FUNDAMENTO: A relação entre atividade inflamatória e pró-trombótica na cardiomiopatia chagásica e em outras etiologias é obscura. OBJETIVO: Estudar o perfil de marcadores pró-trombóticos e pró-inflamatórios em pacientes com insuficiência cardíaca chagásica e compará-los com os de etiologia não chagásica. MÉTODOS: Coorte transversal. Critérios de inclusão: fração de ejeção do VE (FEVE) < 45% e tempo de início de sintomas > um mês. Os pacientes foram divididos em dois grupos: grupo 1 (G1) - sorologias positivas para Chagas - e grupo 2 (G2) - sorologias negativas para Chagas. Fator pró-inflamatório: PCR ultrassensível. Fatores pró-trombóticos: fator trombina-antitrombina, fibrinogênio, antígeno do fator de von Willebrand, P-selectina plasmática e tromboelastograma. Amostra calculada para poder de 80%, assumindo-se diferença de 1/3 de desvio-padrão; p significativo se < 0,05. Análise estatística: teste exato de Fischer para variáveis categóricas; teste t de Student não pareado para variáveis contínuas paramétricas e teste de Mann-Whitney para variáveis contínuas não paramétricas. RESULTADOS: Entre janeiro e junho de 2008, foram incluídos 150 pacientes, 80 no G1 e 70 no G2. Ambos os grupos mantinham médias de PCR ultrassensível acima dos valores de referência, porém, sem diferença significativa (p=0,328). Os níveis de fibrinogênio foram maiores no G2 do que no G1 (p=0,015). Entre as variáveis do tromboelastograma, os parâmetros MA (p=0,0013), G (p=0,0012) e TG (p=0,0005) foram maiores no G2 em comparação ao G1. CONCLUSÃO: Não há indícios de maior status pró-trombótico entre chagásicos. A dosagem de fibrinogênio e dos parâmetros MA, G e TG do tromboelastograma apontam para status pró-trombótico entre não chagásicos. Ambos os grupos tinham atividade inflamatória exacerbada.
IInstituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP
IILaboratório de Hemostasia do Hospital das Clínicas da FMUSP; São Paulo, SP - Brasil
A Insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome endêmica no mundo. No Brasil, apresenta forte impacto socioeconômico, dada à alta morbimortalidade. É a terceira causa geral e a primeira causa cardiovascular de hospitalização em nosso meio1. Na fisiopatologia, predomina a ativação neuro-humoral e inflamatória. Essa última guarda estreita relação com ativação de fatores pró-trombóticos. Isso pode explicar, em parte, o risco aumentado para tromboembolismo, morte súbita, trombose intracavitária e acidente vascular encefálico entre pacientes com IC em relação à população em geral2,3. Mais recentemente, foi demonstrada influência mútua entre fatores pró-inflamatórios e pró-trombóticos4. Marcadores de disfunção/lesão endotelial, de ativação plaquetária ou de ativação da cascata de coagulação5,6 podem estar relacionados à ativação inflamatória7.
Na cardiomiopatia chagásica (CMC), foi demonstrada uma tendência para maior atividade inflamatória, o que pode explicar, em parte, o pior prognóstico. Estudo realizado em nosso meio demonstrou relação entre ativação pró-inflamatória e neuro-humoral e pior prognóstico, inclusive na CMC8.
Outra hipótese para explicar esse pior prognóstico na CMC seria um possível risco adicional para fenômenos trombóticos. Em estudos fisiopatológicos, observou-se aumento significativo de marcadores pró-trombóticos na CMC em relação a controles sadios9. Entretanto, não houve comparação com outras etiologias de IC. Diversos relatos de casos, séries de casos e estudos de caso-controle, incluindo de autópsias, relatam alta prevalência de achados isquêmicos, tais como infarto renal, trombose arterial e outros fenômenos tromboembólicos, nessa população10-14. Todavia, não existem estudos controlados para outras etiologias de IC a esse respeito.
Alguns marcadores pró-trombóticos têm sido estudados em pacientes com IC, a saber: fator de von Willebrand, complexo trombina-antitrombina, dímero-D, fator tecidual, p-selectina, entre outros. Cada marcador estuda uma parte do processo de formação do coágulo. O tromboelastograma é um teste importante na avaliação global da coagulação e da fibrinólise, integrando células e proteínas da coagulação que não são avaliadas nos testes habituais. A análise das variáveis pode determinar o estado de coagulabilidade do paciente. Existe correlação entre o estado de hipercoagulabilidade pós-operatória determinado pela tromboelastografia e as complicações trombóticas pós-operatórias15,16. A sua utilidade em pacientes com IC não está estabelecida.
Assim, planejamos estudar o perfil de marcadores pró-trombóticos e pró-inflamatórios em portadores da CMC, incluindo, nessa análise, a tromboelastografia, em comparação com pacientes portadores de IC de etiologias não chagásicas.
Estudo de coorte transversal. Entre 14 de janeiro de 2008 e 31 de maio do mesmo ano, 150 pacientes com IC crônica definida pelos critérios de Framingham foram consecutivamente selecionados do ambulatório, das unidades de internação, pronto-socorro e unidades de terapia intensiva em nossa instituição.
Os critérios de inclusão eram presença de sintomas de IC há mais de um mês e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) < 45%. Entre esses, 80 pacientes apresentavam etiologia chagásica - grupo 1 (G1) - e 70 pacientes eram não chagásicos - grupo 2 (G2), definidos pela positividade ou negatividade, respectivamente, de, pelo menos, dois testes sorológicos (imunofluorescência indireta e ELISA - ensaio imunoabsorvente ligado à enzima).
Foram excluídos pacientes com prótese valvar mecânica, neoplasia diagnosticada, terapia estrogênica atual, infecção fora de controle, circulação extracorpórea nos últimos dois meses, presença de hipotireoidismo ou hipertireoidismo clínicos não tratados, gravidez suspeita ou confirmada, puerpério, insuficiência hepática ou outra coagulopatia clinicamente relevante, anticoagulação plena, história clínica de trombofilia, cardiomiopatia congênita, concomitância de cardiomiopatia chagásica crônica e isquêmica (presença de doença aterosclerótica coronariana obstrutiva de
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da instituição, e todos os pacientes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Cada paciente teve uma ficha de avaliação clínica individual, que foi preenchida com dados clínicos, laboratoriais, radiológicos, eletrocardiográficos e ecocardiográficos.
Foi realizada coleta de sangue venoso no leito em caso de pacientes internados e no laboratório de análises clínicas em pacientes ambulatoriais.
As amostras para a determinação dos testes de fibrinogênio, trombina-antitrombina, P-selectina, fator de von Willebrand e tromboelastograma foram colhidas em tubos com volume de aspiração de 4,5 ml da marca BD Vacutainer®; que continham citrato de sódio 3,2%, por meio de uma venopunção periférica, sem garroteamento do membro. As amostras para a contagem automatizada de plaquetas foram colhidas em tubos com volume de aspiração de 4,0 ml da marca BD Vacutainer®; que continham EDTA 7,2 mg.
As amostras para determinação da sorologia para Chagas e Proteína C reativa ultrassensível foram colhidas em tubos secos com gel com volume de aspiração de 5 ml da marca Vacuette®; por meio de uma venopunção periférica.
Para a avaliação do sistema de coagulação, foram determinados os níveis séricos de TAT (complexo trombina-antitrombina) e fibrinogênio; para a avaliação da ativação plaquetária, utilizamos a sP-selectina plasmática; para a detecção de lesão endotelial, determinamos o antígeno do fator de von Willebrand; e, para uma avaliação global da coagulação e da fibrinólise, utilizamos o tromboelastograma. Todas as amostras, exceto para o tromboelastograma, foram centrifugadas duas vezes a (3.000 rpm) por 15 minutos, a 22º C, congeladas em nitrogênio líquido a -180º C, estocadas a -80º C antes da determinação final e realizadas em duplicata.
