Numerosas pesquisas têm sido realizadas utilizando modelos experimentais para estudar o desenvolvimento da aterosclerose com dieta induzindo hiperlipidemia. Devido ao fato de que coelhos são muito sensíveis a dietas ricas em colesterol e acumulam grandes quantidades no plasma, a utilização destes animais como modelo experimental para avaliar o desenvolvimento de aterosclerose é de grande relevância, trazendo informação sobre fatores que contribuem para progressão e regressão aplicadas a situações humanas. Sendo assim, nessa revisão a função aterogênica do colesterol é mostrada em trabalhos que incluem o coelho como modelo experimental, uma vez que este animal tornou-se o mais popular modelo experimental de aterosclerose.
Aterosclerose experimental em coelhos
IUniversidade Federal de Ouro Preto
IIDepartamento de Bioquímica e Biologia Celular
IIIUniversidade Federal de Viçosa, Belo Horizonte, MG -Brasil
Numerosas pesquisas têm sido realizadas utilizando modelos experimentais para estudar o desenvolvimento da aterosclerose com dieta induzindo hiperlipidemia. Devido ao fato de que coelhos são muito sensíveis a dietas ricas em colesterol e acumulam grandes quantidades no plasma, a utilização destes animais como modelo experimental para avaliar o desenvolvimento de aterosclerose é de grande relevância, trazendo informação sobre fatores que contribuem para progressão e regressão aplicadas a situações humanas. Sendo assim, nessa revisão a função aterogênica do colesterol é mostrada em trabalhos que incluem o coelho como modelo experimental, uma vez que este animal tornou-se o mais popular modelo experimental de aterosclerose.
A importância de distúrbios de lipoproteínas plasmáticas e anormalidades no metabolismo lipídico caracterizadas por hiperlipidemia e/ou hipercolesterolemia como fator etiológico no desenvolvimento de doenças cardíacas coronarianas e aterosclerose potencial são, atualmente, cada vez mais apoiadas por considerável número de estudos populacionais e epidemiológicos1. Dieta induzindo hipercolesterolemia em coelhos tem sido largamente utilizada como modelo para estudar o desenvolvimento de aterosclerose humana.
A primeira investigação sobre indução experimental de aterosclerose ocorreu em 1908. Ignatowski, utilizando coelhos alimentados com leite, carne e ovo, observou espessamento da íntima em aortas. Em seguida, Lubarsch (1910, 1912) e Steimbiss (1913) foram capazes de desenvolver aterosclerose em aorta de coelhos com dietas que incluíam órgãos internos, como fígado, adrenal e músculo. Tais estudos, bem como outros, indicavam uma função causal de proteínas animais; entretanto, outros pesquisadores acreditavam que o fator que estabelecia aterosclerose como componente da dieta era o colesterol e não as proteínas de tecido animal2.
Para avaliar a teoria da aterogênese a partir do colesterol, Clarkson e Newburgh (1926) alimentaram coelhos com dieta normal, aumentando para 25, 113, 253 ou 507 mg/dia de colesterol administrado em cápsula. Encontrou-se moderada aterosclerose em 71% dos coelhos alimentados com 507 mg/ dia de colesterol por 47-87 dias. Meeker & Kesten (1940,1941) dissolveram 60 ou 250 mg de colesterol em óleo vegetal e acrescentaram à dieta de coelhos por três meses. Os animais desenvolveram típicas lesões ateroscleróticas similares àquelas vistas em humanos, permanecendo, deste modo, a teoria de que o colesterol é o precursor para o desenvolvimento de doença vascular aterosclerótica3.
Para induzir hipercolesterolemia em animais, têm-se utilizado dietas contendo colesterol, as quais variam de rações comerciais suplementadas com níveis substancialmente diferentes de colesterol, assim como modificações nas porções de lipídio e carboidrato e nas diferentes fontes e conteúdos de gordura, contendo ou não ácido cólico4. Em nosso laboratório, temos produzido hipercolesterolemia em coelhos, com 1% de colesterol em rações comerciais em várias pesquisas, para investigarmos substâncias que podem ser viabilizadas, no futuro, como medicamentos no controle do metabolismo lipídico e no desenvolvimento de testes de potenciais terapias e diagnósticos entre diferentes procedimentos experimentais5-12.
Na presente revisão, o objetivo foi analisar criticamente o efeito hipercolesterolêmico de dieta rica em colesterol em estudos utilizando coelhos como modelo experimental a partir de investigações que possam levar a um melhor entendimento da biologia da aterosclerose para doença cardiovascular.
Para melhor entendimento da relação entre desordens do metabolismo de colesterol e aterogênesis, manipulação dietética e a utilização de animais naturalmente com erros metabólicos, como coelhos Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL) e St Thomas Hospital (STH) para produzir hipercolesterolemia familiar e hiperlipidemia combinada à hipercolesterolemia, respectivamente, tem sido o foco de muitos experimentos. Atualmente, a tecnologia de deleção de gens tem permitido pesquisas a fim de produzir uma variedade de modelos de animais transgênicos com desordens de lipoproteínas e, a despeito dessa revolucionária descoberta, muitos desses animais geneticamente modificados têm sido alimentados com colesterol para acelerar aterogênesis2.
O termo "disfunção endotelial", que tem importante implicação no cuidado da doença cardiovascular, é empregado para descrever situações em que o endotélio perde sua propriedade vasoprotetora, representando a etapa inicial de vários processos de lesão vascular, como dano mecânico, hipercolesterolemia, aterosclerose e hipertensão arterial sistêmica13. Além disso, ocorre diminuição do relaxamento endotelial vascular para acetilcolina, causando vasoconstrição e queda do fluxo sanguíneo, como demonstrado por Sun e cols.14 em coelhos alimentados com colesterol, visto que essa menor vasodilatação pode ser ocasionada pela presença de placas de lipídios na aorta.
