation. Located in the proximal promoter, the positive regulatory domains I and II (PRD I and PRD II) are involved in the baseline regulation of gene transcription, showing an affinity with the transcription factors Sp-1, Sp-3, Ets-1, Elf-1, YY1 and MYC-associated zinc finger protein³⁹. Studies in vitro demonstrated that eNOS promoter responsiveness to shear stress is dependent on sequences located between -1,000 and -975, a region relative to transcription start^40,41. Besides, the binding of NF-κβ subunits p50 and p65 to the responsive element GAGACC (-990; -984) - located upstream of the transcription start site, is involved in shear stress activation of the promoter⁴². Also, transcription in bovine endothelial cells subject to laminar flow showed a nine-fold increase in mRNA. This effect was mediated by two distinct mechanisms: 1) transient increase in gene transcription, and 2) subsequent prolonged mRNA half-life⁴³.

The mechanism of eNOS activation has been described as the most elaborated of the free isoforms, reflecting the complexity of the physiologic control of the different vascular beds^17,44. The classical mechanism of constitutive isoform activation is calcium (Ca⁺⁺)-dependent, whereas iNOS is independent of the elevation of intracellular Ca⁺⁺ concentrations, because of the high affinity of the enzyme binding with calmodulin^31,39,44.

The complexity of the eNOS post-transcriptional regulatory mechanisms has been considered in the dimerization of the protein subunits and in the role of the protein caveolin in the formation of the caveolar structure⁴⁵. Endothelial NOS is located inside the caveola and is kept in a less active state via its interaction with caveolin-1²⁶. The mechanisms migration from the cell membrane to the Golgi apparatus and Akt, PKA, and AMPK-kinase-dependent phosphorylations are described as responsible for the activation of this NOS isoform. Thus, the interaction keeps eNOS inactive, and calmodulin acts directly on the competition with caveolin in the promotion of the calcium-dependent enzyme activation¹⁵. Endothelial NOS activity is well known in the vascular environment, and is regulated by six mechanisms after its translation: lipid inclusion; calcium/modulin-dependent mechanism; direct protein-protein interactions; several phosphorilations; glycosylation; and substrate and cofactor availability. Thus, eNOS can interact with several proteins in their "less active" or "more active" states. The plasmalemma-bound eNOS N-myristoylation and palmitoylation processes are required, which, in this state, is associated with caveolin-1 and HSP 90. The protein that interacts with HSP70, named "CHIP", interacts with both HSP70 and HSP90, and downregulates eNOS traffic to the Golgi apparatus, in contrast to "NOSIP" and "NOSTRIN" which can downregulate eNOS location in the plasma membrane. The main eNOS activation mechanism occurs via phosphorylation of the amino acid serine at position 1.177⁴⁶ by the Akt-kinase enzyme (or kinase protein B), which increases eNOS sensitivity to baseline Ca⁺⁺/calmodulin concentrations⁴⁷. Tonic or phasic eNOS activation in response to blood flow is independent of Ca⁺⁺ concentration changes and constitutes the shear stress. Dimmeler et al⁴⁸ demonstrated that the exchange of the serine^1177/1179 residue for the amino acid alanine makes eNOS incapable of responding to phosphorylation and activation by the Akt enzyme, a phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3K)-dependent pathway. Although phosphorylation of the serine¹¹⁷⁷ residue plays a pivotal role in eNOS enzyme activation, its regulation is known to be also dependent on the phosphorylation pattern of other currently well-characterized sites⁴⁹. Phosphorylation of the serine⁶³³ residue, located in the binding domain of flavine mononucleotide (FMN) also increases eNOS activity and seems to be particularly important to keep NO synthesis after serine¹¹⁷⁷ residue phosphorylation and activation by Ca⁺⁺/calmodulin. Phosphorylated by protein kinase C (PKC), the threonin⁴⁹⁵ residue interferes with the calmodulin binding domain, thus downregulating NO synthesis.

Recent studies have evaluated the capacity of certain drugs, such as antioxidants and renin-angiotensin system blockers, to reduce endothelial dysfunction by means mechanisms of eNOS activation via phosphorylation of specific sites such as the serine¹¹⁷⁷ residue. This phosphorylation may be affected by the subcellular enzyme location, such as the caveolae, intercellular junctions, Golgi apparatus, and cytosolic compartments, as well as by protein kinases and phosphatases associated with these structures. Recently, our group⁵⁰ demonstrated that Telmisartan, an angiotensin II receptor blocker, promotes reduction of endothelial dysfunction by means of eNOS activation via phosphorylation of specific sites, such as serine¹¹⁷⁷ and serine⁶³⁵ residues.

Nitric oxide, vascular tone and muscle vasodilatation

After confirmation that NO is synthesized by endothelial cells and that it participates in the cardiovascular hemodynamic regulation, interest was focused on the quantification of its participation in this homeostasis of this system. Studies in vivo in healthy individuals demonstrated that the intra-arterial administration of N^G-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) - an unspecific NOS activity blocker, reduces local blood flow by 25% to 50%⁵¹. Although the baseline vascular tone is the product of vasoconstrictor versus vasodilator forces, these results demonstrate that NO is, at least in part, the modulator of the phenotype at issue.

