FUNDAMENTO: O tratamento da insuficiência cardíaca (IC) conta atualmente com diversos tipos de intervenções. Dentre elas, destacam-se a terapia com betabloqueadores (BB) e o treinamento físico (TF). Contudo, os efeitos da associação dessas terapias são pouco estudados. OBJETIVO: Verificar os efeitos do tratamento com BB, metoprolol (M) e carvedilol (C) associados ao TF na IC em camundongos. MÉTODOS: Utilizamos modelo genético de IC induzida em camundongos por hiperatividade simpática. Inicialmente, dividimos os animais com IC em: sedentários (S); treinados (T); tratados com M (138 mg/kg) (M) ou C (65 mg/kg) (C). Na segunda parte, dividimos os grupos em S; treinado e tratado com M (MT) e treinado e tratado com C (CT). O TF consistiu em treinamento aeróbico em esteira por 8 semanas. A tolerância ao esforço foi avaliada por teste progressivo máximo e a fração de encurtamento foi avaliada (FE) por ecocardiografia. O diâmetro dos cardiomiócitos e a fração de colágeno foram avaliados por meio de análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA de um caminho com post hoc de Duncan. O nível de significância foi considerado p < 0,05. RESULTADOS: Destacando FE e remodelação cardíaca, verificamos que, isoladamente, T, M e C apresentaram melhora das variáveis. Na associação, após o período de intervenção, observamos aumento da tolerância ao esforço em MT e CT (43,0% e 33,0%, respectivamente). Houve também redução do diâmetro dos cardiomiócitos (10,0% e 9,0%, respectivamente) e da fração de colágeno (52,0% e 63,0%), após a intervenção. Porém, somente CT melhorou significantemente a FE. CONCLUSÃO: A associação do TF às terapias com M ou C proporcionou benefícios sobre a função e remodelação cardíaca em camundongos com IC.
ARTIGOS ORIGINAIS
FISIOLOGIA
Associação de betabloqueadores e treinamento físico na insuficiência cardíaca de camundongos
IEscola de Educação Física da Universidade de São Paulo
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP)
IIIUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP - Brasil
A insuficiência cardíaca é a via final comum para diversas doenças cardiovasculares, constituindo-se em uma síndrome caracterizada por sinais e sintomas relacionados à perfusão tecidual inadequada1 e ao excesso de catecolaminas2. De acordo com a visão hemodinâmica, a síndrome da insuficiência cardíaca está associada a um baixo débito cardíaco, com consequente baixo fluxo renal, levando à retenção de sódio e água e ao surgimento de edemas periférico e pulmonar3. Outra característica comum da insuficiência cardíaca é a remodelação cardíaca associada à perda de cardiomiócitos e ao aumento da fração de colágeno4,5.
Nas duas últimas décadas, houve notório progresso no tratamento da IC. A introdução dos agentes betabloqueadores e dos inibidores do sistema renina-angiotensina-aldosterona provocou uma nítida mudança no comportamento clínico dos pacientes, bem como trouxe a perspectiva de índices de sobrevida mais promissores. Ensaios clínicos mostraram reduções relevantes da mortalidade como nunca apresentado anteriormente no tratamento da IC6-10.
As possibilidades de otimização terapêutica e clínica ampliam-se quando medidas não farmacológicas, tais como dieta e atividade física regular, são associadas ao tratamento farmacológico convencional. De fato, o treinamento físico aeróbico tem sido cada vez mais adotado e seus benefícios incluem melhora na qualidade de vida do paciente e tolerância a esforços físicos, além da redução na hiperatividade de sistemas neuro-humorais que está diretamente relacionada à melhora na sobrevida do paciente11 e no balanço autonômico12-14.
Em estudos anteriores do nosso laboratório, demonstramos que a terapia com o betabloqueador carvedilol reduziu significantemente a atividade nervosa simpática em pacientes com IC15, e, mais recentemente, demonstramos que a terapia não farmacológica com o treinamento físico aeróbio provocou redução adicional na atividade simpática de pacientes com IC que já estavam sob terapia com o betabloqueador carvedilol16. Esses resultados sugerem que a associação do treinamento físico aeróbico ao betabloqueador é capaz de otimizar a redução na hiperatividade de sistemas neuro-humorais.
No presente estudo, utilizamos um modelo genético de IC induzida por hiperatividade simpática em camundongos para estudar o efeito da associação dos betabloqueadores metoprolol ou carvedilol ao treinamento físico aeróbico sobre a função e a estrutura cardíacas.
Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57/BL6 com inativação gênica dos receptores α2A/α2C adrenérgicos (α/α2CARKO), na faixa etária compreendida entre os 5-7 meses de vida, provenientes do Biotério da Escola de Educação Física e Esporte da USP (n = 35). Esses camundongos desenvolvem sinais clínicos de IC como edema pulmonar associado à disfunção ventricular grave aos 7 meses de idade, quando a taxa de mortalidade é de 50,0%12,17. A inativação gênica dos receptores α2A e α2C adrenérgicos leva à elevação na liberação de noradrenalina circulante18,19, sendo, portanto, a IC observada neste modelo devido à hiperatividade do sistema nervoso simpático.
O presente estudo foi aprovado no Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da USP (897/06).
Numa primeira etapa do nosso trabalho, com o intuito de avaliar o efeito das terapias isoladas sobre as variáveis analisadas, dividimos os animais aleatoriamente em α2A/α2CARKO sedentário (S); α2A/α2CARKO treinado (T); α2A/α2CARKO tratado com metoprolol (M) α2A/α2CARKO tratado com carvedilol (C). Após conhecermos o efeito isolado dos tratamentos, avaliamos o efeito das terapias associadas e, para isso, os animais foram subdivididos aleatoriamente nos seguintes subgrupos: α2A/α2CARKO sedentário (S); α2A/α2CARKO treinado e tratado com metoprolol (MT) e grupo α2A/α2CARKO treinado e tratado com carvedilol (CT).
Camundongos controle sem IC (WT) são apresentados nas figuras do estudo com uma linha tracejada para que se observe o valor esperado em grupo controle sem insuficiência cardíaca.