Coelhos com 1% de suplementação de colesterol na dieta por 8-10 semanas apresentam prejudicada vasodilatação do endotélio na artéria carótida15 e anormalidades na síntese do óxido nítrico (NO), demonstradas em vasos ateroscleróticos16. Considerando hiperlipidemia e aterosclerose, segmentos aórticos de coelhos hipercolesterolêmicos mostram redução significante de óxido nítrico sintase (NOS) endotelial em relação aos animais-controle17. Vasquez-Vivar e cols.18 relataram que BH4, um cofator para síntese de NO em aortas de coelhos com dieta induzindo hipercolesterolemia, foi acentuadamente reduzido quando comparado a coelhos normocolesterolêmicos. Radicais livres de oxigênio, como o ânion superóxido, podem modular a atividade de NO endógeno em coelhos hipercolesterolêmicos19,20. Interessantemente, isso demonstra que a expressão de NOS relatada em músculo liso vascular de coelhos hipercolesterolêmicos21,22 não é capaz de dominar os defeitos na função vascular endógena.
O aumento de óxido nítrico basal e de vasodilatadores derivados do endotélio é visto em maior quantidade em anéis aórticos do endotélio de coelhos do sexo feminino do que em machos e depende da concentração de estradiol circulante23; portanto, fêmeas são menos inclinadas à dieta para indução de lesões ateroscleróticas do que machos, mas dependem do estado do endotélio arterial, como observado por Holm e cols.24. Estradiol inibe a adesão de monócitos sobre células endoteliais com migração transendotelial, componentes de uma resposta inflamatória que ocorre continuamente através do processo aterogênico após hipercolesterolemia induzida em coelhos25.
O desenvolvimento de intervenções para inibir aterosclerose a partir de colesterol e a disfunção vascular têm recebido muita atenção devido a essa intensa associação. A depleção de L-arginina (um substrato para NOS) em modelos animais de aterosclerose e hipercolesterolemia induz agregação plaquetária, proliferação celular e acumulação de monócito vascular, ao passo que coelhos hipercolesterolêmicos tratados com L-arginina melhoram a vasorreatividade do endotélio-dependente, atenuando os mecanismos de lesão vascular26 e inibindo a neoproliferação intimal27, que podem ser avaliados por vários marcadores propostos de células endoteliais (
O fator de Von Willebrand foi estudado recentemente em coelhos com dieta rica em colesterol por 30 dias. Após a interrupção do tratamento, observou-se que a hipercolesterolemia induz o aumento deste fator, diminuindo após descontinuação da dieta rica em colesterol. Isso demonstra uma correlação positiva com formação de camada de gordura em ambas as fases do estudo, enquanto há um decréscimo dos níveis de fator de crescimento endotelial vascular, após cessar a dieta hipercolesterolêmica, podendo ser um mecanismo reparativo na prévia aterosclerose, o que pode também indicar dano celular endotelial28.
Avaliando os efeitos da hipercolesterolemia para identificar o risco de aterosclerose com proteína C-reativa (PCR), Sun e cols.29 mostraram que PCR é frequentemente depositada em lesões aterosclerótica em modelos com coelhos. Além disso, elevados níveis plasmáticos de PCR associam-se com a gravidade da hipercolesterolemia30.
O aumento na síntese de NO pode ser um mecanismo de defesa para compensar a inativação de NO e proteger contra fatores que representam dano ao organismo, com o nitrito como um potente metabólito correlacionado à formação de camadas de gordura, sendo examinado em curto e longo tempo em coelhos alimentados com colesterol31.
Paralelamente a essas aferições, constata-se que a função endotelial de segmentos vasculares é a alteração mais precoce na aterogênese. O comprometimento funcional da célula endotelial é demonstrado nas repercussões clínicas, como ocorrência de eventos subsequentes à progressão da formação de placa na íntima dos vasos (
O modelo de coelho alimentado com colesterol é notável pelo rápido desenvolvimento de lesões aórticas e baixo custo para manutenção, sendo um regime típico para indução de aterosclerose envolvendo suplementação de 0,5% a 4% de colesterol por peso em aproximadamente 8 a 16 semanas. Nessas condições, coelhos tornam-se rapidamente hipercolesterolêmicos (com colesterol plasmático > 1.000 mg/dl) e as lesões resultantes consistem primariamente de macrófagos derivados de células espumosas32. Contudo, a relação entre formação da lesão aterosclerótica e dieta induzindo hipercolesterolemia em coelhos é dependente de exposição cumulativa preferencialmente em nível de colesterol administrado, demonstrando em coelhos alimentados com 0,5% e 1,0% de colesterol graus similares de hipercolesterolemia induzida14. Alguns pesquisadores apoiam a sugestão de que a formação de lesões avançadas depende da idade do animal. Coelhos mais velhos, com 3-4,5 anos de idade, exibem placas fibróticas enquanto animais mais jovens (4 meses de idade) não apresentam lesões avançadas33.
Como coelhos têm sido utilizados vastamente para estudar o desenvolvimento de aterosclerose em humanos, o rápido desenvolvimento de lesões tem sido produzido com suplementação de colesterol na dieta (< 0,5%), alcançando hipercolesterolemia moderada com níveis de colesterol plasmáticos na faixa de 200 a 800 mg/dl34. Consequentemente, as lesões usualmente produzidas são topográfica e morfologicamente dissimilares àquelas vistas em humanos. Essa dissimilaridade é devida, em parte, ao fato de que humanos comumente não ingerem grandes quantidades de colesterol: em geral, têm níveis de colesterol plasmático que não excedem 800 mg/dl e processam e toleram o consumo de colesterol melhor do que coelhos. Somados a isso, experimentos de longo tempo em coelhos com dietas contendo grandes quantidades de colesterol são desencorajados devido à hepatotoxicidade e à falência do animal. Examinações revelam hepatomegalia com evidência de estase biliar em nível de colesterol plasmático de 3.257 ± 266 mg/dl32. Contudo, a despeito dessas restrições, grande número de pesquisas usa esse modelo para testar a eficiência de fármacos no desenvolvimento de camadas de gordura.