During exercise and mental stress conditions, in addition to the tachycardic response and blood pressure increase, vasodilatation in the skeletal muscle bed is also observed as part of the physiological responses of body adjustment. It was hypothesized that part of this muscle vasodilator response would be modulated by a neural component, and this was later evidenced by the existence of cholinergic sympathetic fibers in the skeletal muscles of some mammal species, except for primates and humans. Electrical stimulation of the sympathetic nerve was verified to lead to vasodilatation in the human muscle bed when presynaptic norepinephrine release was inhibited by intra-arterial drug infusion. However, this vasodilator response was attenuated when a muscarinic antagonist was administered^52,53. Later, it was evident that NO is, at least in part, the modulator of the vasodilator response verified when cholinergic sympathetic fibers are stimulated⁵⁴. In fact, Blair et al⁵⁵ had already shown that forearm vasodilatation in humans during physiologic maneuvers is mediated by a neural component. During application of mental stress, blood flow in the sympathectomized limb did not change in comparison to the blood flow in the control limb. In addition, intra-arterial atropine infusion in the control limb reduced the increase in blood flow by approximately 50%. At that moment, using indirect evidence, the authors suggested the existence of cholinergic sympathetic enervation in the skeletal musculature of humans. Mimicking animal experiments, Dietz et al's studies^56,57 later showed that part of the muscle vasodilator response, as measured in the forearm during exercise or mental stress, is attenuated by the intra-arterial administration of L-NMMA. The mechanisms through which acetylcholine and NO are synthesized and released during the body defense reactions in humans are still not fully understood. Evidences obtained with pharmacological blockade permit only the suggestion of the existence of cholinergic sympathetic fibers in the skeletal musculature. Due to these limitations, the authors do not rule out the possibility of vasodilatation being caused by a combination between circulating and local factors. A small part of endothelial cells could synthesize and release acetylcholine⁵⁸. In addition, activation of β₂-adrenergic receptors located in the vascular smooth muscle would result in relaxation of this tissue and, consequently, in vasodilatation. However, Majmudar et al⁵⁹ verified that part of the vasodilatation resulting from β₂-adrenoceptor activation is mediated by NO. Although the authors do not explain the mechanism responsible for this phenomenon, approximately 25% of the vasodilatation observed in the forearm with infusion of Ritodrine (a selective β₂-adrenergic agonist) was attenuated with the concomitant administration of L-NMMA. These results suggest the existence of β₂-adrenoceptors in the vascular endothelium, thus contributing to the increase in eNOS activity. In addition, increased mechanical stimulation of the vascular endothelium would result in increased NO synthesis via PI-3K-Akt kinase, with subsequent serine¹¹⁷⁷ residue phosphorylation.

eNOS polymorphisms and functional studies on the G894T variant

Genotyped and sequenced in 1993 by Marsden et al³⁸ (GenBank D26607), eNOS is located in chromosome 7q35-36, and variations in its sequence have been described in the promoter, exons and introns²⁷. The gene (21-22 kbp) comprises 26 exons and 25 introns with 133 kDa. The polypeptide sequence generated contains 1,203 amino acids³⁸. The existence of three single nucleotide polymorphisms (SNP) in the promoter, in non-binding locations of transcription factors has already been described in the literature³⁹. SNP were found in introns 2, 11, 12, 18, 22 and 23⁶⁰, and repeat sequence polymorphisms in introns 2, 4, 8, and 13^38,61. Of the polymorphisms found in exons 6 and 7, replacement of the nitrogenous base guanine for thymine (GT) at position 894 located in exon 7 results in a change of the amino acid glutamate (GAG) to aspartate (GAT) at position 298 of the polypeptide sequence⁶². It is suggested that polymorphisms located in the gene promoter have an influence on mRNA transcription, whereas polymorphisms located in coding regions may result in changes in enzymatic activity⁶³.

Residue 298 is located outside in the oxidase domain of the enzyme, binding sites for L-arginine or BH₄. Enzymatic studies using recombinant eNOS showed no difference in Michaelis constant (k_m) or in V_max between the two enzyme forms⁶³. Although the enzymatic activity is seemingly not affected by the Asp²⁹⁸ form of the enzyme, Tesauro et al⁶⁴ showed that this variant is more susceptible to proteolytic cleavage into 100 and 35 KDa fragments, more precisely in position Asp²⁹⁸-Pro²⁹⁹, in comparison to the Glu²⁹⁸ variant. However, Fairchild et al⁶⁵ demonstrated that this proteolytic susceptibility occurred because of an artifact of the sample preparation method. The inconsistency of these results does not rule out the possibility that an unknown proteolytic mechanism or even a change in post-transcriptional regulation may be modulated by the Asp²⁹⁸ variant of the enzyme in vivo.

Association between the G894T variant of the eNOS gene and cardiovascular phenotypes

Several diseases have been associated with abnormalities in NO biosynthesis, and many of these conditions are related to autonomic dysfunction. Population genetics studies have demonstrated a significant association of eNOS gene G894T polymorphism with coronary artery disease (CAD)^66-68 and also with acetylcholine (Ach)-induced coronary vasospasm⁶⁹. Among the cardiovascular dysfunctions, the G894T variant was also demonstrated to be associated with hypertension^70,71, although this association had not been verified in other populations^72,73.

The correlation between genotype and clinical phenotype varies both quantitatively and qualitatively, and the inconsistent association between eNOS polymorphism and several clinical phenotypes is a phenomenon commonly observed in other phenotype-associated genes²⁷. This inconsistency has been attributed to environmental factors, independent alleles, interaction between genes and variability in clinical phenotypes. The importance of environmental factors in the genesis of diseases is reflected in morbidity and mortality differences between genetically homogeneous groups, however with different life styles.

A genetic variation may not be relevant to a determined population, thus reflecting differences in the frequency of allele distribution. One example is the frequency of the allele 894T, which is significantly higher in white populations in comparison to the Japanese population²³. The inconsistent association between eNOS polymorphism and vascular changes is still being attributed to the variation in eNOS distribution in different organs. Arteries of specific organs are subject to different hemodynamic pressures, determining the vessel wall response and subsequent degree of endothelial dysfunction²⁷.

