FUNDAMENTO: Os corticosteroides limitam o crescimento tardio das lesões por radiofrequência (RF) no músculo da coxa de ratos filhotes, mas seus efeitos em ratos púberes e adultos são desconhecidos. OBJETIVO: Avaliar os efeitos dos corticoesteroides na cicatrização das lesões por RF no músculo da coxa de ratos em diferentes faixas etárias. MÉTODOS: Realizou-se ablação no músculo da coxa de 30 ratos (1 lesão por animal): infantis (30 dias de idade, peso 73 g, n = 10), púberes (60 dias de idade, peso 230 g, n = 10) e 10 adultos (90 dias de idade, 310 g, n = 10), subdivididos em controles e tratados, que receberam Hidrocortisona (10 mg/kg IM pós-RF) e Betametasona (3,5 mg/kg IM, duas vezes por semana, por 29 dias). Os ratos foram sacrificados 60 dias após a ablação para análise histopatológica e planimétrica com software específico (ImageJ®). RESULTADOS: Nos infantis, púberes e adultos o ganho de peso no seguimento não diferiu entre controles e tratados. Nos controles, as lesões dos infantis e púberes eram maiores (p = 0,01) que as dos adultos. O tratamento reduziu o tamanho da lesão nos infantis (5,58+0,61 mm² vs 4,02+0,23 mm²; p < 0,01) e nos púberes (5,20+0,47 mm² vs 4,16+0,48 mm²; p < 0,01), mas não nos adultos (4,44+0,50 mm² vs 4,79+0,53 mm², p = NS). Tratados Infantil e Púbere apresentaram menor deposição de colágeno e menos traves fibróticas invadindo o tecido saudável a partir da área de fibrose central, e compondo lesão de dimensões notadamente mais reduzidas que seus controles. Não houve diferenças nos grupos adultos. CONCLUSÃO: Os corticoesteroides parecem reduzir o crescimento tardio da lesão, além de atenuar a proliferação fibrótica nos ratos infantis e púberes.
ARTIGO ORIGINAL
EXPERIMENTAL
Efeitos dos corticoesteroides nas lesões por radiofrequência na coxa de ratos em diferentes faixas etárias
Disciplina de Cardiologia e Departamento de Patologia - Escola Paulista de Medicina - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil
Atualmente a ablação por cateter com energia de radiofrequência (RF) é o procedimento de eleição para o tratamento de pacientes portadores de taquiarritmias, inclusive pediátricos1, devido a sua eficácia e segurança. Entretanto, os efeitos da ablação por RF não se restringem apenas ao momento da aplicação da energia. Efeitos tardios podem se manifestar até seis meses pós-procedimento, como, por exemplo, o bloqueio atrioventricular tardio após ablação de taquicardia por reentrada nodal atrioventricular2. Os mecanismos desses efeitos tardios ainda permanecem obscuros, mas parecem estar relacionados ao crescimento da lesão durante a sua cicatrização, provavelmente por progressão do processo inflamatório e/ou injúria à microcirculação ou dano ultraestrutural ao tecido circunjacente.
Saul e cols.3 demonstraram que lesões por RF no miocárdio ovino imaturo apresentam acentuado crescimento tardio e invasão do tecido miocárdico normal por tecido fibroelástico, achados esses que apontam para possíveis efeitos pró-arrítmicos em populações pediátricas submetidas à ablação por RF, eventualmente levando à morte súbita. Como o processo inflamatório parece participar da extensão tardia da lesão, temos como hipótese que os corticoesteroides poderiam atenuar esse processo4. Nesse aspecto, demonstramos em publicação prévia que os corticoesteroides limitam o crescimento tardio das lesões por RF no músculo da coxa de ratos filhotes5. Porém, essa investigação apresentava algumas limitações relevantes: os efeitos do tratamento nas dimensões da lesão foram aferidos apenas qualitativamente, sem qualquer quantificação; como os animais foram sacrificados no último dia do tratamento (30 dias pós-ablação), o resultado final da cicatrização não foi estabelecido; por fim, não foi determinada a faixa etária na qual o crescimento tardio deixa de ocorrer, uma vez que a faixa etária intermediária (púberes) não foi investigada. O esclarecimento dessas questões motivou a realização do presente trabalho.