Os tratamentos foram realizados via gavagem e as doses utilizadas foram anteriormente testadas a fim de se ajustar e de se obter doses equipotentes na redução da frequência cardíaca dos animais, 135 mg/kg e 68 mg/kg para metoprolol e carvedilol, respectivamente20,21.
O peso corporal foi acompanhado semanalmente em balança semianalítica (Gehaka, BG 400 - São Paulo, SP, Brasil)
A intolerância à realização de esforços foi estimada nos grupos estudados por meio da quantificação da capacidade máxima de realização do exercício físico (tempo total do teste em segundos) através de um teste progressivo escalonado até a exaustão, constatada quando o animal não conseguia manter a corrida, em esteira rolante (confeccionada por serviço autônomo da Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, Brasil) com velocidade inicial de 3 m/min e aumento de 3 m/min a cada 3 min12.
Os grupos de animais treinados foram submetidos a um programa de treinamento físico aeróbico em esteira rolante durante 8 semanas (dos 5 aos 7 meses de idade). As sessões de exercício foram realizadas 5 vezes por semana, com duração de 60 minutos por sessão e intensidade de 60,0% da velocidade máxima verificada no teste progressivo até a exaustão, que, conforme observamos em estudo anterior, corresponde ao máximo estado estável do lactato22, ou seja, corresponde à máxima intensidade de exercício físico onde há um equilíbrio entre a produção e a remoção do lactato sanguíneo durante o exercício prolongado.
Foi realizada a medida indireta da pressão arterial pelo método de pletismografia de cauda ao longo das 8 semanas de intervenção (
O exame ecocardiográfico transtorácico foi realizado antes e após o período de intervenção em todos os grupos estudados. O exame ecocardiográfico foi realizado com os animais anestesiados por meio do anestésico halotano 1,0%, com fluxo 1 l/min de O2 misturado ao anestésico. Foi utilizado o ecocardiógrafo (Acuson Corporation, Sequoia 512 - Mountain View, CA, EUA), com transdutor de 15 MHz. As imagens foram feitas com uma frequência de 14 MHz. A partir da visibilização do ventrículo esquerdo (corte transversal) ao nível dos músculos papilares, foi realizado o modo M e as medidas do diâmetro diastólico (DDVE) e sistólico (DSVE) do ventrículo esquerdo foram obtidas e utilizadas para o cálculo da fração de encurtamento (FS). A fórmula utilizada foi: FS = (DDVE - DSVE) / DDVE. O ecocardiografista (R. S.) estava cego para o genótipo e para o tipo de tratamento dos animais.
Após 48 horas de fixação em formalina tamponada (4,0%), o ventrículo esquerdo foi submetido ao processamento histológico habitual, com cortes de 2 micra e coloração por hematoxilina-eosina ou picrossírius
A fração do volume de colágeno foi calculada pela razão percentual da área do tecido miocárdico corado positivamente para as fibras colágenas (quantidade absoluta de colágeno) e a área total do tecido miocárdico em cada região ventricular examinada (quantidade absoluta de colágeno e miócitos), campo a campo. Um número de 15 a 20 campos foi examinado para cada um dos animais13,20,21,23,24.
Todas as variáveis estudadas apresentaram distribuição normal, analisada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk e, portanto, a análise estatística paramétrica foi utilizada. Os dados estão representados na forma de média ± erro padrão da média.
As variáveis estudadas foram comparadas entre os grupos pela análise de variância (ANOVA) de um caminho (diâmetro transverso dos cardiomiócitos e fração de volume de colágeno) ou um caminho com medidas repetidas (tolerância ao esforço, fração de encurtamento e frequência cardíaca). Para a mortalidade, foi utilizada a análise de
Na
Em relação aos efeitos na estrutura cardíaca, o treinamento físico isoladamente não proporcionou redução significantiva do diâmetro transverso dos cardiomiócitos, contudo, teve efeitos similares às terapias farmacológicas na redução da fração de colágeno cardíaco (
Durante o período experimental, a massa corporal dos animais foi avaliada semanalmente. Observamos que os animais α2A/α2CARKO apresentavam inicialmente uma massa corporal menor que os animais do grupo controle WT (22,2 ± 1,3 g
Avaliamos adicionalmente a curva de mortalidade durante o período de intervenção e não observamos diferença significante entre os grupos (40,0%
Na
Cabe ressaltar que a tolerância ao esforço nos animais α2A/α2CARKO alcançou os valores observados nos camundongos controle sem IC (
Como se pode observar na
Após o período de 8 semanas de intervenção, apenas o grupo α2A/α2CARKO treinado e tratado com carvedilol (CT) melhorou significantemente os valores de fração de encurtamento (
A avaliação morfométrica cardíaca revelou que ambos os betabloqueadores associados ao treinamento físico foram igualmente eficazes em reduzir significantemente o diâmetro transverso dos cardiomiócitos (10,0% e 9,0% para os grupos treinados e tratados com metoprolol e carvedilol, respectivamente) e a fração de colágeno cardíaco (52,0% e 63,0% para os grupos treinados e tratados com metoprolol e carvedilol, respectivamente), o que sugere um possível efeito de remodelação cardíaca reversa associada aos efeitos combinados de ambos betabloqueadores ao treinamento físico (
Nos camundongos que constituem tal modelo de cardiomiopatia induzida por hiperatividade simpática, assim como na IC clínica, é muito comum a observação dos sinais clínicos, como a intolerância aos esforços, o edema pulmonar, a diminuição da função cardíaca e a remodelação cardíaca. É importante salientar que, mesmo não se estabelecendo uma relação causa-efeito sobre a hiperatividade simpática na insuficiência cardíaca clínica, o desequilíbrio autonômico tem importante papel no prognóstico do paciente, o que torna o modelo de camundongos utilizado no presente estudo mais interessante, pois, possibilita estudar o efeito direto da hiperatividade simpática na IC.
Feito esse adendo, os principais resultados deste estudo em camundongos com IC induzida por hiperatividade simpática foram que:
1) Ambos metoprolol e carvedilol, quando associados ao treinamento físico, melhoraram de maneira similar à tolerância aos esforços e reduziram de maneira equipotente a taquicardia de repouso;
2) O treinamento físico e as terapias farmacológicas isoladamente, além da associação do carvedilol ao treinamento físico, melhoraram significantemente a fração de encurtamento;
3) Ambos metoprolol e carvedilol associados ao treinamento físico reduziram similarmente a fração de volume de colágeno cardíaco e o diâmetro transverso dos cardiomiócitos.