Lesões ateroscleróticas são compostas por três componentes maiores. O primeiro é o componente celular, que predominantemente compreende células musculares lisas e macrófagos. O segundo componente é o tecido conectivo matriz e lipídio extracelular. O terceiro componente é o lipídio intracelular, que se acumula dentro de macrófagos, convertendo-se, então, em células espumosas35. Em prévios eventos celulares, tem sido observada a presença de leucócitos aderidos ao arco aórtico torácico e abdominal de coelhos após três semanas de dieta enriquecida com 0,2% de colesterol. Por 3-5 semanas com a mesma dieta, numerosas células espumosas são encontradas no espaço subendotelial e constituem o desenvolvimento de camadas de gordura na mesma localização em que monócitos aderentes foram observados anteriormente36.
Em aorta, vários tipos de placas de camadas de gordura a lesões ateromatosas são observados em modelo experimental, dependendo do grau de consumo de colesterol. Dietas contendo < 0,15% de colesterol resultam em desenvolvimento de lesões de camada de gordura, enquanto placas ateromatosas são mais encontradas com alta quantidade de colesterol na dieta32.
O grau de aterosclerose em coelhos tende a ser maior na aorta abdominal do que na torácica, o que pode ser explicado devido ao efeito hemodinâmico ou pelo fato de que a aorta abdominal de coelhos diminui gradualmente abaixo na bifurcação aórtica. Dessa forma, a aorta mais distal pode ter mais lesão em relação à aorta proximal37. Mudanças ateromatosas com 8 semanas em coelhos alimentados com colesterol são formadas na aorta torácica e, então, estendem para a aorta abdominal, artéria coronária e outros vasos, predominando lesões concêntricas na aorta torácica e na porção proximal da artéria coronária em contraste com aterosclerose branda produzida nas artérias renal, carótida e femural na 15ª semana da dieta38. Não fica claro, todavia, neste estudo, o quanto a exposição com colesterol influenciou o tipo de lesão.
A extensão da aterosclerose em aorta de coelhos pode ser quantificada pela superfície de lesões sudanofílicas39 e por análise imuno-histoquímica40. Recentemente, ressonância magnética de imagem (RMI) não invasiva tem sido usada no estudo de lesões vasculares. Quantificação em RMI e mudanças na composição de placas ateroscleróticas podem ser usadas com RMI para monitorar a progressão e regressão da aterosclerose
Já a avaliação histológica pela taxa de estenose é um importante método para avaliar a gravidade da aterosclerose coronariana, pois a taxa de estenose é diretamente considerada reflexo da condição clínica. Por outro lado, o método de avaliação através da observação macroscópica em coronárias ateroscleróticas em coelhos tem algumas vantagens em relação a métodos histológicos, uma vez que a análise da área da lesão pode ser concluída dentro de um curto tempo, enquanto toda a imagem da distribuição da aterosclerose pode ser facilmente entendida. Quando seções de tecidos de lesões ateroscleróticas coronarianas são necessárias, pode-se retirar somente a parte da placa aterosclerótica, observada macroscopicamente sobre a superfície luminal da artéria coronária42.
A lesão vascular tem participação importante nas desordens cardiovasculares, embora a participação da hipercolesterolemia em eventos tromboembólicos seja ainda pouco entendida, necessitando ser melhor conhecida.
A ruptura da placa aterosclerótica é reconhecida como a maior causa de trombose e subsequentes manifestações clínicas de aterosclerose como angina instável, infarto miocardial e derrame além de, também, consistir um alvo para intervenção clínica43-45. Entretanto, é ainda difícil predizer quando a ruptura de placa ocorrerá já que o estímulo fisiológico adicional requerido para causar o evento é desconhecido. Os mecanismos de ruptura de placa posterior e formação de subsequentes trombos oclusivos não são ainda muito claros. Ademais, também não é evidente se a placa sem acompanhamento de trombo pode causar ou não eventos cardíacos44. Duas hipóteses principais têm sido propostas como causas para ruptura de placa (
Há vários modelos animais de ruptura de placa que têm sido relatados nos últimos anos. Comumente em coelhos alimentados com colesterol, usa-se induzir a lesão a partir de um balão injetado parenteralmente com veneno de víbora Russell e histamina, procedimento este que resultará em ruptura de placa e trombose37. Outro modelo é o de coelhos alimentados com colesterol, com implantação de cateter com balão em aorta torácica. O balão é inflado após a lesão aterosclerótica formar-se ao redor deste, ocasionando ruptura de lesão e trombose46. Entretanto, ambos os modelos conduzem para casos agudos provocados mecanicamente em pesquisas. Assim, o valor desses modelos para estudo sobre apoptose celular, inflamação, aumento de lipídios e degradação de cápsula fibrosa é limitado devido a acentuadas e diferentes características das placas formadas nesses modelos comparados às placas encontradas naturalmente em humanos, uma vez que a lesão está restrita à região subendotelial, mantendo a integridade da lâmina elástica interna47.