O nível de TAT foi determinado pelo método de ELISA (imunoensaio enzimático) Enzygnost® TAT (Dade Behring, Marburg, Alemanha), com intervalos de referência de 1,0 a 4,1 μg/l. A determinação quantitativa de fibrinogênio em plasma humano foi obtida pelo Método Clássico de Clauss, equipamento AMAX-190, número de referência 886-A (Trinity Biotech, St. Louis, MO, EUA), com intervalo de referência de 220-380 mg/dl. A determinação da sP-selectina foi realizada por meio da técnica de ELISA, usando um Kit soluble sP-Selectin ELISA Kit, (BioSource®), Catalog Number - KHS2021, com intervalo de referência de 90-290 ng/ml. A determinação do antígeno de von Willebrand em plasma humano foi realizada pelo clássico método de ELISA - imunoensaio enzimático (Coergenix Inc, Broomfield, Colorado, EUA), com intervalos de referência de 50 a 160%.
As amostras do tromboelastograma foram analisadas, a 37º C, em um intervalo de tempo inferior a 120 minutos, entre a coleta e a realização do teste. Foram utilizados 20 ml de Kaolin (0,006%), 20 ml de cloreto de cálcio (0,2 Molar) e 300 ml de sangue total citratado. Os dados foram analisados pelo
As variáveis estudadas nesse teste foram:
a) Tempo de coagulação
Tempo r (período para atingir 2 mm de amplitude da curva): é o tempo de coagulação medido em minutos. Mede o tempo decorrido do início do ensaio até o momento em que a produção de fibrina se inicia, com intervalo de referência de dois a oito minutos.
b) Cinética do coágulo
Determinação do k (período entre 2 e 20 mm de amplitude da curva): representa o momento em que o coágulo se estabiliza, a rede de fibrina consolida-se, e as plaquetas aderem a essa, com intervalo de referência de um a três minutos.
Ângulo alfa (inclinação ente o r e o k): mede a velocidade de formação do coágulo. Representa a taxa de geração da trombina e a conversão de fibrinogênio em fibrina, com intervalo de referência de 55 a 78º.
c) Força do coágulo
MA (amplitude máxima): é função direta da máxima propriedade dinâmica da fibrina e adesão plaquetária via glicoproteína IIb/IIIa e representa a resistência global do coágulo, com intervalo de referência de 51 a 69 mm.
Parâmetro G (dyn/cm
2): trata-se da conversão algorítmica do MA (em mm) do coágulo em seu valor de resistência a pressão (dyn/cm
2). Enquanto o MA analisa uma reação linear entre a força do coágulo e a atividade plaquetária, o G o faz como uma relação exponencial. O G é mais sensível a alterações na função plaquetária, com intervalo de referência de 4,6 a 10,9 k.
d) CI (índice de coagulação): permite avaliar o estado hemostático global do paciente. É resultante de uma combinação entre os parâmetros cinéticos do coágulo (r, k e ângulo α) e a força do coágulo (MA), com intervalo de referência de -3 a 3.
e) LY 30 (%) e EPL (%): A LY 30 representa a lise do coágulo após 30 minutos e, em conjunto com o EPL (percentual estimado de lise), forma os parâmetros que monitoram a fase final do processo de coagulação, com intervalo de referência de 0 a 8%.
f) MRTG (
g) TMRTG (
h) TG (
Para a avaliação da proteína C reativa (PCR) ultrassensível, o método utilizado foi a nefelometria (Dade Behring, Marburg, Alemanha), com intervalo de referência de < 1,0 mg/l.
Os resultados foram tabulados e analisados usando o
A amostra foi calculada assumindo-se uma estimativa de diferença entre os grupos de, aproximadamente, 1/3 de desvio-padrão para um poder de 80%, considerando-se teste de hipótese bicaudal. Essa estimativa de diferença pode ser considerada razoável, de acordo com a dispersão aferida de variáveis pró-trombóticas em outros estudos em portadores de IC. Considerou-se como estatisticamente significativo um p < 0,05.
Variáveis categóricas e contínuas foram expressas como porcentagens e médias ± desvio-padrão. Comparações de variáveis clínicas, ecocardiográficas e laboratoriais entre os diversos grupos serão realizadas com uso do teste
Características da amostra
Na
Observa-se que os chagásicos (G1) são significativamente mais jovens, têm menor índice de massa corpórea e pior fração de ejeção no ecocardiograma bidimensional, em relação aos não chagásicos (G2). Este grupo apresenta, ainda, maior frequência de tabagismo, dislipidemia, diabetes e hipertensão e fazem uso mais frequentemente de ácido acetil salicílico em relação ao G1.
Trombina-antitrombina
A determinação plasmática da Trombina-antitrombina está disposta na
Fibrinogênio
A dosagem do fibrinogênio foi significativamente mais alta no G2 (343,2 mg/dl ± 69,63) em relação ao G1 (315,0 mg/dl ± 70,41; p=0.0156), conforme a
Contagem automatizada de plaquetas
A contagem automatizada de plaquetas está disposta na
sP-Selectina humana
A determinação plasmática da P-selectina solúvel humana está disposta na
Antígeno do fator de von Willebrand
A determinação plasmática do fator de von Willebrand está disposta na
Os resultados das variáveis do tromboelastograma estão dispostos na
Conforme a
Variável pró-inflamatória
Os resultados das determinações do PCR ultrassensível estão dispostos na
Este é o primeiro estudo controlado a comparar o perfil pró-trombótico de portadores de CMC com IC de etiologia não chagásica. Em relação aos marcadores pró-trombóticos, encontramos semelhança na maior parte dos parâmetros estudados e indícios de maior ativação pró-trombótica entre os não chagásicos, medida pelo tromboelastograma (parâmetros G, MA e TG), bem como pelos níveis de fibrinogênio. Já na análise da atividade inflamatória, encontramos aumento dessa, medida pela PCR ultrassensível, em ambos os grupos, em consonância com estudos previamente publicados8; sem que houvesse diferença significativa entre esses grupos.
Na avaliação do sistema de coagulação, dosamos os níveis plasmáticos de TAT e o fibrinogênio. A importância da dosagem do TAT reside no fato de medir indiretamente a geração de trombina, enzima central da cascata de coagulação, que converte o fibrinogênio em fibrina, promove ativação plaquetária e ativa o fator XIII da coagulação17. A antitrombina III é o inibidor primário da trombina. Em estados pró-trombóticos, espera-se elevação na determinação desse complexo. Em nossa amostra, encontramos elevação desses níveis em mais de 25% dos indivíduos de ambos os grupos, sem diferença significativa entre eles. Assim, demonstra-se tendência procoagulante entre chagásicos e não chagásicos. O fibrinogênio é uma proteína plasmática precursora da fibrina. A trombina cliva o fibrinogênio, dando origem aos monômeros de fibrina, que se agregam para formar polímeros de fibrina insolúveis. Também é uma proteína da fase aguda, cuja concentração está aumentada em resposta a muitos diferentes estímulos fisiológicos, tais como estados inflamatórios, infecção, trauma e tabagismo. Altos níveis plasmáticos de fibrinogênio têm sido associados a estados pró-trombóticos. Também têm sido correlacionados positivamente com o desenvolvimento de doença cardíaca isquêmica, AVC e mortalidade18. Na amostra estudada, a dosagem do fibrinogênio foi significativamente mais alta no G2 em relação ao G1 (p=0.0156). Isso pode ser devido ao fato de o G2 apresentar maior índice de massa corpórea (p=0.0001) e maior frequência de tabagismo (p=0.0330) em relação ao G119.