Portanto, avaliamos aspectos qualitativos e quantitativos da cicatrização consolidada das lesões por RF sob efeito dos corticoesteroides no músculo da coxa de ratos em diferentes faixas etárias (infantis, púberes e adultos).
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo.
Foram utilizados 30 ratos (
1) 05 (cinco) ratos infantis com 30±03 dias de idade - Controles (1m-C).
2) 05 (cinco) ratos infantis com 30±03 dias de idade - Tratados (1m-T).
3) 05 (cinco) ratos púberes com 60±03 dias de idade - Controles (2m-C).
4) 05 (cinco) ratos púberes com 60±03 dias de idade - Tratados (2m-T).
5) 05 (cinco) ratos adultos com 90±03 dias de idade - Controles (3m-C).
6) 05 (cinco) ratos adultos com 90±03 dias de idade - Tratados (3m-T).
As faixas etárias dos ratos infantis, púberes e adultos corresponderiam aproximadamente em humanos, respectivamente, a lactentes e crianças pequenas, ao início da puberdade, e a adolescentes e adultos jovens.
Na indução anestésica foram utilizados: Acepromazina a 0,2% (0,1 mg/kg IM), e associação dos Cloridratos de Tiletamina e Zolazepam (30 mg/kg IM); com manutenção do plano anestésico cirúrgico através da inalação do Isofluorano, sob ventilação espontânea.
Foram realizadas tricotomia e antissepsia do membro posterior direito do rato; procedeu-se à incisão sobre a região do músculo da coxa de aproximadamente 1,0 cm. Pele e fáscia foram dissecadas e afastadas, expondo a região dos músculos mediais do membro pélvico (Semitendinoso e Gastrocnêmio)5.
Um cateter de ablação convencional (Marinr, Medtronic®, 7Fr - ponta de 4mm), conectado ao gerador de RF (AtakrTM, Medtronic®CardioRhythm) com potência máxima de 50 Watts, foi paralelamente posicionado, sob pressão manual constante, sobre o tecido muscular exposto5. Aplicações unipolares de RF (uma por animal) foram realizadas, sob controle de temperatura (70°C, 60 segundos), entre o eletrodo distal do cateter de ablação e placa-eletrodo indiferente sub-posicionada na face medial do membro pélvico. Durante cada aplicação, potência, impedância, temperatura da ponta do cateter e tempo foram monitorados e suas médias anotadas para posterior análise. Posteriormente à ablação, a ferida foi suturada.
Os procedimentos foram realizados pelo mesmo operador, sob condições estéreis, para prevenir infecções. Antibióticos profiláticos não foram utilizados. Em todo o protocolo, a coxa esquerda (a ablação foi feita na coxa direita) foi utilizada para a inoculação dos anestésicos e corticoesteroides.
Metade da população recebeu corticoesteroides consoante a sua respectiva faixa de peso, enquanto a outra metade nada recebeu, servindo de grupo controle. Antes desse procedimento, o peso inicial de cada rato foi anotado para ajuste da dosagem dos corticoesteroides: Hidrocortisona (10 mg/kg IM) inoculada imediatamente após a ablação e, posteriormente, Betametasona (3,5 mg/kg IM) duas vezes por semana - 2ª e 5ª feiras - durante 29 dias pós-procedimento. Para ajuste das dosagens, os ratos foram pesados semana a semana, imediatamente antes de cada inoculação.
Os animais permaneceram albergados no laboratório, sob supervisão médico-veterinária, sendo sacrificados 60±05 dias pós-ablação, ou seja, 30 dias após o término da terapia, de forma a avaliar o aspecto consolidado da cicatrização da lesão.
Ao final do seguimento, os ratos foram repesados para avaliação do ganho ponderal (
A exemplo do nosso estudo anterior5, não foi realizada a aferição das dimensões macroscópicas das lesões crônicas, sejam dos ratos infantis, dos púberes ou dos adultos. A principal razão para isso é que tais lesões são mal delimitadas, principalmente nos dois primeiros grupos, tornando muito imprecisa a sua medição.