A placa aterosclerótica não é uma estrutura estática. Preferencialmente, seu status em qualquer momento é o resultado de uma interação complexa e dinâmica de um grande número de fatores celulares e humorais48. A desestabilização de placa determinada pela quebra de colágeno, com perda local de fonte celular de síntese de colágeno, foi vista em coelhos por Rekhter e cols.49. Eles demonstraram um decréscimo do conteúdo de colágeno total em placas ricas em lipídios tempo dependente, enquanto o nível de ligação cruzada não diferiu entre alto e baixo consumo de colesterol nos grupos. Uma ligação mecânica entre hipercolesterolemia e perda de colágeno é ainda hipotética, embora uma função crítica de macrófagos e outras enzimas proteolíticas têm sido fortemente sugeridas.
Dieta induzindo hipercolesterolemia em coelhos aumenta seletivamente a formação de trombo e embolização em arteríolas, mas não em veias. A observação de que o aumento de colesterol plasmático total resulta principalmente em aumento de colesterol LDL sugere que os efeitos observados da hipercolesterolemia sobre tromboembolismo arteriolar sejam causados pelo LDL e que a estimulação de produção de NO endógeno como estimulado por excesso de L-arginina seja capaz de antagonizar esse acréscimo do colesterol, acentuando tromboembolismo arteriolar50.
Se um trombo é oclusivo, ele conduzirá para infarto do miocárdio45. Como ruptura de placa é a principal complicação clínica, a estabilização da placa é crucial e a diminuição de lipídios pela manipulação dietética mostrou reduzir significativamente a atividade proteolítica e o aumento do conteúdo de colágeno de ateroma estabelecido em coelhos51. O grau substancial de benefício clínico parece ser não proporcional à melhora da estenose produzida por redução do consumo de lipídio, estabilizando a placa ateromatosa pela redução nos níveis de atividade de proteinases, que podem degradar componentes estruturais da matriz extracelular arterial51. Dessa forma, reforça-se a habilidade da placa em resistir à ruptura.
A administração de fatores de crescimento angiogênicos é uma interessante nova terapêutica para doença cardíaca isquêmica. O fator de crescimento de fibroblastos promove reparo vascular e angiogênese, induzindo expressão de fator tecidual em monócitos circulantes e na parede vascular em coelhos normais e hipercolesterolêmicos52.
Segundo Abela e cols.53, o modelo de coelhos com lesões arteriais que desenvolvem trombose após dano arterial mecânico e dieta rica em colesterol ocasiona placa vulnerável para ruptura e trombose, sendo capaz de ser usado para testar agentes farmacológicos que possam reduzir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas vulneráveis ou quantidade de trombos formados. Agentes redutores de lipídios, antioxidantes, bloqueadores de canal de cálcio e inibidores da enzima conversora de angiotensina, além de fármacos antiplaquetários e antitrombóticos, podem ser testados para avaliar a habilidade de reduzir a quantidade de trombos. No entanto, a ruptura espontânea da placa não ocorre nesses modelos, embora o estímulo desencadeador possa provocar trombose arterial. Lesões pr oduzidas nesses animais por lesão mais lipídio formam cápsulas fibrosas constituídas por células musculares lisas. O ateroma humano, tipicamente formado por décadas, pode ter aspectos não parecidos ao obtido em tempo relativamente curto em experimentos com coelho 51.
O coelho é uma espécie animal que tem vários aspectos similares aos dos humanos em relação ao metabolismo de lipoproteínas, exceto pela deficiência de lipase hepática54. Várias características dos coelhos fazem deles um excelente modelo para avaliar os efeitos dos transgenes humanos sobre metabolismo de lipoproteínas e susceptibilidade para aterosclerose: 1) lipoproteínas contendo apoB são similares àquelas vistas em humanos55; 2) fígado de coelhos produzem VLDL contendo apoB-100, como em humanos56; 3) abundância de proteína de transferência de ésteres no plasma de coelhos57.
Pelo menos 4 mecanismos são responsáveis pela homeostase do colesterol e afetam as concentrações de colesterol plasmático (
Em coelhos, a atividade da 7α-hidroxilase e níveis de mRNA são inibidos após dieta hipercolesterolêmica com níveis de colesterol plasmático substancialmente elevados58. Entretanto, Overturf e cols.59 descobriram que, alimentando coelhos com 0,1% de suplementação de colesterol por 7 meses, não produziram hipercolesterolemia, ao passo que aumentando gradualmente o consumo de colesterol dietético, aumentou-se o tamanho do
A excreção de ácidos biliares aumenta a taxa do
Ácidos biliares são conhecidos por serem reabsorvidos no intestino por mecanismos passivos e ativos. Passivamente, o consumo ocorre via não iônica, iônica e difusão de micelas conjugadas ou não conjugadas a ácidos biliares e, ativamente, a absorção saturável ocorre via Na+ dependente de ácidos biliares conjugados contra o gradiente de concentração. Várias espécies, incluindo coelhos, demostram possuir ambos os processos de reabsorção de ácidos biliares62.E, no entanto, devido à natureza hidrofílica relativa de ácidos biliares conjugadosa porém, sofrem uma reabsorção intestinal passiva mínima devido à natureza hidrofílica relativa de ácidos biliares conjugados. O sítio primário de reabsorção de ácido biliar predominantemente é mediado por co-transportador ácido biliar Na+/bile ileal (ABST) e, a interrupção da circulação êntero-hepática dos ácidos biliares pela atenuação da reabsorção de ácidos biliares intestinais é considerada uma das melhores vias de redução dos níveis de colesterol plasmático62. Higaki e cols.63 demonstraram com inibidor de ABST redução das quantidades de retorno de ácido biliar para o fígado e aumento da conversão de colesterol para ácido biliar em coelhos alimentados com colesterol.