O componente plaquetário da coagulação foi avaliado pela contagem automatizada de plaquetas e pelo nível de P-selectina solúvel no plasma. A P-selectina é um membro da família selectina de moléculas de adesão celular que estão envolvidas na adesão dos leucócitos às células endoteliais, plaquetas-leucócitos, plaquetas-vênulas e entre plaquetas. Tem sido relatado que essas moléculas de adesão podem participar da patogênese da IC via modulação da interação plaquetas-leucócitos-endotélio. É estocada nos grânulos alfa das plaquetas e nos corpos de Weibel-Palade nas células endoteliais. É transportada rapidamente para a superfície celular sob uma variedade de mediadores, incluindo trombina, histamina e citocinas. Não está claro se a sP-selectina é um fator causal na formação e progressão de aterosclerose ou simplesmente um marcador de ativação plaquetária e dano endotelial. Seu nível pode estar aumentado em pacientes com diabetes, doença cardíaca isquêmica, tabagismo e em insuficiência cardíaca congestiva, sugerindo uma ativação plaquetária persistente20,21. Em nossa amostra, tanto a contagem de plaquetas quanto os níveis de sP-selectina não foram diferentes entre os grupos.
A lesão endotelial foi avaliada pelos níveis plasmáticos do antígeno do fator de von Willebrand (FvW), que é uma proteína plasmática presente na circulação ligada ao fator VIII por meio de uma ligação covalente. É sintetizada e armazenada nas células endoteliais, porém 15-20% são sintetizados nos megacariócitos e armazenados nas plaquetas circulantes. O FvW pode ser um marcador de lesão e disfunção endotelial, podendo estar aumentado na IC22,23. Um estudo demonstrou relação direta entre os níveis de marcadores inflamatórios (IL6), de lesão endotelial (fator de von Willebrand) e pró-trombóticos (fator tecidual) com descompensação e prognóstico da IC. Os pacientes que, após tratamento da descompensação, evoluíram com redução dos níveis desses marcadores tiveram melhor sobrevida em um seguimento de seis meses6. Dados semelhantes entre pacientes com CMC não existem na literatura. Observamos níveis elevados dessa proteína em ambos os grupos com tendência à maior elevação no grupo chagásico, porém sem diferença estatisticamente significativa.
Para entender a contribuição e a interação de plaquetas, leucócitos, eritrócitos e componentes solúveis no plasma no processo de coagulação, tem sido dada atenção especial à geração de trombina. Em uma coorte prospectiva de 914 pacientes após o primeiro evento tromboembólico venoso, a geração de trombina foi capaz de identificar os pacientes de baixo risco para recorrência desses eventos24. A tromboelastografia, tecnologia que permite,
As plaquetas contribuem com 80% da MA, enquanto o fibrinogênio participa com 20%, além de fornecer sítios de aderência para as plaquetas. O MA elevado sugere atividade plaquetária elevada, indicando maior risco trombótico ou aumento da atividade ou dos níveis de fibrinogênio. O parâmetro G, por ser uma conversão algorítmica do MA, é mais sensível a alterações na função plaquetária ou do fibrinogênio. Em nossa amostra, não encontramos diferença em relação ao número de plaquetas ou à ativação medida pela sP-selectina. Por isso, atribuímos a diferença dos parâmetros G e MA do tromboelastograma aos níveis de fibrinogênio mais elevados entre os não chagásicos do que entre os chagásicos. Por outro lado, os níveis do parâmetro TG (geração total de trombina) demonstram
Em relação aos marcadores pró-inflamatórios, estudamos a PCR ultrassensível, que é uma das principais proteínas de fase aguda. A PCR não somente está aumentada na IC, como também é preditor independente de mortalidade cardiovascular, principalmente nos pacientes de com IC de etiologia isquêmica26,27. Foram demonstrados, também, aumento da atividade inflamatória e pior prognóstico na cardiomiopatia dilatada idiopática e chagásica8. Em nosso estudo, a determinação do PCR mostrou-se aumentada em ambos os grupos, porém sem diferença estatística entre eles.
A exclusão de pacientes com anticoagulação plena poderia constituir viés de seleção. Esses pacientes poderiam apresentar maior perfil pró-trombótico, uma vez que, em sua maioria, já apresentaram fenômenos tromboembólicos ou fatores de risco conhecidos como fibrilação atrial. Entretanto, a probabilidade de alterarmos a conduta terapêutica desses pacientes é pequena, pois já estão sob anticoagulação plena. O intuito desta nova linha de pesquisa é, inicialmente, identificar subgrupos de pacientes sob maior risco desses fenômenos e, futuramente, estudar ampliação das indicações de anticoagulação em pacientes com IC.
A variável pró-inflamatória utilizada neste estudo foi o PCR ultrassensível. Apesar da consagrada utilização como variável prognóstica na IC, seu papel nas diversas etiologias da IC não está completamente validado. Além disso, outros marcadores pró-inflamatórios, como a interleucina-6 e o fator de necrose tumoral alfa, serão futuramente determinados em amostras congeladas e armazenadas desses pacientes, em estudos posteriores.
As variáveis pró-trombóticas estudadas nesta amostra foram escolhidas com o intuito de obter informações acerca de cada uma das etapas do processo de formação e lise do coágulo. Entretanto, outras variáveis que não foram contempladas no presente estudo poderiam ampliar nossa compreensão de outras vias da coagulação. Também está prevista a determinação de outros fatores pró-trombóticos para esse fim em estudos futuros.
Alguns leitores podem sentir falta de um grupo controle sadio para efeito comparativo. No entanto, uma vez que os exames utilizados neste estudo já foram validados e são amplamente utilizados em nosso meio, torna-se redundante tal grupo controle sadio, já que dispomos de valores confiáveis de referência.
Embora o cálculo para um poder de 80% seja considerado adequado, a amostra será ampliada para atingir um poder de 90%, com um total estimado de 300 pacientes.
Outra limitação deste estudo está na diferença entre os grupos. O G2 é mais idoso e mais obeso do que o G1, além de ter maior prevalência de dislipidemia, diabetes, hipertensão e tabagismo. Tais diferenças tornam os dois grupos
Por fim, trata-se de estudo de coorte transversal. Assim, não é possível obter qualquer informação acerca da incidência de fenômenos tromboembólicos nessa amostra ou validação desses marcadores como variáveis prognósticas nesse contexto. Para isso, encontra-se em andamento, uma continuação deste estudo, sob a forma de coorte prospectiva.
Há aumento da atividade inflamatória medida pela PCR ultrassensível em ambos os grupos. Não há indícios de um
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Leila Maria Magalhães Pessoa de Melo pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Correspondência: Leila Maria Magalhães Pessoa de Melo Rua Oscar Freire, 1961, apt. 61 Pinheiros - 05409-011 - São Paulo, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 05/04/09; revisado recebido em 21/12/09; aceito em 28/04/10.
BACKGROUND: The relationship between inflammatory and prothrombotic activity in chagas cardiomyopathy and in other etiologies is unclear. OBJECTIVE: To study the profile of pro-thrombotic and pro-inflammatory markers in patients with Chagas' heart failure and compare them with patients of non-chagas etiology. METHODS: Cross-sectional cohort. Inclusion criteria: left ventricle ejection fraction (LVEF) < 45% and onset time to symptoms > one month. The patients were divided into two groups: group 1 (G1) - seropositive for Chagas - and group 2 (G2) - seronegative for Chagas. Pro-inflammatory factor: Ultra-sensitive CRP. Pro-thrombotic factors: thrombin-antithrombin factor, fibrinogen, von Willebrand factor antigen, plasma P-selectin and thromboelastography. Sample calculated for 80% power, assuming a standard deviation difference of 1/3; significant p if it is < 0.05. Statistical analysis: Fisher's exact test for categorical variables; unpaired Student's t-test for parametric continuous variables and Mann-Whitney test for nonparametric continuous variables. RESULTS: Between January and June 2008, 150 patients were included, 80 in G1 and 70 in G2. Both groups maintained the averages of high sensitivity CRP above baseline values, however, there was no significant difference (p = 0.328). The fibrinogen levels were higher in G2 than in G1 (p = 0.015). Among the thromboelastography variables, the parameters MA (p=0.0013), G (p=0.0012) and TG (p =0.0005) were greater in G2 than in G1. CONCLUSION: There is no evidence of greater pro-thrombotic status among patients with Chagas disease. The levels of fibrinogen and the MA, G and TG parameters of the thromboelastography point to pro-thrombotic status among non-chagas patients. Both groups had increased inflammatory activity.