Anteriormente, mostramos que o treinamento físico melhora a fração de encurtamento na insuficiência cardíaca por melhora no transiente de cálcio e do perfil de expressão das proteínas que regulam o fluxo de Ca2+ intracelular13,23. Além disso, mostramos também que o carvedilol é mais eficaz em reduzir o estresse oxidativo do que em melhorar o transiente de Ca2+ cardíaco20. Portanto, essa combinação pode potencializar os efeitos benéficos de ambas as terapias sobre a função cardíaca. Já a associação do metoprolol com o treinamento físico parece ser menos pronunciada, muito provavelmente em virtude do metoprolol também ter seu efeito cardíaco semelhante ao do TF, ou seja, mais associado ao transiente de cálcio e não à redução do estresse oxidativo20.
Embora o carvedilol e o metoprolol tenham tido efeito diferenciado na associação com o treinamento físico sobre a contratilidade ventricular, ambos, quando associados ao treinamento físico, foram igualmente eficazes em melhorar a tolerância aos esforços.
O aumento da tolerância à realização de esforço físico não depende exclusivamente da melhora da função cardíaca, mas da associação de um melhor desempenho cardíaco com adaptações benéficas em alvos não cardíacos. Isso pode incluir a resposta vasodilatadora no endotélio vascular, na distribuição do débito cardíaco e na resposta ventilatória25, assim como modificações na musculatura esquelética.
Análises da estrutura muscular esquelética, realizadas no mesmo modelo genético utilizado neste estudo, com camundongos α2A/α2C-ARKO, aos 7 meses de idade, por meio da técnica de histoquímica para ATPase miosínica, mostraram diminuição da área seccional das fibras musculares, alteração fenotípica das fibras do tipo I para fibras do tipo II e rarefação capilar. As alterações descritas parecem ainda estar acompanhadas pela mudança do perfil metabólico, com redução da atividade de enzimas oxidativas26. Tal fato pode estar associado à redução progressiva da tolerância ao esforço, observada no presente estudo.
No que diz respeito aos efeitos dos betabloqueadores na tolerância ao esforço, vários estudos na literatura examinaram seu uso em portadores de diversas cardiopatias27,28. Os ensaios clínicos que perduraram por mais de um mês observaram melhoras significativas na função ventricular, mas muito sutis na tolerância ao esforço27,28. Portanto, o treinamento físico parece exercer papel fundamental na melhora da tolerância à realização de esforço na insuficiência cardíaca desses camundongos, corroborando outros estudos que mostram o mesmo efeito29,30.
De modo parecido ao resultado da tolerância à realização de esforço, observamos comportamentos semelhantes na redução da frequência cardíaca nos grupos metoprolol e carvedilol associados ao treinamento físico. Ambos tiveram efeito equipotente sobre a FC, reduzindo-a para os valores semelhantes aos observados nos camundongos WT (linha tracejada) e, portanto, mostrando a eficácia do tratamento com os dois betabloqueadores na diminuição da taquicardia apresentada neste modelo de cardiomiopatia, que está relacionada a um aumento da atividade do sistema nervoso simpático. Tais efeitos bradicárdicos, portanto, podem sugerir uma melhora no balanço autonômico nesses camundongos, que, por sua vez, está relacionada a uma melhora do prognóstico e da sobrevida na insuficiência cardíaca16,31. Além disso, os valores elevados da frequência cardíaca também emergem como preditores independentes de mortalidade na população em geral32,33.
Aliada às alterações na função ventricular, nossos resultados também sugerem a remodelação cardíaca nos camundongos com insuficiência cardíaca (
De fato, o treinamento físico tem efeito na remodelação reversa associada à redução na via de sinalização da calcineurina, que está relacionada à hipertrofia patológica34 ou ativação da via da Akt associada à hipertrofia fisiológica35. Portanto, a associação do TF aos betabloqueadores é uma conduta a ser adotada, uma vez que a remodelação está altamente relacionada ao óbito em pacientes com IC36-38.
Outros efeitos do treinamento físico, minimizando o processo de falência do miocárdio, têm sido recentemente mostrados e podem estar associados, dentre outros fatores, à redução de proteínas associadas à fibrose e à remodelação cardíaca39,40.
A associação de treinamento físico às terapias com metoprolol ou carvedilol melhorou de modo semelhante a tolerância ao esforço e melhorou também a estrutura cardíaca dos camundongos com IC induzida por hiperatividade simpática. No entanto, somente o carvedilol quando associado ao TF melhorou a contratilidade.
À Faculdade de Medicina e à Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo. À FAPESP pelo financiamento do estudo (06/56123-0, 05/59740-7). P. C. B. tem bolsa pesquisador nível ID do CNPq (301519/2008-0).
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Andréa Somolanji Vanzelli pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Correspondência: Andréa Somolanji Vanzelli Rua Arnaldo Simões Pinto, 166 - Vila Bonilha 02917-110 - São Paulo, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 29/09/09; revisado recebido em 11/02/10; aceito em 16/03/10.
BACKGROUND: Currently there are several types of interventions for the treatment of heart failure (HF). Among these are beta-blocker therapy (BB) and physical training (PT). However, the effects of the combination of these therapies are poorly studied. OBJECTIVE: To investigate the effects of BB treatment with metoprolol (M) and carvedilol (C) associated with PT in mice with HF. METHODS: We used a genetic model of sympathetic hyperactivity-induced heart failure in mice. Initially, we divided the HF animals into three groups: sedentary (S); trained (T); treated with M (138 mg/kg) (M); or C (65 mg/kg) (C). In the second part, we divided the groups into three subgroups: sedentary (S); trained and treated with M (TM); and trained and treated with C (CT). The PT consisted of aerobic training on a treadmill for 8 weeks. Exercise tolerance was assessed by maximal graded test, and fractional shortening (FS) was assessed by echocardiography. Cardiomyocyte diameter and collagen volume fraction were evaluated by histological analysis. Data were compared by one way ANOVA and post hoc Duncan test. The significance level was set at p < 0.05. RESULTS: As to FS and cardiac remodeling, we found that, in isolation, T, M, and C showed an improvement of the variables analyzed. As to therapy combination, after the intervention period, we observed an increase in exercise tolerance in MT and CT (43.0% and 33.0% respectively). There was also a reduction in cardiomyocyte diameter (10.0% and 9.0% respectively) and in collagen volume fraction (52.0% and 63.0%) after the intervention. However, only CT significantly improved FS. CONCLUSION: The association of PT with M or C therapies provided benefits on cardiac function and remodeling in HF mice.