O efeito inibitório do colesterol dietético sobre 7α-hidroxilase em coelhos pode ajudar a explicar porque alguns indivíduos são mais sensíveis ao colesterol na dieta e aumentam as concentrações plasmáticas. Esses indivíduos podem responder a dieta hipercolesterolêmica com diminuída síntese de ácido biliar contribuindo para elevar os níveis de colesterol plasmáticos e reduzir os receptores de LDL. Alternativamente, outras pessoas respondem para dieta rica em colesterol com a síntese de ácido biliar sendo estimulada e, assim, os níveis de colesterol plasmáticos não aumentam. Identificando esses indivíduos, pode-se ajudar a esclarecer seu risco aterogênico e, assim, usar recomendações dietéticas mais sensíveis para o tratamento58.
Considerando que a prevalência de aterosclerose e doença cardíaca isquêmica está aumentando no mundo, ocasionando sérias consequências clínicas que exigem esforços para melhorar o conhecimento de sua patogênese, entende-se que é necessário buscar melhorias nas técnicas experimentais e nos novos tratamentos para essas condições, com avanços no uso de modelos experimentais.
Nesse sentido, o coelho como modelo experimental é uma importante ferramenta para o estudo da aterosclerose entre os animais que têm sido utilizados nas investigações científicas. Representa, dentre os animais estudados, o único que tem tendência para exibir hipercolesterolemia pela acumulação de colesterol exógeno com poucos dias de altas concentrações na dieta, já que não pode aumentar a excreção de esteróis. No entanto, cuidadosas extrapolações devem ser realizadas em relação ao grau de hipercolesterolemia produzido em animais de laboratório, uma vez que excedem o que usualmente encontramos em humanos. Limitações e avanços devem ser discutidos para que possam contribuir e elucidar os conhecimentos sobre etiologia, fisiopatologia e tratamento da aterosclerose com a caracterização dessas descobertas.
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro e bolsa de pesquisa e à Rede Mineira de Toxicologia e Farmacologia -TOXIFAR da Fapemig.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPEMIG.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Waleska Cláudia Dornas pela Universidade Federal de Ouro Preto.
Correspondência: Tanus Jorge Nagem Rua Tulipa, 357 - Esplanada 30280-200 - Belo Horizonte, MG - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 27/11/08; revisado recebido em 29/06/09; aceito em 24/08/09.
Many researches have been conducted in experimental models in order to study the development of atherosclerosis from hyperlipidemia-inducing diets. Since rabbits are very sensitive to cholesterol-rich diets and accumulate large amounts of cholesterol in their plasma, their use as experimental models to evaluate the development of atherosclerosis is highly relevant and brings information on factors that contribute to the progression and regression of this condition that can be applied to humans. As such, this review includes studies on the atherogenic function of cholesterol based on rabbits as the experimental model, since they have become the most largely used experimental model of atherosclerosis.
IUniversidade Federal de Ouro Preto
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IIIUniversidade Federal de Viçosa, Belo Horizonte, MG - Brazil
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Many researches have been conducted in experimental models in order to study the development of atherosclerosis from hyperlipidemia-inducing diets. Since rabbits are very sensitive to cholesterol-rich diets and accumulate large amounts of cholesterol in their plasma, their use as experimental models to evaluate the development of atherosclerosis is highly relevant and brings information on factors that contribute to the progression and regression of this condition that can be applied to humans. As such, this review includes studies on the atherogenic function of cholesterol based on rabbits as the experimental model, since they have become the most largely used experimental model of atherosclerosis.
The importance of plasma lipoprotein and lipid metabolism abnormalities characterized by hyperlipidemia and/or hypercholesterolemia as the cause of coronary heart diseases and potential atherosclerosis is increasingly being supported by a considerable number of population-based and epidemiological studies today1. Hypercholesterolemia-inducing diets in rabbits have been largely used as a model to study the development of human atherosclerosis.
The first investigation on experimentally induced atherosclerosis dates back to 1908. Ignatowski used rabbits fed milk, meat and eggs and observed increased intimal thickness of the aorta. Later, Lubarsch (1910, 1912) and Steimbiss (1913) were able to develop atherosclerosis in the aorta of rabbits fed diets including internal organs such as liver, adrenal gland and muscle. These studies, as well as others, showed a causal effect of animal proteins; however, other researchers believe that the element of the diet that caused atherosclerosis was cholesterol rather than animal tissue proteins2.
In order to evaluate the theory of atherogenesis from cholesterol, Clarkson and Newburgh (1926) fed rabbits a normal diet, with increasing doses of cholesterol of 25, 113, 253 or 507 mg/day, administered in capsules. Moderate atherosclerosis was found in 71% of the rabbits fed 507 mg/day of cholesterol for 47-87 days. Meeker & Kesten (1940, 1941) dissolved 60 or 250 mg of cholesterol in vegetable oil and added it to the diet of rabbits for three months. The animals developed typical atherosclerotic lesions similar to those seen in humans, thus corroborating the theory that cholesterol was the precursor for the development of atherosclerotic vascular disease3.
In order to induce hypercholesterolemia in animals, cholesterol-containing diets have been used, and these vary from commercial chow supplemented with substantially different levels of cholesterol, to changes in the amount of lipids, carbohydrates and the different fat sources and contents, whether with or without cholic acid4. In our laboratory, we have been inducing hypercholesterolemia in rabbits by adding 1% of cholesterol to commercial chow in several studies with the purpose of investigating substances that can be further made viable as medications for the control of lipid metabolism, and also of developing tests of potential therapies and diagnosis between different experimental procedures5-12.
The objective of the present review was to make a critical analysis of the hypercholesterolemic effect of cholesterol-rich diets in studies using rabbits as the experimental model that can lead to a better understanding of the biology of atherosclerosis in cardiovascular diseases.
