ORIGINAL ARTICLE

Effect of physical activity and T-786C polymorphism in blood pressure and blood flow in the elderly

Anderson Saranz Zago^I; Eduardo Kokubun^II; Nicola Fenty-Stewart^III; Joon-Young Park^III; Selasi Attipoe^IV; James Hagberg^IV; Michael Brown^III

^IEscola de Educação Física e Esportes - USP, Ribeirão Preto, SP - Brazil

^IIDepartamento de Educação Física - UNESP, Rio Claro, SP - Brazil

^IIIDepartment of Kinesiology - Temple University, Philadelphia - USA

^IVDepartment of Kinesiology - University of Maryland, College Park - USA

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ABSTRACT

BACKGROUND: The T-786C polymorphism of the gene for endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and superoxide anion production may reduce production and bioavailability of nitric oxide, affecting the degree of vasodilation. This effect can be reversed by exercise.

OBJECTIVE: To investigate the influence of aerobic training and T-786C polymorphism in the concentrations of nitric oxide metabolites (NOx) in blood flow (BF) and blood pressure (BP).

METHODS: Thirty-two elderly pre-hypertensive women (59 ± 6 years old) were divided into two groups according to the T-786C polymorphism (TT and TC + CC). We analyzed the concentrations of NOx (plasma) and blood flow by venous occlusion plethysmography at rest, 1, 2 and 3 minutes post-occlusion (BF-0, BF-1 BF-2 BF-3, respectively). Evaluations were performed before and after 6 months of a program of aerobic exercise.

RESULTS: In the pre-training evaluations, NOx levels were lower in TC + CC group than in TT group. The TT group showed correlations between NOx and BF-0 (r = 0.6) and diastolic blood pressure (DBP) and BF-0 (r = -0.7), but no correlation was found in TC + CC group. In the post-training evaluations, there were correlations between NOx and BF-0 (r = 0.6) and the changes in NOx and DBP (r = -0.6) in TT group. There were also correlations between DBP and BF-1 (r = -0.8), DBP, and BF-2 (r = -0.6), DBP, and BF-3 (r = -0.6), in the changes between NOx and BF-1 (r = 0.8) and changes in NOx and DBP (r = -0.7) in TC + CC group.

CONCLUSION: It was concluded that 6 months of aerobic exercise can increase the relationship between NO, BP and BF in elderly of allele C carriers.

Key words: Nitric oxide; superoxide dismutase; exercise; blood pressure; aged; polymorphism, genetic.

Introduction

Nitric oxide (NO) produced by endothelial nitric oxide synthase (eNOS) has an important role in cardiovascular control, especially for vasodilation^1,2. When eNOS is activated, the metabolism of L-arginine is increased generating the formation of L-citrulline and NO by endothelial cells^3-5. Once produced, NO migrates to the vascular smooth muscle cell generating increased activity of guanylate cyclase, resulting in decreased calcium and vascular smooth muscle relaxation^5,6.

In the blood vessel, among the mechanisms involved in maintaining adequate concentrations of NO, it may be noted the activity of eNOS and the bioavailability of NO^7-12.

The activity of eNOS may be genetically determined and some polymorphisms have been identified as potential candidates for the development of arterial hypertension⁹. For example, the C allele of T-786C polymorphism in the promoter region of the eNOS gene has been able to decrease the promoter and transcriptional activity of this gene, reducing the production of NO^7,13.

The bioavailability of NO is closely related to production of superoxide anion (O₂^-) produced by the endothelium, the adventitia layer and vascular smooth muscle cell^1,14-18. Both physical and humoral factors, such as shear stress, can modulate the activity of NAD(P)H oxidase and induce the production of O₂^-12,19. The increase of O₂^- in the cardiovascular system may cause endothelial dysfunction and increased vascular contractility^2,12. When produced in excess, O₂^- reacts with NO producing peroxynitrite (ONOO^-), decreasing the bioavailability of NO².

Opposed to the effects of both mechanisms (gene polymorphisms of eNOS and of the production of O₂^-), aerobic exercise has been indicated as a major stimulus to combat these endothelial disorders^2,19,20. The shear stress induced by the increase in blood flow, especially during physical exercises, may benefit the cardiovascular control mechanism in almost two mechanisms. First, the increased expression of eNOS and thus NO production, and second, the production of extracellular superoxide dismutase (ecSOD), which has the ability to react with O₂^-; potentially increasing the availability of NO for vascular smooth muscle cell^11,20.

So, exercise can regulate NO-mediated vasodilation by lowering the blood pressure values in most hypertensive subjects². However, there is still controversy among studies with respect to the beneficial effects of physical exercise in increasing concentrations of NO and the vasodilator response in individuals carrying eNOS gene polymorphism¹¹.

The objective of this study was to investigate the influence of regular physical activity and T-786C polymorphism of the eNOS gene have in circulating levels of NO metabolites (NOx), the activity of ecSOD, in blood flow (BF) and pressure (BP) in pre-hypertensive elderly women.

Materials and methods

Participants

This study was approved by the Ethics Committee of the University of Maryland College Park/USA and by the Ethics in Research Institute of Biosciences/CEP-IB-UNESP.

On their first visit to the lab, all participants signed an informed consent form. The subjects were 32 apparently healthy women between 50-70 years old, sedentary, pre-hypertensive (without medication), non diabetic and non smokers. Women with overweight and obesity (BMI > 37 kg/m²) were excluded from the study to avoid the interference of these variables in this study results.

The participants were divided into two groups according to the results of analysis of polymorphism of the eNOS gene, being classified as TT and TC + CC. Women in post-menopausal (83.0% of total participants), who were using hormone replacement therapy (45.0% of participants), maintained medications during the study.