IEscola de Educação Física da Universidade de São Paulo
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP)
IIIUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)III, São Paulo, SP - Brazil
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Heart failure is the final common pathway for many cardiovascular diseases. It is a syndrome characterized by signs and symptoms related to inadequate tissue perfusion1 and cathecolamine excess2. According to the hemodynamic view, heart failure syndrome is associated with low cardiac output, with consequent low renal flow, resulting in sodium and water retention and the appearance of peripheral and pulmonary edema3. Another common feature of heart failure is cardiac remodeling associated with loss of cardiomyocytes and increased collagen fraction4,5.
In the last two decades, there was a remarkable progress in the treatment of HF. The introduction of beta blockers and renin-angiotensin-aldosterone inhibitors made a considerable difference in the clinical evolution of patients, offering a more promising prospect for greater survival. Relevant clinical trials showed an unprecedented mortality reduction in the treatment of HF6-10.
There are increased possibilities of therapeutic and clinical optimization when non-pharmacological measures, such as diet and regular physical activity, are associated with conventional pharmacological treatment. Actually, physical training has been increasingly adopted, and its benefits include improved quality of life and tolerance to physical exertion, besides a reduction in the hyperactivity of the neurohumoral system, which is directly related to improved survival rates11 and autonomic balance12-14.
In previous laboratory studies we demonstrated that a therapy with the beta-blocker carvedilol significantly reduced sympathetic nerve activity in patients with HF15. More recently, we demonstrated that a non-pharmacological therapy based on exercise training resulted in additional reduction in sympathetic activity in HF patients who were already under therapy with the beta-blocker carvedilol16. These results suggest that the association of physical training with beta-blocker therapy can optimize the reduction in the hyperactivity of the neurohumoral system.
In this study, we used a genetic model of sympathetic hyperactivity-induced HF in mice to study the effect of the combination of the beta blockers metoprolol or carvedilol with aerobic exercise training on cardiac function and structure.
We used male mice of the C57/BL6 strain with gene inactivation of the α2A/α2C adrenergic receptor (α2A/α2CARKO mice), aged between 5-7 months, from the Laboratory Animal Facility of the School of Physical Education and Sports of the University of São Paulo (n = 35). These mice develop clinical signs of HF such as pulmonary edema associated with severe ventricular dysfunction at 7 months of age, when the mortality rate is 50.0%12,17. The gene inactivation of the α2A and α2C adrenergic receptors leads to an increase in the release of circulating noradrenaline18,19. Therefore, the HF observed in this model results from sympathetic nervous system hyperactivity.
This study was approved by the Ethics Committee of the Medical School of the University of São Paulo (897/06).
As a first step in our study, in order to evaluate the effect of isolated therapies on the variables analised, the animals were randomly divided into four groups: α2A/α2CARKO sedentary mice (S); α2A/α2CARKO trained mice (T); α2A/α2CARKO mice treated with metoprolol (M); and α2A/α2CARKO mice treated with carvedilol (C). After observing the isolated effect of the treatments, the effects of combined therapies were evaluated and, for that end, the animals were randomly divided into the following subgroups: α2A/α2CARKO sedentary mice (S); α2A/α2CARKO mice trained and treated with metoprolol (MT); and α2A/α2CARKO mice trained and treated with carvedilol (CT).
Control mice without HF (WT) are shown in the figures of the study with a dashed line to indicate the expected value in a control group without heart failure.
The treatments were carried out by gavage, and the doses used were previously tested in order to adjust them and to obtain equipotent doses for reducing the heart rate of animals, which corresponded to 135 mg/kg and 68 mg/kg for metoprolol and carvedilol, respectively20,21.
Body weight was monitored weekly in a semi-analytical scale (Gehaka, BG 400 - São Paulo, Brazil).
Intolerance to exertion was estimated in the groups studied by quantifying the maximum capacity to perform physical exercise (total test time in seconds) using a phased progressive exercise test to exhaustion, which was evidenced when the animal could not continue running on the treadmill (manufactured by the Federal University of São Carlos, São Carlos, Brazil) with an initial velocity of 3 m/min, and an increase of 3 m/min every 3 min12.
The groups of trained animals underwent a program of aerobic exercise training on treadmill for 8 weeks (from 5 to 7 months of age). The exercise sessions were conducted 5 times per week, lasting 60 minutes per session, with an intensity of 60.0% of the maximum speed recorded in the progressive test to exhaustion, which, as noted in a previous study, corresponds to the maximum lactate steady state22 ie, corresponds to the maximum exercise intensity in which there is a balance between production and removal of blood lactate during prolonged exercise.
We performed an indirect measurement of blood pressure using the tail plethysmographic method over the 8 weeks of intervention (Kent Scientific, CODA - Torrington, CT, USA). By using the pressure pulses recorded, we calculated the heart rate of the mice, as had already been done in previous studies13,20,21,23.
The transthoracic echocardiography was performed before and after the intervention period in all groups. The echocardiographic examination was performed with the animals anesthetized with the inhalation of the anesthetic halothane 1.0%, mixed with an O2 flow of 1 l/min. We used an echocardiograph (Acuson Corporation, Sequoia 512 - Mountain View, CA, USA) with a 15 MHz transducer. Images were taken at a frequency of 14 MHz. From the visualization of the left ventricle (cross section) at the level of the papillary muscles, M-mode was performed, and the diastolic diameter (LVDD) and the systolic diameter (LVSD) of the left ventricle were obtained and used to calculate fractional shortening (FS). The formula used was: FS = (LVDD - LVSD)/LVDD. The echocardiographer (R. S.) was blinded to the genotype and the type of treatment of the animals.