For a better understanding of the relationship between disorders of cholesterol metabolism and atherogenesis, diet manipulation and the use of animals with inherited metabolic errors such as Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL) and St. Thomas Hospital (STH) rabbits to induce familial hypercholesterolemia and hyperlipidemia combined with hypercholesterolemia, respectively, have been the focus of many experiments. Today, gene deletion technology has made possible studies producing a variety of transgenic animal models with lipoprotein disorders but, despite this revolutionary breakthrough, many of these genetically modified animals have been fed cholesterol to accelerate atherogenesis2.
The term "endothelial dysfunction", which has an important implication in the management of cardiovascular diseases, is used to describe situations in which the endothelium loses its vasoprotective property, and represents the initial phase of several processes of vascular lesion such as mechanical damage; hypercholesterolemia; atherosclerosis; and systemic hypertension13. In addition, vascular endothelial relaxation in response to acetylcholine is decreased, thus leading to vasoconstriction and reduced blood flow, as demonstrated by Sun et al14 in cholesterol-fed rabbits, since this decreased vasodilation may be caused by the presence of lipid plaques in the aorta.
Rabbits receiving a supplementation of 1% cholesterol in their diets for 8-10 weeks show impaired endothelial vasodilation in the carotid artery15 and abnormalities of the nitric oxide (NO) synthesis, as demonstrated in atherosclerotic vessels16. Considering hyperlipidemia and atherosclerosis, aortic segments of hypercholesterolemic rabbits show significant reduction of endothelial nitric oxide synthase (NOS) in relation to controls17. Vasquez-Vivar et al18 reported that BH4, a cofactor for the synthesis of NO in the aorta of rabbits fed a hypercholesterolemia-inducing diet, was markedly reduced in comparison to normocholesterolemic rabbits. Oxygen-free radicals such as the superoxide anion can modulate the activity of endogenous NO in hypercholesterolemic rabbits19,20. Interestingly, this demonstrates that NOS expression reported in vascular smooth muscle of hypercholesterolemic rabbits21,22 is not able to dominate the defects of the endogenous vascular function.
The increase in basal nitric oxide and in endothelium-derived vasodilators is more significant in endothelium-intact aortic rings of female rabbits than in those of males and depends on circulating estradiol concentrations23. Therefore, females are less susceptible to a diet inducing atherosclerotic lesions than males, but it depends on the state of the arterial endothelium, as observed by Holm et al24. Estradiol inhibits monocyte adhesion to endothelial cells with transendothelial migration, components of an inflammatory response that continually occurs throughout the atherogenic process after induced hypercholesterolemia in rabbits25.
The development of interventions aimed at inhibiting atherosclerosis from cholesterol, and vascular dysfunction have received much attention because of this important association. L-arginine (a NOS substrate) depletion in animal models of atherosclerosis and hypercholesterolemia induces platelet aggregation, cell proliferation, and vascular monocyte accumulation, whereas endothelial-dependent vasoreactivity is improved in hypercholesterolemic rabbits treated with L-arginine, thus attenuating the mechanisms of vascular lesion26 and inhibiting neointimal proliferation27, which can be assessed by means of several endothelial cell markers proposed (
Von Willebrand factor was recently studied in rabbits fed a cholesterol-rich diet for 30 days. Hypercholesterolemia was observed to induce increased levels of this factor, which later decreased after withdrawal of the cholesterol-rich diet. This showed a positive correlation with fatty streak formation in both study phases, while there was a decrease in vascular endothelial growth factor levels after withdrawal of the cholesterol-rich diet. This could be a reparative mechanism in the early atherosclerosis, and could also reflect endothelial cell damage28.
While evaluating the effects of hypercholesterolemia on the risk of atherosclerosis using C-reactive protein (CRP), Sun et al29 showed that CRP is frequently deposited in atherosclerotic lesions in rabbit models. Additionally, high plasma CRP levels are associated with the severity of hypercholesterolemia30.
Increased NO synthesis may be a defense mechanism to compensate NO inactivation and protect against factors that represent body damage, with nitrite being a potent metabolite correlated with fatty streak formation; this has already been studied in the short and long term in cholesterol-fed rabbits 31.
Parallel to these findings, endothelial function of vascular segments has been proven to be the earliest alteration in atherogenesis. The functional impairment of endothelial cells is demonstrated in the clinical consequences, such as the occurrence of events subsequent to the progression of plaque formation in the intima (
The cholesterol-fed rabbit model is remarkable because of the rapid development of aortic lesions and low maintenance cost, and the typical diet to induce atherosclerosis involves supplementation of 0.5% to 4% cholesterol per weight for approximately 8 to 16 weeks. Under these conditions, rabbits rapidly become hypercholesterolemic (plasma cholesterol > 1,000 mg/dl), and the resulting lesions primarily consist of macrophage-derived foam cells32. However, the relationship between atherosclerotic lesion formation and hypercholesterolemia-inducing diets in rabbits is dependent on the cumulative exposure rather than on the level of administered cholesterol, with rabbits fed 5.5% and 1.0% cholesterol showing similar degrees of induced hypercholesterolemia14. Some researchers support the suggestion that the formation of advanced lesions depends on the age of the animal. Aged rabbits, with 3-4.5 years of age, show fibrotic plaques, whereas young animals (4 months of age) do not show advanced lesions33.