As peças retiradas foram conservadas individualmente em formol a 10%. A lesão foi fatiada em diversos cortes histológicos de modo que a abrangesse completamente. As lâminas (três lâminas/peça) foram coradas por H.E. e tricrômico de Masson. Durante a análise qualitativa, as lesões eram delimitadas na própria lâmina (
Além dos aspectos histopatológicos de cada lesão dedicou-se especial atenção à leitura da proliferação fibrótica e dos infiltrados celulares inflamatórios. Como previamente demonstrado em ovinos3 e no músculo da coxa de ratos5, as lesões agudas por RF em adultos e filhotes são semelhantes. Contudo, enquanto nos adultos as dimensões das lesões crônicas se mantêm comparáveis às das lesões agudas, nos filhotes elas aumentam acentuadamente. Portanto, no presente estudo, por definição5, o crescimento tardio da lesão foi caracterizado pelo aumento na dimensão das lesões por RF em relação aos adultos, enquanto que a sua extensão tardia foi definida como a ocorrência de múltiplas extensões de tecido fibroelástico que, a partir da área fibrótica central, invadem o tecido muscular saudável circunjacente às lesões crônicas por RF.
Para a avaliação planimétrica das lesões, utilizou-se o software ImageJ®6,7 - amplamente difundido em citometria8 e outros estudos planimétricos9-12 - que calcula automaticamente a área da lesão (
Em cada animal, a lâmina que apresentasse a maior área de lesão (largura e comprimento em mm2) era utilizada como estimativa do tamanho da lesão. Em função da complexa geometria das lesões, muito irregulares e espraiadas, principalmente nos infantis, apesar do número relativamente grande de cortes histológicos realizados, não foi possível quantificar o volume das lesões.
As variáveis são expressas como média±desvio-padrão. Utilizou-se análise da variância (ANOVA) para a comparação entre os grupos da amostra. Valores de p<0,05 foram considerados significantes.
Uma lesão por RF foi criada na coxa de cada animal. Como exemplificado na
Durante o seguimento, nenhum animal apresentou intercorrências, tampouco infecções locais ou sistêmicas. Do procedimento à eutanásia, todos os grupos apresentaram ganho ponderal significativo (
Nos infantis e púberes, as lesões eram extensas (aproximadamente 2 cm de largura), de coloração pálida e bordos irregulares, dificultando a visualização de seus limites e inviabilizando a aferição macroscópica das suas dimensões. Nos adultos, por sua vez, as lesões eram mais bem delimitadas, com bordos regulares e caracterizadas por áreas arredondadas de coloração pálida com cerca de 1 cm de largura. Em todos os grupos, as lesões eram rasas, com profundidade em torno de 2 mm.
Os achados qualitativos foram muito consistentes em todos os grupos, como se observa na
Já nos infantis e púberes tratados, as lesões apresentaram dimensões notadamente reduzidas em relação aos controles. As cicatrizes eram imaturas, com retardo na cicatrização, caracterizada por menor deposição colágena e presença de tecido de granulação. Além disso, havia menos traves fibróticas invadindo o tecido saudável a partir da área de fibrose central. Nos adultos tratados, não se notaram diferenças apreciáveis em relação aos controles.
Como ilustrado na
Neste modelo de ablação por RF no músculo da coxa de ratos, pudemos demonstrar, qualitativamente e quantitativamente, que: 1) as lesões nos infantis e púberes apresentam crescimento e extensão tardios, de forma mais acentuada nos infantis, o que não ocorreu com os adultos; 2) os corticoesteroides parecem atenuar tais fenômenos nessas faixas etárias. Esses achados corroboram e estendem nossas observações prévias neste modelo experimental, quando demonstramos que os corticoesteroides reduziam o crescimento tardio da lesão em filhotes5.
No presente estudo, observamos o efeito final dos corticoesteroides, pois a eutanásia foi realizada 30 dias após o término do tratamento, totalizando seguimento de 60 dias pós-ablação. Desse modo, estudamos as lesões já consolidadas. Em nosso estudo inicial, o sacrifício deu-se imediatamente ao final do tratamento (30 dias pós-ablação). Portanto, não se sabia se os efeitos dos corticoesteroides se manteriam a longo prazo, o que agora pudemos confirmar.