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Heart failure (HF) is a syndrome that is endemic in the world. In Brazil, it has a strong socioeconomic impact, due to the high morbidity/mortality. It is the third overall cause and the first cardiovascular cause of hospitalization in our society1. In pathophysiology, there is prevalence of inflammatory and neurohumoral activation. The latter is closely related to the activation of prothrombotic factors. This may explain, in part, the increased risk of thromboembolism, sudden death, intracavitary thrombosis and stroke among patients with HF, compared to the population in geral2,3. More recently, the mutual influence between pro-inflammatory and prothrombotic factors was demonstrated4. Markers of endothelial injury/dysfunction, platelet activation or activation of the coagulation cascade5,6 may be related to inflammatory activation7.
In the Chagas cardiomyopathy (CCM), there has been evidence of a tendency for increased inflammatory activity, which may partly explain the worse prognosis. A study conducted in Brazil showed a relationship between the pro-inflammatory and neurohumoral activation and the worse prognosis, including in the CCM8.
Another hypothesis to explain this worse prognosis in the CCM would be a possible additional risk for thrombosis. In pathophysiological studies, there was evidence of a significant increase in pro-thrombotic markers in CCM, compared to healthy controls9. However, there was no comparison with other HF etiologies. Several case reports, case series and case-control studies, including of autopsies, have reported high prevalence of ischemic findings, such as renal infarction, arterial thrombosis and other thromboembolic events in this population10-14. However, there are no controlled studies for other etiologies of HF in this respect.
Some pro-thrombotic markers have been studied in patients with HF, namely: von Willebrand factor, thrombin-antithrombin complex, D-dimer, tissue factor, p-selectin, among others. Each marker studies a part of the clot formation. The thromboelastography is an important test in the overall evaluation of coagulation and fibrinolysis, integrating cells and coagulation proteins that are not assessed in the usual tests. The analysis of variables can determine the patient's coagulability state. There is a correlation between the postoperative hypercoagulability state determined by thromboelastography and the postoperative thrombotic complications15,16. Its usefulness in patients with HF has not been established.
Thus, we plan to study the profile of pro-thrombotic and pro-inflammatory markers in patients with CCM. This study will also include thromboelastography, in comparison with patients with HF of non-chagas etiologies.
Cross-sectional cohort study. Between January 14, 2008 and May 31, 2008, 150 patients with chronic heart failure defined by Framingham criteria were consecutively selected from the outpatient clinic, inpatient units, emergency rooms and intensive care units at our institution.
The criteria for inclusion were symptoms of heart failure for more than a month and left ventricle ejection fraction (LVEF) < 45%. Among the patients included, 80 had Chagas disease - Group 1 (G1) - and 70 were non-Chagas patients - Group 2 (G2), defined by the positive result or negative result, respectively, of at least two serological tests (indirect immunofluorescence and ELISA - enzyme linked immunosorbent assay).
The study excluded patients with mechanical valve prosthesis, with diagnosed neoplasia, who were currently in estrogen therapy, with out-of-control infection, who had used a cardiopulmonary bypass in the last two months, with untreated clinical hypothyroidism or hyperthyroidism, who were apparently or confirmedly pregnant, postpartum patients, patients with liver failure or other clinically relevant coagulopathy, with full anticoagulation, clinical history of thrombophilia, congenital cardiomyopathy, concomitant chronic Chagas and ischemic cardiomyopathy (presence of obstructive coronary atherosclerotic disease of
The study was approved by the institution's Ethics and Research Committee, and all patients signed a consent form. There was an individual clinical assessment form for each patient. This form was filled out with clinical, laboratory, radiological, electrocardiographic and echocardiographic data.
The venous blood was collected on beds, in the case of hospitalized patients, and in the clinical analysis laboratory, in the case of outpatients.
The samples used for determining the tests of fibrinogen, thrombin-antithrombin, P-selectin, von Willebrand factor and thromboelastography were collected in BD Vacutainer™ tubes (draw volume = 4.5 ml), which contained 3.2% of sodium citrate, through peripheral venipuncture, without applying a tourniquet to the limb. The samples for automated counting of platelets were collected in BD Vacutainer™ tubes (draw volume = 4.0 ml), which contained 7.2 mg of EDTA.
The samples used for determining the serology for Chagas and high sensitivity C-reactive protein were collected into dry Vacuette™ tubes containing gel (draw volume = 5 ml), through peripheral venipuncture.
To evaluate the coagulation system, we determined the serum levels of TAT (thrombin-antithrombin complex) and fibrinogen; to evaluate the platelet activation, we used plasma sP-selectin; to detect endothelial injury, we determined the von Willebrand factor antigen and; for an overall evaluation of coagulation and fibrinolysis, we used thromboelastography. All samples, except for the thromboelastography, were centrifuged twice (at 3,000 rpm) for 15 minutes, at 22° C. Then, the samples were frozen in liquid nitrogen at -180° C and stored at -80° C prior to the final determination. The whole procedure (centrifuging twice, freezing and storing) was carried out twice.
The TAT level was determined by the method ELISA (enzyme-linked immunoassay), Enzygnost™ TAT (Dade Behring, Marburg, Germany), with reference ranges from 1.0 to 4.1 μg/l. The quantitative determination of fibrinogen in human plasma was obtained by the Classical Clauss Method, equipment AMAX-190, reference number 886-A (Trinity Biotech, St. Louis, MO, USA), with a reference range between 220 and 380 mg/dl. The sP-selectin was determined by the ELISA technique, by using a soluble 'sP-selectin ELISA' Kit (BioSource™), Catalog Number - KHS2021, with reference range between 90 and 290 ng/ml. The von Willebrand factor antigen in human plasma was determined by the classical method of ELISA - enzyme immunoassay (Coergenix Inc, Broomfield, Colorado, USA), with reference range between 50 and 160%.
The thromboelastography samples were analyzed at 37° C, in a time interval shorter than 120 minutes between collection and testing. We used 20 ml of Kaolin (0.006%), 20 ml of calcium chloride (0.2 Molar) and 300 ml of citrated whole blood. The data were analyzed by the TEG™ software from Haemoscope Corporation (Niles, IL, USA), with graphical representation of the formation and subsequent clot lysis.
The following variables were studied in this test:
a) Coagulation time
• R time (time to reach 2 mm of curve amplitude): is the coagulation time measured in minutes. It measures the time elapsed from the beginning of the test until when the production of fibrin is initiated, with reference range between two and eight minutes.
b) Kinetics of clot
• Determination of k (period between 2 and 20 mm of amplitude of the curve): it represents the moment when the clot stabilizes, the fibrin meshwork consolidates and the platelets adhere to the fibrin meshwork, with reference range from one to three minutes.
• Alpha angle (inclination between "r" and "k"): it measures the clot formation speed. It represents the thrombin generation rate and the conversion of fibrinogen into fibrin, with reference range from 55 to 78º.
c) Strength of the clot
• MA (maximum amplitude): it is a direct function of the maximum dynamic property of fibrin and platelet bonding via glycoprotein IIb/IIIa, and it represents the ultimate strength of the clot, with reference range between 51 and 69 mm.
• G parameter (dyn/cm2): it is the algorithmic conversion of the MA (in mm) of the clot into its pressure resistance value (dyn/cm2). While the MA is used to analyze a linear reaction between clot strength and platelet activity, the G does it as an exponential relationship. G is more sensitive to changes in platelet function, with reference range from 4.6 to 10.9 k.
d) CI (coagulation index): it allows evaluating the patient's overall hemostatic state. It results from a combination of the kinetic parameters of the clot (r, k and α angle) and the clot strength (MA), with reference range between -3 and 3.
e) LY 30 (%) and EPL (%): LY 30 represents the clot lysis after 30 minutes and it makes up, together with the EPL (estimated percentage of lysis), the parameters that monitor the final phase of the coagulation process, with reference range from 0 to 8%.
f) MRTG (Maximum rate of thrombus generation - mm/min): it represents the peak of thrombin generation, with reference range from 5 to 17 mm/min.
g) TMRTG (Time to maximum rate of thrombus generation - min): it represents the time elapsed to reach the peak of thrombin generation, with reference range between 6 and 12 min.
h) TG (Total thrombus generation - mm/min): it represents the total area of thrombin generation, with reference range from 584 to 796 mm/min.
The method used for evaluating the high sensitivity C-reactive protein (CRP) was nephelometry (Dade Behring, Marburg, Germany), with reference range of < 1.0 mg/l.
The results were tabulated and analyzed by using software Microsoft Excel 2003 (Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA). The software used for the statistical analysis was GraphPad Prism™ (GraphPad Software, Inc, USA).
The sample was calculated by assuming that there was an estimated difference between groups of approximately 1/3 of standard deviation for 80% power, considering the two-tailed hypothesis test. This estimate of difference can be considered reasonable, according to the dispersion measured from pro-thrombotic variables in other studies in patients with HF. A p value < 0.05 was considered to be statistically significant.
Categorical and continuous variables were expressed as percentages and means ± standard deviation. The clinical, echocardiographic and laboratory variables among the various groups will be compared by using the unpaired Student's t-test, for parametric continuous variables, and the Mann-Whitney test for nonparametric variables. The Fisher's exact test was used to compare proportions.
It is possible to note that Chagas patients (G1) are significantly younger, have lower body mass index and worse ejection fraction in two-dimensional echocardiography, compared with non-chagas patients (G2). In this group, there is also a higher incidence of smoking addiction, dyslipidemia, diabetes and hypertension and the more frequent use of acetylsalicylic acid, compared to G1.
• Thrombin-antithrombin
• Fibrinogen
The level of fibrinogen was significantly higher in G2 (343.2 mg/dl ± 69.63) compared to G1 (315.0 mg/dl ± 70.41, p = 0.0156), as shown in
• Automated platelet count
• Human sP-Selectin
• Von Willebrand factor antigen
The plasma determination of the von Willebrand factor is shown in
The results of the thromboelastography variables are shown in
According to
Proinflammatory variable
The results of the determinations of high sensitivity CRP are shown in
This is the first controlled study to compare the pro-thrombotic profile of patients with CCM with HF of non-Chagas etiology. With respect to pro-thrombotic markers, we found similarity in most parameters studied and evidence of greater pro-thrombotic activation among non-Chagas patients, as measured by the thromboelastography (G, MA and TG parameters) and as determined by fibrinogen levels. In the analysis of inflammatory activity, we found an increase in such activity, as measured by the high sensitivity CRP, in both groups, which is consistent with previously published studies8. And there was no significant difference between the groups.
In the evaluation of the coagulation system, we measured the plasma levels of TAT and the fibrinogen. It is important to measure the TAT because we indirectly measure the generation of thrombin, the central enzyme of the coagulation cascade, which converts fibrinogen into fibrin, stimulates platelet activation and activates factor XIII of coagulation17. Antithrombin III is the primary inhibitor of thrombin. In pro-thrombotic states, the determination of this complex is expected to rise. In our sample, we found an increase in these levels in more than 25% of subjects in both groups, without any significant difference between the two groups. This demonstrates the procoagulant tendency among chagas and non-chagas patients. Fibrinogen is a plasma protein that is a precursor of fibrin. Thrombin cleaves the fibrinogen to form fibrin monomers, which bond to form insoluble fibrin polymers. It is also an acute-phase protein, whose concentration is increased in response to many different physiological stimuli, such as inflammatory states, infection, trauma, and smoking. High plasma levels of fibrinogen have been associated with pro-thrombotic states. High plasma levels of fibrinogen have also been positively linked with the development of ischemic heart disease, stroke and mortality18. In the sample studied, the level of fibrinogen was significantly higher in G2 than in G1 (p=0.0156). This may be due to the fact that, in G2, the body mass index is greater (p = 0.0001) and the frequency of smoking is higher (p = 0.0330), compared to G119.
The platelet component of the coagulation was assessed by automated counting of platelets and by measuring the level of soluble P-selectin in plasma. The P-selectin is a member of the selectin family of cell adhesion molecules that are involved with the binding of leukocytes with endothelial cells, platelet-leukocytes, platelet-venules and between platelets. It has been reported that these adhesion molecules may participate in the pathogenesis of HF via modulation of the platelet-leukocyte-endothelium interaction. It is stored in alpha granules of platelets and in Weibel-Palade bodies of endothelial cells. It is rapidly transported to the cell surface under a variety of mediators, including thrombin, histamine and cytokines. It is unclear whether sP-selectin is a causal factor in the formation and progression of atherosclerosis or simply a marker of platelet activation and endothelial damage. Its level may be increased in patients that smoke, patients with diabetes, with ischemic heart disease and with congestive heart failure, which suggests persistent platelet activation20,21. In our sample, both the platelet count and the sP-selectin levels were not different between groups.
The endothelial injury was assessed by checking the plasma levels of the von Willebrand factor (vWF) antigen, which is a plasma protein that is present in the circulation and is bound to factor VIII through a covalent bond. It is synthesized and stored in endothelial cells, but 15-20% is synthesized in megakaryocytes and stored in circulating platelets. The von Willebrand factor may be a marker of endothelial injury and dysfunction, and it may be increased in HF22,23. One study showed a direct relationship between levels of inflammatory markers (IL6), of endothelial injury (von Willebrand factor) and of prothrombotic levels (tissue factor) and decompensation and prognosis of HF. The patients that, after undergoing the treatment of decompensation, improved with a reduction in the levels of these markers had a better rate of survival in a six-month monitoring period6. There are no similar data among CCM patients in the literature. The levels of this protein were high in both groups, with a tendency to higher levels in the Chagas group, but without statistically significant differences.
To understand the contribution and interaction of platelets, leukocytes, erythrocytes and plasma soluble components in the coagulation process, special attention has been paid to the generation of thrombin. In a prospective cohort of 914 patients, after the first venous thromboembolic event, the generation of thrombin was able to identify patients at low risk for recurrence of such events24. Thromboelastography, a technology that allows simulating,
Platelets contribute to 80% of the MA, while the fibrinogen participates with 20%, besides providing sites for platelet adhesion. The high MA suggests increased platelet activity, indicating a higher risk of thrombosis or increase in the activity or in the levels of fibrinogen. The G parameter, as it is an algorithmic conversion of MA, is more sensitive to changes in platelet function or fibrinogen levels. In our sample, we found no difference in the number of platelets or in the activation measured by sP-selectin. Therefore, we attribute the difference in G and MA parameters of the thromboelastography to higher fibrinogen levels among non-chagas patients than among patients with Chagas disease. On the other hand, the TG (total generation of thrombin) parameter levels show a pro-thrombotic status that does not depend on fibrinogen, since thrombin is a central enzyme in the coagulation cascade, as it converts fibrinogen into fibrin, which leads to the formation of clot. In our study, the TG was statistically higher in G2 than in G1, p = 0.0005. High levels of thrombin generation may represent greater potential for hypercoagulability status25. However, as most of the values of such parameters were within normal ranges in both groups, one might question the clinical importance of such findings.