Procedures

All participants performed the Bruce treadmill test with ECG for detection of cardiovascular disease, as described previously²¹. A diet record was performed and participants were instructed to keep the phase 1 diet of the American Heart Association (AHA), with stable weight for at least 3 weeks, as described previously²². All basic tests were performed before and after 6 months of a physical training program and the difference between the pre and post evaluations (post - pre = difference) was also used for the purposes of verifying the effectiveness of training in each variable studied.

Basic tests

The evaluation encompassed maximum oxygen consumption test (VO₂max), blood flow (BF), blood pressure (BP) and blood collection.

Maximal oxygen consumption (VO₂max) - was determined by voluntary exhaustion test, through a system of indirect calorimetry (model 2300, Hans Rudolph Inc., Kansas City, Missouri) and gas analyzer (model 1100, Perkin Elmer, Inc Danbury, Conn.) connected to a computer. VO₂max was determined when two of three criteria were met: respiratory exchange > 1.1, heart rate > 220 - age, and an increase greater than 150 ml min^-1 in VO₂ during the last two minutes of test²³. During the test, heart rate (HR), BP and ECG were monitored.

Blood flow - All participants were conducted to the laboratory between 7:00 and 9:00 am after fasting for 12 hours. The participants remained at rest in a lying position for 15 minutes, and blood flow was measured at the nondominant forearm using the technique of venous occlusion plethysmography. Briefly, using an automatic inflator, a small cuff was inflated around the wrist and a larger cuff around the upper arm (humerus) to 180 mmHg and 55 mmHg, respectively. To create ischemia of the arm, the cuff was inflated to 50 mmHg above systolic blood pressure at rest and maintained for 5 minutes. After this period of ischemia, the wrist cuff was inflated again and the arm was inflated to 55 mmHg, every minute²⁴. It has been shown that the tissue has the ability to recover from ischemia in three minutes and that peak vasodilation occurs in about one minute after the release of the cuff^24,25. Thus, BF was measured at rest (BF-0) and one, two and three minutes of reactive hyperemia (BF-1 BF-2 and BF-3, respectively), after 5 minutes of ischemia. The HR and BP were measured simultaneously in the other arm. Vascular resistance (VR) of the arm was calculated with the mean BP divided by the BF.

Casual blood pressure - The systolic and diastolic BP (SBP and DBP) were measured after 15 minutes of rest in the sitting position on three separate days according to the JNC 7 guidelines²⁶. The mean of three measurements was considered for data analysis.

Blood analysis - Blood samples were collected in heparinized tubes for analysis of ecSOD activity, and in tubes containing EDTA for analysis of concentrations of NO metabolites (NOx), after fasting of 12 hours, and centrifuged at 2000 rpm, at 4ºC for 20 minutes. The plasma supernatant was immediately transferred to Eppendorf tubes and frozen at -80 ºC for later analysis.

Concentration of the metabolites of NO - Plasma was ultrafiltered and nitric oxide metabolites (NOx) were measured by Greiss assay (analysis of concentrations of nitrite after conversion of nitrate to nitrite), as described previously^21,27. The samples were analyzed in duplicates and the average between them was considered for statistical analysis. The coefficients of variation were within and between 3.3% and 4.9% respectively.

EcSOD activity - The activity of plasma ecSOD levels was measured using commercial kits from Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). The samples were analyzed in duplicates and the average between them was considered for statistical analysis. The coefficients of variation within and between were 22.0% and 7.0% respectively.

Genetic analysis - The DNA of the participants was isolated from leucocytes using PureGene kit (Gentra System, Minneapolis, MN). The T-786C polymorphism of the eNOS gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) using the following primers: F: 5'-CACCCAGGCCCACCCCAACT-3' and R:5'-GCCGCAGGTCGACAGAGAG ACT-3'. The DNA was denatured for 5 minutes to 95ºC, followed by 35 cycles of denaturation (30s, 95ºC), annealing (15s, 54ºC) and extension (30s, 72ºC). The PCR product was digested by the enzyme MspI at 37ºC, followed by four hours in agarose gel 2.0%. The T allele yields a fragment of 415 bp, and the C allele yields fragments of 370 bp and 45 bp.

C allele carriers were grouped into the same group (TC + CC) and compared with the TT group. The frequency of genotype TT and TC + CC in the population is approximately 32.0% and 68.0%, respectively^28-31. The C allele is considered capable of generating deleterious effects on the cardiovascular system and both genotypes (TC and CC) showed similar responses, unlike genotype TT^13,29. Thus, it is appropriate to group both TC and CC genotypes in the same group for analysis in this study.

Aerobic physical training

All participants underwent a supervised program of aerobic exercise on a treadmill for six months, three times a week, with gradual intensity increase over the weeks. With appropriate heating and relaxation, the initial session consisted of 20 minutes of aerobic exercise to 50.0% of VO₂max. The duration of training was increased 5 minutes per week until reaching 40 minutes. Thereafter, the intensity was increased by 5.0% of VO₂max every week until it reaches 70.0%. The intensity control was performed by heart rate monitors.

Only participants who completed 75.0% of the training sessions were included in the final results of this study.

Statistical analysis

A descriptive analysis was performed for both groups (TT and TC + CC) and a one-way ANOVA to detect statistical differences between groups, taking into account the T-786C polymorphism of the eNOS gene as an independent variable and as dependent variable, BMI, BP, VO₂max, the NOx and activity of ecSOD. A two-way ANOVA was performed with genotype as independent variables and physical activity, and as a dependent variable, BF, BP and BMI. The Pearson correlation analysis was also carried out aiming at detecting possible relationships between the variables analyzed in this study.

All results are expressed as mean and standard error of mean. The significance level was p < 0.05. Data were analyzed using the statistical package SPSS 13.0.

Results

Thirty-two pre-hypertensive women were divided into two groups according to the T-786C polymorphism of the eNOS gene (TT - 20 participants and TC + CC - 12 participants).

No statistical difference was found between groups in SBP, DBP and BMI, variables before and after the exercise program. VO₂max significantly increased in both groups after the exercise program.

The values of BMI, BP and VO₂max of both groups are summarized in Table 1.

In the pre-training, NOx levels were statistically different (p < 0.03) between groups and, as expected, the TC + CC group showed lower values in comparison to the TT group (Figure 1-A). The activity of ecSOD was 30.0% lower in the TC + CC group compared with the TT group, but this difference was not statistically significant (Figure 1-B).

In the post-training evaluation, the TT group maintained the plasma NOx values of the pre-training, while the TC + CC group had an increase in these levels. After the exercise program (Figure 1-A), no significant difference was found between the groups, ie, the difference found in the pre-training did not remain significant after physical training.

Both in pre- and in post-exercise program, no differences were observed between groups in the variable blood flow and vascular resistance. Although this result did not reach statistical differences, the TC + CC group showed higher blood flow values compared to the TT group in the pre-training evaluation, suggesting a lower rate of recovery of blood flow (Figure 2-A). In the post-training evaluation, this small difference was not perceived, with both groups presenting about the same result (Figure 2-B). Basically, vascular resistance had the same pattern of blood flow in relation to both groups and evaluations (Figure 2-C and 2-D).

The Pearson correlation analysis found, in the pre-training evaluation for the TT group, correlations between NOx and BF-0, also found between DBP and the variables of flow and resistance (BF-0, RV-0 and RV-1). In the post-training evaluation, there were correlations between NOx and BF-0 and between the changes in NOx and changes in DBP. For the TC + CC group, no correlation was found in the pre-training evaluation, but in post-training evaluation it was found correlations between DBP and BF-1, BF-2 and BF-3 and between changes in NOx and changes in the BF-1 and DBP. All correlations are summarized in Table 2.

Discussion

This study was conducted to assess the potential effects of T-786C polymorphism of the eNOS gene and six months for a regular program of physical exercise on hemodynamic responses of elderly women pre-hypertensive.

NO has an important role in vascular control, especially in vasodilation. Both eNOS activity as the mechanisms responsible for the bioavailability of NO contributes to the maintenance of an adequate concentration of nitric oxide in the blood vessel, and both mechanisms may be affected by physical exercise.

As expected, after 6 months of aerobic exercise, the result of VO₂max increased significantly for both groups, demonstrating that the intervention applied possessed sufficient stimulus to improve aerobic capacity of participants.

In blood pressure, both systolic and diastolic, no difference was found between the groups and between pre- and post-training. Several studies have shown a beneficial effect of physical exercise on blood pressure. For example, Hagberg et al³² found that regular exercise has the ability to reduce BP in approximately 75.0% of hypertensive patients and that training with moderate intensity seems to generate greater benefits than with high intensity, for such reductions. Higashi et al⁴ observed a beneficial effect of regular aerobic exercise on blood pressure values for hypertensive patients.

It is noteworthy, however, that these studies refer to the beneficial effects of physical exercise in hypertensive individuals, unlike the present study, which used pre-hypertensive individuals, a fact that could explain the absence of differences in blood pressure values between pre- and post-physical training.

The T-786C polymorphism of the eNOS gene is potentially important for cardiovascular control, as has been reported that the presence of C allele decreases the expression of this gene³³. In the present study, NO metabolites were significantly lower for the TC + CC group compared with the TT group, in the pre-training. This result is in agreement with previous studies, which also showed that individuals carrying the C allele for the same polymorphism had lower concentrations of NO^13,34,35. For example, Nakayama et al¹³ observed that carriers of C allele have a decrease of 50.0% of promoter activity when compared to individuals carrying the T allele, which is consistent with the concept that the C allele may reduce the concentrations of NO.

In the post-training evaluation, no difference was found for the values of NOx in the TT group. One possible explanation for this finding is that the participants' concentrations of NOx in this group because of the lack of difference between the pre- and post-training, are already at optimal values to maintain BP control. For the TC + CC group, the levels of NOx increased after aerobic training, but this increase was not statistically significant. This result suggests that although physical training has not been enough to increase the concentrations of NOx, an increase of eNOS activity in individuals carrying the C allele, since the difference between the groups in the pre-training evaluation for NOx, did not remain significant in post-training evaluation. This result is in agreement with several other studies that have shown similar results^3,20,36.

There is growing evidence to indicate that chronic exercise increases the antioxidant defense system in human blood vessels by increasing the activity of ecSOD^8,14,37. Aerobic exercise can increase the activity of ecSOD and potentially increase the bioavailability of NO^11,20. However, the biological activity of NO is dependent on superoxide anions, which compromise the functionality of NO³⁸. In this study, the activity of ecSOD was lower for the TC + CC group compared to the TT group in the pre-training evaluation, but this difference did not reach statistical significance.

After the exercise program, both groups increased the activity of ecSOD proportionally, but this increase remained without statistical differences between evaluatons and groups. Thus, it is suggested that antioxidant activity related to the bioavailability of NO is not impaired in the study participants. This result is in agreement with the study of Di Massimo et al³⁸ that showed NOx values regardless of the values of ecSOD.

The release of NO has been considered as a strong mediator for reactive hyperemia in peripheral arteries⁴. Thus, low levels of NOx observed in the TC + CC group, associated with the responses of BF among groups in the pre-training evaluation, are in agreement with other studies that have shown similar results²⁴. Although no difference was found in variable BF, the TT group had lower responses in the pre-training evaluation. This result indicates that the TT group returned to resting values more rapidly than TC + CC group.

Although the individuals carrying the C allele present lower levels of NOx and lower activity of ecSOD in the pre-training evaluation, blood flow still remained relatively high. This result suggests that there are several other substances that may be contributing to this cardiovascular response, eg, potassium, oxygen, carbon dioxide and adenosine^39,40. From the moment that C allele carriers have some vascular dysfunction, it is possible that other vasodilators are working to control responses to blood flow, thereby offsetting the reduced production of NO^17,40.

In TC + CC group, no correlation was found in the pre-training evaluation among variables NOx, BF and BP. This result can be explained by the deleterious effect of C allele in regulating the generation and bioavailability of NO. However, with the correlations found in post-training evaluation among the variables of blood pressure, blood flow and NOx, it can be stated that six months of a regular program of aerobic exercise can increase the relationship between these variables in individuals with C allele.

After the exercise program, apparently, the TT group had a normal response to vascular function, resulting in a reduced effect of the exercise program at rest and after reactive hyperemia in BF. For the TC + CC group, although blood flow values were higher, the subjects had similar responses compared to the responses from the TT group. So it seems that the ability to return to homeostasis more rapidly in the TC + CC group in post-exercise evaluation, may indicate a favorable response to physical training, resulting in improved peripheral vascular function. This result is in agreement with previous studies that showed a beneficial effect of exercise on blood flow in different genotypes^4,24,36.

Although this study has some limitations, such as exclusion of certain population characteristics (obese, diabetic, heart disease patients etc.), the analysis of just a polymorphism and only some substances to the production and to the bioavailability of NO, it is possible to suggest a beneficial effect of physical exercise considering the studies variables.

In summary, this study found a positive effect of physical exercise program with respect to the T-786C polymorphism of the eNOS gene. This suggests that an increased level of regular physical activity can improve the response to cardiovascular control, especially of NO in C allele carriers, contributing to the relationship between blood pressure and blood flow.

Acknowledgments

Department of Kinesiology - University of Maryland / Grant KO1AG019640 (M. D. Brown).

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by Grant KO1AG019640 (M.D. Brown).

Study Association

This study is not associated with any post-graduation program.

References

ARTÍCULO ORIGINAL

Efecto del ejercicio físico y del polimorfismo T-786C en la presión arterial y en el flujo sanguíneo de añosas

Anderson Saranz Zago^I; Eduardo Kokubun^II; Nicola Fenty-Stewart^III; Joon-Young Park^III; Selasi Attipoe^IV; James Hagberg^IV; Michael Brown^III

^IEscola de Educação Física e Esportes - USP, Ribeirão Preto, SP - Brasil

^IIDepartamento de Educação Física - UNESP, Rio Claro, SP - Brasil

^IIIDepartment of Kinesiology - Temple University, Philadelphia - USA

^IVDepartment of Kinesiology - University of Maryland, College Park - USA

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: El polimorfismo T-786C del gen de la sintetasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) y la producción de anión superóxido pueden disminuir la producción y biodisponibilidad del óxido nítrico, comprometiendo el grado de vasodilatación, pudiendo este efecto ser revertido por el ejercicio físico.

OBJETIVO: Investigar la influencia del entrenamiento aeróbico y del polimorfismo T-786C en las concentraciones de los metabolitos del óxido nítrico (NOx), en el flujo sanguíneo (FS) y en la presión arterial (PA).

MÉTODOS: Treinta y dos añosas prehipertensas (59 ± 6 años) fueron separadas en dos grupos de acuerdo con el polimorfismo T-786C (TT y TC+CC). Fueron analizadas las concentraciones de NOx (plasma) y flujo sanguíneo por pletismografía de oclusión venosa en reposo, 1, 2 y 3 minutos post oclusión (FS-0, FS-1, FS-2, FS-3, respectivamente). Las evaluaciones fueron realizadas antes y después de 6 meses de un programa de ejercicio aeróbico.

RESULTADOS: En las evaluaciones pre entrenamiento, los niveles de NOx fueron menores en el grupo TC+CC en relación al grupo TT. El grupo TT presentó correlaciones entre NOx y FS-0 (r = 0,6) y presión arterial diastólica (PAD) y FS-0 (r = -0,7), sin embargo ninguna correlación fue encontrada en el grupo TC+CC. En las evaluaciones post entrenamiento, ocurrieron correlaciones entre NOx y FS-0 (r = 0,6) y en los cambios del NOx y PAD (r = -0,6) en el grupo TT. También fueron obtenidas correlaciones entre PAD y FS-1 (r = -0,8), PAD y FS-2 (r = -0,6), PAD y FS-3 (r = -0,6), en los cambios entre NOx y FS-1 (r = 0,8) y cambios del NOx y PAD (r = -0,7) en el grupo TC+CC.

CONCLUSIÓN: Se concluye que 6 meses de ejercicio aeróbico pueden contribuir a aumentar las relaciones existentes entre NO, PA y FS en añosas portadoras del alelo C.

Palabras clave: Óxido nítrico, superóxido dismutasa, ejercicio, presión arterial, añoso, polimorfismo genético.

Introducción

El óxido nítrico (NO) producido por la sintetasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) posee una importante función en el control cardiovascular, especialmente para la vasodilatación^1,2. Cuando la eNOS es activada, el metabolismo de la L-arginina es aumentado generando la formación de L-citrulina y de NO por las células endoteliales^3-5. Una vez producido, el NO migra hacia la célula muscular lisa vascular generando un aumento de la actividad de la guanilato ciclasa, culminando en la disminución de calcio y en el relajamiento de la musculatura lisa vascular^5,6.

En el vaso sanguíneo, entre los mecanismos envueltos en la manutención de las concentraciones adecuadas de NO, se pueden destacar la actividad de la eNOS y la biodisponibilidad de NO^7-12.

La actividad de la eNOS puede ser genéticamente determinada y algunos polimorfismos han sido identificados como potenciales candidatos para el desarrollo de hipertensión arterial⁹. Por ejemplo, el alelo C del polimorfismo T-786C de la región promotora del gen de la eNOS ha sido capaz de disminuir la actividad promotora y transcripcional de ese gen, reduciendo la producción de NO^7,13.

La biodisponibilidad de NO está estrechamente relacionada con la producción de anión superóxido (O₂^-) producido por el endotelio, capa adventicia y célula muscular lisa vascular^1,14-18_. Tanto factores físicos como humorales, como por ejemplo el shear stress, pueden modular la actividad de la NAD(P)H oxidasa e inducir la producción de O₂^{- 12,19}. El aumento de O₂^- en el sistema cardiovascular puede generar una disfunción endotelial y un aumento de la contractibilidad vascular^2,12. Cuando es producido en exceso, los O₂^- reaccionan con el NO produciendo peroxinitrito (ONOO^-), disminuyendo la biodisponibilidad del NO².

Contraponiéndose a los efectos de ambos mecanismos (polimorfismos del gen de la eNOS y de la producción de O₂^-), el ejercicio aeróbico ha sido señalado como uno de los principales estímulos para combatir tales disfunciones endoteliales^2,19,20. El shear stress inducido por el aumento del flujo sanguíneo, especialmente durante la realización de ejercicios físicos, puede beneficiar el mecanismo de control cardiovascular en prácticamente dos mecanismos. Primero, por el aumento de la expresión de la eNOS y, consecuentemente, de la producción de NO, y segundo, por la producción de la enzima superóxido dismutasa extracelular (ecSOD), que posee la capacidad de reaccionar con los O₂^-, aumentando potencialmente la disponibilidad de NO para la célula muscular lisa vascular^11,20.

De tal forma, el ejercicio físico puede regular la vasodilatación mediada por el NO disminuyendo los valores de presión arterial en la mayoría de los individuos hipertensos². Con todo, aun existen controversias entre los estudios con relación a los efectos benéficos del ejercicio físico en el aumento de las concentraciones de NO y en la respuesta vasodilatadora en individuos portadores del polimorfismo del gen de la eNOS¹¹.

Así, el objetivo de este estudio fue investigar la influencia que el ejercicio físico regular y el polimorfismo T-786C del gen de la eNOS tendrían en los niveles circulantes de los metabolitos del NO (NOx), en la actividad de la ecSOD, en el flujo sanguíneo (FS) y en la presión arterial (PA) de mujeres añosas pre-hipertensas.

Materiales y métodos

Participantes

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la University of Maryland College Park/USA y por el Comité de Ética en Investigación del Instituto de Biociencias/CEP-IB-UNESP.

En su primera visita al laboratorio, todos los participantes firmaron un término de consentimiento libre y aclarado. Participaron 32 mujeres aparentemente sanas, entre 50-70 años, sedentarias, prehipertensas (sin uso de medicación), no diabética y no fumante. Las mujeres con sobrepeso y obesidad (IMC > 37 kg/m²) fueron eliminadas del estudio para evitar la interferencia de estas variables en los resultados de este estudio.

Las participantes fueron divididas en dos grupos según el resultado del análisis del polimorfismo del gen de la eNOS, siendo clasificadas como TT y TC+CC. Las mujeres en el período de post-menopausia (83,0% del total de las participantes), que hacían uso de terapia de reposición hormonal (45,0% de las participantes), mantuvieron las medicaciones durante el estudio.

Procedimientos

Todos los participantes realizaron el test de Bruce en cinta con electrocardiograma para la detección de enfermedad cardiovascular, según descripto previamente²¹. Un registro de dieta fue realizado y las participantes fueron instruidas a mantener la fase 1 de la dieta del American Heart Association (AHA), con estabilidad del peso por lo menos 3 semanas, según descripto previamente²². Todos los tests básicos fueron realizados antes y después de 6 meses de un programa de entrenamiento físico y la diferencia entre las evaluaciones pre y post (post - pre = diferencia) también fue utilizada para fines de verificar la eficacia del entrenamiento en cada variable estudiada.

Tests básicos

Las evaluaciones comprendieron los tests de consumo máximo de oxígeno (VO₂max), flujo sanguíneo (FS), presión arterial (PA) y recolección sanguínea.

Consumo máximo de oxígeno (VO₂max) - El VO₂max fue determinado por el test de agotamiento voluntario, a través de un sistema de calorimetría indirecta (modelo 2300, Hans Rudolph, Inc., Kansas City, Missouri) y analizador de gases (modelo 1100, Perkin Elmer, Inc., Danbury, Connecticut) conectados a una computadora. El VO₂max fue determinado cuando dos de los tres criterios fuesen alcanzados: intercambio respiratorio > 1,1; Frecuencia cardíaca > 220 - edad; y un aumento mayor que 150 ml min^"1 en el VO_2, durante los dos últimos minutos de test²³. Durante el test, la frecuencia cardíaca (FC), PA y el electrocardiograma fueron monitoreados.

Flujo sanguíneo - Todos los participantes fueron conducidos al laboratorio entre las 7:00 y 9:00 horas después de un ayuno de 12 horas. Los participantes permanecieron en reposo, en la posición acostada por 15 minutos, y el flujo sanguíneo fue medido en el antebrazo no dominante usando la técnica de pletismografía de oclusión venosa. Usando un inflador automático, un pequeño manguito fue inflado alrededor de la muñeca y un manguito mayor alrededor del brazo (húmero) a 180 mmHg y 55 mmHg, respectivamente. Para criar la isquemia del brazo, el manguito fue inflado a 50 mmHg encima de la presión arterial sistólica de reposo, siendo mantenida por 5 minutos. Después de ese período de isquemia, el manguito de la muñeca fue inflado nuevamente y el del brazo fue inflado a 55 mmHg, a cada minuto²⁴. Ha sido mostrado que el tejido posee la capacidad de recuperarse de la isquemia en tres minutos y que el pico de vasodilatación ocurre en aproximadamente un minuto después de la liberación del manguito^24,25. Así, el FS fue medido en reposo (FS-0) y uno, dos y tres minutos de hiperemia reactiva (FS-1, FS-2 y FS-3, respectivamente), después de los 5 minutos de isquemia. La FC y la PA fueron medidas simultáneamente en el otro brazo. La resistencia vascular (RV) del brazo fue calculada con la media de la PA dividida por el FS.

Presión arterial casual - Las PA sistólica y PA diastólica (PAS y PAD) fueron medidas después de 15 minutos de reposo en la posición sentado, en tres días separados de acuerdo con el JNC 7 guidelines²⁶. La media de las tres medidas fue considerada para fines de análisis de datos.

Análisis sanguíneo - Las muestras sanguíneas fueron colectadas en tubos heparinizados para el análisis de la actividad de la ecSOD, y en tubos conteniendo EDTA para análisis de las concentraciones de los metabolitos del NO (NOx), después de un ayuno de 12 horas, siendo centrifugadas a 2.000 rpm, a 4º C y por 20 minutos. El supernadante plasmático fue inmediatamente transferido para eppendorfs y congelado a -80º C para análisis posterior.

Concentración de los metabolitos de NO - El plasma fue ultrafiltrado y los metabolitos del óxido nítrico (NOx) fueron analizados por ensayo de Greiss (análisis de las concentraciones de nitrito después de conversión de nitrato para nitrito), según descripto previamente^21,27. Las muestras fueron analizadas en duplicatas y la media entre ellas fue considerada para fines de análisis estadístico. Los coeficientes de variación intra y inter fueron de 3,3% y 4,9%, respectivamente.

Actividad de la ecSOD - La actividad de la ecSOD plasmática fue medida a través de kits comerciales de la Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). Las muestras fueron analizadas en duplicado y la media entre ellas fue considerada para fines de análisis estadístico. Los coeficientes de variación intra y inter fueron de 22,0% y 7,0%, respectivamente.

Análisis genético - El ADN de los participantes fue aislado de los leucocitos utilizando el kit de la PureGene (Gentra System, Minneapolis, MN). El polimorfismo T-786C del gen de la eNOS fue detectado a través de reacciones en cadena de polimerasa (PCR), utilizándo los siguientes primers: F:5'-CACCCAGGCCCACCCCAACT-3' and R:5'-GCCGCAGGTCGACAGAGAG ACT-3'. EL ADN fue desnaturalizado por 5 minutos a 95º C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (30s, 95º C), anillamiento (15s, 54º C) y extensión (30s, 72º C). El producto del PCR fue digerido por la enzima MspI a 37º C, seguido de 4 horas en gel de agarosa a 2,0%. El alelo T produjo un fragmento de 415 bp, el alelo C produjo fragmentos de 370 bp y 45 bp.

Los portadores del alelo C fueron agrupados en un mismo grupo (TC+CC) siendo comparados con el grupo TT. La frecuencia del genotipo TT y TC+CC en la población es de aproximadamente 32,0% y 68,0%, respectivamente^28-31. El alelo C es considerado capaz de generar efectos deletéreos en el sistema cardiovascular y ambos genotipos (TC y CC) demuestran respuestas similares, diferentemente del genotipo TT^13,29. De esa forma, es apropiado agrupar ambos genotipos TC y CC en un mismo grupo para análisis de este estudio.

Entrenamiento físico aeróbico

Todos los participantes realizaron un programa supervisado de ejercicios físicos aeróbico, en cinta ergométrica, durante 6 meses, tres veces por semana, con intensidad progresiva durante las semanas. Con calentamiento y relajamiento apropiados, la sesión inicial consistió en 20 minutos de ejercicio aeróbico a 50,0% del VO₂max. La duración del entrenamiento fue aumentada 5 minutos por semana hasta alcanzar 40 minutos. A partir de ese momento, la intensidad era aumentada en 5,0% del VO₂max cada semana hasta alcanzar 70,0%. El control de la intensidad fue realizado a través de monitores de frecuencia cardíaca.

Apenas los participantes que completaron 75,0% de las sesiones de entrenamiento fueron incluidos en los resultados finales de este estudio.

Análisis estadístico

Fue realizado un análisis descriptivo para ambos grupos (TT y TC+CC) y una ANOVA one-way para detectar diferencias estadísticas entre los grupos, teniendo en consideración el polimorfismo T-786C del gen de la eNOS como variable independiente y, como variable dependiente, el IMC, la PA, la VO₂max, la NOx y la actividad de la ecSOD. Una ANOVA two-way fue realizada teniendo como variable independiente el genotipo y el ejercicio físico, y, como variable dependiente, el FS, la PA y el IMC. El análisis de correlación de Pearson también fue realizado buscando detectar posibles relaciones entre las variables analizadas en este estudio.

Todos los resultados fueron expresados en media y error estándar de la media. El nivel de significancia fue de p < 0,05. Los datos fueron analizados usando el paquete estadístico SPSS 13.0.

Resultados

Treinta y dos mujeres pre hipertensas fueron divididos en dos grupos, de acuerdo con el polimorfismo T-786C del gen de la eNOS (TT - 20 participantes y TC+CC - 12 participantes).

Ninguna diferencia estadística fue encontrada entre los grupos en las variables PAS, PAD y IMC, antes y después del programa de ejercicio físico. El VO₂max aumentó significativamente en ambos grupos, después del programa de ejercicio físico.

Los valores de IMC, PA y VO₂max de ambos grupos están detallados en la Tabla 1.

En la evaluación preentrenamiento, los niveles de NOx fueron estadísticamente diferentes (p < 0,03) entre los grupos y, como esperado, el grupo TC+CC presentó valores más bajos con relación al grupo TT (Figura 1-A). La actividad de la ecSOD fue 30,0% menor en el grupo TC+CC con relación al grupo TT, pero esta diferencia no se presentó estadísticamente significante (Figura 1-B).

En la evaluación post-entrenamiento, el grupo TT mantuvo los valores plasmáticos de NOx del momento preentrenamiento, mientras que el grupo TC+CC tuvo un aumento en estos niveles. Después del programa de ejercicio físico (Figura 1-A), ninguna diferencia significativa fue encontrada entre los grupos, o sea, la diferencia encontrada en la evaluación preentrenamiento no permaneció significante después del entrenamiento físico.

Tanto en la evaluación pre como en la evaluación post programa de ejercicio físico, ninguna diferencia estadística fue observada entre los grupos en la variable flujo sanguíneo y en la resistencia vascular periférica. Aunque tal resultado no haya alcanzado diferencias estadísticas, el grupo TC+CC presentó valores mayores de flujo sanguíneo comparado al grupo TT en la evaluación preentrenamiento, sugiriendo una menor tasa de recuperación del flujo sanguíneo (Figura 2-A). En la evaluación post entrenamiento, esa pequeña diferencia no fue percibida, presentando ambos grupos prácticamente el mismo resultado (Figura 2-B). Básicamente, la resistencia vascular tuvo el mismo comportamiento del flujo sanguíneo en relación a ambos grupos y evaluaciones (Figura 2-C y 2-D).

El análisis de correlación de Pearson encontró en la evaluación pre entrenamiento para el grupo TT, correlaciones entre NOx y FS-0, también encontradas entre PAD y las variables de flujo y resistencia (FS-0, RV-0 y RV-1). En la evaluación post entrenamiento, hubo correlaciones entre NOx y FS-0 y entre los cambios de la NOx y los cambios en la PAD. Para el grupo TC+CC, ninguna correlación significante fue encontrada en la evaluación pre entrenamiento, pero, en la evaluación post-entrenamiento, fueron encontradas correlaciones entre PAD y FS-1, FS-2 y FS-3 y entre los cambios en la NOx y los cambios en el FS-1 y PAD. Todas las correlaciones encontradas están resumidas en la Tabla 2.

Discusión

El presente estudio fue desarrollado para evaluar el potencial efecto del polimorfismo T-786C del gen de la eNOS y de 6 meses de un programa regular de ejercicio físico en las respuestas hemodinámicas de mujeres añosas pre-hipertensas.

El NO posee una importante función en el control vascular, especialmente en la vasodilatación. Tanto la actividad de la eNOS como los mecanismos responsables por la biodisponibilidad del NO contribuyen a la manutención de una adecuada concentración de óxido nítrico en el vaso sanguíneo, y ambos mecanismos pueden ser afectados por el ejercicio físico.

Como era esperado, después de 6 meses de ejercicio aeróbico, el resultado del VO₂max tuvo un aumento significativo para ambos grupos, demostrando que la intervención aplicada poseyó estímulo suficiente para mejorar la capacidad aeróbica de las participantes.

En la presión arterial, tanto sistólica cuanto diastólica, ninguna diferencia fue encontrada entre los grupos y entre las evaluaciones pre y post-entrenamiento. Diversos estudios han evidenciado un efecto benéfico del ejercicio físico sobre la presión arterial. Por ejemplo, Hagberg et al³² observaron que el ejercicio físico regular posee la capacidad de disminuir la PA en aproximadamente 75,0% de los individuos hipertensos y que el entrenamiento con intensidad moderada parece generar mayores beneficios que los de alta intensidad, para tales reducciones. Higashi et al⁴ observaron un efecto benéfico del ejercicio aeróbico regular en los valores de PA para individuos hipertensos.

Cabe resaltar, mientras tanto, que esos estudios hacen referencia a los efectos benéficos del ejercicio físico en individuos hipertensos, diferentemente del presente estudio, que utilizó individuos pre-hipertensos, hecho que podría justificar la ausencia de diferencias en los valores de presión arterial entre las evaluaciones pre y post-entrenamiento físico.

El polimorfismo T-786C del gen de la eNOS es potencialmente importante para el control cardiovascular, pues ha sido relatado que la presencia del alelo C disminuye la expresión de este gen³³. En el presente estudio, los metabolitos del NO fueron significativamente menores para el grupo TC+CC comparado con el grupo TT, en la evaluación pre-entrenamiento. Tal resultado está en concordancia con estudios previos, que también mostraron que individuos portadores del alelo C para el mismo polimorfismo poseían menores concentraciones de NO^13,34,35. Por ejemplo, Nakayama et al¹³ observaron que los portadores del alelo C poseen una disminución de 50,0% de la actividad promotora cuando es comparado a los individuos portadores del alelo T, el cual es consistente con el concepto de que el alelo C puede reducir las concentraciones de NO.

En la evaluación post-entrenamiento, ninguna diferencia fue encontrada para los valores de NOx en el grupo TT. Una posible explicación para ese resultado es que las concentraciones de NOx de los participantes de ese grupo, debido a la ausencia de diferencia entre las evaluaciones pre y post-entrenamiento, ya se encuentran en valores ideales para mantener el control de la PA. Para el grupo TC+CC, los niveles de NOx aumentaron después del entrenamiento aeróbico, pero este aumento no fue estadísticamente significante. Tal resultado sugiere que, aunque el entrenamiento físico realizado no haya sido suficiente para aumentar las concentraciones de NOx, hubo un aumento de la actividad de la eNOS en individuos portadores del alelo C, pues la diferencia existente entre los grupos en la evaluación pre-entrenamiento para la NOx, no se mantuvo significante en la evaluación post-entrenamiento. Ese resultado está en concordancia con varios otros estudios que mostraron resultados similares^3,20,36.

Existen crecientes evidencias para indicar que el ejercicio crónico aumenta el sistema de defensa antioxidante en vasos sanguíneos de humanos a través del aumento de la actividad de la ecSOD^8,14,37. El ejercicio aeróbico puede aumentar la actividad de la ecSOD y potencialmente aumentar la biodisponibilidad de NO^11,20. Mientras tanto, la actividad biológica del NO es dependiente de los aniones superóxidos, los cuales comprometen la funcionalidad del NO³⁸. En el presente estudio, la actividad de la ecSOD fue menor para el grupo TC+CC comparado al grupo TT en la evaluación pre-entrenamiento, pero esta diferencia no alcanzó significancia estadística.

Después del programa de ejercicio, ambos grupos aumentaron proporcionalmente la actividad de la ecSOD, pero este aumento permaneció sin diferencias estadísticas entre las evaluaciones y grupos. De esa forma, se sugiere que la capacidad antioxidante relacionada a la biodisponibilidad de NO no está perjudicada en los participantes de este estudio. Ese resultado está en concordancia con el estudio de Di Massimo et al³⁸, que evidenciaron los valores de NOx independientemente de los valores de ecSOD.

La liberación del NO ha sido considerada como un fuerte mediador para la hiperemia reactiva en arterias periféricas⁴. De ese modo, bajos niveles de NOx observados en el grupo TC+CC, asociado a las respuestas del FS entre los grupos en la evaluación pre-entrenamiento, están en concordancia con otros estudios que mostraron resultados similares²⁴. Aunque ninguna diferencia haya sido encontrada en la variable FS, el grupo TT presentó menores respuestas en la evaluación pre-entrenamiento. Tal resultado indica que el grupo TT volvió a los valores de reposo más rápidamente que el grupo TC+CC.

A pesar de que los individuos portadores del alelo C presentaron niveles menores de NOx y menor actividad de la ecSOD en la evaluación pre-entrenamiento, el flujo sanguíneo aun permaneció relativamente elevado. Ese resultado sugiere que existen varias otras sustancias que pueden estar contribuyendo a esta respuesta cardiovascular, como por ejemplo, potasio, oxígeno, dióxido de carbono y adenosina^39,40. A partir del momento en que los portadores del alelo C poseen alguna disfunción vascular, es posible que otros vasodilatadores estén actuando para controlar las respuestas al flujo sanguíneo, compensando así la reducida producción de NO^17,40.

En el grupo TC+CC, ninguna correlación fue encontrada en la evaluación pre-entrenamiento entre las variables NOx, FS y PA. Ese resultado puede ser explicado por el efecto deletéreo del alelo C en la regulación entre producción y biodisponibilidad del NO. Mientras tanto, con las correlaciones encontradas en la evaluación post-entrenamiento entre las variables de presión arterial, flujo sanguíneo y NOx, se puede afirmar que 6 meses de un programa regular de ejercicios aeróbicos pueden contribuir a aumentar la relación existente entre esas variables en individuos portadores del alelo C.

Después del programa de ejercicio, aparentemente, el grupo TT poseía una respuesta normal para la función vascular, resultando en un reducido efecto del programa de ejercicio en reposo y después de la hiperemia reactiva en el FS. Para el grupo TC+CC, aunque los valores de flujo sanguíneo hayan sido más altos, los individuos tuvieron respuestas similares comparadas a las respuestas del grupo TT. Siendo así, parece que la capacidad de retorno a la homeostasis más rapidamente, en el grupo TC+CC en la evaluación post-ejercicio, puede indicar una respuesta favorable del entrenamiento físico, resultando en una mejora de la función vascular periférica. Tal resultado está en concordancia con estudios previos que mostraron un efecto benéfico del ejercicio físico en el flujo sanguíneo en diferentes genotipos^4,24,36.

A pesar de que este estudio posee algunas limitaciones, como por ejemplo, exclusión de determinadas características poblacionales (obesos, diabéticos, cardiópatas etc.), del análisis de apenas un polimorfismo y de solamente algunas sustancias relacionadas tanto a la producción como a la biodisponibilidad del NO, es posible sugerir un efecto benéfico del ejercicio físico frente a las variables analizadas.

En resumen, el presente estudio encontró un efecto positivo del programa de ejercicio físico con relación al polimorfismo T-786C del gen de la eNOS. Eso sugiere que un aumento del nivel de actividad física regular puede mejorar la respuesta al control cardiovascular, especialmente del NO en portadores del alelo C, contribuyendo a la relación entre presión arterial y flujo sanguíneo.

Agradecimientos

Department of Kinesiology - University of Maryland/Grant KO1AG019640 (M. D. Brown).

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiamiento

El presente estudio fue financiado por Grant KO1AG019640 (M.D. Brown).

Vinculación Académica

No hay vinculación de este estudio a programas de post grado.

Referencias