Além disso, em nosso trabalho pioneiro5, os efeitos do tratamento nas dimensões das lesões não puderam ser quantificados, baseando-se exclusivamente em critérios histológicos qualitativos. No presente trabalho, por outro lado, pela primeira vez na literatura, as lesões foram mensuradas através de
É importante ressaltar que não foi possível aferir o volume das lesões, pois sua geometria é muito irregular (principalmente em sua periferia), e por isso optamos pela aferição da área central da lesão em mm2. Para tal, dentre os vários cortes histológicos de uma mesma peça, selecionamos o que apresentava maiores dimensões de largura e comprimento como representante da lesão. Embora não possibilite determinar volume total da lesão, o método utilizado se mostrou adequado e reprodutível para estimativa do tamanho da lesão e comparação entre os grupos - nosso maior objetivo. Reforçando a adequação da nossa metodologia, observou-se redução na área de lesão secundária ao tratamento nos infantis (28%) e nos púberes (20%), mas não nos adultos, nos quais já se demonstrou que os corticoesteroides não reduzem o tamanho das lesões por RF4. Por fim, os achados quantitativos foram corroborados pela análise qualitativa realizada pelo patologista.
Outra contribuição inédita do presente estudo foi demonstrar que as lesões por RF nos púberes ainda apresentam crescimento e extensão tardios, embora menos acentuados que nos infantis. Já havíamos relatado que a evolução dessas lesões nos ratos infantis (correspondentes a lactentes e crianças pequenas) e adultos (correspondentes a adolescentes e adultos jovens) era semelhante à observada no miocárdio ovino3 e canino4. Enquanto nos adultos, histologicamente, a lesão crônica se caracteriza por cicatriz bem definida, com bordos delimitados, nos infantis ocorre acentuado crescimento da lesão, com cicatrizes mal delimitadas e extensas, evidenciando invasão do músculo adjacente por múltiplas traves de tecido fibroblástico. As lesões nos púberes (correspondentes ao início da puberdade) apresentam características intermediárias entre os infantis e os adultos. Embora as lesões revelem aumento das suas dimensões em relação aos adultos (crescimento tardio), a cicatriz se apresenta mais bem delimitada que nos infantis e com menor invasão do tecido adjacente por traves fibrosas (extensão tardia).
O aumento de tamanho das lesões por RF em tecidos musculares imaturos tem sido atribuído a dois fatores: distensão passiva secundária ao crescimento do músculo, como ocorre nas cicatrizes de atriotomia criadas em cães filhotes13, e proliferação celular dos elementos constituintes da lesão, responsável pelas traves fibrosas invadindo o tecido circunjacente. Isso porque, nessa fase, em contraste com o músculo adulto, as células musculares e intersticiais se dividem ativamente14,15. Nossos achados sugerem que, nos púberes, o crescimento passivo predomina em relação à proliferação celular, enquanto nos infantis os dois componentes imperam.
Durante o seguimento, o ganho ponderal dos filhotes foi de 350% e o dos púberes 70%, valores esperados para essas faixas etárias. A análise histológica qualitativa foi consistente ao observar que as lesões dos infantis eram maiores que as dos púberes. Entretanto, embora a área de lesão dos infantis (5,58+0,61 mm2) tenha sido maior que a dos púberes (5,20+0,47mm2), essa diferença não atingiu significância estatística (p > 0,10). Isso pode estar relacionado ao tamanho da amostra ou à metodologia de medição empregada, que, por aferir apenas a área central da lesão, tende a subestimar lesões extensas e de geometria irregular, como são características dos ratos infantis.
Nosso estudo não é capaz de identificar as vias pelas quais os corticoesteroides reduzem o crescimento tardio das lesões por RF na coxa de ratos infantis e púberes. Essas ações podem estar correlacionadas aos complexos efeitos dessas drogas no processo cicatricial16-18, como diminuição progressiva do número dos fibroblastosinibindo, dessa forma, a síntese de colágeno com consequente retardo da cicatrização. É também possível que, além da inibição de leucócitos e fibroblastos, os corticoesteroides exerçam essas ações através da redução de citocinas e fatores de crescimento celular17.