Since rabbits have been widely used to study the development of atherosclerosis in humans, rapid development of lesions has been achieved by supplementing their diet with cholesterol (<0.5%), thus reaching moderate hypercholesterolemia, with plasma cholesterol levels in the range of 200 to 800 mg/dl34. Consequently, the lesions usually produced are topographically and morphologically different from those seen in humans. This difference is partly due to the fact that humans do not usually eat large amounts of cholesterol: generally their plasma cholesterol levels do not exceed 800 mg/dl, and they process and tolerate cholesterol intake better than rabbits. Additionally, long-term experiments in rabbits fed diets containing large amounts of cholesterol are discouraging due to hepatotoxicity and failure of the animal to thrive. Gross examinations revealed hepatomegaly with evidence of bile stasis at plasma cholesterol levels of 3,257 ± 266 mg/dl32. However, despite these restrictions, a large number of studies use this model to test the efficiency of drugs in the development of fatty streaks.
Atherosclerotic lesions are composed of three major components. The first is the cell component, which is predominantly comprised of smooth muscle cells and macrophages. The second component is the connective tissue matrix and extracellular lipid. The third is intracellular lipid, which accumulates within macrophages, then converting into foam cells35. In previous cell events, the presence of leukocytes adhered to the thoracic and abdominal aorta has been observed in rabbits fed a 0.2% cholesterol-enriched diet for three weeks. After 3-5 weeks on the same diet, numerous foam cells are found in the subendothelial space and constitute the development of fatty streaks in the same site where adherent monocytes had been previously observed36.
In the aorta, several types of plaques going from fatty streak to atheromatous lesions are observed in experimental models, depending on the degree of cholesterol intake. Diets containing < 0.15% cholesterol result in the development of fatty streak lesions, whereas atheromatous plaques are more frequently found when high amounts of cholesterol are present in the diet32.
The degree of atherosclerosis in rabbits tends to be greater in the abdominal aorta than in the thoracic aorta, and this can be explained by the hemodynamic effect or by the fact that the abdominal aorta of rabbits gradually tapers down to the aortic bifurcation. Therefore, the distal aorta may have more lesions than the proximal aorta37. Atheromatous changes after 8 weeks in rabbits fed cholesterol initiate in the thoracic aorta and then extend to the abdominal aorta, coronary artery and other vessels, with a predominance of concentric lesions in the thoracic aorta and proximal portion of the coronary artery in contrast to mild atherosclerosis found in the renal, carotid and femoral arteries in the 15th week of diet38. However, the extent to which the exposure to cholesterol influenced this type of lesion is not clear in this study.
The extent of atherosclerosis in the aorta of rabbits may be quantified by the area of sudanophilic lesions39 and by immunohistochemical analyses40. Recently, non-invasive magnetic resonance imaging (MRI) has been used in the study of vascular lesions. MRI quantification and changes in the composition of atherosclerotic plaques may be used with MRI to monitor the progression and regression of in vivo atherosclerosis. The advantage of this method is that serial studies may be conducted in order to verify the response to therapeutic interventions41.
Histological studies on the rate of stenosis, in turn, are an important method for the assessment of the severity of coronary atherosclerosis, because the rate is considered a direct reflex of the clinical condition. On the other hand, the assessment method using gross examination of atherosclerotic coronary arteries in rabbits has some advantages in relation to histological methods, since the analysis of the lesion area may be carried out in a short time, while the overall image of the atherosclerosis distribution may be easily understood. When tissue sections of atherosclerotic coronary lesions are necessary, it is possible to remove only the atherosclerotic plaque portion, which can be macroscopically observed from the luminal surface of the coronary artery42.
Vascular lesions play an important role in cardiovascular disorders, although the participation of hypercholesterolemia in thromboembolic events remains poorly understood, thus requiring a better understanding.
Rupture of the atherosclerotic plaque is known to be the major cause of thrombosis and subsequent clinical manifestations of atherosclerosis such as unstable angina, myocardial infarction and stroke, in addition to being a target of clinical intervention43-45. However, it is still difficult to predict when plaque rupture will occur, since the additional physiological stimulus required to trigger this event is unknown. The mechanisms of posterior plaque rupture and formation of subsequent occlusive thrombi remain not fully understood. Furthermore, it is still not clear whether plaques without thrombi can cause cardiac events44. Two main hypotheses have been proposed for the causes of plaque rupture (
Several animal models of plaque rupture have been reported in the past few years. In cholesterol-fed rabbits, the lesion is commonly induced using an intravenously injected balloon containing Russel’s viper venom and histamine, a procedure that will result in plaque rupture and thrombosis37. Another model is that of cholesterol-fed rabbits with implantation of a balloon catheter in the thoracic aorta. The balloon is inflated after the atherosclerotic lesion is formed around it, thus leading to lesion rupture and thrombosis46. However, both are models of acute mechanically-induced cases in a research context. Thus, the value of these models for the study of cell apoptosis, inflammation, increased lipids, and degradation of the fibrous capsule is limited due to different and marked characteristics of the plaques formed in these models in comparison to those found naturally in humans since, in the latter, the lesions are restricted to the subendothelial region, thus maintaining the integrity of the internal elastic layer47.
The atherosclerotic plaque is not a static structure. Rather, its status at any given moment is the result of the complex and dynamic interplay of a very large number of cellular and humoral factors48. Rekhter et al49 observed plaque destabilization determined by collagen breakdown with local loss of the cellular source of collagen synthesis in rabbits49. The authors demonstrated a time-dependent decrease in total collagen content in lipid-rich plaques, whereas the level of cross-linking did not differ between high and low cholesterol intake in the groups. A mechanical link between hypercholesterolemia and collagen loss is still hypothetical, although a critical function of macrophages and other proteolytic enzymes has been strongly suggested.
Hypercholesterolemia-inducing diet in rabbits selectively increases thrombus formation and embolism in arterioles, but not in venules. The observation that increased total plasma cholesterol results mainly in increased LDL cholesterol suggests that the effects seen of hypercholesterolemia on arteriolar thromboembolism are caused by LDL, and that the stimulus to endogenous NO production by excess L-arginine is able to antagonize this increased cholesterol, hence this enhancement of arteriolar thromboembolism50.