Philip et al⁶² studied patients undergoing surgical revascularization and observed that vascular reactivity to phenylephrine (PE) infusion is influenced by the G894T variant of the eNOS gene. The dose-dependent vasoconstrictor response to PE was significantly greater for the TT and GT alleles in comparison to the homozygote GG group, thus indicating that vascular reactivity to vasoconstrictor drugs may be influenced by eNOS polymorphism in humans. The greater dose-dependent response of patients with the 894T variant suggests reduced NO biosynthesis. Systemic administration of N^G-nitro-_L-arginine methyl esther (L-NAME) leads to hypertension in humans^74,75. According to Frandsenn et al⁷⁶, the administration of 4mg/kg of L-NAME in humans reduces eNOS activity by 67%. The possibly reduced NO bioavailability subsequent to eNOS gene variations is an important candidate to the susceptibility to the development of endothelial dysfunction^62,63 and changes in modulation of the sympathetic nervous activity on the vessel⁷⁷.

Studies demonstrating the association between the G894T variant of the eNOS gene and cardiovascular phenotypes point to a possible reduction in NO bioavailability, thus suggesting that eNOS transcribed from the mutant allele has an abnormal enzymatic activity. The lack of evidence supporting this rationale encouraged us to test the functionality of the genetic variant on the muscle vasodilatation phenotype⁷⁸. If the G894T variant of the eNOS gene could reduce the enzymatic activity, individuals with the mutant allele (T) would show a smaller increase in muscle blood flow in response to the handgrip isometric exercise. In order to test this hypothesis, 287 individuals were genotyped; from these, 33 healthy individuals were selected to represent three genotypes: GG (wild type), GT and TT. The results showed that attenuated reflex muscle vasodilatation in response to exercise occurred only in the TT genotype, since vasodilatation among heterozygotes (GT genotype) was similar to that observed among homozygotes for the G allele (GG genotype). These results suggest that the presence of the G allele is sufficient to overcome a possible T allele deficiency. Subsequent analyses in vivo proved that the attenuated muscle vasodilatation observed in the TT genotype is a consequence of the reduced eNOS-mediated vasodilatation, since intra-arterial L-NMMA infusion did not change the vasodilator response to exercise in this genotype. In contrast, L-NMMA significantly reduced the vasodilator response to exercise in the GG genotype to values similar to those of the TT genotype. Also, our study demonstrated that the attenuated muscle vasodilatation observed in the TT genotype may not be accounted to a possibly increased vasoconstrictor sympathetic tone. In fact, the muscle sympathetic nervous activity, as measured directly in the fibular nerve using the microneurography technique, increased in a similar fashion among the genotypes during exercise. Although these results do not confirm the functionality of the T allele in the alteration of the enzymatic activity (this variant may be in linkage disequilibrium with other functional variant on the same gene or on a nearby gene on the same chromosome), they may be used as a marker of the dysfunction observed in the muscle vasodilatation phenotype. This is the first demonstration that the G894T variant of the eNOS gene is functionally associated with reduced eNOS-mediated vasodilatation. Also, these results suggest that the reduced endothelium-dependent vasodilatation may anticipate vascular dysfunction in individuals with the TT-genotype.

Conclusion

NO synthases were proven to be constitutively expressed (eNOS and nNOS) and NO plays an important role in the regulation of cardiovascular activities. These facts aroused the interest for the understanding of the molecular and cellular mechanisms that regulate their functionality. Although these mechanisms are complexo and difficult to access, some of them have already been elucidated, thus permitting partial knowledge of the NO biology. In this context, the advances in molecular biology techniques enabled the identification of variants in the human genetic code that could, at least in part, explain the phenotypical response variation between individuals. Genetic association studies are not easy to understand. A single gene may have a small to moderate participation in the regulation of a multigenic phenotype and, in this situation, a determinate functional genetic variant in this gene would explain only a small part of the phenotype response variation. The screening of candidate genes, that is, the identification of multiple genes and their respective polymorphisms which trigger variations in the cardiovascular function leads to the moment when part of the diagnosis and management adopted for the treatment will be based on genomic medicine.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESP.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Rodrigo Gonçalves Dias, from Universidade Estadual de Campinas e Instituto do Coração - InCor (HCFMUSP) de São Paulo.

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Rodrigo Gonçalves Dias

Unidade de Hipertensão - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular

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05403-000 - São Paulo, SP - Brazil

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Manuscript received February 12, 2009; revised manuscript received June 26, 2009; accepted August 14, 2009.

ARTÍCULO DE REVISIÓN

Óxido nítrico y sistema cardiovascular: activación celular, reactividad vascular y variante genética

Rodrigo Gonçalves Dias^I,II; Carlos Eduardo Negrão^I; Marta Helena Krieger^II

^IInstituto do Coração - InCor (HCFMUSP), São Paulo, SP

^IILabcardio - Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

El óxido nítrico (NO), primariamente identificado como un factor relajante derivado del endotelio, es un radical libre actuante en la señalización de diferentes procesos biológicos. La identificación de las isoformas de las sintasas del NO (NOS) y la subsecuente caracterización de los mecanismos de activación celulares de las enzimas posibilitaron tanto la comprensión de parte de las interacciones fisiológicas como la comprensión de parte de los mecanismos de enfermedad, en la cual el NO está envuelto. La isoforma endotelial de la NOS (eNOS), expresada principalmente en el endotelio vascular, desempeña importante papel en la regulación de la reactividad vascular y en el desarrollo y en la progresión de la aterosclerosis. Esta revisión tiene el propósito de contextualizar al lector sobre la estructura de la eNOS y sus mecanismos de activación celular. Teniendo en vista los avances de la biología molecular, trataremos aun de los conocidos mecanismos de regulación de la expresión génica y del papel de variantes en el código genético de la eNOS asociados a fenotipos cardiovasculares. Aunque se reconozca la importancia del NO como molécula ateroprotectora, nuestra atención estará volcada a la revisión de literatura envolviendo NO y su participación en la modulación del fenotipo de vasodilatación muscular.

Palabras clave: Óxido nítrico, óxido nítrico sintasa tipo III, polimorfismo genético.