Nossos achados sugerem que os corticoesteroides reduzem o crescimento tardio da lesão por RF não só nos ratos infantis como nos púberes. Se confirmados por estudos posteriores, nossos resultados indicam a possibilidade de limitar a extensão tardia das lesões por RF através de intervenções farmacológicas, o que poderia ser clinicamente útil especialmente na ablação de lactentes e crianças pequenas, faixa etária na qual o crescimento da lesão tem sido associado a efeitos pró-arrítmicos19. O fato de as lesões nos púberes serem menores, mais homogêneas e com menor intensidade de traves fibrosas em comparação aos infantis, sugere uma menor propensão à formação de substrato arritmogênico nessa faixa etária. Entretanto, novas investigações são necessárias a fim de determinar o significado funcional dessas lesões.
O estudo foi realizado no músculo esquelético normal de roedores. Portanto, os resultados não se prestam à inferência direta ao coração humano ou a pacientes pediátricos com arritmias5. A formulação e a dosagem dos corticoesteroides foram arbitrárias, não sendo determinada a dose mais eficaz20,21. As lesões agudas não foram estudadas. Entretanto, nosso estudo prévio5 já havia demonstrado que as lesões agudas em filhotes e adultos são semelhantes. As faixas etárias dos roedores podem não corresponder com exatidão às dos humanos.
Neste modelo, as lesões por RF na coxa de ratos infantis e púberes, apresentam crescimento e extensão tardios, mais acentuadamente nos infantis - o que não ocorre nos adultos. Os corticoesteroides parecem reduzir esses fenômenos nos infantis e púberes. Esses achados podem ter implicações para a ablação por RF em populações pediátricas.
Ao Sr. Wladmir Martins, pela orientação da computação gráfica deste estudo.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Mieko Okada pela Universidade Federal de São Paulo.
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Guilherme Fenelon Rua Pedro de Toledo, 781 - 10º andar - Fundos 04039-032 - São Paulo, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 15/11/09; revisado recebido em 13/01/10; aceito em 22/02/10.
BACKGROUND: The corticosteroids limit the late growth of the lesions by radiofrequency (RF) on the rats' infants' thighs, but the effects on the pubescent and adult rats are unknown. OBJECTIVE: Evaluate the effects of the corticosteroids in the healing of the lesions by RF on the rats' thighs muscles in different age groups. METHODS: Ablation was performed on the thigh muscle of 30 rats (1 lesion per animal): infants (30 days old, weight 73 g, n = 10), pubescents (60 days old, weight 230 g, n = 10) and 10 adults (90 days old, 310 g, n = 10), subdivided in control and treated groups, that received Hydrocortisone (10 mg/kg IM post-RF) and Betametasone (3.5 mg/kg IM, twice a week, for 29 days). The rats were sacrificed 60 days after the ablation for hystopathological and planimetric analysis with specified software (ImageJ®). RESULTS: In the infant, pubescent and adult groups, the weight gain in the follow up did not differ between the control and the treated ones. In the control group, the lesions of the infants and pubescents were superior (p = 0.01) to the adults'. The treatment reduced the size of the lesion in the infants (5.58+0.61 mm² vs 4.02+0.23 mm²; p < 0.01) and pubescents (5.20+0.47 mm² vs 4.16+0.48 mm²; p < 0.01), but not in the adults (4.44+0.50 mm² vs 4.79+0.53 mm², p = NS). Infant and pubescent treated groups presented lower collagen deposition and less fibrotic bands invading the healthy tissue from the central fibrosis area, and forming lesions with remarkably more reduced dimensions than their controls. There were no differences in the adult groups. CONCLUSION: The corticosteroids seem to reduce the late growth of lesion, in addition to attenuate the fibrotic proliferation in the infant and pubescent rats.
Effects of the corticosteroids in the lesions by radiofrequency on rats' thigh in different age groups
Disciplina de Cardiologia e Departamento de Patologia - Escola Paulista de Medicina - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil
Currently, the catheter ablation with radiofrequency (RF) energy is the chosen procedure for the treatment of patients with tachyarrhythmias, including pediatric ones1, due to its efficacy and safety. However, the RF ablation effects are not restricted only to the energy application moment. Late effects can also appear up to six months after the procedure, such as, for example, the late atrioventricular block after tachycardia ablation by atrioventricular nodal reentry2. The mechanisms of these late effects still remain obscure, but seem to be related to the lesion growth during its healing, probably by inflammatory process progression and/or damage to microcirculation or ultra structural damage to the surrounding tissue.