With respect to pro-inflammatory markers, we studied the high sensitivity CRP, which is one of the main acute-phase proteins. CRP is not only increased in HF, but it is also an independent predictor of cardiovascular mortality, especially among patients with HF of ischemic etiology26,27. The increase in inflammatory activity and worse prognosis in Chagas-related and idiopathic dilated cardiomyopathy8. In our study, the determination of CRP was shown to be increased in both groups, but there was no statistical difference between them.
The exclusion of patients with full anticoagulation could be selection bias. These patients may have an increased pro-thrombotic profile, since most of them have experienced thromboembolic events or have 'known risk factors' such as atrial fibrillation in most cases. However, there is a small probability that we will alter the therapeutic approach of such patients, because they are already on full anticoagulation. Initially, the purpose of this new line of research is to identify subgroups of patients that are at an increased risk of experiencing such events and, in the future, to study the expansion of indications for anticoagulation in patients with HF.
The proinflammatory variable used in this study was the high sensitivity CRP. Despite the acknowledged use as a prognostic variable in HF, its role in different etiologies of HF is not fully validated. In addition, other pro-inflammatory markers, such as interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha, will be determined at a later time in frozen and stored samples of these patients, in future studies.
The prothrombotic variables studied in this sample were chosen with the purpose of obtaining information about each one of the steps in the clot formation and lysis process. However, other variables that were not addressed in this study could enhance our understanding of other coagulation pathways. There are also plans to establish other prothrombotic factors for this purpose in future studies.
Some readers may miss a healthy control group for comparison purposes. However, as the tests used in this study have been validated and they are widely used in our environment, it would be redundant to use this healthy control group, since we already have reliable baseline values.
Even though the calculation for 80% power is considered adequate, the sample will be expanded to reach 90% power, with an estimated total of 300 patients.
Another limitation of this study is the difference between the groups. G2 is older and more obese than G1. In addition, there is higher prevalence of dyslipidemia, diabetes, hypertension and smoking addiction in G2. Such differences make the two groups mismatched on key variables in the inflammation and thrombosis processes. Thus, differences that may exist between the two groups may have been attenuated by the heterogeneity in the prevalence of risk factors. This effect can be attenuated by statistical resources such as the analysis of covariance.
Finally, it is a cross-sectional cohort study. Thus, it is not possible to obtain any information about the incidence of thromboembolic events in this sample or validation of these markers as prognostic variables in this context. In order to do this, there is a continuation of this study in progress, in the form of a prospective cohort study.
There is an increase in inflammatory activity measured by the high sensitivity PCR in both groups. There is no evidence of higher prothrombotic status in the chagas group, compared to non-chagas patients.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Leila Maria Magalhães Pessoa de Melo, from
IInstituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP, São Paulo, SP - Brasil
IILaboratório de Hemostasia do Hospital das Clínicas da FMUSP, São Paulo, SP - Brasil
Correspondencia
La insuficiencia cardíaca (IC) es un síndrome endémico en el mundo. En el Brasil, presenta fuerte impacto socioeconómico, dada la alta morbimortalidad. Es la tercera causa general y la primera causa cardiovascular de hospitalización en nuestro medio1. En la fisiopatología, predomina la activación neurohumoral e inflamatoria. Esa última guarda estrecha relación con activación de factores protrombóticos. Eso puede explicar, en parte, el riesgo aumentado para tromboembolismo, muerte súbita, trombosis intracavitaria y accidente vascular encefálico entre pacientes con IC en relación a la población en general2,3. Más recientemente, fue demostrada influencia mutua entre factores proinflamatorios y protrombóticos4. Marcadores de disfunción/lesión endotelial, de activación plaquetaria o de activación de la cascada de coagulación5,6 pueden estar relacionados a la activación inflamatoria7.
En la cardiomiopatía chagásica (CMC), fue demostrada una tendencia a mayor actividad inflamatoria, lo que puede explicar, en parte, el peor pronóstico. Estudio realizado en nuestro medio demostró relación entre activación proinflamatoria y neurohumoral y peor pronóstico, inclusive en la CMC8.
Otra hipótesis para explicar ese peor pronóstico en la CMC sería un posible riesgo adicional para fenómenos trombóticos. En estudios fisiopatológicos, se observó aumento significativo de marcadores protrombóticos en la CMC en relación a controles sanos9. Mientras tanto, no hubo comparación con otras etiologías de IC. Diversos relatos de casos, series de casos y estudios de caso-control, incluyendo de autopsias, relatan alta prevalencia de hallazgos isquémicos, tales como infarto renal, trombosis arterial y otros fenómenos tromboembólicos, en esa población10-14. Sin embargo, no existen estudios controlados para otras etiologías de IC a ese respecto.
Algunos marcadores protrombóticos han sido estudiados en pacientes con IC, a saber: factor de von Willebrand, complejo trombina-antitrombina, dímero-D, factor tisular, p-selectina, entre otros. Cada marcador estudia una parte del proceso de formación del coágulo. El tromboelastograma es un test importante en la evaluación global de la coagulación y de la fibrinólisis, integrando células y proteínas de la coagulación que no son evaluadas en los tests habituales. El análisis de las variables puede determinar el estado de coagulabilidad del paciente. Existe correlación entre el estado de hipercoagulabilidad postoperatoria determinado por la tromboelastografía y las complicaciones trombóticas postoperatorias15,16. Su utilidad en pacientes con IC no está establecida.
Así, planeamos estudiar el perfil de marcadores protrombóticos y proinflamatorios en portadores de la CMC, incluyendo, en ese análisis, la tromboelastografía, en comparación con pacientes portadores de IC de etiologías no chagásicas.
Estudio de cohorte transversal. Entre 14 de enero de 2008 y 31 de mayo del mismo año, 150 pacientes con IC crónica definida por los criterios de Framingham fueron consecutivamente seleccionados del ambulatorio, de las unidades de internación, emergencias y unidades de terapia intensiva en nuestra institución.
Los criterios de inclusión eran presencia de síntomas de IC hace más de un mes y fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) < 45%. Entre esos, 80 pacientes presentaban etiología chagásica - grupo 1 (G1) - y 70 pacientes eran no chagásicos - grupo 2 (G2), definidos por la positividad o negatividad, respectivamente, de, por lo menos, dos tests serológicos (inmunofluorescencia indirecta y ELISA - ensayo imunoabsorbente ligado a la enzima).
Fueron excluidos pacientes con prótesis valvar mecánica, neoplasia diagnosticada, terapia estrogénica actual, infección fuera de control, circulación extracorpórea en los últimos dos meses, presencia de hipotiroidismo o hipertiroidismo clínicos no tratados, gravidez sospechada o confirmada, puerperio, insuficiencia hepática u otra coagulopatía clínicamente relevante, anticoagulación plena, historia clínica de trombofilia, cardiomiopatía congénita, concomitancia de cardiomiopatía chagásica crónica e isquémica (presencia de enfermedad aterosclerótica coronaria obstructiva de
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación de la institución, y todos los pacientes firmaron el Término de Consentimiento Libre y Aclarado. Cada paciente tuvo una ficha de evaluación clínica individual, que fue llenada con datos clínicos, de laboratorio, radiológicos, electrocardiográficos y ecocardiográficos.
Fue realizada recolección de sangre venosa en la cama en caso de pacientes internados y en el laboratorio de análisis clínicos en pacientes ambulatorios.
Las muestras para la determinación de los tests de fibrinógeno, trombina-antitrombina, P-selectina, factor de von Willebrand y tromboelastograma fueron recogidas en tubos con volumen de aspiración de 4,5 ml de la marca BD Vacutainer®, que contenían citrato de sodio 3,2%, por medio de una venopunción periférica, sin ligadura del miembro. Las muestras para el recuento automatizado de plaquetas fueron recogidas en tubos con volumen de aspiración de 4,0 ml de la marca BD Vacutainer®, que contenían EDTA 7,2 mg.