Introducción

La evidencia primaria de que el endotelio es un componente indispensable en la regulación del tono vascular surgió cuando análisis experimentales demostraron que, en la ausencia de esa monocapa de epitelio pavimentoso, la vasodilatación inducida por la acetilcolina no ocurría. En aquel momento, Furchgott y Zawadzki¹ documentaron que, cuando era estimulado, el endotelio era capaz de liberar una sustancia vasoactiva que fue denominada factor relajante derivado del endotelio (EDRF, del inglés endothelium-derived relaxing factor). Pasados algunos años, el EDRF fue identificado por Ignarro et al² como el óxido nítrico (NO), un compuesto caracterizado en 1977 por Ferid Murad que, cuando liberado por nitratos, causaba relajación en células musculares lisas. Ese contexto le valió a Robert F. Furchgott, Ferid Murad y Louis J. Ignarro el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1998 (fig. 1). Una serie de estudios fue responsable por la caracterización de que el endotelio libera otros EDRF como la prostaciclina (PGI₂) y el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF, del inglés endothelium-derived hyperpolarizing factor), además de factores constritores derivados del endotelio (EDCF, del inglés endothelium-derived contracting factors), como la endotelina (ET-1), productos de la vía de la ciclooxigenasa como el tromboxano A₂ (TXA₂) y especies reactivas de oxígeno como el anión superóxido (O₂^.-)³. Esos descubrimientos asociados a la caracterización del endotelio como un sensor biológico capaz de detectar cualquier estímulo mecánico, físico o químico - y responder a él - lo elevó al puesto de un tejido multifuncional que desempeña importante papel en la homeostasia de todos los sistemas fisiológicos.

Óxido nítrico y sistema cardiovascular

El NO, una molécula gaseosa actuante en la señalización de diferentes procesos biológicos, es un radical libre que presenta un electrón desemparejado en la última capa y una vida media de 4 a 8 segundos en medio acuoso oxigenado^4,5. Descripto como un gas lábil, capaz de libre difusión en las membranas celulares, tal característica colabora con su alta actividad biológica⁶. El reconocimiento de que el endotelio vascular es un órgano activo y que su integridad favorece efectos benéficos, como acción antioxidante, antiinflamatoria, anticoagulante, profibrinolítica, inhibitoria de la adhesión y migración de leucocitos, inhibitoria de la proliferación y migración de las células musculares lisas, inhibitoria de la agregación y adhesión plaquetaria, vino a ampliar aun más las múltiples acciones del NO⁷. Así, ese escenario ateroproctetor es caracterizado por una armonía entre sustancias liberadas por el endotelio, en el cual el NO es citado como uno de los compuestos vasoactivos de mayor relevancia. Caracterizado como un desorden sistémico que antecede a la aterosclerosis y sus complicaciones, la disfunción endotelial en arterias coronarias ateroscleróticas fue inicialmente demostrada por Ludmer et al⁸ y, después, relacionada a la alteración en la biodisponibilidad del NO⁹.

En la actual literatura, hay concordancia de que la reducida actividad biológica de NO, causada tanto por la reducción en la síntesis como por el aumento de la degradación por el estrés oxidativo, ha sido identificada como el mecanismo de mayor relevancia en el proceso multifactorial en la disfunción endotelial y en la participación de las principales disfunciones cardiovasculares¹⁰. Así, la reducción en la biodisponibilidad del NO y la consecuente disfunción endotelial determinan, en el ambiente vascular, el desencadenamiento de eventos como alteraciones en el tono, disfunciones trombóticas, proliferación y migración de células musculares lisas (CML), y adhesión de leucocitos¹¹. En la disfunción endotelial, ocurre también el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO)¹², y estas pueden reducir la disponibilidad de NO endotelial por diferentes vías: inactivación directa del NO por superóxido, con formación de peroxinitrito (ONOO^-)¹³; reducción en la expresión y en la actividad de las sintasas del NO, por causa de los cambios en sus sustratos o cofactores, y en el aumento de los niveles de dimetilarginina asimétrica (ADMA)¹⁴; y, aun, desacoplamiento de la NOS endotelial causado por la oxidación aumentada de tetraidrobiopterina (BH₄)¹⁵.

El entendimiento de la complejidad de la función endotelial y la dificultad de estudiar cada uno de sus componentes aisladamente vienen siendo superados. En ese contexto, modelos animales capaces de reproducir una disfunción endotelial fueron desarrollados, posibilitando, por ejemplo, el funcionamiento del sistema en condiciones de baja o aumentada biodisponibilidad de NO. Además de eso, estudios in vivo en humanos, a través de la infusión intraarterial de compuestos con potencial de modular la función endoteliodependiente o endotelioindependiente, posibilitaron la investigación de los mecanismos moduladores de la función vascular en las diferentes condiciones fisiológicas y enfermedades de mayor prevalencia.

Sintasas de óxido nítrico

La producción enzimática del NO a partir del aminoácido L-arginina es mediada por una familia de tres sintasas de óxido nítrico (NOS), codificadas por genes distintos¹⁶. Las isoformas comparten 50%-60% de homología en la secuencia de aminoácidos, en los dominios oxidasa y reductasa¹⁷. Esas isoformas exhiben características distintas que reflejan sus funciones específicas in vivo¹⁸.

La sintasa endotelial del óxido nítrico (eNOS o NOS III; 7q35-36) y la sintasa neuronal del óxido nítrico (nNOS o NOS I; 12q24.2) poseen mecanismo de activación constitutivo (cNOS). La isoforma inducida (iNOS o NOS II; 17cen-q12) se encuentra expresada en procesos celulares anormales como en la insuficiencia cardíaca¹⁹, inducidas por citoquinas y agentes inflamatorios, lo que resulta en alto flujo de NO^20,21. La eNOS, encontrada principalmente en las células endoteliales en compartimientos denominados caveolas²², es esencial para la manutención del tono vascular basal. Ese tono es, en parte, mediado por la síntesis del NO, un compuesto vasoactivo participante en la regulación del flujo sanguíneo en los diversos lechos vasculares y, particularmente, en el flujo sanguíneo coronario²³. La ubicación subcelular de la síntesis de NO ejerce gran influencia en su actividad biológica. En la década de 1990, la identificación inicial de la ubicación de la eNOS en la caveola, en la membrana plasmática de las células, proveyó la base estructural para el reconocimiento de la compartimentación en los mecanismos de señalización celular promovido por el NO. La subsecuente observación de que la eNOS interactúa directamente con las proteínas estructurales de la caveola, las caveolinas, proveyó la evidencia bioquímica de la interacción entre eNOS y caveola y su implicación con numerosas moléculas de señalizaciones concentradas en ese ambiente de la membrana celular²⁴. Un gran número de evidencias reveló que las caveolas son capaces de reclutar numerosas moléculas de señalización y regular sus actividades en vez de servir como simple soporte para el intercambio y el transporte celulares²⁵. Así, fue descripto que la eNOS se ubica dentro de la caveola y es mantenida en un estado menos activo por medio de su interacción con la caveolina-1²⁶.

Estructura de la eNOS

La eNOS funciona como un dímero, constituida de dos monómeros idénticos, que, a su vez, pueden ser divididos funcional y estructuralmente en dos dominios principales: un dominio C-terminal reductasa, homólogo al citocromo P450 y que contiene sitios de ligazón para NADPH, flavina mononucleótido (FMN) y flavina adenina dinucleótido (FAD), y un dominio N-terminal oxidasa, que abstrae un electrón del sustrato L-arginina y posee sitios de ligazón para el hierro heme, para el cofactor tetraidrobiopterina (BH₄) y para la L-arginina^20,21,27 (fig. 2). La reacción de catálisis de las NOS constitutivas envuelve dos niveles de oxidación: la hidroxilación de la L-arginina en N^G-hidroxi-L-arginina, seguida de la oxidación de este intermediario con utilización de un electrón de la NADPH, formando L-citrulina y NO²⁸. Esa reacción consume 1,5 mol de NADPH y 2 mols de oxígeno por mol de L-citrulina formada^16,29,30. Cofactores como hierro heme, BH₄ y L-arginina han sido particularmente estudiados, y la baja biodisponibilidad de estos induce al fenómeno de la eNOS disfuncional^31-33. El hierro heme es esencial para la dimerización de las tres isoformas³⁴, bajas concentraciones o ausencia de L-arginina catalizan la reducción del oxígeno en superóxido (O₂^.-)³⁵, y niveles disminuidos de BH₄ llevan a la producción simultánea de NO y O₂^.-, productos que reaccionan entre si formando peroxinitrito (ONOO^-)³⁶.

Regulación de la expresión génica y de la actividad de la eNOS

Una vez verificado que las células endoteliales contienen una concentración basal de la proteína eNOS, el gen de la eNOS fue considerado constitutivamente expresado. Es interesante que, estudios posteriores demostraron que concentraciones estables del mRNA son sujetas a un modesto nivel de regulación³⁷. La región promotora del gen de la eNOS fue clonada, demostrando poseer un complejo mecanismo de regulación de la expresión génica. Semejante a la región promotora de genes constitutivamente expresados, la región promotora del gen de la eNOS no contiene la secuencia TATA Box. Mientras tanto, posee múltiples secuencias DNA cis-regulatorias, incluyendo CCAT box, sitios Sp1, GATA motifis, CACCC box, sitios AP-1 y AP-2, región de ligazón p53, elementos NF-1, además de secuencias responsivas a elementos esteroles y shear stress³⁸. Las secuencias promotoras humana y bovina presentan 75% de homología, sugiriendo una alta conservación evolutiva de la regulación transcripcional del gen. Ubicados en la región promotora proximal, los dominios regulatorios positivos I y II (PRD I y PRD II) están envueltos en la regulación basal de la transcripción génica, presentando afinidad por los factores de transcripción Sp-1, Sp-3, Ets-1, Elf-1, YY1 y proteína MYC-associatedzinc finger³⁹. Estudios in vitro demostraron que la responsividad del promotor de la eNOS al shear stress es dependiente de secuencias ubicadas entre -1.000 y -975, región relativa a la inicialización de la transcripción^40,41. Además de eso, la ligazón de las subunidades p50 y p65 del NF-κβ al elemento responsivo GAGACC (-990; -984), ubicado anteriormente al sitio de inicialización de la transcripción, está envuelta en la activación del promotor por el shear stress⁴². Y aun, la transcripción en células endoteliales bovina sometidas a flujo laminar presentó aumento de 9 veces del mRNA. Ese efecto fue mediado por dos mecanismos distintos: 1. aumento transiente de la transcripción del gen y 2. subsecuente vida media prolongada del mRNA⁴³.

El mecanismo de activación de la eNOS ha sido descripto como el más elaborado de las tres isoformas, reflejando la complejidad del control fisiológico de los diferentes lechos vasculares^17,44.El mecanismo clásico de activación de las isoformas constitutivas es dependiente del calcio (Ca⁺⁺), mientras que la iNOS es independiente de la elevación de las concentraciones intracelulares de Ca⁺⁺, debido a alta afinidad de la ligazón de la enzima con la calmodulina^31,39,44.

La complejidad de los mecanismos de regulación post transcripcionales de la eNOS ha sido considerada, tanto como consecuencia de la dimerización de las subunidades de la proteína como en función del papel de la proteína caveolina en la formación de la estructura caveolar⁴⁵. La eNOS se ubica dentro de la caveola y es mantenida en un estado menos activo por su interacción con la caveolina-1²⁶. Los mecanismos de migración de la membrana celular para el complejo de Golgi y las fosforilaciones Akt, PKA y AMPK-quinasa dependientes son descriptos como responsables por la activación de esa isoforma de la EN LOS. Así, la interacción mantiene la eNOS inactiva, y la calmodulina actúa directamente, compitiendo con la caveolina, para promover la activación calcio-dependiente de la enzima¹⁵. La actividad de la eNOS es bien conocida en el ambiente vascular y es regulada por seis mecanismos después de su traducción: inclusión de lípidos, mecanismo calcio/calmodulina dependiente, interacciones directas proteína-proteína, diferentes fosforilaciones sitio dirigidas, glucosilación y disponibilidad de substratos y cofactores. Así, la eNOS puede interactuar con varias proteínas en sus estados "menos activos" o "más activos". Son requeridas etapas de N-meristolación y palmitación de la eNOS ligada a plamalema, que, en este estado, se encuentra asociada a caveolina-1 y a HSP 90. La proteína que hace interacción con la HSP70, denominada "CHIP", interactúa con ambas HSP70 y HSP90, y regula negativamente el tráfico de la eNOS para el complejo de Golgi, en contraste con la "NOSIP" y "NOSTRIN" que pueden regular negativamente la ubicación de la eNOS en la membrana plasmática. El principal mecanismo de activación de la eNOS se da por la fosforilación del aminoácido serina en la posición 1177⁴⁶ por la enzima Akt-quinasa (o proteína quinasa B), lo que aumenta la sensibilidad de la eNOS a las concentraciones basales de Ca⁺⁺/calmodulina⁴⁷. La activación tónica o fásica de la eNOS en respuesta al flujo sanguíneo es independiente de las alteraciones en la concentración del Ca⁺⁺ y se constituye del shear-stress. Dimmeler et al⁴⁸ demostraron que el intercambio del residuo de serina^1177/1179 por el aminoácido alanina vuelve a la eNOS incapaz de responder a la fosforilación y activación por la enzima Akt, una vía dependiente de fosfatidilinositol-3 quinasa (PI-3K). Aunque la fosforilación del residuo de serina¹¹⁷⁷ desempeñe un papel preponderante en la activación enzimática de la eNOS, es sabido que su regulación también depende del estándar de fosforilación de otros sitios actualmente bien caracterizados⁴⁹. La fosforilación del residuo de serina⁶³³, ubicado en el dominio de ligazón de la flavina mononucleótido (FMN), también aumenta la actividad de la eNOS y parece ser particularmente importante en la manutención de la síntesis de NO después de la activación por Ca⁺⁺/calmodulina y fosforilación del residuo de serina¹¹⁷⁷. Fosforilado por la proteína quinasa C (PKC), el residuo de treonina⁴⁹⁵ interfiere con el dominio de ligazón de la calmodulina, regulando negativamente la síntesis del NO.

Recientes estudios han evaluado la capacidad de determinados fármacos en la reducción de la disfunción endotelial, como los antioxidantes y bloqueadores del sistema renina-angiotensina, por medio de los mecanismos de activación de la eNOS vía fosforilación del sitios específicos como el residuo de serina¹¹⁷⁷. Esa fosforilación puede ser afectada por la ubicación subcelular de la enzima, tales como caveola, uniones intercelulares, complejo de Golgi y compartimientos citosólicos, así como por quinasas proteicas y fosfatasas asociadas a esas estructuras. Recientemente, nuestro grupo⁵⁰ demostró que el Telmisartan, bloqueador del receptor de angiotensina II, promueve reducción de la disfunción endotelial por medio de la activación de la eNOS vía fosforilación de sitios específicos, como el residuo de serina¹¹⁷⁷ y serina⁶³⁵.

Óxido nítrico, tono vascular y vasodilatación muscular

Después de la verificación de que el NO es sintetizado por las células endoteliales y que participa de la regulación hemodinámica cardiovascular, el interés comenzó a concentrarse en la cuantificación de su participación en la homeostasia de ese sistema. Estudios in vivo en individuos sanos demostraron que la administración intraarterial de N^G-monometil-L-arginina (L-NMMA), un bloqueador inespecífico de la actividad de las NOS, reduce el flujo sanguíneo local entre 25% y 50%⁵¹. Aunque el tono vascular basal sea el producto de las fuerzas constrictoras versus fuerzas vasodilatadoras, esos resultados demuestran que el NO es, por lo menos en parte, el modulador del fenotipo en cuestión.

Durante condiciones de estrés mental y ejercicio, es observado, juntamente con la respuesta taquicárdica y el aumento de la presión arterial, vasodilatación en lecho muscular esquelético como parte de las respuestas fisiológicas de ajuste del organismo. Fue postulado que parte de esa respuesta vasodilatadora muscular sería modulada por un componente neural, lo que quedó evidente posteriormente por la existencia de fibras simpáticas colinérgicas para la musculatura esquelética de algunas especies de mamíferos, con excepción de primates y humanos. Se verificó que la estimulación eléctrica del nervio simpático provocaba vasodilatación en lecho muscular humano cuando la liberación presináptica de noradrenalina era inhibida por la infusión intraarterial de fármacos. Mientras tanto, esa respuesta vasodilatadora se mostró atenuada cuando un antagonista muscarínico fue administrado^52,53. Posteriormente, quedó evidente que el NO se constituye, por lo menos en parte, como el modulador de la respuesta vasodilatadora verificada cuando fibras simpáticas colinérgicas son estimuladas⁵⁴. De hecho, Blair et al⁵⁵ ya habían evidenciado que, en humanos, la vasodilatación en el antebrazo, durante maniobras fisiológicas, es mediada por un componente neural. Durante la aplicación del estrés mental, el flujo sanguíneo en el miembro simpatectomizado no se alteraba, cuando era comparado al flujo sanguíneo en el miembro control. Además de eso, la infusión intraarterial de atropina en el miembro control reducía en aproximadamente 50% el aumento en el flujo sanguíneo. En aquel momento, utilizando las evidencias indirectas, los autores sugirieron la existencia de inervación simpática colinérgica para la musculatura esquelética de humanos. Mimetizando los experimentos en animales, más tarde los estudios de Dietz et al^56,57 dejaron evidente que parte de la respuesta vasodilatadora muscular, medida en el antebrazo, durante el estrés mental o el ejercicio es atenuada con la administración intraarterial del L-NMMA. Los mecanismos por los cuales la acetilcolina y el NO son sintetizados y liberados durante las reacciones de defensa del organismo no están completamente elucidados en humanos. Las evidencias alcanzadas con bloqueos farmacológicos permiten apenas sugerir la existencia de fibras simpáticas colinérgicas para la musculatura esquelética. En consecuencia de tales limitaciones, los autores no descartan la posibilidad de que la vasodilatación sea causada por una combinación entre factores circulantes y locales. Una pequeña parte de las células endoteliales podría sintetizar y liberar acetilcolina⁵⁸. Además de eso, la activación de receptores β₂-adrenérgicos ubicados en el músculo liso vascular resultaría en la relajación de ese tejido y, en consecuencia, en la vasodilatación. Mientras tanto, Majmudar et al⁵⁹ verificaron que parte de la vasodilatación resultante de la activación de los β₂-adrenoceptores es mediada por el NO. Aunque los autores no expliquen el mecanismo responsable por ese fenómeno, aproximadamente 25% de la vasodilatación observada en el antebrazo con la infusión de Ritodrine (agonista selectivo β₂-adrenérgico) fue atenuada con la confusión de L-NMMA. Esos resultados sugieren la existencia de los β₂-adrenoceptores en el endotelio vascular, contribuyendo al aumento de la actividad de la eNOS. Además de eso, el aumento de la estimulación mecánica del endotelio vascular resultaría en síntesis aumentada de EN EL, vía PI-3K-Akt quinasa, con subsecuente fosforilación del residuo de serina¹¹⁷⁷.

Polimorfismos de la eNOS y estudios funcionales de la variante G894T

Genotipada y secuenciada en 1993 por Marsden et al³⁸ (GenBank D26607), la eNOS está ubicada en el cromosoma 7q35-36, y variaciones en su secuencia han sido descriptas en la región promotora, exones e intrones²⁷. El gen (21-22 kbp) comprende 26 exones y 25 intrones con 133 kDa. La secuencia polipeptídica generada contiene 1.203 aminoácidos³⁸. Ya está descripta en la literatura la existencia de tres polimorfismos de un único nucleótido (SNP) en la región promotora, en localizaciones de no ligazón de factores de transcripción³⁹. En los intrones 2, 11, 12, 18, 22 y 23, fueron encontrados SNP⁶⁰ y polimorfismos de secuencias repetidas en los intrones 2, 4, 8 y 13^38,61. De los polimorfismos encontrados en los exones 6 y 7, la sustitución de la base nitrogenada guanina por timina (GT), en la posición 894 ubicada en el exón 7, resulta en la sustitución del aminoácido glutamato (GAG) por aspartato (GAT) en la posición 298 de la secuencia polipeptídica⁶². Se sugiere que los polimorfismos ubicados en la región promotora del gen desempeñan influencia en la transcripción del RNAm, mientras que los polimorfismos ubicados en regiones codificadoras pueden resultar en alteración de actividad enzimática⁶³.

El residuo 298 está ubicado externamente en el dominio oxidasa de la enzima, sitios de ligazón para L-arginina o BH₄. Estudios enzimáticos que utilizaron eNOS recombinante mostraron que no hay diferencia en la constante de Michaelis (k_m) ni en la V_máx. entre las dos formas de la enzima⁶³. Aunque la actividad enzimática parezca no ser afectada por la forma Asp²⁹⁸ de la enzima, Tesauro et al⁶⁴ mostraron que esa variante presenta mayor susceptibilidad al clivaje proteolítico en fragmentos de 100 y 35 KDa, precisamente en la posición Asp²⁹⁸-Pro²⁹⁹, cuando es comparada a la variante Glu²⁹⁸. Mientras tanto, Fairchild et al⁶⁵ demostraron que tal susceptibilidad proteolítica ocurría por causa de un artefacto de la preparación del experimento. La inconsistencia de esos resultados no excluye la posibilidad de que, in vivo, un desconocido mecanismo proteolítico, o hasta aun una alteración en la regulación post transcripcional, pueda estar siendo modulado por la variante Asp²⁹⁸ de la enzima.

Asociación de la variante G894T del gen de la eNOS con fenotipos cardiovasculares

Diversas enfermedades han sido asociadas a anormalidades en la biosíntesis del NO, y muchas de esas condiciones están relacionadas a la disfunción autonómica. Estudios en genética poblacional han demostrado importante asociación del polimorfismo G894T del gen de la eNOS con enfermedad arterial coronaria (EAC)^66-68 y también con el espasmo coronario inducido por acetilcolina (Ach)⁶⁹. Entre las disfunciones cardiovasculares, fue aun verificado que la variante G894T se encuentra asociada a la hipertensión arterial^70,71, aunque esa asociación no haya sido verificada en otras poblaciones^72,73.

La correlación entre genotipo y fenotipo clínico varía cuantitativa y cualitativamente, y la inconsistente asociación entre el polimorfismo de la eNOS y varios fenotipos clínicos es un fenómeno frecuentemente observado en otros genes asociados la fenótipos²⁷. Esa inconsistencia ha sido atribuida a factores ambientales, alelos independientes, interacción entre genes y variabilidades en fenotipos clínicos. La importancia de los factores ambientales en la génesis de enfermedades se refleja en las diferencias de morbilidad y mortalidad entre grupos genéticamente homogéneos, aunque con estilos de vida diferentes.

Una variación genética puede no ser relevante a una determinada población, reflejando diferencias en la frecuencia de la distribución de los alelos. Un ejemplo de eso es la frecuencia del alelo 894T que es significativamente mayor en poblaciones blancas cuando es comparado a la población japonesa²³. La inconsistente asociación entre el polimorfismo de la eNOS y las alteraciones vasculares aun ha sido atribuida a la variación en la distribución de la eNOS en diferentes órganos. Arterias de órganos específicos son sujetas a diferentes presiones hemodinámicas, determinando la respuesta de la pared del vaso y el consecuente grado de disfunción endotelial²⁷.

Philip et al⁶² observaron, en pacientes sometidos a cirugía de revascularización, que la reactividad vascular a la infusión de fenilefrina (PE) es influenciada por la variante G894T del gen de la eNOS. La respuesta vasoconstrictora dosis-dependiente a la PE fue significativamente mayor para los alelos TT y GT, cuando fue comparada al grupo homocigoto GG, indicando que la reactividad vascular a las drogas vasoconstrictoras puede ser influenciada por el polimorfismo de la eNOS en humanos. La mayor respuesta dosis-dependiente de los pacientes con la variante 894T sugiere una reducida biosíntesis del NO. La administración sistémica de N^G-nitro-_L-arginina metil ester (L-NAME) provoca hipertensión en humanos^74,75. Según Frandsenn et al⁷⁶, la administración de 4 mg/kg de L-NAME en humanos reduce en 67% la actividad de la eNOS. La posible biodisponibilidad reducida del NO, en consecuencia de las variaciones en el gen de la eNOS, es un importante candidata para la susceptibilidad al desarrollo de la disfunción endotelial^62,63 y a la alteración de la modulación de la actividad nerviosa simpática sobre el vaso⁷⁷.

Las investigaciones que demostraron asociación de la variante G894T del gen de la eNOS con fenotipos cardiovasculares señalan una posible reducción de la biodisponibilidad del NO, sugiriendo que la eNOS transcripta del alelo mutante presenta actividad enzimática alterada. La falta de evidencias sobre este racional nos incentivó a testear la funcionalidad de la variante genética en el fenotipo de vasodilatación muscular⁷⁸. Si la variante G894T del gen de la eNOS fuese capaz de disminuir la actividad enzimática, individuos portadores del alelo mutante (T) presentarían menor aumento del flujo sanguíneo muscular en respuesta al ejercicio isométrico de handgrip. Para testear tal hipótesis, 287 individuos fueron genotipados, y, entre ellos, se seleccionaron 33 sanos para representar tres genotipos: GG (wild-type), GT y TT. Como resultado, la atenuada vasodilatación muscular refleja al ejercicio ocurrió apenas en el genotipo TT, una vez que la vasodilatación entre los heterocigotos (genotipo GT) fue similar a aquella observada entre los individuos homocigotos para el alelo G (genotipo GG). Esos resultados sugieren que la presencia del alelo G es lo suficiente para superar la posible deficiencia del alelo T. Análisis subsecuentes in vivo comprobaron que la atenuada vasodilatación muscular observada en el genotipo TT es consecuencia de la reducida vasodilatación mediada por la eNOS, una vez que la infusión intraarterial de L-NMMA no alteró la respuesta vasodilatadora al ejercicio en ese genotipo. En contraste, el L-NMMA redujo de forma significativa la respuesta vasodilatadora al ejercicio en el genotipo GG, para valores similares a los del genotipo TT. Además de eso, nuestro estudio demostró que la atenuada vasodilatación muscular observada en el genotipo TT no puede ser acreditada a un posible tono simpático vasoconstrictor aumentado. De hecho, la actividad nerviosa simpática muscular, medida directamente en el nervio fibular por la técnica de microneurografía, aumentó de forma semejante entre los genotipos durante el ejercicio. Aunque esos resultados no confirmen la funcionalidad del alelo T en la alteración de la actividad enzimática (esa variante puede estar en desequilibrio de ligazón con otra variante funcional en el mismo gen o en un gen próximo en el mismo cromosoma), pueden ser utilizados como un marcador de la disfunción observada del fenotipo de vasodilatación muscular. Esta es la primera demostración de que la variante G894T del gen de la eNOS está funcionalmente asociado a la reducida vasodilatación mediada por la eNOS. Además de eso, tales resultados sugieren que la reducida vasodilatación endotelio-dependiente pueda anticipar una disfunción vascular en individuos portadores del genotipo TT.

Conclusión

La verificación de que las sintasas de NO son constitutivamente expresadas (eNOS y nNOS) y que el NO desempeña importante función en la regulación de las actividades cardiovasculares aumentó el interés por el entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares que rigen su funcionalidad. Aunque esos mecanismos sean complejos y de difícil acceso, una parte de ellos ya fue elucidada, permitiendo parcial comprensión de la biología del NO. En ese contexto, los avances en las técnicas de biología molecular posibilitaron la identificación de variantes en el código genético humano que pudiesen explicar, por lo menos en parte, la variación de respuesta fenotípica entre individuos. Los estudios de asociación en genética no son fáciles de comprender. Un único gen puede desempeñar de media a moderada participación en la regulación de un fenotipo multigénico, y, en esa situación, una determinada variante genética funcional en ese gen podría explicar apenas una pequeña parte de la variación de respuesta del fenotipo. El rastreo de genes candidatos, o sea, la identificación de múltiples genes y sus respectivos polimorfismos desencadenantes de variaciones en la función cardiovascular, camina hacia el momento en que parte del diagnóstico y de la conducta adoptados para el tratamiento será basada en la medicina genómica.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiamiento

El presente estudio fue financiado por la FAPESP.

Vinculación Académica

Este artículo es parte de tesis de Doctorado de Rodrigo Gonçalves Dias por la Universidad Estadual de Campinas e Instituto do Coração - InCor (HCFMUSP) de São Paulo.

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Correspondencia:

Rodrigo Gonçalves Dias

Unidade de Hipertensão - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular

Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44 (2º andar; Bloco II) - Cerqueira César

05403-000 - São Paulo, SP - Brasil

E-mail:

diasrg99@yahoo.com.br

Artículo recibido en 12/02/09; revisado recibido en 26/06/09; aceptado en 14/08/09.