Saul et al3 demonstrated that the lesions by RF in the ovine myocardium present remarked late growth and invasion of the normal myocardic tissue by fibroelastic tissue; these findings indicate possible pro-arrhythmic effects in pediatric populations who underwent RF ablation, eventually leading to sudden death. As the inflammatory process seems to participate in the late extension of the lesion, we have as hypothesis that the corticosteroids could attenuate this process4. In this aspect, we demonstrated in a previous publication that the corticosteroids limit the late growth of the lesions by RF on the rats' infants' thigh muscle5. However, this investigation presented some relevant limitations: the effects of the treatment in the lesion dimensions were considered only qualitatively, without any quantification; as the animals were sacrificed on the last treatment day (30 days after the ablation), the final result of healing was not established; finally, it was not determined the group age in which the late growth stop occurring, as the intermediary age group (pubescents) was not investigated. The explanation of these issues motivated the present paper.
Therefore, we evaluated qualitative and quantitative aspects of the consolidate healing of the lesions by RF under effect of corticosteroids on the rats' thigh muscle in different age groups (infants, pubescents and adults).
This study was approved by the Ethics Committee on Research of the
Thirty rats were used (
1) 05 (five) infant rats 30±03 days old - Controls (1m-C).
2) 05 (five) infant rats 30±03 days old - Treated (1m-T).
3) 05 (five) pubescent rats 60±03 days old - Controls (2m-C).
4) 05 (five) pubescent rats 60±03 days old - Treated (2m-T).
5) 05 (five) adult rats 90±03 days old - Controls (3m-C).
6) 05 (five) adult rats 90±03 days old - Treated (3m-T).
The group of infant, pubescent and adult rats would correspond approximately in humans, respectively, to infants and toddlers, to the beginning of puberty and to adolescents and young adults.
In the anesthetic induction, it was used: Acepromazine at 0.2% (0,1 mg/kg IM), and association of tiletamine hydrochlorides and Zolazepam (30 mg/kg IM); with maintenance of the surgical anesthetic plan through the inhalation of isoflurane, under spontaneous ventilation.
Trichotomy and anti-sepsia of the rat's right posterior limb were performed, the incision was performed on the thigh muscle region of approximately 1.0 cm. Skin and fascia were dissected and removed, exposing the region of the medial muscles of the pelvic member (Semitendinosus and Gastrocnemius)5.
A conventional ablation catheter (Marinr, MedtronicTM, 7Fr - tip of 4 mm), connected to the RF generator (AtakrTM, MedtronicTMCardioRhythm) with maximum power of 50 Watts, was positioned in parallel, under constant manual pressure, over the exposed muscular tissue5. Unipolar application of RF (one per animal) was performed, under temperature control (70° C, 60 seconds), between the ablation catheter distal electrode and the indifferent plate-electrode, underpositioned on the medial face of the pelvic member. During each application, power, impedance, temperature of the catheter tip and time were monitored and their means recorded for posterior analysis. After the ablation, the wound was sutured.
The procedures were performed by the same operator, under sterile conditions, to prevent infections. Prophylactic antibiotics were not used. All over the protocol, the left thigh (the ablation was performed on the right thigh) was used for the innoculation of the anesthetics and corticosteroids.
Half of the population received corticosteroids according to the respective weight range, while the other half received nothing, serving as control group. Before this procedure, the initial weight of each rat was recorded for dosage adjust of the corticosterods; hydrocortisone (10 mg/kg IM) innoculated immediately after the ablation and, later, Betametasone (3.5 mg/kg IM) twice a week - Mondays and Thursdays - for 29 days after the procedure. For adjusting the dosages, the rats were weighed weekly, immediately before each innoculation.
The animals were kept in the lab, under medical-veterinary supervision, being sacrificed 60±05 days after the ablation, that is, 30 days after the end of the therapy, in order to evaluate the consolidated aspect of the lesion healing.
At the end of the follow-up, the rats were weighed again to evaluate the ponderal gain (
As in our previous study5, the measurement of the macroscopic dimensions of the chronic lesions was not performed for the infant, pubescent or adult rats. The main reason for this is that such lesions are badly delimited, mainly in the two first groups, making the measurement very imprecise.