If a thrombus is occlusive, it will lead to myocardial infarction45. Since plaque rupture is the main clinical complication, plaque stabilization is crucial, and a lipid-lowering diet proved able to significantly reduce the proteolytic activity and increase the collagen content in atheromas established in rabbits51. The substantial degree of clinical benefit seems not to be proportional to the improvement in the stenosis produced by lipid lowering that stabilizes the atheromatous plaque by reducing the levels and activity of proteinases that can degrade key structural components of the arterial extracellular matrix51. Thus, the ability of the plaque to resist rupture is reinforced.
The administration of angiogenic growth factors is an interesting new approach to ischemic cardiac disease. Fibroblast growth factor promotes vascular repair and angiogenesis, inducing tissue factor expression in circulating monocytes and the vascular wall of normal and hypercholesterolemic rabbits52.
According to Abela et al53, rabbit models with arterial lesions that develop thrombosis after mechanical arterial wall injury and cholesterol-rich diet lead to plaques vulnerable to rupture and thrombosis, and can be used to test pharmacological agents that may reduce the development of vulnerable atherosclerotic plaques such as lipid-lowering agents; antioxidants; calcium channel blocking agents; and angiotensin-converting enzyme inhibitors. Antiplatelet and antithrombotic agents can be tested for their ability to reduce the amount of thrombus complicating plaque disruption. However, spontaneous plaque rupture does not occur in these models, although the triggering stimulus may lead to arterial thrombosis. Lesions produced in these animals by a combination of injury and a high-lipid diet lead to the formation of fibrous caps consisting of smooth muscle cells. Some aspects of human atheromas, typically formed in decades, may not be similar to those of atheromas obtained in a relatively short time in rabbit experiments51.
Rabbits are an animal species that have several aspects similar to those of humans as regards the lipoprotein metabolism, except for hepatic lípase defficiency54. Several characteristics of rabbits make them an excellent model for the assessment of effects of human transgenes on lipoprotein metabolism and susceptibility to atherosclerosis: 1) apoB-containing lipoproteins are similar to those seen in humans55; 2) rabbit liver produces apoB-100-containing VLDL, like in humans56; 3) abundance of ester-transfer protein in rabbit plasma57.
At least four mechanisms are responsible for cholesterol homeostasis and affect plasma cholesterol concentrations (
In rabbits, 7α-hydroxylase activity and mRNA levels are inhibited after a hypercholesterolemia-inducing diet with significantly high plasma cholesterol levels58. However, Overturf et al59 found that by feeding rabbits a diet supplemented with 0.1% cholesterol for 7 months, this did not induce hypercholesterolemia, whereas by gradually increasing diet cholesterol intake, the bile acid pool increased inversely to 7α-hydroxylase activity60.
Bile acid excretion increases the clearance rate, which decreases the effective concentration of intracellular cholesterol, thus inhibiting the influence of cholesterol on the expression of LDL receptors, since bile acids are predominantly reabsorbed via the enterohepatic circulation and return to the liver to exert a negative feedback control on the 7α-hydroxylase enzyme and to regulate cholesterol metabolism61.
Bile acids are known to be reabsorbed in the intestine via passive and active mechanisms. Passive uptake occurs via non-ionic, ionic and micellar diffusion of conjugated or unconjugated bile acids; active, Na+-dependent, saturable absorption of conjugated bile acids occur against a concentration gradient. It has been proven that several species, rabbits included, have both bile acid reabsorption processes62. However, they have minimal passive intestinal reabsorption due to the relative hydrophilic nature of conjugated bile acids. The primary site of bile acid reabsorption is predominantly mediated by the ileal Na+/bile acid (IBAT) cotransporter and the interruption of the enterohepatic circulation of bile acids through attenuation of intestinal bile acid reabsorption is considered one of the best pathways for the reduction of plasma cholesterol levels62. Higaki et al63 used IBAT inhibitor and demonstrated a reduction in the amount of bile acid return to the liver and increased conversion of cholesterol into bile acid in cholesterol-fed rabbits.
The inhibitory effect of diet cholesterol on 7α-hydroxylase in rabbits can help explain why some individuals are more sensitive to diet cholesterol and have their plasma cholesterol concentration increased. These individuals may respond to a high-cholesterol diet with a decreased bile acid synthesis, thus contributing to the elevation of plasma cholesterol levels and reduction of LDL receptors. Alternatively, other individuals respond to a cholesterol-rich diet with increased bile acid synthesis and, thus, plasma cholesterol levels do not increase. Identifying these individuals may help determine their atherosclerosis risk so that more sensible recommendations can be made for dietary treatment58.
Considering that the prevalence of atherosclerosis and ischemic heart disease is increasing worldwide, with serious clinical consequences that require efforts for a better understanding of their pathogenesis, it is clear that the search for improved experimental techniques and new therapies for these conditions is necessary, seeing the advances in the use of experimental models.
In this sense, rabbits as experimental models are an important tool for the study of atherosclerosis among the animals that have been used in clinical investigations. Among the animals studied, only rabbits show a tendency to develop hypercholesterolemia via accumulation of exogenous cholesterol after a few days receiving high-cholesterol diets, since their sterol excretion cannot be increased. However, careful extrapolations should be made in relation to the degree of hypercholesterolemia produced in laboratory animals, since they exceed the levels usually found in humans. Limitations and advances should be discussed so that they can contribute to and broaden the knowledge on the etiology, pathophysiology and treatment of atherosclerosis with the characterization of these findings.
The authors thank
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPEMIG.
This article is part of the thesis of master submitted by Waleska Cláudia Dornas, from