After 48 hours of formalin fixation (4.0%), the left ventricle was subjected to the usual histological processing, with 2 micron slices and hematoxylin-eosin or picrosirius
The collagen volume fraction was calculated as the percent ratio between the myocardial tissue area positively stained for collagen fibers (the absolute amount of collagen) and the total area of myocardial tissue in each ventricular region examined (absolute amount of collagen and myocytes), field by field. About 15-20 fields were examined for each animal13,20,21,23,24.
All variables showed normal distribution, when analyzed using the Shapiro-Wilk normality test, and therefore, the parametric statistical analysis was used. Data were expressed as mean ± standard error of mean.
The variables were compared among groups by one-way analysis of variance (ANOVA) (cardiomyocyte cross-sectional diameter and collagen fraction volume), or one way repeated measures (exercise tolerance, fractional shortening, and heart rate). For mortality,
In
Regarding the effects on cardiac structure, physical training alone did not result in a significant reduction of the cardiomyocyte cross-sectional diameter; however, it had effects similar to the pharmacological therapies in reducing the cardiac collagen fraction (
During the experimental period, the body weight of the animals was measured weekly. We observed that α2A/α2CARKO animals initially had lower body mass than those of the WT control group (22.2 ± 1.3 g
Additionally, we evaluated the mortality curve during the intervention period and found no significant difference among groups (40.0%
In
It should be emphasized that exercise tolerance in α2A/α2CARKO animals reached the values observed in control mice without HF (
As shown in
By 8 weeks after the intervention, only the α2A/α2CARKO mice group trained and treated with carvedilol (CT) significantly improved in values of fractional shortening (
The morphometric assessment showed that both cardiac beta-blockers associated with exercise training were equally effective in significantly reducing cardiomyocyte cross-sectional diameter (10.0% and 9.0% for the trained groups treated with metoprolol and carvedilol, respectively) and cardiac collagen fraction (52.0% and 63.0% for the trained groups treated with metoprolol and carvedilol, respectively), suggesting a possible effect of reverse cardiac remodeling associated with the combined effects of both beta-blockers to physical training (
In mice with sympathetic hyperactivity-induced cardiomyopathy as well as in clinical HF, the manifestation of clinical signs, such as intolerance to exertion, pulmonary edema, decreased cardiac function, and cardiac remodeling, is very common. It is important to emphasize that, even though a cause-effect on sympathetic hyperactivity has not been established in clinical heart failure, the autonomic imbalance plays an important role in the patient's prognosis, which makes the mice model used in this study even more interesting, because it allows for studies evaluating the direct effect of sympathetic hyperactivity in HF.
Following this addendum, the main results of this study in mice with sympathetic hyperactivity-induced HF were:
1) Both metoprolol and carvedilol, when combined with physical training, similarly improved tolerance to exertion and reduced resting tachycardia in an equipotent manner;
2) Both physical and pharmacologic therapies, individually, and the association of carvedilol with physical training significantly improved fractional shortening;
3) Both metoprolol and carvedilol associated with physical training similarly reduced collagen volume fraction and cardiomyocyte cross-sectional diameter.
We demonstrated previously that exercise training improved fractional shortening in heart failure by improving the calcium transient and the expression profile of proteins that regulate intracellular Ca2+ flow13,23. The association of metoprolol with physical training seems to be less effective, probably because metoprolol has a cardiac effect similar to that of PT, i.e. it is more associated with the calcium transient and not with reducing oxidative stress.20
Although carvedilol and metoprolol in combination with exercise training produced different effects on ventricular contractility, both were equally effective in improving tolerance to exertion when combined with exercise training.
The increased tolerance to physical exertion is not associated only with an improved cardiac function, but with the combination of better cardiac performance with beneficial adaptations in non-cardiac target organs. This may include the vasodilator response in the vascular endothelium, the cardiac output distribution, the ventilatory response25, and changes in skeletal muscles.
Skeletal muscle structure analyses, conducted in the same genetic model used in this study, with α2A/α2C-ARKO mice of 7 months of age, using the technique of staining for myosin ATPase, showed a decreased cross-sectional area of muscle fibers, a phenotypic change of fiber type I to type II fibers, and capillary rarefaction. Besides, the changes described appear to be accompanied by a change in the metabolic profile, with a reduced activity of oxidative enzymes26. This may be associated with the progressive reduction in exercise tolerance observed in this study.
With regard to the effects of beta blockers in tolerance to exertion, several studies in the literature have examined their use in patients with various heart diseases27,28. Clinical trials that have lasted for more than a month have observed significant improvements in ventricular function, but very subtle improvement in exercise tolerance27,28. Therefore, physical training seems to play a key role in improving tolerance to exertion in mice with heart failure , corroborating the results of other studies that show the same effect29,30.
Similarly to what was observed for tolerance to exertion, heart rate reduction had the same outcome pattern in the groups treated with metoprolol and carvedilol associated with physical training. Both had equipotent effects on HR, reducing it to values similar to those observed in WT mice (dashed line), and thus showing the effectiveness of the treatment with both beta-blockers in reducing tachycardia in this model of cardiomyopathy, which is related to an increased activity of the sympathetic nervous system. Therefore, these bradycardic effects in mice, may suggest an improvement in the autonomic balance, which, in turn, is associated with an improved prognosis and survival in heart failure16,31. Moreover, high values of heart rate are also independent predictors of mortality in the general population32,33.
Besides changes in ventricular function, our results also suggest the presence of cardiac remodeling in mice with heart failure (
Actually, physical training has an effect on the reverse remodeling associated with a reduction in the calcineurin signaling pathway, which is related to pathological hypertrophy34, or Akt activation, which in turn is related to physiological hypertrophy35. Therefore, the association of PT to beta-blockers is an approach to be adopted, because remodeling is highly related to death in patients with HF36-38.
Other effects of physical training on minimizing the process of myocardial failure have recently been shown and may be associated with a reduction in proteins associated with fibrosis and cardiac remodeling, among other factors39,40.
The association of physical training to therapy with metoprolol or carvedilol similarly improved tolerance to exertion and also improved the cardiac structure in mice with HF induced by sympathetic hyperactivity. However, only carvedilol, when associated with PT, improved contractility.