The removed pieces were individually preserved in formol at 10%. The lesion was sliced in several histological cuts to encompass it totally. The slides (three slides/piece) were stained by H.E. and Masson's trichrome. During the qualitative analysis, the lesions were delimited on the slide itself (
In addition to the histopathological aspects of each lesion, special attention was taken to the reading of the fibrotic proliferation and of the inflammatory cellular infiltrate. As previously demonstrated in ovines3 and in the rats' thigh muscle5, the acute lesions by RF in adults and infants are similar. However, while in the adults the chronic lesion dimensions are comparable to the acute lesions, in the infants, they remarkably increase. Therefore, in the present study, by definition5, the later growth of the lesion was characterized by the increase in the lesion by RF dimension in relation to the adults, while its late extension was defined as the occurrence of multiple fibroblast tissue extensions that, from the central fibrotic area, invade the healthy muscle tissue surrounding the chronic lesions by RF.
For the planimetric evaluation of the lesions, ImageJTM6,7 software was used - broadly disseminated in cytometry8 and other planimetric studies9-12 - which automatically calculates the lesion area (
In each animal, the slide presenting the biggest lesion area (width and length in mm2) was used as size estimate of the lesion. Due to the complex geometry of the lesions, very irregular and spread, mainly in infants, despite the relatively large number of histological cuts performed, it was not possible to quantify the volume of the lesions.
The variables are expressed as mean ± standard deviation. Variance analysis (ANOVA) was used for comparing the sample groups. The p < 0.05 values were considered as significant.
A lesion by RF was created in the thigh of each animal. As shown in
During the follow-up, no animal presented another occurrence, or local or systemic infections. From the procedure to the euthanasia, all the groups presented significant ponderal gain (
In the infants and pubescents, the lesions were extensive (approximately 2 cm wide), pale colored and with irregular edges, making difficult the visualization of their limits and making unfeasible the macroscopic evaluation of their dimensions. In adults, in turn, the lesions were much more delimited, with regular edges and characterized by rounded, pale colored areas, around 1 cm wide. In all the groups, the lesions were shallow, around 2 mm deep.
The qualitative findings were very consistent in all groups, as observed on
In the treated infants and pubescents, the lesions presented notably reduced dimensions in relation to the controls. The scars were immature, with delayed healing, characterized by smaller collagen deposition and presence of granulation tissue. In addition, there were less fibrotic bands invading the healthy tissue from the central fibrosis area. On adults treated, noticeable differences were not seen in relation to the controls.
As illustrated in
In this ablation model by RF on the rats' thigh muscle, we can demonstrate, qualitatively and quantitatively, that: 1) the lesions in the infants and pubscents presented late growth and extension, more remarkably in the infants, which did not occur in the adults's group; 2) it seems that the corticosteroids attenuate such phenomena in these age groups. These findings corroborate and expand our previous observations in this experimental model, when we demonstrate that the corticosteroids reduced the late lesion growth in infants5.
In the present study, we observed the final the corticosteroid effects, because the euthanasia was performed 30 days after the end of the treatment, totalling a 60-day follow-up after the ablation. Thus, we studied already consolidated lesions. In our initial study, the sacrifice was immediately after the end of the treatment (30 days after the ablation). Therefore, it was not known if the corticosteroids effect would be kept in the long term, which now we can confirm.
Additionally, in our pioneer paper5, the treatment effects on the lesions dimensions could not be quantified, based exclusively on qualitative histological criteria. In the present paper, on the other hand, for the first time in the literature, the lesions were measured through specific software6-12, confirming that the corticosteroids reduce the lesion area in the infants and pubescents. These results can not be attributed to individual variations or to discrepancies in the ablation procedure. The biophysical parameters of the RF applications and the weight gain of the animals during the follow-up did not differ between the control and treated groups. Additionally, the qualitative and quantitative histological findings were very consistent in all the groups, indicating that the casuistry was adequate.
It is important to emphasize that it was not possible to measure the volume of the lesions, as their geometry is very irregular (mainly in its surroundings), and therefore we opted by the measurement of the lesion central area in mm2. Thus, among the several histological cuts of a same piece, we selected the one that presented bigger dimensions in width and length as representative of the lesion. Although it does not make possible to determine the total volume of the lesion, the method used was adequate and reproductible for estimating the lesion size and comparison among the groups - our major objective. Reinforcing the adequacy of our methodology, it was observed a reduction in the lesion area secondary to the treatment for the infants (28%) and pubescents (20%), but not for the adults, for which it was already demonstrated that the corticosteroids do not reduce the lesion by RF size4. Finally, the quantitative findings were corroborated by the qualitative analysis performed by the pathologist.