Las muestras para determinación de la serología para Chagas y Proteína C reactiva ultrasensible fueron recogidas en tubos secos con gel con volumen de aspiración de 5 ml de la marca Vacuette®, por medio de una venopunción periférica.
Para la evaluación del sistema de coagulación, fueron determinados los niveles séricos de TAT (complejo trombina-antitrombina) y fibrinógeno; para la evaluación de la activación plaquetaria, utilizamos la sP-selectina plasmática; para la detección de lesión endotelial, determinamos el antígeno del factor de von Willebrand; y, para una evaluación global de la coagulación y de la fibrinólisis, utilizamos el tromboelastograma. Todas las muestras, excepto para el tromboelastograma, fueron centrifugadas dos veces a (3.000 rpm) por 15 minutos, a 22º C, congeladas en nitrógeno líquido a -180 ºC, conservadas a -80 ºC antes de la determinación final y realizadas por duplicado.
El nivel de TAT fue determinado por el método de ELISA (inmunoensayo enzimático) Enzygnost® TAT (Dade Behring, Marburg, Alemania), con intervalos de referencia de 1,0 a 4,1 µg/L. La determinación cuantitativa de fibrinógeno en plasma humano fue obtenida por el Método Clásico de Clauss, equipamiento AMAX-190, número de referencia 886-LA (Trinity Biotech, St. Louis, MO, EUA), con intervalo de referencia de 220-380 mg/dl. La determinación de la sP-selectina fue realizada por medio de la técnica de ELISA, usando un Kit soluble sP-Selectin ELISA Kit, (BioSource®), Catalog Number - KHS2021, con intervalo de referencia de 90-290 ng/ml. La determinación del antígeno de von Willebrand en plasma humano fue realizada por el clásico método de ELISA - inmunoensayo enzimático (Coergenix Inc, Broomfield, Colorado, EUA), con intervalos de referencia de 50 a 160%.
Las muestras del tromboelastograma fueron analizadas, a 37 ºC, en un intervalo de tiempo inferior a 120 minutos, entre la recolección y la realización del test. Fueron utilizados 20 ml de Kaolin (0,006%), 20 ml de cloruro de calcio (0,2 Molar) y 300 ml de sangre total citratada. Los datos fueron analizados por el
Las variables estudiadas en ese test fueron:
a) Tiempo de coagulación
Tiempo r (período para alcanzar 2 mm de amplitud de la curva): es el tiempo de coagulación medido en minutos. Mide el tiempo transcurrido del comienzo del ensayo hasta el momento en que la producción de fibrina se inicia, con intervalo de referencia de dos a ocho minutos.
b) Cinética del coágulo
Determinación del k (período entre 2 y 20 mm de amplitud de la curva): representa el momento en que el coágulo se estabiliza, la rede de fibrina se consolida, y las plaquetas se adhieren a ésta, con intervalo de referencia de uno a tres minutos.
Ángulo alfa (inclinación entre el r y el k): mide la velocidad de formación del coágulo. Representa la tasa de generación de la trombina y la conversión de fibrinógeno en fibrina, con intervalo de referencia de 55 a 78º.
c) Fuerza del coágulo
MA (amplitud máxima): es función directa de la máxima propiedad dinámica de la fibrina y adhesión plaquetaria vía glicoproteína IIb/IIIa y representa la resistencia global del coágulo, con intervalo de referencia de 51 a 69 mm.
Parámetro G (dyn/cm2): se trata de la conversión algorítmica del MA (en mm) del coágulo en su valor de resistencia a presión (dyn/cm2). Mientras que el MA analiza una reacción lineal entre la fuerza del coágulo y la actividad plaquetaria, el G lo hace como una relación exponencial. El G es más sensible a alteraciones en la función plaquetaria, con intervalo de referencia de 4,6 a 10,9 k.
d) CI (índice de coagulación): permite evaluar el estado hemostático global del paciente. Es resultante de una combinación entre los parámetros cinéticos del coágulo (r, k y ángulo α) y la fuerza del coágulo (MA), con intervalo de referencia de -3 a 3.
e) LY 30 (%) y EPL (%): La LY 30 representa la lisis del coágulo después de 30 minutos y, en conjunto con el EPL (porcentual estimado de lisis), forma los parámetros que monitorean la fase final del proceso de coagulación, con intervalo de referencia de 0 a 8%.
f) MRTG (
g) TMRTG (
h) TG (
Para la evaluación de la proteína C reactiva (PCR) ultrasensible, el método utilizado fue la nefelometría (Dade Behring, Marburg, Alemania), con intervalo de referencia de < 1,0mg/L.
Los resultados fueron tabulados y analizados usando el
La muestra fue calculada asumiéndose una estimativa de diferencia entre los grupos de, aproximadamente, 1/3 de desvío-estándar para un poder de 80%, considerándose test de hipótesis bicaudal. Esa estimativa de diferencia puede ser considerada razonable, de acuerdo con la dispersión medida de variables protrombóticas en otros estudios en portadores de IC. Se consideró como estadísticamente significativo un p < 0,05.
Variables categóricas y continuas fueron expresadas como porcentajes y medias ± desvío-estándar. Comparaciones de variables clínicas, ecocardiográficas y de laboratorio entre los diversos grupos serán realizadas con uso del test t de Student no pareado, para variables continuas paramétricas, y el test de Mann-Whitney, para variables no paramétricas. EL test exacto de Fisher fue utilizado para comparación entre proporciones.
En la
Se observa que los chagásicos (G1) son significativamente más jóvenes, tienen menor índice de masa corporal y peor fracción de eyección en el ecocardiograma bidimensional, en relación a los no chagásicos (G2). Este grupo presenta, aun, mayor frecuencia de tabaquismo, dislipidemia, diabetes e hipertensión y hacen uso más frecuentemente de ácido acetil salicílico en relación al G1.
• Trombina-antitrombina
La determinación plasmática de la Trombina-antitrombina está dispuesta en la
• Fibrinógeno
El dosaje del fibrinógeno fue significativamente más alto en el G2 (343,2mg/dl ± 69,63) en relación al G1 (315,0mg/dl ± 70,41; p=0.0156), según la
• Recuento automatizada de plaquetas
El recuento automatizado de plaquetas está dispuesto en la
• sP-Selectina humana
La determinación plasmática de la P-selectina soluble humana está dispuesta en la
Todos los valores están expresados en mediana (intervalo intercuartil).
• Antígeno del factor de von Willebrand
La determinación plasmática del factor de von Willebrand está dispuesta en la
Los resultados de las variables del tromboelastograma están dispuestos en la
Según la
Los resultados de las determinaciones del PCR ultrasensible están dispuestos en la
Este es el primer estudio controlado a comparar el perfil protrombótico de portadores de CMC con IC de etiología no chagásica. En relación a los marcadores protrombóticos, encontramos semejanza en la mayor parte de los parámetros estudiados e indicios de mayor activación protrombótica entre los no chagásicos, medida por el tromboelastograma (parámetros G, MA y TG), así como por los niveles de fibrinógeno. Ya en el análisis de la actividad inflamatoria, encontramos aumento de ésta, medida por la PCR ultrasensible, en ambos grupos, en consonancia con estudios previamente publicados8, sin que hubiese diferencia significativa entre esos grupos.