The authors would like to express their appreciation to the School of Medicine and the School of Physical Education and Sports of the University of São Paulo. Also to FAPESP for funding the study (06/56123-0, 05/59740-7). PCB has been awarded an ID level researcher scholarship by CNPq (301519/2008-0).
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Andréa Somolanji Vanzelli, from
FUNDAMENTO: El tratamiento de la insuficiencia cardiaca (IC) cuenta actualmente con diversos tipos de intervenciones. De entre ellas podemos destacar la terapia con betabloqueantes (BB) y el entrenamiento físico (EF). Con todo, los efectos de la asociación de estas terapias son poco estudiados. OBJETIVO: Verificar los efectos del tratamiento con BB, metoprolol (M) y carvedilol (C) asociados al EF en la IC en ratones. MÉTODOS: Utilizamos modelo genético de IC inducida en ratones por hiperactividad simpática. Inicialmente, dividimos los animales con IC en: sedentarios (S); entrenados (E); tratados con M (138 mg/kg) (M) o C (65 mg/kg) (C). En la segunda parte, dividimos los grupos en S; entrenado y tratado con M (ME) y entrenado y tratado con C (CE). El EF consistió en entrenamiento aeróbico en estera por 8 semanas. La tolerancia al esfuerzo se evaluó por prueba progresivo máxima y la fracción de acortamiento se evaluó (FE) por ecocardiografía. El diámetro de los cardiomiocitos y la fracción de colágeno fueron evaluados por medio de análisis histológico. Los dados fueron comparados por ANOVA de un camino con post hoc de Duncan. El nivel de significancia se consideró como p < 0,05. RESULTADOS: Destacando FE y remodelación cardíaca, verificamos que, aisladamente, E, M y C presentaron mejora de las variables. En la asociación, tras el período de intervención, observamos aumento de la tolerancia al esfuerzo en ME y CE (el 43% y el 33%, respectivamente). Hubo también reducción del diámetro de los cardiomiocitos (el 10% y el 9%, respectivamente) y de la fracción de colágeno (el 52% y el 63%), tras la intervención. Sin embargo, solamente CE mejoró significantemente la FE. CONCLUSIÓN: La asociación del EF a las terapias con M o C proporcionó beneficios sobre la función y remodelación cardíaca en ratones con IC.</
IEscola de Educação Física da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, SP - Brasil
IIIUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP - Brasil
Correspondencia
La insuficiencia cardiaca es la vía final común para diversas enfermedades cardiovasculares, constituyéndose en un síndrome caracterizado por señales y síntomas relacionados a la perfusión tisular inadecuada1 y al exceso de catecolaminas2. De acuerdo con la visión hemodinámica, el síndrome de la insuficiencia cardiaca está asociada a un bajo gasto cardiaco, con consecuente bajo flujo renal, conllevando la retención de sodio y agua y la aparición de edemas periférico y pulmonar3. Otra característica común de la insuficiencia cardiaca es la remodelación cardíaca asociada a la pérdida de cardiomiocitos y al aumento de la fracción de colágeno4,5.
En las dos últimas décadas, hubo notorio progreso en el tratamiento de la IC. La introducción de los agentes betabloqueantes y de los inhibidores del sistema renina-angiotensina-aldosterona provocó un nítido cambio en el comportamiento clínico de los pacientes, así como trajo la perspectiva de índices de sobrevida más promisores. Ensayos clínicos mostraron reducciones relevantes de la mortalidad como nunca presentado anteriormente en el tratamiento de la IC6-10.
Las posibilidades de optimización terapéutica y clínica se amplían cuando mediciones no farmacológicas, tales como dieta y actividad física regular, son asociadas al tratamiento farmacológico convencional. De hecho, el entrenamiento físico aeróbico se viene adoptando cada vez más y sus beneficios incluyen mejora en la calidad de vida del paciente y tolerancia a esfuerzos físicos, además de la reducción en la hiperactividad de sistemas neurohumorales que está directamente relacionada a la mejora en la sobrevida del paciente11 y en el balance autonómico12-14.
En estudios anteriores de nuestro laboratorio, demostramos que la terapia con el betabloqueante carvedilol redujo significantemente la actividad nerviosa simpática en pacientes con IC15, y, más recientemente, revelamos que la terapia no farmacológica con el entrenamiento físico aerobio provocó reducción adicional en la actividad simpática de pacientes con IC que ya estaban bajo terapia con el betabloqueante carvedilol16. Estos resultados sugieren que la asociación del entrenamiento físico aeróbico al betabloqueante es capaz de optimizar la reducción en la hiperactividad de sistemas neurohumorales.
En el presente estudio, utilizamos un modelo genético de IC inducida por hiperactividad simpática en ratones para estudiar el efecto de la asociación de los betabloqueantes metoprolol o carvedilol al entrenamiento físico aeróbico sobre la función y la estructura cardíacas.
Se utilizaron ratones machos de linaje C57/BL6 con inactivación génica de los receptores a2A/a2C adrenergicos (a2A/a2CARKO), en el grupo de edad comprendida entre los 5-7 meses de vida, provenientes del Bioterio de la Escuela de Educación Física y Deporte de la USP (n = 35). Estos ratones desarrollan señales clínicos de IC como edema pulmonar asociado a la disfunción ventricular severa a los 7 meses de edad, cuando a tasa de mortalidad es del 50%12,17. La inactivación génica de los receptores a2A y a2C adrenergicos provoca la elevación en la liberación de noradrenalina circulante18,19, siendo, por tanto, la IC observada en este modelo debido a la hiperactividad del sistema nervioso simpático.
El presente estudio se aprobó en el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la USP (897/06).
En una primera etapa de nuestro trabajo, con el intuito de evaluarse el efecto de las terapias aisladas sobre las variables analizadas, dividimos los animales aleatoriamente en a2A/a2CARKO sedentario (S); a2A/a2CARKO entrenado (E); a2A/a2CARKO tratado con metoprolol (M) a2A/a2CARKO tratado con carvedilol (C). Después de conocer el efecto aislado de los tratamientos, evaluamos el efecto de las terapias asociadas y, para esto, los animales se subdividieron aleatoriamente en los siguientes subgrupos: a2A/a2CARKO sedentario (S); a2A/a2CARKO entrenado y tratado con metoprolol (ME) y grupo a2A/a2CARKO entrenado y tratado con carvedilol (CE).