Another new contribution of the present study was to demonstrate that the lesions by RF on the pubescents still presented late growth and extension, although less remarkable than in the infants. We have already reported that the evolution of these lesions in infant rats (corresponding to infants and toddlers) and adults (corresponding to adolescents and young adults) was similar to the one observed in the ovine3 and canine4 myocardium. While in adults, histologically, the chronic lesion is characterized by a well-defined scar, with delimited edges, in the infants there is a remarkable lesion growth, with badly delimited and extensive scars, with evidence of invasion of the adjacent muscle by multiple fibroblastic tissue bands. The lesions in the pubescents (corresponding to the beginning of puberty) presented intermediary characteristics, between the infants' and adults' characteristics. Although the lesions revealed increase of their dimensions in relation to the adults (late growth), the scar is presented better delimited than the infants' and with smaller invasion of the adjacent tissue by fibrous bands (late extension).
The increased lesion by RF size in immature muscular tissues has been attributed to two factors: passive distention secondary to the muscle growth, as happens to the atriotomy scars created in dog infants13, and cellular proliferation of the constituent elements of the lesion, responsible for the fibrosis bands invading the surrounding tissue. This happens, in this phase, because, in contrast with the adult muscle, the muscle and interstitial cells divide actively14,15. Our findings suggest that, in the pubescents, the passive growth predominates in relation to the cellular proliferation, while in the infants the two components prevail.
During the follow-up, the ponderal gain of the infants was of 350% and of the pubescents 70%, expected values for these age groups. The qualitative histological analysis was consistent when observing that the infants' lesions were bigger than those of the pubescents. However, although the lnfants' lesion area (5.58+0,61 mm2) has been bigger than the one of the pubescents (5.20+0.47 mm2), this difference was not statistically significant (p > 0.10). This can be related to the sample size or the measuring methodology used, which measures only the central area of the lesion and tends to subestimate extensive lesions with irregular geometry, as the infant rats' characteristics are.
Our study was not able to identify the pathways through which the corticosteroids reduce the late growth of the lesions by RF on infant and pubescents rats' thighs. These actions can be correlated to the complex effects of these drugs in the healing process16-18, such as progressive decrease of the fibroblast number, thus, the collagen synthesis with consequent delay in healing. And it is also possible that, in addition to the leukocytes and fibroblasts inhibition, the corticosteroids exercise these actions through the cytokines reduction and cellular growth factors17.
Our findings suggest that the corticosteroids reduce the late growth of the lesion by RF not only in infant rats but also in the pubescent rats. If confirmed by posterior studies, our results indicate the possibility of limitating the late extension of the lesions by RF through pharmacological interventions, what could be clinically useful specially in the infants and toddler children's ablation, age group in which the lesion growth has been associated to pro-arrhythmic effects19. The fact that the lesions in the pubescents is smaller, more homogeneous and with lower intensity of fibrous bands in comparison to the infants', suggest a lower propension to the formation of arrhythmogenic substract in this age group. However, new investigations are necessary in order to determine the functional meaning of these lesions.
The study was performed on the normal skeletal muscle of rodends. Therefore, the results are not for direct inference to the human heart of pediatric patients with arrhythmias5. The formulation and the corticosteroids dosage were arbitrary, not being determined the most effective dose20,21. The acute lesions were not studied. However, our previous study5 had already demonstrated that the acute lesions in infants and adults are similar. The age group of the rodends may not correspond exactly to the one of the humans.
In this model, the lesions by RF on the infant and pubescent rat's thigh present late growth and extension, more remarkably in the infants - which does not occur in adults. The corticosteroids seem to reduce these phenomena in infants and pubescent subjects. These findings can have implications to the ablation by RF in pediatric populations.
Mr. Wladmir Martins, for the orientation on graphic computing in this study.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of master submitted by Mieko Okada, from
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Manuscript received November 15, 2009; revised manuscript received January 13, 2010; accepted February 22, 2010.