En la evaluación del sistema de coagulación, dosamos los niveles plasmáticos de TAT y el fibrinógeno. La importancia del dosaje del TAT reside en el hecho de medir indirectamente la generación de trombina, enzima central de la cascada de coagulación, que convierte el fibrinógeno en fibrina, promueve activación plaquetaria y activa el factor XIII de la coagulación17. La antitrombina III es el inhibidor primario de la trombina. En estados protrombóticos, se espera elevación en la determinación de ese complejo. En nuestra muestra, encontramos elevación de esos niveles en más de 25% de los individuos de ambos grupos, sin diferencia significativa entre ellos. Así, se demuestra tendencia procoagulante entre chagásicos y no chagásicos. El fibrinógeno es una proteína plasmática precursora de la fibrina. La trombina separa el fibrinógeno, dando origen a los monómeros de fibrina, que se agregan para formar polímeros de fibrina insolubles. También es una proteína de la fase aguda, cuya concentración está aumentada en respuesta a muchos diferentes estímulos fisiológicos, tales como estados inflamatorios, infección, trauma y tabaquismo. Altos niveles plasmáticos de fibrinógeno han sido asociados a estados protrombóticos. También han sido correlacionados positivamente con el desarrollo de enfermedad cardíaca isquémica, ACV y mortalidad18. En la muestra estudiada, el dosaje del fibrinógeno fue significativamente más alto en el G2 en relación al G1 (p=0.0156). Eso puede ser debido al hecho de que el G2 presenta mayor índice de masa corporal (p=0.0001) y mayor frecuencia de tabaquismo (p=0.0330) en relación al G119.
El componente plaquetario de la coagulación fue evaluado por el recuento automatizado de plaquetas y por el nivel de P-selectina soluble en el plasma. La P-selectina es un miembro de la familia selectina de moléculas de adhesión celular que están envueltas en la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales, plaquetas-leucocitos, plaquetas-vênulas y entre plaquetas. Ha sido relatado que esas moléculas de adhesión pueden participar de la patogénesis de la IC vía modulación de la interacción plaquetas-leucocitos-endotelio. Es guardada en los gránulos alfa de las plaquetas y en los cuerpos de Weibel-Palade en las células endoteliales. Es transportada rápidamente a la superficie celular bajo una variedad de mediadores, incluyendo trombina, histamina y citocina. No está claro si la sP-selectina es un factor causal en la formación y progresión de aterosclerosis o simplemente un marcador de activación plaquetaria y daño endotelial. Su nivel puede estar aumentado en pacientes con diabetes, enfermedad cardíaca isquémica, tabaquismo y en insuficiencia cardíaca congestiva, sugiriendo una activación plaquetaria persistente20,21. En nuestra muestra, tanto el recuento de plaquetas como los niveles de sP-selectina no fueron diferentes entre los grupos.
La lesión endotelial fue evaluada por los niveles plasmáticos del antígeno del factor de von Willebrand (FvW), que es una proteína plasmática presente en la circulación ligada al factor VIII por medio de una ligazón covalente. Es sintetizada y almacenada en las células endoteliales, sin embargo 15-20% son sintetizados en los megacariocitos y almacenados en las plaquetas circulantes. El FvW puede ser un marcador de lesión y disfunción endotelial, pudiendo estar aumentado en la IC22,23. Un estudio demostró relación directa entre los niveles de marcadores inflamatorios (IL6), de lesión endotelial (factor de von Willebrand) y protrombóticos (factor tisular) con descompensación y pronóstico de la IC. Los pacientes que, después de tratamiento de la descompensación, evolucionaron con reducción de los niveles de esos marcadores tuvieron mejor sobrevida en un seguimiento de seis meses6. Datos semejantes entre pacientes con CMC no existen en la literatura. Observamos niveles elevados de esa proteína en ambos grupos con tendencia a mayor elevación en el grupo chagásico, sin embargo sin diferencia estadísticamente significativa.
Para entender la contribución y la interacción de plaquetas, leucocitos, eritrocitos y componentes solubles en el plasma en el proceso de coagulación, ha sido dada atención especial a la generación de trombina. En una cohorte prospectiva de 914 pacientes después del primer evento tromboembólico venoso, la generación de trombina fue capaz de identificar los pacientes de bajo riesgo para recurrencia de esos eventos24. La tromboelastografía, tecnología que permite,
Las plaquetas contribuyen con 80% de la MA, mientras que el fibrinógeno participa con 20%, además de proveer sitios de adherencia para las plaquetas. El MA elevado sugiere actividad plaquetaria elevada, indicando mayor riesgo trombótico o aumento de la actividad o de los niveles de fibrinógeno. El parámetro G, por ser una conversión algorítmica del MA, es más sensible a alteraciones en la función plaquetaria o del fibrinógeno. En nuestra muestra, no encontramos diferencia en relación al número de plaquetas o a la activación medida por la sP-selectina. Por eso, atribuimos la diferencia de los parámetros G y MA del tromboelastograma a los niveles de fibrinógeno más elevados entre los no chagásicos que entre los chagásicos. Por otro lado, los niveles del parámetro TG (generación total de trombina) demuestran
En relación a los marcadores proinflamatorios, estudiamos la PCR ultrasensible, que es una de las principales proteínas de fase aguda. La PCR no solamente está aumentada en la IC, como también es predictor independiente de mortalidad cardiovascular, principalmente en los pacientes con IC de etiología isquémica26,27. Fueron demostrados, también, aumento de la actividad inflamatoria y peor pronóstico en la cardiomiopatía dilatada idiopática y chagásica8. En nuestro estudio, la determinación del PCR se mostró aumentada en ambos grupos, sin embargo sin diferencia estadística entre ellos.
La exclusión de pacientes con anticoagulación plena podría constituir sesgo de selección. Esos pacientes podrían presentar mayor perfil protrombótico, una vez que, en su mayoría, ya presentaron fenómenos tromboembólicos o factores de riesgo conocidos como fibrilación atrial. Mientras tanto, la probabilidad de alterar la conducta terapéutica de esos pacientes es pequeña, pues ya están bajo anticoagulación plena. El propósito de esta nueva línea de investigación es, inicialmente, identificar subgrupos de pacientes bajo mayor riesgo de esos fenómenos y, en el futuro, estudiar la ampliación de las indicaciones de anticoagulación en pacientes con IC.
La variable proinflamatoria utilizada en este estudio fue el PCR ultrasensible. A pesar de la consagrada utilización como variable pronóstica en la IC, su papel en las diversas etiologías de la IC no está completamente validado. Además de eso, otros marcadores proinflamatorios, como la interleucina-6 y el factor de necrosis tumoral alfa, serán futuramente determinados en muestras congeladas y almacenadas de esos pacientes, en estudios posteriores.
Las variables protrombóticas estudiadas en esta muestra fueron escogidas con el propósito de obtener informaciones acerca de cada una de las etapas del proceso de formación y lisis del coágulo. Mientras tanto, otras variables que no fueron contempladas en el presente estudio podrían ampliar nuestra comprensión de otras vías de la coagulación. También está prevista la determinación de otros factores protrombóticos para ese fin en estudios futuros.
Algunos lectores pueden sentir la falta de un grupo control sano para efecto comparativo. Mientras tanto, una vez que los exámenes utilizados en este estudio ya fueron validados y son ampliamente utilizados en nuestro medio, se vuelve redundante tal grupo control sano, ya que disponemos de valores confiables de referencia.
Aunque el cálculo para un poder de 80% sea considerado adecuado, la muestra será ampliada para alcanzar un poder de 90%, con un total estimado de 300 pacientes.
Otra limitación de este estudio está en la diferencia entre los grupos. El G2 es más añoso y más obeso que el G1, además de tener mayor prevalencia de dislipidemia, diabetes, hipertensión y tabaquismo. Tales diferencias vuelven los dos grupos
Por fin, se trata de estudio de cohorte transversal. Así, no es posible obtener alguna información acerca de la incidencia de fenómenos tromboembólicos en esa muestra o validación de esos marcadores como variables pronósticas en ese contexto. Para eso, se encuentra en andamiento, una continuación de este estudio, bajo la forma de cohorte prospectiva.
Hay aumento de la actividad inflamatoria medida por la PCR ultrasensible en ambos grupos. No hay indicios de un
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue financiado por la FAPESP.
Este artículo es parte de tesis de Doctorado de Leila Maria Magalhães Pessoa de Melo por la Facultad de Medicina de la Universidad de San Pablo.