Ratones control sin IC (WT) se presentan en las figuras del estudio con una línea punteada para que se observe el valor esperado en grupo control sin insuficiencia cardiaca.
Los tratamientos se llevaron a cabo realizados vía gavage y las dosis utilizadas fueron anteriormente probadas a fin de ajustarse y de obtenerse dosis equipotentes en la reducción de la frecuencia cardíaca de los animales, 135 mg/kg y 68 mg/kg para metoprolol y carvedilol, respectivamente20,21.
El peso corporal se siguió semanalmente en balanza semianalítica (Gehaka, BG 400 - São Paulo, SP, Brasil)
La intolerancia a la realización de esfuerzos se estimó en los grupos estudiados por medio de la cuantificación de la capacidad máxima de realización del ejercicio físico (tiempo total de la prueba en segundos) a través de una prueba progresiva escalonada hasta el agotamiento, constatado cuando el animal no lograba mantener la corrida, en cinta rodante (confeccionada por servicio autónomo de la Universidad Federal de São Carlos, São Carlos, SP, Brasil) con velocidad inicial de 3 m/min y aumento de 3 m/min a cada 3 min12.
Los grupos de animales entrenados se sometieron a un programa de entrenamiento físico aeróbico en cinta rodante durante 8 semanas (de los 5 a los 7 meses de edad). Las sesiones de ejercicio se llevaron a cabo 5 veces por semana, con duración de 60 minutos por sesión e intensidad del 60% de la velocidad máxima verificada en la prueba progresiva hasta el agotamiento, que, conforme observamos en estudio anterior, corresponde al máximo estado estable del lactato22, es decir, corresponde a la máxima intensidad de ejercicio físico donde hay un equilibrio entre la producción y la remoción del lactato sanguíneo durante el ejercicio prolongado.
Se realizó la medición indirecta de la presión arterial mediante el método de pletismografía de cola a lo largo de las 8 semanas de intervención (
El examen ecocardiográfico transtorácico se llevó a cabo antes y tras el período de intervención en todos los grupos estudiados. El examen ecocardiográfico se realizó con los animales anestesiados mediante el anestésico halotano 1%, con flujo 1 l/min de O2 misturado al anestésico. Se utilizó el ecocardiógrafo (Acuson Corporation, Sequoia 512 - Mountain View, CA, EUA), con transductor de 15 MHz. Las imágenes se hicieron con una frecuencia de 14 MHz. A partir de la visualización del ventrículo izquierdo (corte transversal) al nivel de los músculos papilares, se llevó a cabo el modo M y las mediciones del diámetro diastólico (DDVI) y sistólico (DSVI) del ventrículo izquierdo fueron obtenidas y utilizadas para el cálculo de la fracción de acortamiento (FS). La fórmula utilizada fue: FS = (DDVI - DSVI) / DDVI. El ecocardiografista (R. S.) estaba ciego para el genotipo y para el tipo de tratamiento de los animales.
Tras 48 horas de fijación en formalina tamponada (4%), el ventrículo izquierdo se sometió al procesamiento histológico habitual, con cortes de 2 micra y tinción por hematoxilina-eosina o picrossírius
La fracción del volumen de colágeno se calculó por la razón porcentual del área del tejido miocárdico sonrosado positivamente para las fibras colágenas (cantidad absoluta de colágeno) y el área total del tejido miocárdico en cada región ventricular examinada (cantidad absoluta de colágeno y miocitos), campo a campo. Un número de 15 a 20 campos se examinó para cada uno de los animales13,20,21,23,24.
Todas las variables estudiadas presentaron distribución normal, analizada por la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y, por tanto, se utilizó el análisis estadístico paramétrico . Los datos están representados en la forma de promedio ± error estándar del promedio.
Las variables estudiadas se compararon entre los grupos por el análisis de variancia (ANOVA) de un camino (diámetro transverso de los cardiomiocitos y fracción de volumen de colágeno) o un camino con mediciones repetidas (tolerancia al esfuerzo, fracción de acortamiento y frecuencia cardíaca). Para la mortalidad, se utilizó el análisis de
Efecto aislado de los tratamientos (entrenamiento físico, metoprolol y carvedilol sobre la tolerancia al esfuerzo, función contráctil y estructura cardíaca)
En la
Con relación a los efectos en la estructura cardíaca, el entrenamiento físico aisladamente no proporcionó reducción significativa del diámetro transverso de los cardiomiocitos, con todo, tuvo efectos similares a las terapias farmacológicas en la reducción de la fracción de colágeno cardiaco (
Durante el período experimental, la masa corporal de los animales se evaluó semanalmente. Observamos que los animales a2A/a2CARKO presentaban inicialmente una masa corporal menor que los animales del grupo control WT (22,2 ± 1,3 g
Evaluamos adicionalmente la curva de mortalidad durante el período de intervención y no observamos diferencia significativa entre los grupos (40,0%
En la
Cabe resaltar que la tolerancia al esfuerzo en los animales a2A/a2CARKO alcanzó los valores observados en los ratones control sin IC (
Como se puede observar en la
Tras el período de 8 semanas de intervención, solamente el grupo a2A/a2CARKO entrenamiento y tratado con carvedilol (CE) mejoró significantemente los valores de fracción de acortamiento (
La evaluación morfométrica cardiaca reveló que ambos betabloqueantes asociados al entrenamiento físico fueron igualmente eficaces en reducir significantemente el diámetro transverso de los cardiomiocitos (el 10% y el 9% para los grupos entrenados y tratados con metoprolol y carvedilol, respectivamente) y la fracción de colágeno cardíaco (el 52% y el 63% para los grupos entrenados y tratados con metoprolol y carvedilol, respectivamente), lo que sugiere un posible efecto de remodelación cardíaca reversa asociada a los efectos combinados de ambos betabloqueantes al entrenamiento físico (
En los ratones que constituyen tal modelo de cardiomiopatía inducida por hiperactividad simpática, así como en la IC clínica, es muy común la observación de los signos clínicos, como la intolerancia a los esfuerzos, el edema pulmonar, la disminución de la función cardíaca y la remodelación cardíaca. Es importante resaltar que, aun sin establecer una relación causa-efecto sobre la hiperactividad simpática en la insuficiencia cardiaca clínica, el desequilibrio autonómico juega un importante rol en el pronóstico del paciente, lo que vuelve el modelo de ratones utilizado en el presente estudio lo más interesante, ya que, posibilita estudiar el efecto directo de la hiperactividad simpática en la IC.
