abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil cXLLjyHjTBPD3yBmN73JYNF 00003 S0066-782X2010001400003 S0066-782X(10)09500403 10.1590/S0066-782X2010005000121 Artigos Originais Influência de combinações genéticas nos níveis de HDL-c em uma população do sul do Brasil Andrade Fabiana Michelsen de Fiegenbaum Marilu Almeida Silvana de Hutz Mara Helena Porto Alegre Rio Grande do Sul Universidade Federal do Rio Grande do Sul Brazil Porto Alegre Rio Grande do Sul Universidade FEEVALE Brazil Porto Alegre Rio Grande do Sul Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre Brazil Porto Alegre Rio Grande do Sul Centro Universitário Metodista do IPA Brazil 10 2010 95 4 430 435 03 03 2010 21 08 2009 12 04 2010 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: Baixos níveis de HDL-c são importantes preditores de doença coronariana, a primeira causa de morte no mundo todo. Muitos fatores afetam os níveis de HDL-c, tais como os polimorfismos de genes que codificam proteínas-chave para a via de transporte reverso de colesterol. OBJETIVO: Investigar a influência de sete polimorfismos dos genes CETP, APOA1, ABCA1 e SCARB1 genes nos níveis de HDL-c em uma população da região sul do Brasil. MÉTODOS: Os polimorfismos foram investigados em uma amostra de 500 indivíduos de descendência europeia, mas os níveis de HDL-c de somente 360 indivíduos foram ajustados para cofatores usando regressão linear múltipla no estudo de associação. A amostra foi dividida em tercis de acordo com os níveis ajustados de HDL-c e frequências de alelos e haplótipos foram comparadas entre o 1º e o 3º tercis dos níveis ajustados de HDL-c. RESULTADOS: Quando as combinações dos alelos de risco foram testadas, a frequência de combinações alélicas em três genes (haplótipo 1 do gene APOA1, variante 2S do gene SCARB1, e alelo B1 do gene CETP) foi significantemente mais alta no tercil inferior dos níveis ajustados de HDL-c (28,3%) do que no tercil superior (14,9%; p=0,008), o que indica que a presença dessas variantes aumentou 2,26 vezes a chance de ter níveis de HDL-C < 39,8 mg/dl. CONCLUSÃO: Espera-se que esses marcadores, quando estudados separadamente, tenham uma pequena influência na característica que está sendo analisada, mas uma influência maior foi detectada quando os marcadores foram estudados em combinação. Em uma população da região sul do Brasil, nossos dados mostraram uma influência significante das combinações das variantes dos genes APOA1, SCARB1 e CETP nos níveis de HDL-c.

 Colesterol HDL população polimorfismo genético região sul 08 09 2010

ARTIGO ORIGINAL

BIOLOGIA MOLECULAR

Influência de combinações genéticas nos níveis de HDL-c em uma população do sul do Brasil

Fabiana Michelsen de AndradeI; Marilu FiegenbaumII,III; Silvana de AlmeidaIII; Mara Helena HutzIV

IUniversidade Feevale, Porto Alegre, RS - Brasil

IICentro Universitário Metodista IPA, Porto Alegre, RS - Brasil

IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS - Brasil

IVUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: Baixos níveis de HDL-c são importantes preditores de doença coronariana, a primeira causa de morte no mundo todo. Muitos fatores afetam os níveis de HDL-c, tais como os polimorfismos de genes que codificam proteínas-chave para a via de transporte reverso de colesterol.

OBJETIVO: Investigar a influência de sete polimorfismos dos genes CETP, APOA1, ABCA1 e SCARB1 genes nos níveis de HDL-c em uma população da região sul do Brasil.

MÉTODOS: Os polimorfismos foram investigados em uma amostra de 500 indivíduos de descendência europeia, mas os níveis de HDL-c de somente 360 indivíduos foram ajustados para cofatores usando regressão linear múltipla no estudo de associação. A amostra foi dividida em tercis de acordo com os níveis ajustados de HDL-c e frequências de alelos e haplótipos foram comparadas entre o 1º e o 3º tercis dos níveis ajustados de HDL-c.

RESULTADOS: Quando as combinações dos alelos de risco foram testadas, a frequência de combinações alélicas em três genes (haplótipo 1 do gene APOA1, variante 2S do gene SCARB1, e alelo B1 do gene CETP) foi significantemente mais alta no tercil inferior dos níveis ajustados de HDL-c (28,3%) do que no tercil superior (14,9%; p=0,008), o que indica que a presença dessas variantes aumentou 2,26 vezes a chance de ter níveis de HDL-C < 39,8 mg/dl.

CONCLUSÃO: Espera-se que esses marcadores, quando estudados separadamente, tenham uma pequena influência na característica que está sendo analisada, mas uma influência maior foi detectada quando os marcadores foram estudados em combinação. Em uma população da região sul do Brasil, nossos dados mostraram uma influência significante das combinações das variantes dos genes APOA1, SCARB1 e CETP nos níveis de HDL-c.

Palavras-chave: Colesterol HDL/genética, população/genética, polimorfismo genético, região sul/Brasil.

Introdução

Estudos epidemiológicos tem fornecido fortes evidências de que níveis baixos de lipoproteína de alta densidade (HDL-c) estão associados com aumento do risco de doença arterial coronariana (DAC)1. Sendo assim, as causas dos baixos níveis de HDL-c tem sido intensivamente investigadas e estudos genéticos tem se concentrado nos genes que codificam as proteínas que tem um papel importante no metabolismo do HDL-c ou no transporte reverso do colesterol (TRC). As proteínas nesses grupos incluem: apolipoproteínas, tais como A-I, A-II e E; enzimas, tais como CETP, LCAT e LIPC; e receptores de membrana, tais como ABCA1 e SCARB1. Quando associados, esses genes candidatos são substancialmente polimórficos e muitos estudos tem investigado a associação desses polimorfismos com o risco de alterações nos perfis lipídicos. Entretanto, ainda precisa ser esclarecido se esses polimorfismos afetam os perfis lipídicos e se essa influência é encontrada em diferentes populações; o que não foi investigado em nenhuma população sulamericana até hoje.

Este estudo investigou a influência de sete polimorfismos dos genes CETP, APOA1, ABCA1 e SCARB1 nos níveis de HDL-c em uma população da região sul do Brasil.

Métodos

Indivíduos

A amostra populacional consistiu em 500 indivíduos de ascendência europeia, como anteriormente descrito2. Os voluntários incluídos nessa amostra foram convidados a participar do estudo em dois centros clínicos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul entre indivíduos que foram encaminhados a vários centros de saúde para exames de sangue de rotina. Um questionário foi utilizado para coletar dados sobre uso de medicamentos e variáveis relacionadas ao estilo de vida, tais como tabagismo, atividade física, etilismo, uso de contraceptivos orais, menopausa e medidas antropométricas. O tabagismo foi classificado como não-fumante ou fumante atual; ex-fumantes foram excluídos. Todos os indivíduos deram seu consentimento livre e informado antes de serem incluídos no estudo. Os critérios de exclusão foram: gravidez, hiperlipidemia secundária devido a doença renal, hepática ou tireoidiana; e diabete ou níveis de glicemia de jejum > 7 mmol/l3. Mulheres recebendo terapia de reposição hormonal e indivíduos recebendo medicamentos hipolipemiantes, beta-bloqueadores ou anti-inflamatórios também foram excluídos.

Os participantes foram examinados pela manhã após um jejum de 12 horas. O peso foi medido sem sapatos e com roupas leves. A altura foi medida sem sapatos, com os calcanhares juntos e as com o dorso encostado na parede. O índice de massa corporal (IMC) foi calculado como peso/altura2 (kg/m2). A circunferência da cintura (CC) foi medida na menor circunferência horizontal entre a 12ª costela e a crista ilíaca.

Análises laboratoriais

As amostras de sangue foram coletadas após um jejum de 12 horas. Colesterol total (CT), lipoproteína de alta densidade, colesterol (HDL-c) e triglicérides (TG) foram dosados em cada centro clínico usando métodos enzimáticos padronizados4. Os níveis de lipoproteína de baixa densidade colesterol (LDL-c) foram calculados usando a fórmula de Friedwald5. Os níveis de glicemia também foram dosados para assegurar que nenhum indivíduo com diabete tenha sido incluído no estudo.

A técnica de salting-out foi utilizada para extrair o DNA das amostras de sangue6. O DNA foi amplificado utilizando-se PCR e primers oligonucleotídeos sob as condições previamente descritas para CETP7, APOA18, ABCA19 e SCARB110. Os produtos da amplificação foram subsequentemente digeridos com as seguintes enzimas de restrição sob as condições recomendadas pelo fabricante: Taq I (CETP - TaqIB), Msp I (APOA1 - g-75a e c+83t), Xag I (ABCA1 - Arg219Lys), Alu I (SCARB1 - Gly2Ser), ApaI (SCARB1 - c780t) e Hae III (SCARB1 - c1050t). Os genótipos foram determinados após a realização de eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio e um marcador de 100 pb foi usada para determinar os tamanhos das bandas.

Análise estatística

As frequências alélicas foram estimadas pelo método de contagem de genes. Um teste c2 para "goodness of fit" foi utilizado para verificar se as frequências alélicas eram as esperadas de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. As frequências de haplótipos de máxima verossimilhança e o desequilíbrio de ligação foram estimados usando o software Arlequin 200011. Os haplótipos dos genes SCARB1 e APOA1 foram determinados usando-se o método descrito por Long12.

Apenas 360 indivíduos foram analisados no estudo de associação entre SNPs e níveis de HDL-c, por que os dados completos dos outros indivíduos não estavam disponíveis. Regressões lineares múltiplas foram realizadas para ajustar os níveis de HDL-c usando o método backward stepwise. As covariantes incluídas no primeiro modelo foram sexo, idade, CC, tabagismo, etilismo, IMC, níveis de triglicérides (TG) e menopausa, bem como todos os termos de interação possíveis. No modelo final usado para o ajuste dos níveis de HDL-c, as covariantes significantes que permaneceram no modelo foram sexo, idade, IMC, níveis de TG, níveis de TG x idade, estado pós-menopausa e níveis de TG x menopausa para mulheres. Os níveis de TG foram log-transformados para remoção de assimetria na distribuição. A amostra foi dividida de acordo com os tercis de HDL-c e a heterogeneidade entre os grupos em tabelas de contingência foi testada usando o Teste c2 ou Teste Exato de Fisher. As regressões logísticas foram realizadas para obter o odds ratio (OR) para cada variante genética ou combinação de variantes. Todas as análises foram realizadas com o software Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versão 11.0 para Windows.

Resultados

A Tabela 1 mostra as frequências de alelos e genótipos para os genes CETP, ABCA1 e SCARB1 genes, bem como as frequências de haplótipos para o gene APOA1. As frequências de haplótipos do gene SCARB1 não são mostradas por que elas não influenciaram os níveis de HDL-c em qualquer análise posterior. Todas as frequências genotípicas estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg (dados não mostrados). Um forte desequilíbrio de ligação entre as duas variantes do gene APOA1 foi detectado (D'= -0,84, c2=10,04, p<0,001) e o haplótipo 1 (-75g/+83c) foi o mais comum. Para o gene SCARB1, o alelo 780t foi o mais frequentemente encontrado com 1050c, indicando um desequilíbrio significante (D'= - 0,44, c2=5,97, p=0,015). Gly2Ser não esteve ligado a nenhuma das outras duas variantes investigadas nesse gene.

A prevalência de cada haplótipo do gene APOA1 e as frequências alélicas das outras variantes do estudo foram comparadas entre o 1º e o 3º tercis de HDL-c ajustado para variáveis não-genéticas (Tabela 2) e as características clínicas de acordo com esses grupos são mostradas na Tabela 3. Embora a diferença não tenha sido estatisticamente significante, o haplótipo 1 do gene APOA1, o alelo TaqIB*1 do gene CETP, e o alelo 2Ser do gene SCARB1 foram mais frequentes no 1º tercil (p=0,18, p=0,16 e p=0,29). Quando as frequências de alelos e haplótipos foram novamente comparadas entre o 1º e o 4º quartis de HDL-c, as mesmas tendências foram encontradas, exceto pelo Gly2Ser SNP do gene SCARB1, que tinha um valor de p menor (p=0,14).

Com base nesses resultados, os alelos de risco para baixos níveis de HDL-c foram selecionados a partir das comparações estatísticas que resultaram em valores de p < 0,25. Essas variantes, chamadas de "variantes de risco", são mostradas na Tabela 4, que também mostra como os portadores dessas variantes foram analisados posteriormente: como portadores homozigotos, ou como portadores heterozigotos e homozigotos.

A frequência de indivíduos com combinações de risco genético para baixos níveis de HDL-c foi comparada entre o 1º e o 3º tercis de HDL-c (Tabela 5). Primeiro, os portadores de combinações de duas variantes deletérias foram avaliados, como mostrado na Tabela 4 e então a frequência dos portadores de combinações de três variantes deletérias foi comparada. Essas comparações mostraram que ser um portador de variantes de risco dos genes APOA1 e CETP aumentou em 2,4 vezes a chance de ter níveis de HDL-c < 39,8 mg/dl (p=0,005). Quando, além dessa combinação, o individuo também é portador do alelo de risco do gene SCARB1, essa chance era 2,26 vezes maior (p=0,008). Embora esse gene não pareça alterar o risco de apresentar baixos níveis de HDL-c, isso pode ser o resultado do fato de que apenas um pequeno número de portadores carregam essa combinação tripla. Quando o gene SCARB1 foi analisado em combinações com os genes CETP e APOA1, resultados limítrofes foram encontrados (OR=1,6, p=0,08), o que não foi observado quando os genes CETP e APOA1 genes foram avaliados separadamente (Tabela 2).

Discussão

As frequências alélicas encontradas nesse estudo são em sua maioria similares àquelas detectadas em estudos com diferentes populações. Para o gene CETP, a prevalência de 35,7% para o alelo raro é levemente menor que aquela detectada em populações de ascendência europeia exclusivamente, que foi de aproximadamente 40%13-17. No gene ABCA1, os valores encontrados para o SNP Arg219Lys estiveram dentro dos limites de variação encontrados em outras populações de ascendência europeia: de 25% para alemães a 38% para norte-americanos9,18-21. Resultados similares foram encontrados para o gene APOA1 quando comparado com valores para outras populações de ascendência europeia22. Nossos dados sobre o gene SCARB1 são comparáveis àqueles relatados em alguns poucos estudos publicados até hoje, mas a frequência alélica de 17% encontrada no estudo para o SNP do intron 5 e a frequência de 29,3% para a variante do exon 8 são levemente diferentes das frequências encontradas por Richard e cols.23 para norte-americanos (9% e 49%) e por Acton e cols.10 para uma população espanhola (10,5% e 43,8%). Nossa análise da variante no exon 1 mostrou que a frequência do alelo raro foi levemente mais baixa do que aquela encontrada em uma população espanhola10. Essas diferenças podem refletir diferenças na composição étnica das populações sendo comparadas.

O padrão do desequilíbrio de ligação entre as variantes do gene APOA1 foi similar àquele encontrado na literatura24. Em nossa população, nenhum desequilíbrio de ligação foi encontrada entre o SNP do exon 1 do gene SCARB1 e os outros SNPs do estudo, de acordo com os achados relatados para outras populações10,25,26. Entretanto, o padrão de ligação de desequilíbrio entre os SNPs do intron 5 e exon 8 diferem dependendo da população sendo estudada: nas populações espanhola10 e norte-americana25, a variante rara do intron 5 esteve ligada à variante comum do exon 8, que foi o mesmo encontrado em outras populações. Entretanto, em uma amostra populacional da Áustria e em uma amostra populacional diferente dos EUA, os dois alelos comuns estiveram ligados23,26.

Quando avaliados separadamente, nossos dados não mostraram nenhuma influência significante dos polimorfismos estudados nos níveis de HDL-c (Tabela 4). Três das variantes estudadas tinham frequências alélicas similares na comparação entre o 1º e o 3º tercis. Duas delas são polimorfismos do gene SCARB1, encontrados no intron 5 e exon 8, e os poucos dados sobre eles na literatura não mostram nenhuma influência sobre os níveis de HDL-c10,25-28, nem indicam qualquer associação com o sexo e uso de hormônios23,28,29. Além disso, nenhuma influência da variante Arg219Lys no gene ABCA1 foi encontrada em vários estudos com diferentes populações20,21,30.

Selecionamos polimorfismos dos genes CETP, APOA1 e SCARB1 para uma valiação combinada. Embora alguns autores tenham detectado efeitos isolados desses genes nos níveis de HDL-c, vários outros estudos descobriram que a influência desses genes é muito fraca para ser detectada quando eles são avaliados separadamente13,26,31,32.

Essas diferenças na magnitude de uma influência genética podem refletir diferenças entre a composição genética de cada população, bem como as diferenças ambientais entre elas. A avaliação do efeito combinado de genes nos níveis de HDL-c é rara na literatura, o que torna a comparação de dados difícil. A avaliação de dois ou três variantes de risco revelou uma influência significante das variantes dos genes APOA1, CETP e SCARB1 nos níveis de HDL-c. Esse achado está de acordo com estudos dos genes APOA1 e CETP em outras populações8,33-37. Entretanto, para o SNP Gly2Ser do gene SCARB1, os poucos estudos conduzidos até agora associaram a presença do alelo 2Gly com uma diminuição nos níveis de HDL-c. Em nossa população, a combinação do alelo 2Ser e as variantes dos genes APOA1 e CETP foi mais frequente nos participantes com níveis mais baixos de HDL-c (Tabela 5). Dois outros autores25,27 não detectaram qualquer influência significante desse alelo sobre os níveis de HDL-c. Dessa forma, o papel desse polimorfismo deve ser investigado em outros estudos e não podemos descartar a possibilidade de que ele atue como marcador de outra variante ainda não estudada, embora seja uma troca de aminoácidos. A confirmação dessa hipótese explicaria as diferenças entre nossos dados e os achados relatados por Acton e cols.10.

Os papéis fisiológicos dessas três proteínas estão intimamente associados: CETP é uma enzima-chave no metabolismo de HDL38, enquanto SR-BI e apoAI agem como receptor e ligante do HDL-c39,40. Dessa forma, a interação detectada pode ser entendida quando analisada em associação com o metabolismo e via de absorção do HDL-c.

O presente estudo detectou influências genéticas nos níveis de HDL-c, mas apresentou algumas limitações. Os maiores problemas foram o pequeno tamanho da amostra para o estudo de associação e o fato de que não havia dados disponíveis para 140 pacientes. Dessa forma, influências genéticas menos evidentes, que podem ser detectadas apenas em uma amostra maior, podem ter sido perdidas. Além disso, um estudo prospectivo da influência das combinações alélicas deve ser realizado para confirmar o impacto clínico desses genes no perfil lipídico de nossa população.

A direção da influência genética nos níveis de HDL-c parece ser, na maioria dos casos, independente do background genético ou de variações ambientais, mas a magnitude desse efeito difere grandemente entre diferentes populações. Qualquer característica multifatorial é influenciada por vários loci; dessa forma, análises de interações entre genes devem ser realizadas, pois podem ser a única forma de avaliar seu real papel genético em cada população.

Agradecimentos

Agradecemos Maria Perpetua de Oliveira Pinto por seu auxilio técnico e Marcel Arsand e Fabiano Roldão por sua ajuda na coleta da amostra. Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil), Programa de Apoio à Núcleos de Excelência (PRONEX, Brasil) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Brasil) pelo apoio financeiro.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq, CAPES, PRONEX e FAPERGS.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Fabiana Michelsen de Andrade pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Correspondência:

Fabiana Michelsen de Andrade

Universidade Feevale - 239/2755, PROPI s. 201 F - Vila Nova

93352-000 - Novo Hamburgo, RS - Brasil

E-mail:

fabiana.andrade@feevale.br,

fabiana.michelsen@hotmail.com

Artigo recebido em 21/08/09; artigo revisado recebido em 03/03/10; aceito em 12/04/10.

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BACKGROUND: Low HDL-C levels are important predictors of coronary disease, the first cause of death worldwide. Many factors affect HDL-C levels, such as polymorphisms of genes encoding for key proteins of the reverse cholesterol transport pathway. OBJECTIVE: To investigate the influence of seven polymorphisms of the CETP, APOA1, ABCA1 and SCARB1 genes on HDL-C levels in a southern Brazilian population. METHODS: The polymorphisms were investigated in a sample of 500 individuals of European descent, but HDL-C levels from only 360 individuals were adjusted for cofactors using multiple linear regressions in the association study. The sample was divided in tertiles according to adjusted HDL-C levels, and allele and haplotype frequencies were compared between the 1st and 3rd tertiles of adjusted HDL-C levels. RESULTS: When combinations of risk alleles were tested, the frequency of allele combinations in three genes (haplotype 1 of APOA1 gene, variant 2S of SCARB1 gene, and allele B1 of CETP gene) was significantly higher in the lower tertile of adjusted HDL-C (28.3%) than in the upper tertile (14.9%; p=0.008), which indicated that the presence of these variants increased 2.26 times the chances of having HDL-C levels below 39.8 mg/dl. CONCLUSION: These markers, when studied separately, are expected to have a small influence on the characteristic under analysis, but greater influence was detected when the markers were studied in combination. In a population of southern Brazilians, our data showed a significant influence of variant combinations of APOA1, SCARB1 and CETP genes on HDL-c levels.

 Cholesterol population polymorphism, genetic south region

ORIGINAL ARTICLE

Fabiana Michelsen de AndradeI; Marilu FiegenbaumII,III; Silvana de AlmeidaIII; Mara Helena HutzIV

IUniversidade Feevale, RS - Brazil

IICentro Universitário Metodista IPA, RS - Brazil

IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, RS - Brazil

IVUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS - Brazil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Low HDL-C levels are important predictors of coronary disease, the first cause of death worldwide. Many factors affect HDL-C levels, such as polymorphisms of genes encoding for key proteins of the reverse cholesterol transport pathway.

OBJECTIVE: To investigate the influence of seven polymorphisms of the CETP, APOA1, ABCA1 and SCARB1 genes on HDL-C levels in a southern Brazilian population.

METHODS: The polymorphisms were investigated in a sample of 500 individuals of European descent, but HDL-C levels from only 360 individuals were adjusted for cofactors using multiple linear regressions in the association study. The sample was divided in tertiles according to adjusted HDL-C levels, and allele and haplotype frequencies were compared between the 1st and 3rd tertiles of adjusted HDL-C levels.

RESULTS: When combinations of risk alleles were tested, the frequency of allele combinations in three genes (haplotype 1 of APOA1 gene, variant 2S of SCARB1 gene, and allele B1 of CETP gene) was significantly higher in the lower tertile of adjusted HDL-C (28.3%) than in the upper tertile (14.9%; p=0.008), which indicated that the presence of these variants increased 2.26 times the chances of having HDL-C levels below 39.8 mg/dl.

CONCLUSION: These markers, when studied separately, are expected to have a small influence on the characteristic under analysis, but greater influence was detected when the markers were studied in combination. In a population of southern Brazilians, our data showed a significant influence of variant combinations of APOA1, SCARB1 and CETP genes on HDL-c levels.

Key words: Cholesterol, HDL/genetics; population/genetics; polymorphism, genetic; south region/Brazil.

Introduction

Epidemiologic studies have provided strong evidence that low concentrations of HDL cholesterol (HDL-C) are associated with increased risk of coronary artery disease (CAD)1. Therefore, the causes of low HDL-C levels have been intensively investigated, and genetic studies have focused on genes encoding for proteins that play important roles in the metabolism of HDL-C or in reverse cholesterol transport (RCT). Proteins in these groups include: apolipoproteins, such as A-I, A-II and E; enzymes, such as CETP, LCAT and LIPC; and membrane receptors, such as ABCA1 and SCARB1. When associated, these candidate genes are substantially polymorphic, and many studies have investigated the association of these polymorphisms with the risk of changes in lipid profiles. However, it remains unclear how these polymorphisms affect lipid profiles and whether this influence is found in different populations; this has not been studied in any South American population to this date. This study investigated the influence of seven polymorphisms of the CETP, APOA1, ABCA1 and SCARB1 genes on HDL-C levels in a southern Brazilian population.

Methods

Subjects

The population sample consisted of 500 individuals of European descent, as previously described2. The volunteers included in this sample were enrolled at two clinical centers of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul among individuals referred from several city health centers for routine blood tests. A questionnaire was used to collect data on drug intake and lifestyle variables, such as smoking, physical activity, alcohol consumption, oral contraceptive use, menopause, and anthropometric measurements. Smoking status was classified as non-smoker or current smoker; ex-smokers were excluded. All individuals gave their informed consent before inclusion in the study. Exclusion criteria were: pregnancy; secondary hyperlipidemia due to kidney, liver or thyroid disease; and diabetes or fasting blood glucose levels higher than 7 mmol/l3. Women on hormone replacement therapy and individuals taking lipid-lowering medications, beta-blockers or anti-inflammatory drugs were also excluded.

Participants were examined in the morning after a 12-hour fast. Weight was measured in subjects without shoes and with light clothing. Body height was measured without shoes, with heels placed together and the back to the wall. Body mass index (BMI) was calculated as weight/height2 (kg/m2). Waist circumference was measured at the smallest horizontal circumference between the 12th rib and the iliac crest.

Laboratory analyses

Blood samples were collected after a 12-hour fast. Total cholesterol, HDL cholesterol and triglycerides were measured at each Clinical Center using standard enzymatic methods4. LDL cholesterol levels were calculated using Friedwald's formula5. Glucose levels were also measured to ensure that no individuals with diabetes were included in the study. A salting-out procedure was used to extract DNA from blood samples6. DNA was amplified using PCR and oligonucleotide primers under the conditions previously described for CETP7, APOA18, ABCA19, and SCARB110. The amplification products were subsequently digested with the following restriction enzymes under conditions recommended by the manufacturer: Taq I (CETP - TaqIB), Msp I (APOA1 - g-75a and c+83t), Xag I (ABCA1 - Arg219Lys), Alu I (SCARB1 - Gly2Ser), ApaI (SCARB1 - c780t) and Hae III (SCARB1 - c1050t). Genotypes were determined after electrophoresis on agarose gels containing ethidium bromide, and a 100 bp ladder was used to score the band sizes.

Statistical analyses

Allele frequencies were estimated by gene counting. A c2 test for goodness of fit was used to check whether allele frequencies agreed with those expected according to Hardy-Weinberg equilibrium. Maximum-likelihood haplotype frequencies and linkage disequilibrium were estimated using the Arlequin 2000 software package11. SCARB1 and APOA1 gene haplotypes were determined using the method described by Long12.

Only 360 subjects were analyzed in the association study between SNPs and HDL-C levels because the full sets of data for the other individuals were not available. Multiple linear regressions were performed to adjust HDL-C levels using the backward stepwise method. Covariates entered in the first model were gender, age, waist, smoking, alcohol consumption, BMI, triglyceride levels and menopause, as well as all possible interaction terms. In the final model used for HDL-C adjustment, significant covariates that remained in the model were gender, age, BMI, triglyceride levels, triglyceride levels x age, post-menopausal status and triglyceride levels x menopause for women. Triglyceride levels were log-transformed to remove skewness. The sample was divided according to HDL-C tertiles, and heterogeneity between groups in contingency tables was tested using the c2 or the Fisher exact test. Logistic regressions were performed to obtain the odds ratio for each genetic variant or combination of variants. All analyses were made with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 11.0 for Windows.

Results

Table 1 shows the allele and genotype frequencies for the CETP, ABCA1 and SCARB1 genes, as well as the haplotype frequencies for the APOA1 gene. The haplotype frequencies of the SCARB1 gene are not shown because they did not influence HDL-C levels in any posterior analysis. All genotype frequencies are in Hardy-Weinberg equilibrium (data not shown). Strong linkage disequilibrium between the two variants of the APOA1 gene was detected (D'= -0.84, c2=10.04, p<0.001), and haplotype 1 (-75g/+83c) was the most common. For the SCARB1 gene, allele 780t was the most frequently found with 1050c, which indicated a significant disequilibrium (D'= - 0.44, c2=5.97, p=0.015). Gly2Ser was not linked to any of the other two variants investigated in this gene.

The prevalence of each haplotype of the APOA1 gene and the allele frequencies of the other variants under study were compared between the 1st and 3rd HDL-C tertiles adjusted for non-genetic variables (Table 2), and the clinical characteristics according to these groups are shown in Table 3. Although the difference was not statistically significant, haplotype 1 of the APOA1 gene, the TaqIB*1 allele of the CETP gene, and the 2Ser allele of the SCARB1 gene were more frequent in the 1st tertile (p=0.18, p=0.16 and p=0.29). When allele and haplotype frequencies were again compared between the first and the fourth HDL-C quartiles, the same trends were found, except for the Gly2Ser SNP of the SCARB1 gene, that had a smaller p value (p=0.14).

Based on these results, risk alleles for low HDL-C levels were selected from the statistical comparisons that yielded values of p lower than 0.25. These variants, labeled "risk variants", are shown in Table 4, which also shows how the carriers of these variants were analyzed later: whether as homozygous, or as heterozygous and homozygous carriers.

The frequency of individuals with genetic risk combinations for low HDL-C levels was compared between the 1st and 3rd HDL-C tertiles (Table 5). First, the carriers of combinations of two deleterious variants were evaluated, as shown in Table 4, and then the frequency of carriers of combinations of three deleterious variants was compared. These comparisons showed that being a carrier of risk variants of the APOA1 and CETP genes increased 2.4 times the chance of having HDL-C levels below 39.8 mg/dl (p=0.005). When in addition to this combination the participant also carried the risk allele of the SCARB1 gene, this chance was 2.26 times greater (p=0.008). Although this gene did not seem to change the risk of having low HDL-C levels, this may be a result of the fact that only a small number of carriers had this triple combination. When SCARB1 was analyzed in combinations with CETP and APOA1, borderline results were found (OR=1.6, p=0.08), which was not observed when the CETP and APOA1 genes were evaluated separately (Table 2).

Discussion

Allele frequencies found in this study are mostly similar to those detected in studies with different populations. For the CETP gene, the prevalence of 35.7% for the rare allele is slightly lower than that detected in populations of exclusive European descent, which was about 40%13-17. In the ABCA1 gene, the values found for the Arg219Lys SNP were within the range of variation found in other populations of European descent: from 25% for Germans to 38.5% for North Americans9,18-21. Similar results were found for the APOA1 gene when compared with values from other populations of European descent22. Our data on the SCARB1 gene are comparable with those reported in the few studies published to this date, but the 17% allele frequency found in our study for intron 5 SNP and the 29.3% for the exon 8 variant are slightly different from the frequencies found by Richard et al23 for North Americans (9% and 49%) and by Acton et al10 for a Spanish population (10.5% and 43.8%). Our analysis of the exon 1 variant showed that the frequency of our rare allele was slightly lower than that found in a Spanish population10. These differences may reflect differences in the ethnic composition of the populations under comparison.

The pattern of linkage disequilibrium between the variants of the APOA1 gene was similar to those found in the literature24. In our population, no linkage disequilibrium was found between exon 1 SNP of the SCARB1 gene and the other SNPs under study according to findings reported for other populations10,25,26. However, the pattern of linkage disequilibrium between the intron 5 and exon 8 SNPs differ depending on the population under study: in Spanish10 and North American25 populations, the intron 5 rare variant was linked to the exon 8 common variant, which was the same that was found in our population. However, in an Austrian sample and in a different population sample in the United States, the two common alleles were linked23,26.

When evaluated separately, our data did not show any significant influence of the polymorphisms under study on HDL-C levels (Table 4). Three of the variants under study had allele frequencies that were very similar in the comparison between the 1st and 3rd tertiles. Two of them are SCARB1 gene polymorphisms, found at intron 5 and exon 8, and the scarce data about them in the literature have not demonstrated their influence on HDL-C levels10,25-28 nor indicated any associations with sex and use of hormones23,28,29. Moreover, no influence of the Arg219Lys variant on the ABCA1 gene was found in several studies with different populations20,21,30.

We selected polymorphisms of the genes CETP, APOA1 and SCARB1 for a combined evaluation. Although some authors detected isolated effects of these genes on HDL-C levels, several other studies found that the influence of these genes is too weak to be detected when they are evaluated separately13,26,31,32.

These differences in the magnitude of a genetic influence may reflect differences between the genetic composition of each population, as well as environmental differences between them. The evaluation of combined gene effects on HDL-C levels is rare in the literature, which makes comparison of data difficult. The evaluation of two or three risk variants revealed a significant influence of variants of the APOA1, CETP and SCARB1 genes on HDL-C levels. This finding is in agreement with studies of APOA1 and CETP genes in other populations8,33-37. However, for the Gly2Ser SNP of the SCARB1 gene, the few studies conducted so far associated the presence of the 2Gly allele with a decrease in HDL-C levels. In our population, the combination of the 2Ser allele and variants of APOA1 and CETP genes was more frequent in the participants with lower HDL-C levels (Table 5). Two other authors25,27 did not detect any significant influence of this allele on HDL-C levels. Therefore, the role of this polymorphism should be further investigated, and we cannot rule out the possibility that it acts as a marker of another variant not yet studied, although it is an exchange of amino acids. The confirmation of this hypothesis would explain the differences between our data and findings reported by Acton et al10.

The physiologic roles of these three proteins are closely associated: CETP is a key enzyme in HDL metabolism38, whereas SR-BI and apoAI act as receptor and ligand of HDL-C39,40. Therefore, the interaction detected may be understood when analyzed in association with HDL-C metabolism and absorption path.

This study detected genetic influences on HDL-C levels, but it had some limitations. Major problems were the small sample size for the association study and the fact that data were missing for 140 patients. Therefore, less evident genetic influences, which can only be detected when a larger sample size is used, might not have been detected. Moreover, a prospective study of the influence of allelic combinations should be conducted to confirm the clinical impact of these genes on the lipid profile of our population.

The direction of the genetic influence on HDL-C levels seems to be, in most cases, independent of genetic background or environmental variations, but the magnitude of this effect differs greatly between different populations. Any multifactorial characteristic is influenced by several loci; therefore, analyses of interactions between genes should be conducted, even if their separate effects cannot be detected, because that may be the only way to evaluate their actual genetic role in each population.

Acknowledgements

We thank Maria Perpetua de Oliveira Pinto for technical assistance, and Marcel Arsand and Fabiano Roldão for help in sample collection. Financial support was provided by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil), Programa de Apoio a Nucleos de Excelência (PRONEX, Brazil) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Brazil).

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq, CAPES, PRONEX e FAPERGS.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Fabiana Michelsen de Andrade, from Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

References

Artículos Originales Influencia de combinaciones genéticas en los niveles de HDL-c en una población del sur del Brasil

FUNDAMENTO: Bajos niveles de HDL-c son importantes predictores de enfermedad coronaria, la primera causa de muerte en todo el mundo. Muchos factores afectan los niveles de HDL-c, tales como los polimorfismos de genes que codifican proteínas-clave para la vía de transporte reverso de colesterol. OBJETIVO: Investigar la influencia de siete polimorfismos de los genes CETP, APOA1, ABCA1 y SCARB1 genes en los niveles de HDL-c en una población de la región sur del Brasil. MÉTODOS: Los polimorfismos fueron investigados en una muestra de 500 individuos de descendencia europea, pero los niveles de HDL-c de solamente 360 individuos fueron ajustados para cofactores usando regresión lineal múltiple en el estudio de asociación. La muestra fue dividida en terciles de acuerdo con los niveles ajustados de HDL-c y frecuencias de alelos y haplotipos fueron comparadas entre el 1º y el 3º terciles de los niveles ajustados de HDL-c. RESULTADOS: Cuando las combinaciones de los alelos de riesgo fueron probadas, la frecuencia de combinaciones alélicas en tres genes (haplotipo 1 del gen APOA1, variante 2S del gen SCARB1, y alelo B1 del gen CETP) fue significativamente más alta en el tercil inferior de los niveles ajustados de HDL-c (28,3%) que en el tercil superior (14,9%; p=0,008), lo que indica que la presencia de esas variantes aumentó 2,26 veces la posibilidad de tener niveles de HDL-C < 39,8 mg/dl. CONCLUSIÓN: Se espera que esos marcadores, cuando sean estudiados separadamente, tengan una pequeña influencia en la característica que está siendo analizada, pero una influencia mayor fue detectada cuando los marcadores fueron estudiados en combinación. En una población de la región sur del Brasil, nuestros datos mostraron una influencia significativa de las combinaciones de las variantes de los genes APOA1, SCARB1 y CETP en los niveles de HDL-c.

 Colesterol HDL población polimorfismo genético región sur

ARTÍCULO ORIGINAL

Fabiana Michelsen de AndradeI; Marilu FiegenbaumII, III; Silvana de AlmeidaIII; Mara Helena HutzIV

IUniversidade Feevale, Porto Alegre, RS - Brasil

IICentro Universitário Metodista IPA, Porto Alegre, RS - Brasil

IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS - Brasil

IVUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: Bajos niveles de HDL-c son importantes predictores de enfermedad coronaria, la primera causa de muerte en todo el mundo. Muchos factores afectan los niveles de HDL-c, tales como los polimorfismos de genes que codifican proteínas-clave para la vía de transporte reverso de colesterol.

OBJETIVO: Investigar la influencia de siete polimorfismos de los genes CETP, APOA1, ABCA1 y SCARB1 genes en los niveles de HDL-c en una población de la región sur del Brasil.

MÉTODOS: Los polimorfismos fueron investigados en una muestra de 500 individuos de descendencia europea, pero los niveles de HDL-c de solamente 360 individuos fueron ajustados para cofactores usando regresión lineal múltiple en el estudio de asociación. La muestra fue dividida en terciles de acuerdo con los niveles ajustados de HDL-c y frecuencias de alelos y haplotipos fueron comparadas entre el 1º y el 3º terciles de los niveles ajustados de HDL-c.

RESULTADOS: Cuando las combinaciones de los alelos de riesgo fueron probadas, la frecuencia de combinaciones alélicas en tres genes (haplotipo 1 del gen APOA1, variante 2S del gen SCARB1, y alelo B1 del gen CETP) fue significativamente más alta en el tercil inferior de los niveles ajustados de HDL-c (28,3%) que en el tercil superior (14,9%; p=0,008), lo que indica que la presencia de esas variantes aumentó 2,26 veces la posibilidad de tener niveles de HDL-C < 39,8 mg/dl.

CONCLUSIÓN: Se espera que esos marcadores, cuando sean estudiados separadamente, tengan una pequeña influencia en la característica que está siendo analizada, pero una influencia mayor fue detectada cuando los marcadores fueron estudiados en combinación. En una población de la región sur del Brasil, nuestros datos mostraron una influencia significativa de las combinaciones de las variantes de los genes APOA1, SCARB1 y CETP en los niveles de HDL-c.

Palabras clave: Colesterol HDL/genética, población/genética, polimorfismo genético, región sur/Brasil.

Introducción

Estudios epidemiológicos han mostrado fuertes evidencias de que niveles bajos de lipoproteína de alta densidad (HDL-c) están asociados con aumento del riesgo de enfermedad arterial coronaria (EAC)1. Siendo así, las causas de los bajos niveles de HDL-c han sido intensivamente investigadas y estudios genéticos se han concentrado en los genes que codifican las proteínas que tienen un papel importante en el metabolismo del HDL-c o en el transporte reverso del colesterol (TRC). Las proteínas en esos grupos incluyen: apolipoproteínas, tales como LA-I, LA-II y Y; enzimas, tales como CETP, LCAT y LIPC; y receptores de membrana, tales como ABCA1 y SCARB1. Cuando son asociados, esos genes candidatos son sustancialmente polimórficos y muchos estudios han investigado la asociación de esos polimorfismos con el riesgo de alteraciones en los perfiles lipídicos. Entre tanto, aun precisa ser aclarado si esos polimorfismos afectan los perfiles lipídicos y si esa influencia es encontrada en diferentes poblaciones; lo que no fue investigado en ninguna población sudamericana hasta hoy.

Este estudio investigó la influencia de siete polimorfismos de los genes CETP, APOA1, ABCA1 y SCARB1 en los niveles de HDL-c en una población de la región sur del Brasil.

Métodos

Individuos

La muestra poblacional consistió en 500 individuos de ascendencia europea, como fue anteriormente descripto2. Los voluntarios incluidos en esa muestra fueron invitados a participar del estudio en dos centros clínicos de la Universidad Federal de Rio Grande do Sul entre individuos que fueron encaminados a varios centros de salud para exámenes de sangre de rutina. Un cuestionario fue utilizado para colectar datos sobre uso de medicamentos y variables relacionadas al estilo de vida, tales como tabaquismo, actividad física, etilismo, uso de anticonceptivos orales, menopausia y medidas antropométricas. El tabaquismo fue clasificado como no-fumante o fumante actual; ex-fumantes fueron excluidos. Todos los individuos dieron su consentimiento libre e informado antes de ser incluidos en el estudio. Los criterios de exclusión fueron: gravidez, hiperlipidemia secundaria debido a enfermedad renal, hepática o tiroidea; y diabetes o niveles de glucemia de ayuno > 7 mmol/l3. Mujeres recibiendo terapia de reposición hormonal e individuos recibiendo medicamentos hipolipemiantes, betabloqueaantes o antiinflamatorios también fueron excluidos.

Los participantes fueron examinados por la mañana después de un ayuno de 12 horas. El peso fue medido sin zapatos y con ropas leves. La altura fue medida sin zapatos, con los talones juntos y con el dorso recostado en la pared. El índice de masa corporal (IMC) fue calculado como peso/altura2 (kg/m2). La circunferencia de la cintura (CC) fue medida en la menor circunferencia horizontal entre la 12ª costilla y la cresta ilíaca.

Análisis de laboratorio

Las muestras de sangre fueron colectadas después de un ayuno de 12 horas. Colesterol total (CT), lipoproteína de alta densidad colesterol (HDL-c) y triglicéridos (TG) fueron dosados en cada centro clínico usando métodos enzimáticos estandarizados4. Los niveles de lipoproteína de baja densidad colesterol (LDL-c) fueron calculados usando la fórmula de Friedwald5. Los niveles de glucemia también fueron dosados para asegurar que ningún individuo con diabetes haya sido incluido en el estudio.

La técnica de salting-out fue utilizada para extraer el ADN de las muestras de sangre6. El ADN fue amplificado utilizándose PCR y primers oligonucleotídos bajo las condiciones previamente descriptas para CETP7, APOA18, ABCA19 y SCARB110. Los productos de la amplificación fueron subsecuentemente digeridos con las siguientes enzimas de restricción bajo las condiciones recomendadas por el fabricante: Taq I (CETP - TaqIB), Msp I (APOA1 - g-75a y c+83t), Xag I (ABCA1 - Arg219Lys), Alu I (SCARB1 - Gly2Ser), ApaI (SCARB1 - c780t) y Hae III (SCARB1 - c1050t). Los genotipos fueron determinados después de la realización de electroforesis en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio y un marcador de 100 pb fue usado para determinar los tamaños de las bandas.

Análisis estadístico

Las frecuencias alélicas fueron estimadas por el método de conteo de genes. Un test c2 para "goodness of fit" fue utilizado para verificar si las frecuencias alélicas eran las esperadas de acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg. Las frecuencias de haplotipos de máxima verosimilitud y el desequilibrio de ligazón fueron estimados usando el software Arlequin 200011. Los haplotipos de los genes SCARB1 y APOA1 fueron determinados usando el método descripto por Long12.

Apenas 360 individuos fueron analizados en el estudio de asociación entre SNPs y niveles de HDL-c, por que los datos completos de los otros individuos no estaban disponibles. Regresiones lineales múltiples fueron realizadas para ajustar los niveles de HDL-c usando el método backward stepwise. Las covariantes incluidas en el primer modelo fueron sexo, edad, CC, tabaquismo, etilismo, IMC, niveles de triglicéridos (TG) y menopausia, así como todos los términos de interacción posibles. En el modelo final usado para el ajuste de los niveles de HDL-c, las covariantes significativas que permanecieron en el modelo fueron sexo, edad, IMC, niveles de TG, niveles de TG x edad, estado post-menopausia y niveles de TG x menopausia para mujeres. Los niveles de TG fueron log-transformados para remoción de asimetría en la distribución. La muestra fue dividida de acuerdo con los terciles de HDL-c y la heterogeneidad entre los grupos en tablas de contingencia fue probada usando el Test c2 o Test Exacto de Fisher. Las regresiones logísticas fueron realizadas para obtener el odds ratio (OR) para cada variante genética o combinación de variantes. Todos los análisis fueron realizados con el software Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versión 11.0 para Windows.

Resultados

La Tabla 1 muestra las frecuencias de alelos y genotipos para los genes CETP, ABCA1 y SCARB1 genes, así como las frecuencias de haplotipos para el gen APOA1. Las frecuencias de haplotipos del gen SCARB1 no son mostradas por que ellas no influenciaron los niveles de HDL-c en cualquier análisis posterior. Todas las frecuencias genotípicas están en equilibrio de Hardy-Weinberg (datos no mostrados). Un fuerte desequilibrio de ligazón entre las dos variantes del gen APOA1 fue detectado (D´= -0,84, c2=10,04, p<0,001) y el haplotipo 1 (-75g/+83c) fue el más común. Para el gen SCARB1, el alelo 780t fue el más frecuentemente encontrado con 1050c, indicando un desequilibrio significativa (D´= - 0,44, c2=5,97, p=0,015). Gly2Ser no estuvo ligado a ninguna de las otras dos variantes investigadas en ese gen.

La prevalencia de cada haplotipo del gen APOA1 y las frecuencias alélicas de las otras variantes del estudio fueron comparadas entre el 1º y el 3º terciles de HDL-c ajustado para variables no-genéticas (Tabla 2) y las características clínicas de acuerdo con esos grupos son mostradas en la Tabla 3. Aunque la diferencia no haya sido estadísticamente significativa, el haplotipo 1 del gen APOA1, el alelo TaqIB*1 del gen CETP, y el alelo 2Ser del gen SCARB1 fueron más frecuentes en el 1º tercil (p=0,18, p=0,16 y p=0,29). Cuando las frecuencias de alelos y haplotipos fueron nuevamente comparadas entre el 1º y el 4º cuartiles de HDL-c, las mismas tendencias fueron encontradas, excepto por el Gly2Ser SNP del gen SCARB1, que tenía un valor de p menor (p=0,14).

Con base en esos resultados, los alelos de riesgo para bajos niveles de HDL-c fueron seleccionados a partir de las comparaciones estadísticas que resultaron en valores de p < 0,25. Esas variantes, llamadas de "variantes de riesgo", son mostradas en la Tabla 4, que también muestra como los portadores de esas variantes fueron analizados posteriormente: como portadores homocigotos, o como portadores heterocigotos y homocigotos.

La frecuencia de individuos con combinaciones de riesgo genético para bajos niveles de HDL-c fue comparada entre el 1º y el 3º terciles de HDL-c (Tabla 5). Primero, los portadores de combinaciones de dos variantes deletéreas fueron evaluados, como es mostrado en la Tabla 4 y entonces la frecuencia de los portadores de combinaciones de tres variantes deletéreas fue comparada. Esas comparaciones mostraron que ser un portador de variantes de riesgo de los genes APOA1 y CETP aumentó en 2,4 veces la posibilidad de tener niveles de HDL-c < 39,8 mg/dl (p=0,005). Cuando, además de esa combinación, el individuo también es portador del alelo de riesgo del gen SCARB1, esa posibilidad era 2,26 veces mayor (p=0,008). Aunque ese gen no parezca alterar el riesgo de presentar bajos niveles de HDL-c, eso puede ser el resultado del hecho de que apenas un pequeño número de portadores cargan esa combinación triple. Cuando el gen SCARB1 fue analizado en combinaciones con los genes CETP y APOA1, resultados limítrofes fueron encontrados (OR=1,6, p=0,08), lo que no fue observado cuando los genes CETP y APOA1 genes fueron evaluados separadamente (Tabla 2).

Discusión

Las frecuencias alélicas encontradas en ese estudio son en su mayoría similares a aquellas detectadas en estudios con diferentes poblaciones. Para el gen CETP, la prevalencia de 35,7% para el alelo raro es levemente menor que aquella detectada en poblaciones de ascendencia europea exclusivamente, que fue de aproximadamente 40%13-17. En el gen ABCA1, los valores encontrados para el SNP Arg219Lys estuvieron dentro de los limites de variación encontrados en otras poblaciones de ascendencia europea: de 25% para alemanes a 38% para norte-americanos9,18-21. Resultados similares fueron encontrados para el gen APOA1 cuando fue comparado con valores para otras poblaciones de ascendencia europea22. Nuestros datos sobre el gen SCARB1 son comparables a aquellos relatados en algunos pocos estudios publicados hasta hoy, pero la frecuencia alélica de 17% encontrada en el estudio para el SNP del intron 5 y la frecuencia de 29,3% para la variante del exon 8 son levemente diferentes de las frecuencias encontradas por Richard et al23 para norteamericanos (9% y 49%) y por Acton et al10 para una población española (10,5% y 43,8%). Nuestro análisis de la variante en el exon 1 mostró que la frecuencia del alelo raro fue levemente más baja que aquella encontrada en una población española10. Esas diferencias pueden reflejar diferencias en la composición étnica de las poblaciones comparadas.

El estándar del desequilibrio de ligazón entre las variantes del gen APOA1 fue similar a aquel encontrado en la literatura24. En nuestra población, ningún desequilibrio de ligazón fue encontrado entre el SNP del exon 1 del gen SCARB1 y los otros SNPs del estudio, de acuerdo con los hallazgos relatados para otras poblaciones10,25,26. Entre tanto, el estándar de ligazón de desequilibrio entre los SNPs del intron 5 y exon 8 difieren dependiendo de la población estudiada: en las poblaciones española10 y norteamericana25, la variante rara del intron 5 estuvo ligada a la variante común del exon 8, que fue el mismo encontrado en otras poblaciones. Entre tanto, en una muestra poblacional de Austria y en una muestra poblacional diferente de los EUA, los dos alelos comunes estuvieron ligados23,26.

Cuando fueron evaluados separadamente, nuestros datos no mostraron ninguna influencia significativa de los polimorfismos estudiados en los niveles de HDL-c (Tabla 4). Tres de las variantes estudiadas tenían frecuencias alélicas similares en la comparación entre el 1º y el 3º terciles. Dos de ellas son polimorfismos del gen SCARB1, encontrados en el intron 5 y exon 8, y los pocos datos sobre ellos en la literatura no muestran ninguna influencia sobre los niveles de HDL-c10,25-28, ni indican ninguna asociación con el sexo y uso de hormonas23,28,29. Además de eso, ninguna influencia de la variante Arg219Lys en el gen ABCA1 fue encontrada en varios estudios con diferentes poblaciones20,21,30.

Seleccionamos polimorfismos de los genes CETP, APOA1 y SCARB1 para una evaluación combinada. Aunque algunos autores hayan detectado efectos aislados de esos genes en los niveles de HDL-c, varios otros estudios descubrieron que la influencia de esos genes es muy débil para ser detectada cuando son evaluados separadamente13,26,31,32.

Esas diferencias en la magnitud de una influencia genética pueden reflejar diferencias entre la composición genética de cada población, así como las diferencias ambientales entre ellas. La evaluación del efecto combinado de genes en los niveles de HDL-c es rara en la literatura, lo que vuelve la comparación de datos difícil. La evaluación de dos o tres variantes de riesgo reveló una influencia significativa de las variantes de los genes APOA1, CETP y SCARB1 en los niveles de HDL-c. Ese hallazgo está de acuerdo con estudios de los genes APOA1 y CETP en otras poblaciones8,33-37. Entre tanto, para el SNP Gly2Ser del gen SCARB1, los pocos estudios conducidos hasta ahora asociaron la presencia del alelo 2Gly con una disminución en los niveles de HDL-c. En nuestra población, la combinación del alelo 2Ser y las variantes de los genes APOA1 y CETP fue más frecuente en los participantes con niveles más bajos de HDL-c (Tabla 5). Dos otros autores25,27 no detectaron ninguna influencia significativa de ese alelo sobre los niveles de HDL-c. De esa forma, el papel de ese polimorfismo debe ser investigado en otros estudios y no podemos descartar la posibilidad de que actúe como marcador de otra variante aun no estudiada, aunque sea un intercambio de aminoácidos. La confirmación de esa hipótesis explicaría las diferencias entre nuestros datos y los hallazgos relatados por Acton et al10.

Los papeles fisiológicos de esas tres proteínas están íntimamente asociados: CETP es una enzima-clave en el metabolismo de HDL38, en cuanto SR-BI y apoAI actúan como receptor y ligante del HDL-c39,40. De esa forma, la interacción detectada puede ser entendida cuando es analizada en asociación con el metabolismo y vía de absorción del HDL-c.

El presente estudio detectó influencias genéticas en los niveles de HDL-c, pero presentó algunas limitaciones. Los mayores problemas fueron el pequeño tamaño de la muestra para el estudio de asociación y el hecho de que no había datos disponibles para 140 pacientes. De esa forma, influencias genéticas menos evidentes, que pueden ser detectadas apenas en una muestra mayor, pueden haber sido perdidas. Además de eso, un estudio prospectivo de la influencia de las combinaciones alélicas debe ser realizado para confirmar el impacto clínico de esos genes en el perfil lipídico de nuestra población.

La dirección de la influencia genética en los niveles de HDL-c parece ser, en la mayoría de los casos, independiente del background genético o de variaciones ambientales, pero la magnitud de ese efecto difiere grandemente entre diferentes poblaciones. Cualquier característica multifactorial es influenciada por varios loci; de esa forma, análisis de interacciones entre genes deben ser realizadas, pues pueden ser la única forma de evaluar su real papel genético en cada población.

Agradecimientos

Agradecemos a Maria Perpetua de Oliveira Pinto por su auxilio técnico y Marcel Arsand y Fabiano Roldão por su ayuda en la recolección de la muestra. Agradecemos al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico y Tecnológico (CNPq, Brasil), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX, Brasil) y Fundación de Amparo a la Pesquisa del Estado de Rio Grande do Sul (FAPERGS, Brasil) por el apoyo financiero.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiamiento

El presente estudio fue financiado por el CNPq, CAPES, PRONEX y FAPERGS.

Vinculación Académica

Este artículo es parte de tesis de Doctorado de Fabiana Michelsen de Andrade por la Universidad Federal de Rio Grande do Sul.

Referencias