Tras hacerse esta observación, los principales resultados de este estudio en ratones con IC inducida por hiperactividad simpática fueron:
1) Ambos metoprolol y carvedilol, cuando asociados al entrenamiento físico, mejoraron de manera similar a la tolerancia a los esfuerzos y redujeron de manera equipotente la taquicardia de reposo;
2) El entrenamiento físico y las terapias farmacológicas aisladamente, además de la asociación del carvedilol al entrenamiento físico, mejoraron significantemente la fracción de acortamiento;
3) Ambos metoprolol y carvedilol asociados al entrenamiento físico redujeron similarmente la fracción de volumen de colágeno cardíaco y el diámetro transverso de los cardiomiocitos.
Anteriormente, evidenciamos que el entrenamiento físico mejora la fracción de acortamiento en la insuficiencia cardiaca por mejora en el transiente de calcio y del perfil de expresión de las proteínas que regulan el flujo de Ca2+ intracelular13,23. Además de ello, mostramos también que el carvedilol es más eficaz en reducir el estrés oxidativo que en mejorar el transiente de Ca2+ cardíaco20. Por tanto, esta combinación puede potencializar los efectos benéficos de ambas terapias sobre la función cardíaca. Ya la asociación del metoprolol con el entrenamiento físico parece ser menos pronunciada, muy probablemente en virtud del metoprolol también tener su efecto cardíaco semejante al del EF, o sea, más asociado al transiente de calcio y no a la reducción del estrés oxidativo20.
Aunque el carvedilol y el metoprolol hayan tenido efecto diferenciado en la asociación con el entrenamiento físico sobre la contractilidad ventricular, ambos, cuando asociados al entrenamiento físico, fueron igualmente eficaces en mejorar la tolerancia a los esfuerzos.
El aumento de la tolerancia a la realización de esfuerzo físico no depende exclusivamente de la mejora de la función cardíaca, sino de la asociación de un mejor desempeño cardíaco con adaptaciones benéficas en blancos no cardíacos. Esto puede incluir la respuesta vasodilatadora en el endotelio vascular, en la distribución del gasto cardiaco y en la respuesta ventilatoria25, así como modificaciones en la musculatura esquelética.
Análisis de la estructura muscular esquelética, realizadas en el mismo modelo genético utilizado en este estudio, con ratones α2A/α2C-ARKO, a los 7 meses de edad, por medio de la técnica de histoquímica para ATPase miosínica, mostraron disminución del área seccional de las fibras musculares, alteración fenotípica de las fibras del tipo I para fibras del tipo II y rarefacción capilar. Las alteraciones descriptas parecen todavía estar acompañadas por el cambio del perfil metabólico, con reducción de la actividad de enzimas oxidativas26. Tal hecho puede estar asociado a la reducción progresiva de la tolerancia al esfuerzo, observada en el presente estudio.
En lo que toca a los efectos de los betabloqueantes en la tolerancia al esfuerzo, varios estudios en la literatura examinaron su uso en portadores de diversas cardiopatías27,28. Los ensayos clínicos que perduraron por más de un mes observaron mejoras significativas en la función ventricular, pero muy sutiles en la tolerancia al esfuerzo27,28. Por tanto, el entrenamiento físico parece ejercer rol fundamental en la mejora de la tolerancia a la realización de esfuerzo en la insuficiencia cardíaca de estos ratones, corroborando otros estudios que muestran el mismo efecto29,30.
De modo parecido al resultado de la tolerancia a la realización de esfuerzo, observamos comportamientos semejantes en la reducción de frecuencia cardíaca en los grupos metoprolol y carvedilol asociados al entrenamiento físico. Ambos tuvieran efecto equipotente sobre la FC, reduciéndola a valores semejantes a los observados en los ratones WT (línea punteada) y, por tanto, mostrando la eficacia del tratamiento con los dos betabloqueantes en la disminución de la taquicardia presentada en este modelo de cardiomiopatía, que está relacionada a un aumento de la actividad del sistema nervioso simpático. Tales efectos bradicárdicos, por tanto, pueden sugerir una mejora en el balance autonómico en estos ratones, que, a su vez, está relacionada a una mejora del pronóstico y de la sobrevida en la insuficiencia cardiaca16,31. Además de ello, los valores elevados de la frecuencia cardíaca también emergen como predictores independientes de mortalidad en la población en general32,33.
Aliada a las alteraciones en la función ventricular, nuestros resultados también sugieren la remodelación cardíaca en los ratones con insuficiencia cardiaca (
De hecho, el entrenamiento físico tiene efecto en la remodelación reversa asociada a la reducción en la vía de señalización de la calcineurina, que está relacionada a la hipertrofia patológica34 o activación de la vía de Akt asociada a la hipertrofia fisiológica35. Por tanto, la asociación del EF a los betabloqueantes es una conducta a adoptar, una vez que la remodelación está altamente relacionada al óbito en pacientes con IC36-38.
Otros efectos del entrenamiento físico, minimizando el proceso de falla del miocardio, han sido recientemente evidenciados y pueden estar asociados, de entre otros factores, a la reducción de proteínas asociadas a la fibrosis y a la remodelación cardiaca39,40.
La asociación de entrenamiento físico a las terapias con metoprolol o carvedilol mejoró de modo semejante a tolerancia al esfuerzo y mejoró también la estructura cardíaca de los ratones con IC inducida por hiperactividad simpática. Sin embargo, solamente el carvedilol cuando asociado al EF mejoró la contractilidad.
A la Facultad de Medicina y a la Escuela de Educación Física y Deporte de la Universidad de São Paulo. A la FAPESP por el financiamiento del estudio (06/56123-0, 05/59740-7). P. C. B. tiene una beca investigador nivel ID del CNPq (301519/2008-0).
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue financiado por la FAPESP.
Este artículo forma parte de tesis de Doctorado de Andréa Somolanji Vanzelli por la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo.