FUNDAMENTO: As cardiopatias são doenças de alta prevalência, sendo a cardite reumática uma doença de grande relevância em países em desenvolvimento. As alterações em câmaras cardíacas esquerdas se associam à disfunção endotelial, com aumento dos níveis de endotelina-1 (ET-1) e consequências sobre a circulação pulmonar, muitas vezes determinando a hipertensão pulmonar (HP). No entanto, a presença de ET-1 e seus receptores na própria valva mitral, promovendo alterações vasculares pulmonares e aumentando a deformação valvar reumática, ainda é um assunto não abordado na literatura. OBJETIVO: Determinar, mediante técnicas moleculares, a expressão dos genes da endotelina e dos seus receptores em valvas mitrais reumáticas. MÉTODOS: 27 pacientes submetidos à troca valvar mitral tiveram seu tecido valvar analisado, a fim de determinar a presença de genes de ET-1 e seus receptores A e B. Foram feitas análises histológica e molecular das valvas (divididas em fragmentos M1, M2 e M3) e colhidos dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Foram divididos em três grupos: valvopatia mitral, mitroaórtica e pacientes reoperados. RESULTADOS: O estudo mostrou a manifestação do gene da ET-1 em 40,7% dos espécimes e de seu receptor A em todas as amostras, com manifestação minoritária do gene do receptor B (22,2%). CONCLUSÃO: Todos os pacientes expressaram a presença do gene do receptor A. Não houve diferença estatística quanto à gravidade da doença, expressa em classe funcional, e aos subgrupos estudados (valvopatas mitrais, mitroaórticos e pacientes reoperados), ou quanto à expressão dos genes da ET-1 e seus receptores entre os subgrupos estudados (valvopatas mitrais, mitroaórticos e pacientes reoperados).
Universidade de Brasília, Instituto do Coração DF, Hospital de Base DF, Brasília, DF - Brasil
Febre reumática (FR) é uma doença reumática, inflamatória, de origem autoimune e recidivante, como resposta do organismo a infecções pelo estreptococo (
A endotelina, substância com forte potência vasoconstritora (dez vezes mais potente que a angiotensina II), foi descrita por Yanagisawa em 19883. Sua importância e a de seus receptores na patogênese de diversas doenças - em especial aquelas em que a vasoconstrição e a proliferação celular excessivas estão envolvidas - tem sido objeto de intensa pesquisa. Além disso, são importantes reguladoras da deposição de colágeno e matriz extracelular4. Também exercem múltiplos efeitos biológicos, através de seus receptores A e B, e suas concentrações tissulares refletem com maior precisão a ativação do sistema das endotelinas4. Em algumas doenças5, a endotelina-1 (ET-1) pode representar a ligação entre alterações vasculares e o metabolismo acelerado do colágeno associado ao processo fibrótico. Estimulada por forças de fricção, a síntese e a expressão de ET-1 ficam aumentadas. Esse fator físico, encontrado em disfunções valvares onde a coaptação entre os folhetos é deficiente - e pode se fazer mediante maior atrito - associa-se a outros fatores, químicos e endógenos, determinando alterações na composição tecidual. No entanto, estudos continuam a ser conduzidos no sentido de demonstrar essa correlação entre os efeitos vasoconstritores e a fibrose tissular5. É possível que esse mecanismo patológico venha a se mostrar relevante na valvopatia reumática, associando níveis aumentados de ET-1, encontrados na doença, às deformidades valvares.
Uma variedade de doenças cardiovasculares tem a participação de ET-1 em sua patogênese. Considerando-se tudo o que foi discutido nos trechos acima, podemos esperar aplicações terapêuticas dos antagonistas dos receptores de ET-15. Através deles, as ações do sistema de endotelinas podem ser revertidas, traduzindo-se em benefício clínico para muitos pacientes.
Foram coletadas 27 amostras de valvas junto a serviços de cirurgia cardiovascular (Instituto do Coração do Distrito Federal/InCor-DF e Hospital de Base do Distrito Federal), posteriormente submetidas à análise histológica e molecular. Os pacientes, adultos e de ambos os sexos, foram escolhidos dentre aqueles admitidos com doença mitral reumática e indicação para substituição cirúrgica da valva nativa por prótese.
Foram considerados critérios de inclusão no estudo:
Portadores de valvopatia mitral de características reumáticas ao ecocardiograma;
Portadores de doença mitral isolada ou em associação à outra valvopatia (aórtica, tricúspide);
Indicação de intervenção cirúrgica por critérios preestabelecidos nas unidades de cirurgia cardiovascular escolhidas, sem indicação de valvotomia percutânea ou reparo valvar (comissurotomia/valvoplastia mitral):
Moderada ou grave (área valvar mitral
2) e classificação funcional III ou IV (
Pacientes sintomáticos (NYHA II, III e IV) com função ventricular esquerda normal (fração de ejeção > 60% e diâmetro endossistólico de ventrículo esquerdo < 45 mm);
Pacientes assintomáticos ou sintomáticos, com disfunção leve de ventrículo esquerdo (fração de ejeção 50 a 60% e diâmetro endossistólico de ventrículo esquerdo 45 a 50 mm);
Pacientes assintomáticos ou sintomáticos, com disfunção moderada de ventrículo esquerdo (fração de ejeção 30 a 50% e diâmetro endossistólico de ventrículo esquerdo 50 a 55 mm);
Reoperação valvar mitral, desde que o tecido valvar mitral fosse ainda o nativo (ou seja, quando a primeira cirurgia foi de reparo valvar - comissurotomia/valvoplastia mitral);
Anuência do paciente ou representante legal em participar do estudo (através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE).
Os critérios de exclusão foram os seguintes:
Pacientes candidatos à valvotomia percutânea ou cirurgia para reparo valvar;
Pacientes portadores de outras doenças cardiovasculares que tivessem indicação cirúrgica. São exemplos a doença coronariana obstrutiva, aneurismas de ventrículo esquerdo e anomalias cardíacas congênitas cianóticas ou acianóticas;
Reoperação em pacientes já submetidos a troca valvar mitral (ausência de tecido valvar mitral nativo);
Não concordância do paciente ou representante legal em participar do estudo.
Esses pacientes foram internados e submetidos aos exames pré-operatórios de rotina em cada instituição. Previamente informados e consultados a respeito de seu consentimento em participar do estudo, preencheram e concordaram com o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE. Dados pessoais e epidemiológicos dos pacientes foram colhidos, bem como algumas informações a respeito da sintomatologia e da classificação funcional (NYHA) e dados ecocardiográficos (valvopatia mitral predominante, estimativa de área valvar, estimativa de pressão sistólica pulmonar, área do orifício regurgitante efetivo, volume regurgitante). O protocolo do estudo foi aceito pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília (UnB).
Imediatamente após a sua retirada, o segmento da valva obtido era fragmentado, obedecendo o seguinte: considerando toda a extensão do fragmento retirado, sempre havia tecido valvar da extremidade livre até próximo ao anel mitral. Esse tecido valvar era, então, separado em três segmentos, grosseiramente iguais em tamanho, nomeados M1, M2 e M3 - o primeiro próximo do anel mitral, o terceiro na extremidade, em contato com a cordoalha tendínea, e o segundo na região intermediária. Tal divisão pretendia a diferenciação em regiões que são, macroscopicamente, distintas quanto ao seu acometimento pela doença reumática.
Todas as valvas retiradas e fragmentadas foram fixadas em solução de formalina neutra 10% (pH 7,0), sendo posteriormente submetidas à descalcificação, inclusão em parafina e corte de 4 μc de espessura no micrótomo. A coloração foi obtida pela técnica de hematoxilina-eosina. Cada segmento foi analisado quanto à presença de fibrose, calcificação, ossificação, neoformação vascular e infiltrado mononuclear.
A extração do RNA total das 27 amostras foi realizada por meio da utilização do reagente Trizol® (
Esse método consiste na maceração de aproximadamente 100 μg de tecido valvar (previamente congelado a -80º C), com motor manual (Motor Cordless - Kontes) em capela de fluxo laminar. Uma vez homogeneizado, o tecido foi submetido a repetidas centrifugações, purificação com clorofórmio, precipitação com isopropanol e limpeza com etanol 75%.
Foi realizada a diluição de 4 μl RNA em 196 μl de água milliQ, totalizando 200 μl de solução. Essas amostras foram colocadas em cubeta específica e analisadas no espectrofotômetro (UV-1601 -
Foi obtido o cDNA total dos 27 pacientes analisados pela reação de transcriptase reversa (RT). Para essa reação, foi utilizado o RNA extraído pelo método do Trizol e ajustado para uma concentração final de 1 μg/μl por regra de três simples. Foi seguido o procedimento recomendado para o kit ImProm-II™
A partir dos cDNAs produzidos, foram realizadas reações de PCR para detecção da expressão dos genes de interesse nos fragmentos valvares dos pacientes analisados. Dessa forma, foram construídos
Após as amplificações, o volume 5 μl de cada amostra foi analisado através de eletroforese em gel de agarose 1%, acrescido de brometo de etídio 5 mg/ml e tampão de amostra (azul de bromofenol) 6x.
A análise estatística dos dados foi realizada através do teste exato de Fisher. É um teste da classe dos testes exatos, onde o p-valor é calculado como se os totais marginais fossem fixos. É considerado significativo se inferior a 0,05.
Foram submetidos ao tratamento cirúrgico 27 pacientes, entre os meses de março de 2006 e setembro de 2007, de acordo com os critérios de inclusão e exclusão definidos previamente. Dois indivíduos foram operados no Hospital de Base do Distrito Federal e o restante no Incor-DF. Todos os pacientes consentiram em participar do trabalho. Foram 15 os pacientes do sexo feminino e 12 do masculino, com uma média de idade de 46,2 anos (16 a 67 anos; DP: 12,6 -
Dos dados individuais colhidos, observamos pacientes nas quatro classificações funcionais (NYHA) assim distribuídos: 1 paciente na CF I (paciente 21 - 3,7% da população); 14 pacientes na CF II (pacientes 1, 2, 3, 7, 9, 10, 11, 16, 17, 18, 19, 20, 24 e 26 - 51,8%); 11 na CF III (pacientes 4, 5, 6, 8, 13, 14, 15, 22, 23, 25 e 27 - 40,7%) e 1 paciente na CF IV (paciente 12 - 3,7%). Em termos de prevalência de lesão valvar, observamos dupla lesão em 19 pacientes (70,3%), insuficiência valvar pura em 5 pacientes (18,5%) e estenose valvar pura em 3 pacientes (11,2%) (
Os dados ecocardiográficos obtidos foram da área valvar, do gradiente transvalvar mitral, da pressão sistólica da artéria pulmonar, do volume regurgitante e do orifício regurgitante efetivo (na insuficiência mitral). Os achados revelaram uma área valvar média de 1,1 cm2 (DP: 5,3; 0,6-1,9 cm2 - dados de todos os 22 pacientes); gradiente transvalvar médio de 14,8 mmHg (DP: 6,9; 6-32 mmHg - dados de 20 dos 22 pacientes, 90,9%); pressão sistólica média da artéria pulmonar 55,9 mmHg (DP: 16,4; 21-100 mmHg - dados de 21 dos 22 pacientes, 95,4%); volume regurgitante médio de 88,3 ml (DP: 61,3; 58-209 ml - dados de 6 dos 24 pacientes, 25%); e orifício regurgitante efetivo médio de 0,47 cm2 (DP: 0,26; 0,27-1 cm2 - dados de 6 dos 24 pacientes, 25% -
As manifestações clínicas mais comuns foram a dispneia (25 dos 27 pacientes - 92,5%), dor torácica (9 pacientes - 33,3%), dispneia paroxística noturna (7 pacientes - 25,9%), o edema de MMII (3 pacientes - 11,1%) e a ortopneia (em 3 pacientes - 11,1%). As palpitações apresentaram-se em 2 pacientes (7,4%) e a taquipneia e os escarros hemoptóicos manifestaram-se cada qual em apenas 1 paciente (3,7%). Apenas 1 paciente se dizia assintomático durante a internação (
No tocante à abordagem cirúrgica, foram submetidos à reoperação 5 pacientes (18,5% - pacientes 2, 4, 8, 22 e 23), enquanto os demais (22 pacientes - 81,5%) foram abordados cirurgicamente pela primeira vez. Daqueles reoperados, o tempo médio desde a primeira cirurgia foi de 12,2 anos (DP: 6,3; paciente 22: 5 anos, paciente 2: 9 anos; paciente 23: 10 anos; paciente 8: 16 anos; paciente 4: 21 anos).
A quantificação de RNA mostrou uma razão entre absorbâncias dentro do intervalo considerado adequado em 91,3% das amostras da região M1 (em 21 das 23 amostras); em 87,5% das amostras na região M2 (21 das 24 amostras); e em 92% das amostras na região M3 (23 das 25 amostras), todas as quais foram submetidas à realização de cDNA.
A análise em gel de agarose foi feita em 21 das 27 amostras colhidas (77,8%); as seis amostras restantes foram submetidas a PCR em tempo real (22,2%). Revelou a presença do gene da ET-1 em 40,7% das amostras (11 das 27 amostras pesquisadas - pacientes 1, 2, 3, 8, 9, 12, 14, 22, 23, 24, 26) e do receptor A (ETrA) em todas as 27 amostras investigadas (100%). O gene correspondente ao receptor B (ETrB) foi identificado em 6 amostras (22,2% - pacientes 1, 9, 13, 21, 22 e 26).
Após a coleta dos fragmentos valvares, 12 deles foram submetidos à inclusão em parafina e coloração pela técnica de hematoxilina-eosina. Posteriormente, foram analisados quanto à presença de fibrose, calcificação, ossificação, neoformação vascular e infiltrado mononuclear. Também foram feitas lâminas identificadas como M1, M2 e M3, dependendo da disponibilidade de material, priorizando sua utilização para as etapas de extração de RNA e subsequentes.
Observou-se uma grande quantidade de fibrócitos, tecido conjuntivo denso, fibras colágenas do tipo I (eosinofílicas) e substância fundamental extracelular. O tecido é grosseiramente avascular. Não foram encontrados miócitos de Anitschkow ou os característicos nódulos de Aschoff.
Nos fragmentos M3, foram visualizados: processo inflamatório com celularidade alta, vascularização do tecido com capilares permeando-o (destacando-se a maior vascularização tecidual relativamente às demais áreas) e colágeno transformado ou neoformado (hialinização do colágeno). Foram também observados fibroblastos, linfócitos e áreas de calcificação distrófica (necrose do tecido com depósito). Nas lâminas de segmento M2, os achados foram semelhantes, com zonas de cicatrização, pequenos focos de inflamação e células mais afastadas entre si. Além disso, também foi visualizada ossificação. Na análise histológica do segmento M1, foram encontradas as mesmas características já citadas anteriormente, exceto pela ausência de calcificação ou ossificação. Em termos de achados histológicos individuais, foram encontradas:
Fibrose em todos os pacientes nas amostras M3 (2, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 22); e em 10 pacientes nas amostras M2 e M1 (2, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 22) - 83,3% do total de pacientes analisados;
Neoformação vascular em 9 pacientes (2, 5, 6, 8, 9, 11, 14, 15, 22) - 75% do total de pacientes analisados; também encontrada em 2 amostras M1 (22,2%), 4 amostras M2 (44,4%), 5 amostras M3 (55,5%) e em 2 pacientes (11 e 15 - 22,2%), sendo encontrada em dois fragmentos simultaneamente (M1/M3 e M2/M3, respectivamente);
Infiltrado de mononucleares em 6 pacientes (2, 5, 6, 8, 9, 22) - 50% do total analisado; encontrado em 1 amostra M1 (16,6%), 3 amostras M2 (50%), 2 amostras M3 (33,3%), sendo que em nenhum paciente foi encontrado em dois ou mais fragmentos simultaneamente;
Calcificação em 3 pacientes (9, 13, 22) - 25% do total de pacientes analisados; não foi encontrada em amostra M1, mas em 1 amostra M2 (33,3%) e em duas amostras M3 (66,6%), sendo que em nenhum paciente foi encontrado em dois ou mais fragmentos simultaneamente;
Ossificação em apenas uma amostra (M2) do paciente 9 - 8,3% do total de pacientes analisados.
O estudo mostrou a manifestação do gene da ET-1 em 40,7% dos espécimes (11 das 27 valvas) e de seu receptor A em todas as amostras examinadas de valvas reumáticas na população descrita, com manifestação minoritária do gene do receptor B (6 das 27 amostras - 22,2%).
Os pacientes foram escolhidos a partir de sua indicação para correção cirúrgica valvar6. Em certos casos, as informações que constavam nos prontuários médicos, algumas muito relevantes, foram extraviadas permanentemente dos registros do paciente, impedindo sua apreciação em nosso estudo.
Não foram excluídos indivíduos anteriormente submetidos à valvoplastia (portadores de fragmentos valvares acometidos por reação inflamatória artificialmente aumentada pela manipulação operatória prévia), pela importância do grupo para comparação com pacientes cuja intervenção operatória realizada seria a primeira. O número de pacientes submetidos à reoperação correspondeu a 18,5% dos casos (5 pacientes) - uma fração significativa se comparada ao número total de casos.
Conforme podemos avaliar (com base na
Optamos pela subdivisão da valva em diferentes regiões, seguindo descrições que mostram a heterogeneidade na composição valvar, quando considerada em sua secção longitudinal (extremidade livre até sua inserção no anel mitral)2. Nesse sentido, buscamos evidenciar possíveis diferenças na identificação (ou não) dos genes da ET-1 e receptores A e B, que poderiam existir entre os segmentos M1, M2 e M3. Sabe-se que a ET-1 tem importante função reguladora na deposição de colágeno nos tecidos7; resta-nos definir se o aumento da composição tecidual de colágeno tem algum tipo de efeito sobre a presença ou aumento da concentração da ET-1 e seus receptores8. No entanto, a escassez de algumas amostras não permitiu a coleta de tecido valvar suficiente para análise histológica e molecular, ou mesmo dos três segmentos de interesse. Outra dificuldade, apresentada quando os fragmentos das três áreas eram colhidos, foi encontrar amostras pouco celularizadas, de onde pouco conteúdo nuclear poderia ser extraído.
A etapa seguinte, de extração do RNA das amostras, tem por finalidade a demonstração da expressão de um gene. O processo requeria perda e degradação mínimas do fragmento (muitas vezes exíguo). O tecido estudado era pouco celularizado, contendo grande quantidade de colágenos e elastina, e células mesenquimais (como miofibroblastos e miócitos cardíacos) em pequena quantidade. Isso influenciou decisivamente na obtenção do RNA, já que este é oriundo daquelas últimas. A amostra de RNA resultante, invariavelmente, foi escassa.
Em seguida, foi feita a quantificação de RNA por espectrofotometria. O intervalo considerado adequado compreendia valores entre 1,6 e 2,6 da razão mencionada. A
A presença de ETrA nas amostras é um resultado interessante e aguardado já que, além de ser o receptor predominante nos miócitos cardíacos9, esse receptor correlaciona-se a processos inflamatórios, exuberantes na doença reumática em sua fase exsudativa, também presentes na fase proliferativa10. Apesar de os sujeitos do estudo se encontrarem em fases mais tardias, nas quais restam apenas as sequelas cicatriciais de processos outrora vigentes10, acreditamos que possa ser possível a permanência de receptores celulares residuais, mesmo após a defervescência da atividade inflamatória primária.
Os receptores B (ETrB) foram encontrados em poucas amostras da série, conforme podemos observar nas
Conforme destacamos anteriormente, pode ocorrer mudança fenotípica de um subtipo de receptor de ET para outro de acordo com condições encontradas
Acreditamos que a principal limitação do estudo deve-se à ausência de um grupo controle, livre de doença reumática ou de outra espécie, do qual fosse possível extrair informações semelhantes acerca da presença dos peptídeos, objeto de nossa avaliação. No entanto, a obtenção desses espécimes só seria possível quando oriundos de tecido valvar normal e ainda viável.
A análise estatística foi feita através do teste exato de Fisher, usado para examinar a significância da associação entre tabelas de contingência. Este é um teste estatístico utilizado em análises de dados categorizados quando o tamanho da amostra é pequeno. O teste demonstrou uma disposição, entre os pacientes do sexo masculino dessa amostra populacional, para uma maior probabilidade de apresentar o ET-1, além de forte tendência para que haja associação entre a presença desse gene e as variáveis edema de MMII (p = 0,056) e dispneia paroxística noturna (p = 0,084). No entanto, seja pela pequena amostra, seja pelo valor de p, não podemos afirmar tal correlação.
A busca da cura da cardiopatia valvar reumática por intermédio de agentes farmacológicos, em substituição à troca valvar ou valvoplastia cirúrgicas, ainda carece de pesquisa e permeia diversos setores da saúde pública. O controle dos surtos de estreptococos através de medidas sanitárias seria um bom começo. O diagnóstico precoce, determinando menor ou nenhum comprometimento da valva e de seu aparelho subvalvar, permitiria o tratamento de inúmeros indivíduos de maneira menos onerosa. A identificação de valvopatas em risco, por meio de um acompanhamento ambulatorial regular, encaminharia-os ao tratamento invasivo, antes do surgimento de complicações.
Talvez a criação de estratégias adequadas nas políticas de saúde, aliada às pesquisas médicas em áreas básicas e clínicas, permitam encontrar opções às terapêuticas atuais. Nesse contexto, possivelmente o sistema de endotelinas e seus antagonistas venham colaborar, limitando a reação inflamatória valvar, modulando a vasorreatividade e modificando o curso fisiopatológico e clínico da valvopatia reumática.
Apesar de não haver significância estatística, existe uma tendência à presença de ET-1 em pacientes do sexo masculino. Todos os pacientes, independentemente das características individuais (sexo, idade, classe funcional e alteração valvar mitral), expressaram a presença do gene do receptor A.
Dos pacientes reoperados, 4 são mulheres na menopausa; uma delas encontrava-se em idade fértil e expressou os três genes estudados.
Não houve diferença estatística quanto à gravidade da doença, expressa em classe funcional, e aos subgrupos estudados (valvopatas mitrais, mitro-aórticos e pacientes reoperados), assim como também não houve diferença quanto à expressão dos genes da ET-1 e seus receptores entre os subgrupos estudados (valvopatas mitrais, mitro-aórticos e pacientes reoperados).
Houve uma tendência à maior presença de ET-1, na população estudada, entre os pacientes com edema de membros inferiores e dispneia paroxística noturna, onde houve um maior número de mulheres.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Edmilson Bastos de Moura pela Universidade de Brasília-UnB.
Correspondência: Edmilson Bastos de Moura CCSW 1 Ed. Rivoli apto 314 Sudoeste - 70680-150 - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 11/11/08
Revisado recebido em 11/11/08
Aceito em 29/01/09.
FUNDAMENTO: Las cardiopatías son enfermedades de alta prevalencia, siendo la carditis reumática una enfermedad de gran relevancia en países en desarrollo. Las alteraciones en cámaras cardíacas izquierdas se asocian a la disfunción endotelial, con aumento de los niveles de endotelina-1 (ET-1) y consecuencias sobre la circulación pulmonar, muchas veces determinando la hipertensión pulmonar (HP). Mientras que, la presencia de ET-1 y sus receptores en la propia válvula mitral, promoviendo alteraciones vasculares pulmonares y aumentando la deformación valvar reumática, aún es un asunto no abordado en la literatura. OBJETIVO: Determinar, mediante técnicas moleculares, la expresión de los genes de la endotelina y de sus receptores en válvulas mitrales reumáticas. MÉTODOS: 27 pacientes sometidos a reemplazo valvular mitral tuvieron su tejido valvar analizado, a fin de determinar la presencia de genes de ET-1 y sus receptores A y B. Fueron hechos análisis histológico y molecular de las valvas (divididas en fragmentos M1, M2 y M3) y recogidos datos clínicos y epidemiológicos de los pacientes. Fueron divididos en tres grupos: valvopatía mitral, mitroaórtica y pacientes reoperados. RESULTADOS: El estudio mostró la manifestación del gen da ET-1 en 40,7% de los sujetos y de su receptor A en todas las muestras, con manifestación minoritaria del gen del receptor B (22,2%). CONCLUSIÓN: Todos los pacientes expresaron la presencia de gen del receptor A. No hubo diferencia estadística en cuanto a la gravedad de la enfermedad, expresada en clase funcional, y a los subgrupos estudiados (valvopatías mitrales, mitroaórticos y pacientes reoperados), o en cuanto a la expresión de los genes de la ET-1 y sus receptores entre los subgrupos estudiados (valvopatías mitrales, mitroaórticos y pacientes reoperados).
Universidade de Brasília, Instituto do Coração DF, Hospital de Base DF, Brasília, DF - Brasil
La fiebre reumática (FR) es una enfermedad reumática, inflamatoria, de origen autoinmune y recidivante, como respuesta del organismo a infecciones por el estreptococo (
La endotelina, sustancia con fuerte potencia vasoconstrictora (diez veces más potente que la angiotensina II), fue descripta por Yanagisawa en 19883. Su importancia y la de sus receptores en la patogénesis de diversas enfermedades - en especial aquellas en que la vasoconstricción y la proliferación celular excesivas están envueltas - han sido objeto de intensa investigación. Además de eso, son importantes reguladoras de la deposición de colágeno y matriz extracelular4. También ejercen múltiples efectos biológicos, a través de sus receptores A y B, y sus concentraciones tisulares reflejan con mayor precisión la activación del sistema de las endotelinas4. En algunas enfermedades5, la endotelina-1 (ET-1) puede representar la conexión entre alteraciones vasculares y el metabolismo acelerado del colágeno asociado al proceso fibrótico Estimulada por fuerzas de fricción, la síntesis y la expresión de ET-1 son aumentadas. Ese factor físico, encontrado en disfunciones valvulares donde la coaptación es deficiente - y puede hacerse mediante un mayor roce -, se asocia a otros factores, químicos y endógenos, determinando alteraciones en la composición tisular. Mientras tanto, estudios continúan a ser conducidos en el sentido de demostrar esa correlación entre los efectos vasoconstrictores y la fibrosis tisular5. Es posible que ese mecanismo patológico venga a mostrarse relevante en la valvopatía reumática, asociando niveles aumentados de ET-1, encontrados en la enfermedad, a las deformidades valvulares.
Una variedad de enfermedades cardiovasculares tienen la participación de ET-1 en su patogénesis. Considerando todo lo que fue discutido en los trechos encima, podemos esperar aplicaciones terapéuticas de los antagonistas de los receptores de ET-15. A través de ellos, las acciones del sistema de endotelinas pueden ser revertidas, traduciéndose en beneficio clínico para muchos pacientes.
Fueron recogidas 27 muestras de válvulas en servicios de cirugía cardiovascular (Instituto do Coração do Distrito Federal/InCor-DF y Hospital de Base do Distrito Federal), posteriormente sometidas a análisis histológico y molecular. Los pacientes, adultos y de ambos sexos, fueron escogidos entre aquellos admitidos con enfermedad mitral reumática y indicación para sustitución quirúrgica de la válvula nativa por prótesis.
Fueron considerados criterios de inclusión en el estudio:
• Portadores de valvopatía mitral de características reumáticas al ecocardiograma;
• Portadores de enfermedad mitral aislada o en asociación a otra valvopatía (aórtica, tricúspide);
• Indicación de intervención quirúrgica por criterios preestablecidos en las unidades de cirugía cardiovascular escogidas, sin indicación de valvotomía percutánea o reparación valvar (comisurotomia/valvoplastia mitral):
• Moderada o grave (área valvar mitral
1,5 cm
2
) y clasificación funcional III o IV (
NYHA), no candidatos a valvotomía percutánea o reparo valvar.
• Pacientes sintomáticos (NYHA II, III y IV) con función ventricular izquierda normal (fracción de eyección > 60% y diámetro endosistólico de ventrículo izquierdo < 45 mm);
• Pacientes asintomáticos o sintomáticos, con disfunción leve de ventrículo izquierdo (fracción de eyección 50-60% y diámetro endosistólico de ventrículo izquierdo 45-50 mm);
• Pacientes asintomáticos o sintomáticos, con disfunción moderada de ventrículo izquierdo (fracción de eyección 30-50% y diámetro endosistólico de ventrículo izquierdo 50-55 mm);
• Reoperación valvar mitral, desde que el tejido valvar mitral fuese todavía el nativo (o sea, cuando la primera cirugía fue de reparo valvar - comisurotomía/valvoplastía mitral);
• Anuencia del paciente o representante legal en participar del estudio (a través de la firma del Término de Consentimiento Libre y Aclarado - TCLA).
Los criterios de exclusión fueron los siguientes:
• Pacientes candidatos a valvotomía percutánea o cirugía para reparo valvar;
• Pacientes portadores de otras enfermedades cardiovasculares que tuviesen indicación quirúrgica. Son ejemplos la enfermedad coronaria obstrutiva, aneurismas de ventrículo izquierdo y anomalías cardíacas congénitas cianóticas o acianóticas;
• Reoperación en pacientes ya sometidos a reemplazo valvar mitral (ausencia de tejido valvar mitral nativo);
• No concordancia del paciente o representante legal en participar del estudio.
Esos pacientes fueron internados y sometidos a los exámenes pre-operatorios de rutina en cada institución. Previamente informados y consultados al respecto de su consentimiento en participar del estudio, llenaron y concordaron con el Término de Consentimiento Libre y Aclarado - TCLA. Datos personales y epidemiológicos de los pacientes fueron recolectados, así como algunas informaciones respecto a la sintomatología y de la clasificación funcional (NYHA) y datos ecocardiográficos (valvulopatía mitral predominante, estimativa de área valvar, estimativa de presión sistólica pulmonar, área del orificio regurgitante efectivo, volumen regurgitante). El protocolo del estudio fue aceptado por el Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Brasilia (UnB).
Inmediatamente después de su retirada, el segmento de la válvula obtenido era fragmentado, obedeciendo lo siguiente: considerando toda la extensión del fragmento retirado, siempre había tejido valvar de la extremidad libre hasta cerca del anillo mitral. Ese tejido valvar era, entonces, separado en tres segmentos, groseramente iguales en tamaño, nombrados M1, M2 y M3 - el primero próximo del anillo mitral, el tercero en la extremidad, en contacto con la cuerda tendinosa y el segundo en la región intermedia. Tal división pretendía la diferenciación en regiones que son, macroscópicamente, distintas en cuanto a su afectación por la enfermedad reumática.
Todas las válvulas retiradas y fragmentadas fueron fijadas en solución de formalina neutra 10% (pH 7,0), siendo posteriormente sometidas a descalcificación, inclusión en parafina y corte de 4
La extracción del RNA total de las 27 muestras fue realizada por medio de la utilización del reactivo Trizol® (
Este método consiste em la maceración de aproximadamente 100
Fue realizada la dilución de 4
Fue obtenido el cDNA total de los 27 pacientes analizados por la reacción de transcriptasa reversa (RT). Para esa reacción, fue utilizado el RNA extraído por el método del Trizol y ajustado para una concentración final de 1
A partir de los cDNAs producidos, fueron realizadas reacciones de PCR para detección de la expresión de los genes de interés en los fragmentos valvares de los pacientes analizados. De esa forma, fueron construidos
Después de las amplificaciones, el volumen 5
El análisis estadístico de los datos fue realizado a través del test exacto de Fisher. Es un test de la clase de los testes exactos, donde el p-valor es calculado como si los totales marginales fuesen fijos. Es considerado significativo si inferior a 0,05.
Fueron sometidos al tratamiento quirúrgico 27 pacientes, entre los meses de marzo de 2006 y setiembre de 2007, de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión definidos previamente. Dos individuos fueron operados en el Hospital de Base del Distrito Federal y el restante en el Incor-DF. Todos los pacientes consintieron en participar del trabajo. Fueron 15 los pacientes del sexo femenino y 12 del masculino, con una media de edad de 46,2 años (16-67 años; DP: 12,6 -
De los datos individuales recogidos, observamos pacientes en las cuatro clasificaciones funcionales (NYHA) así distribuidos: 1 paciente en la CF I (paciente 21 - 3,7% de la población); 14 pacientes en la CF II (pacientes 1, 2, 3, 7, 9, 10, 11, 16, 17, 18, 19, 20, 24 y 26 - 51,8%); 11 en la CF III (pacientes 4, 5, 6, 8, 13, 14, 15, 22, 23, 25 e 27 - 40,7%) y 1 paciente en la CF IV (paciente 12 - 3,7%). En términos de prevalencia de lesión valvar, observamos doble lesión en 19 pacientes (70,3%), insuficiencia valvar pura en 5 pacientes (18,5%) y estenosis valvar pura en 3 pacientes (11,2%) (
Los datos ecocardiográficos obtenidos fueron del área valvar, del gradiente transvalvar mitral, de la presión sistólica de la arteria pulmonar, del volumen regurgitante y del orificio regurgitante efectivo (en la insuficiencia mitral). Los hallazgos revelaron un área valvar media de 1,1 cm2 (DP: 5,3; 0,6-1,9 cm2 - datos de todos los 22 pacientes); gradiente transvalvar medio de 14,8 mmHg (DP: 6,9; 6-32 mmHg - datos de 20 de los 22 pacientes, 90,9%); presión sistólica media de la arteria pulmonar 55,9 mmHg (DP: 16,4; 21-100 mmHg - datos de 21 de los 22 pacientes, 95,4%); volumen regurgitante medio de 88,3 ml (DP: 61,3; 58-209 ml - datos de 6 de los 24 pacientes, 25%); y orificio regurgitante efectivo medio de 0,47 cm2 (DP: 0,26; 0,27-1 cm2 - datos de 6 de los 24 pacientes, 25% -
Las manifestaciones clínicas más comunes fueron la disnea (25 de los 27 pacientes - 92,5%), dolor torácico (9 pacientes - 33,3%), disnea paroxística nocturna (7 pacientes - 25,9%), el edema de MMII (3 pacientes - 11,1%) y la ortopnea (en 3 pacientes - 11,1%). Las palpitaciones se presentaron en 2 pacientes (7,4%) y la taquipnea y los esputos hemópticos se manifestaron cada cual en apenas 1 paciente (3,7%). Apenas 1 paciente se decía asintomático durante la internación (
En lo tocante al abordaje quirúrgico, fueron sometidos a reoperación 5 pacientes (18,5% - pacientes 2, 4, 8, 22 y 23), en cuanto a los demás (22 pacientes - 81,5%) fueron abordados quirúrgicamente por primera vez. De aquellos reoperados, el tiempo medio desde la primera cirugía fue de 12,2 anos (DP: 6,3; paciente 22: 5 años, paciente 2: 9 años; paciente 23: 10 años; paciente 8: 16 años; paciente 4: 21 años).
La cuantificación de RNA mostró una razón entre absorbencias dentro del intervalo considerado adecuado en 91,3% de las muestras de la región M1 (en 21 de las 23 muestras); en 87,5% de las muestras en la región M2 (21 de las 24 muestras); y en 92% de las muestras en la región M3 (23 de las 25 muestras), todas las cuales fueron sometidas a la realización de cDNA.
El análisis en gel de agarosa fue hecho en 21 de las 27 muestras recolectadas (77,8%); las seis muestras restantes fueron sometidas a PCR en tiempo real (22,2%). Reveló la presencia del gen de la ET-1 en 40,7% de las muestras (11 de las 27 muestras investigadas - pacientes 1, 2, 3, 8, 9, 12, 14, 22, 23, 24, 26) y del receptor A (ETrA) en las 27 muestras investigadas (100%). El gen correspondiente al receptor B (ETrB) fue identificado en 6 muestras (22,2% - pacientes 1, 9, 13, 21, 22 y 26).
Después de la recolección de los fragmentos valvares, 12 de ellos fueron sometidos a la inclusión en parafina y coloración por la técnica de hematoxilina-eosina. Posteriormente, fueron analizados respecto a la presencia de fibrosis, calcificación, osificación, neoformación vascular e infiltrado mononuclear. También fueron hechas láminas identificadas como M1, M2 y M3, dependiendo de la disponibilidad de material, priorizando su utilización para las etapas de extracción de RNA y subsecuentes.
Se observó una gran cantidad de fibrocitos, tejido conjuntivo denso, fibras colágenas del tipo I (eosinofílicas) y sustancia fundamental extracelular. El tejido es groseramente avascular. No fueron encontrados miocitos de Anitschkow o los característicos nódulos de Aschoff.
Em los fragmentos M3, fueron vistos: proceso inflamatorio con celularidad alta, vascularización del tejido con capilares permeándolo (destacándose la mayor vascularización tisular relativamente a las demás áreas) y colágeno transformado o neoformado (hialinización del colágeno). Fueron también observados fibroblastos, linfocitos y áreas de calcificación distrófica (necrosis del tejido con depósito). En las láminas de segmento M2, los hallazgos fueron semejantes, con zonas de cicatrización, pequeños focos de inflamación y células más alejadas entre sí. Además de eso, también fue vista osificación. En el análisis histológico del segmento M1, fueron encontradas las mismas características ya citadas anteriormente, excepto por la ausencia de calcificación u osificación. En términos de hallazgos histológicos individuales, fueron encontradas:
• Fibrosis en todos los pacientes en las muestras M3 (2, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 22); y en 10 pacientes en las muestras M2 y M1 (2, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 22) - 83,3% del total de pacientes analizados;
• Neoformación vascular en 9 pacientes (2, 5, 6, 8, 9, 11, 14, 15, 22) - 75% del total de pacientes analizados; también encontrada en 2 muestras M1 (22,2%), 4 muestras M2 (44,4%), 5 muestras M3 (55,5%) y en 2 pacientes (11 y 15 - 22,2%), siendo encontrada en dos fragmentos simultáneamente (M1/M3 y M2/M3, respectivamente);
• Infiltrado de mononucleares en 6 pacientes (2, 5, 6, 8, 9, 22) - 50% del total analizado; encontrado en 1 muestra M1 (16,6%), 3 muestras M2 (50%), 2 muestras M3 (33,3%), siendo que en ningún paciente fue encontrado en dos o más fragmentos simultáneamente;
• Calcificación en 3 pacientes (9, 13, 22) - 25% del total de pacientes analizados; no fue encontrada en muestra M1, pero en 1 muestra M2 (33,3%) y en dos muestras M3 (66,6%), siendo que en ningún paciente fue encontrado en dos o más fragmentos simultáneamente;
• Osificación en apenas una muestra (M2) del paciente 9 - 8,3% del total de pacientes analizados.
El estudio mostró la manifestación del gen de la ET-1 en 40,7% de los sujetos (11 de las 27 valvas) y de su receptor A en todas las muestras examinadas de valvas reumáticas en la población descripta, con manifestación minoritaria del gen del receptor B (6 de las 27 muestras - 22,2%).
Los pacientes fueron escogidos a partir de su indicación para corrección quirúrgica valvar6. En ciertos casos, las informaciones que constaban en las historias clínicas, algunas muy relevantes, fueron extraviadas permanentemente de los registros del paciente, impidiendo su apreciación en nuestro estudio.
No fueron excluidos individuos anteriormente sometidos a valvoplastía (portadores de fragmentos valvares acometidos por reacción inflamatoria artificialmente aumentada por la manipulación operatoria previa), por la importancia del grupo para comparación con pacientes cuya intervención operatoria realizada sería la primera. El número de pacientes sometidos a reoperación correspondió a 18,5% de los casos (5 pacientes) - una fracción significativa si es comparada al número total de casos.
Según pudimos evaluar (con base en la
Optamos por la subdivisión de la valva en diferentes regiones, siguiendo descripciones que muestran la heterogeneidad en la composición valvar, cuando es considerada en su sección longitudinal (extremidad libre hasta su inserción en el anillo mitral)2. En ese sentido, buscamos evidenciar posibles diferencias en la identificación (o no) de los genes de la ET-1 y receptores A y B, que podrían existir entre los segmentos M1, M2 y M3. Se sabe que la ET-1 tiene importante función reguladora en la deposición de colágeno en los tejidos7; nos falta definir si el aumento de la composición tisular de colágeno tiene algún tipo de efecto sobre la presencia o aumento de la concentración de la ET-1 y sus receptores8. Mientras, la escasez de algunas muestras no permitió la recolección de tejido valvar suficiente para análisis histológico y molecular, o aún dos o tres segmentos de interés. Otra dificultad, presentada cuando los fragmentos de las tres áreas eran recogidos, fue encontrar muestras poco celularizadas, de donde poco contenido nuclear podría ser extraído.
La etapa siguiente, de extracción del RNA de las muestras, tiene por finalidad la demostración de la expresión de un gen. El proceso requería pérdida y degradación mínimas del fragmento (muchas veces exiguo). El tejido estudiado era poco celularizado, conteniendo gran cantidad de colágenos y elastina, y células mesenquimales (como miofibroblastos y miocitos cardíacos) en pequeña cantidad. Eso influyó decisivamente en la obtención del RNA, ya que este es oriundo de aquellas últimas. La muestra de RNA resultante, invariablemente, fue escasa.
Enseguida, fue hecha la cuantificación de RNA por espectrofotometría. El intervalo considerado adecuado comprendía valores entre 1,6 y 2,6 de la razón mencionada. La
La presencia de ETrA em las muestras es un resultado interesante y aguardado ya que, además de ser el receptor predominante em los miocitos cardíacos9, ese receptor se correlaciona a procesos inflamatorios, exhuberantes en la enfermedad reumática en su fase exudativa, también presentes em la fase proliferativa10. A pesar de que los sujetos del estudio se encontraban en fases más tardías, en las cuales falta sólo saber las secuelas cicatrizales de procesos otrora vigentes10, creemos que pueda ser posible la permanencia de receptores celulares residuales, aún después de la defervescencia de la actividad inflamatoria primaria.
Los receptores B (ETrB) fueron encontrados en pocas muestras de la serie, según podemos observar en las
Según destacamos anteriormente, puede ocurrir cambio fenotípico de un subtipo de receptor de ET para otro de acuerdo con condiciones encontradas
Creemos que la principal limitación del estudio se debe a la ausencia de un grupo control, libre de enfermedad reumática o de otra especie, del cual fuese posible extraer informaciones semejantes acerca de la presencia de los péptidos, objeto de nuestra evaluación. Mientras tanto, la obtención de esos sujetos sólo sería posible cuando fuesen oriundos de tejido valvar normal y todavía viable.
El análisis estadístico fue hecho a través del test exacto de Fisher, usado para examinar la significancia de la asociación entre tablas de contingencia. Este es un test estadístico utilizado en análisis de datos categorizados cuando el tamaño de la muestra es pequeño. El test demostró una disposición, entre los pacientes del sexo masculino de esa muestra poblacional, para una mayor probabilidad de presentar el ET-1, además de fuerte tendencia para que haya asociación entre la presencia de ese gen y las variables edema de MMII (p = 0,056) y disnea paroxística nocturna (p = 0,084). Mientras tanto, sea por la pequeña muestra, sea por el valor de p, no podemos afirmar tal correlación.
La búsqueda de la cura de la cardiopatía valvar reumática por intermedio de agentes farmacológicos, en sustitución del reemplazo valvar o valvoplastía quirúrgicas, todavía carece de investigación y permea diversos sectores de la salud pública. El control de los brotes de estreptococos a través de medidas sanitarias sería un buen comienzo. El diagnóstico precoz, determinando menor o ningún compromiso de la valva y de su aparato subvalvar, permitiría el tratamiento de innúmeros individuos de manera menos onerosa. La identificación de valvópatas en riesgo, por medio de un acompañamiento ambulatorial regular, los encaminaría al tratamiento invasivo, antes del surgimiento de complicaciones.
Tal vez la creación de estrategias adecuadas en las políticas de salud, aliada a las investigaciones médicas en áreas básicas y clínicas, permitan encontrar opciones a las terapéuticas actuales. En ese contexto, posiblemente el sistema de endotelinas y sus antagonistas colaboren, limitando la reacción inflamatoria valvar, modulando la vasorreactividad y modificando el curso fisiopatológico y clínico de la valvopatía reumática.
A pesar de no haber significancia estadística, existe una tendencia a la presencia de ET-1 en pacientes del sexo masculino. Todos los pacientes, independientemente de las características individuales (sexo, edad, clase funcional y alteración valvar mitral), expresaron la presencia del gen del receptor A.
De los pacientes reoperados, 4 son mujeres en la menopausia; una de ellas se encontraba en edad fértil y expresó los tres genes estudiados.
No hubo diferencia estadística en cuanto a la gravedad de la enfermedad, expresada en clase funcional, y a los subgrupos estudiados (valvópatas mitrales, mitro-aórticos y pacientes reoperados), así como tampoco hubo diferencia en cuanto a la expresión de los genes de la ET-1 y sus receptores entre los subgrupos estudiados (valvópatas mitrales, mitro-aórticos y pacientes reoperados).
Hubo una tendencia a la mayor presencia de ET-1, en la población estudiada, entre los pacientes con edema de miembros inferiores y disnea paroxística nocturna, donde hubo un mayor número de mujeres.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio no tuvo fuentes de financiación externas.
Este artículo es parte de la disertación de Maestría de Edmilson Bastos de Moura por la Universidad de Brasília-UnB.
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Edmilson Bastos de Moura CCSW 1 Ed. Rivoli apto 314 - Sudoeste 70680-150 - Brasil E-mail:
Artículo recibido el 11/11/08; revisado recibido el 11/11/08; aceptado el 29/01/09.
BACKGROUND: Cardiopathies are high prevalence conditions. Among them, rheumatic carditis is of high relevance in developing countries. Left cardiac chamber changes are associated to endothelial dysfunction and ET-1 levels increase. Pulmonary circulation is then affected, and not seldom leading to pulmonary hypertension (PH). However, the presence of ET-1 and its receptors in the mitral valve itself - promoting pulmonary vascular changes, with increased rheumatic valvular deformation - has not been discussed in the literature. OBJECTIVE: To determine the expression of endothelin gene and its receptors in rheumatic mitral valves through techniques of molecular genetics. METHODS: Twenty-seven patients submitted to mitral valve replacement had their valvular tissue examined to determine the presence of ET-1 genes and their A and B receptors. Histological and molecular analysis of the valves was performed (divided into M1, M2 and M3 fragments), with patients' clinical and epidemiological data collected. Patients were divided into 3 groups (mitral valvopathy, mitroaortic valvopathy, and reoperation patients). RESULTS: The study showed endothelin-1 gene expression in 40.7% specimens and A receptor in all samples; receptor gene B had lower expression (22.2%). CONCLUSION: All patients showed A receptor gene expression. No statistically significant difference was observed in regard to condition severity, expressed according to functional class, and subgroups (mitral valvopathy, mitroaortic valvopathy, and reoperation patients).
Universidade de Brasília, Instituto do Coração DF, Hospital de Base DF, Brasília, DF - Brazil
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Rheumatic fever (RF) is a rheumatic, inflammatory, recurring disease, mediated by autoimmune responses of the body to Lancefield Group A streptococcal infections (
Endothelin - a powerful vasoconstrictor (ten times more powerful than angiotensin II) - was described by Yanagisawa in 19883. The relevance of endothelin, as well as of its receptors in the pathogenesis of a number of diseases - especially those where vasoconstriction and cellular overproliferation are involved - has been the focus of extensive research. Additionally, they play a significant part in collagen deposition and extracellular matrix4. They have multiple biological effects through their A and B receptors, and their tissue concentrations are more accurate reflection of endothelin system activation4. ET-1 may act as a link between vascular changes and collagen accelerated metabolism associated to fibrotic process under certain conditions5. Estimulated by friction forces, ET-1 synthesis and expression are increased. That physical factor - found in valvular dysfunctions under deficient coaptation between leaflets and likely to occur through increased friction - is associated to other chemical and endogenous factors, resulting in tissue composition changes. However, studies are being conducted to demonstrate the correlation between vasoconstricting effects and tissue fibrosis5. That pathological mechanism may be shown to be relevant in rheumatic valvopathy by associating ET-1 increased levels as found in the condition and valvular deformities.
A number of cardiovascular diseases have shown to include ET-1 in their pathogenesis. In the light of the arguments above, therapeutic applications may be expected from ET-1 receptors antagonists5. Through them, endothelin system actions may be reverted and translated into clinical benefit for quite a number of patients.
Twenty-seven samples of valves were collected at Carciovascular Surgery Services (
Study inclusion criteria were the following:
Mitral valvopathy patients with rheumatic evidence on echocardiogram;
Mitral disease patients - whether isolated or in association with another valvopathy (aortic, tricuspid);
Surgery intervention indication based on selected Cardiovascular Surgery Units criteria, with no indication for percutaneous valvotomy or valve repair (commissurotomy/mitral valvoplasty):
Moderate or severe (mitral valve area
2) and functional classification III or IV (NYHA), non-candidates to percutaneous valvotomy or valve repair;
Symptomatic patients (NYHA II, III and IV), with normal left ventricular function (ejection fraction > 60% and LV endosystolic diameter < 45 mm);
Symptomatic or asymptomatic patients, with mild left ventricular dysfunction (50 to 60% ejection fraction and 45 to 50 mm LV endosystolic diameter );
Symptomatic or asymptomatic patients, with mild l left ventricular dysfunction (30 to 50% ejection fraction and 50 to 55 mm LV endosystolic diameter);
Reoperation of mitral valve, provided mitral valve tissue was still native (that is to say, when the first surgery was for valve repair - (commissurotomy/mitral valvoplasty);
Consent from patient or legal representative to participate in the study (Informed Consent having been signed).
Exclusion criteria included:
Patients who were candidates for percutaneous valvotomy or valve repair surgery;
Other cardiovascular diseases patients with surgery indication. Some examples are: obstructive coronary heart disease, LV aneurysm, congenital, cyanotic or acyanotic cardiac abnormalities;
Reoperation on patients already submitted to mitral valve replacement (absence of native mitral valve tissue);
No consent from patient or legal representative to participate in the study.
The patients were hospitalized and submitted to routine preoperative exams at each institution. After the patients were informed and consulted on their consent to participate in the study, they were given the Informed Consent Form and agreed to sign. Personal and epidemiological patient data were collected, as well as information on symptoms and functional classification (NYHA), echocardiography data (major mitral valvopathy, valvular area estimate, pulmonary systolic pressure estimate, effective regurgitant orifice area, regurgitant volume). Study Protocol was approved by the Research Ethics Committee at the School of Health Sciences, University of Brasilia - UnB (
Immediately after excision, the valve segment that was obtained was fragmented as follows: When considering excised fragment extension, it always contained valve tissue from the free end to the area close to the mitral ring. That valvular tissue was then separated into 3 segments that were roughly the same size, and named M1, M2 and M3: the first one, close to the mitral ring; the third one, at the end, in contact with chordae tendineae; and the second one in intermediate position. Such segmentation was intended to differentiate the areas - which present macroscopic differences in rheumatic disease affection.
All excised, fragmented valves were formalin-fixed (neutral 10% solution - pH 7.0). They were later submitted to decalcification, paraffin-embedded, and microtome cutting (4 μc thick). Coloring was performed through hematoxylin and eosin procedure. Each segment was analyzed for fibrosis, calcification, ossification, vascular neoformation, and mononuclear infiltrate.
Total RNA extraction from the 27 samples was performed through the use of Trizol™ (
The method consists in the maceration of approximately 100 μg of valvar tissue (previously frozen at - 80ºC), through the use of a manual motor (Cordless - Kontes) in laminary flow hood. Once homogenized, the tissue was submitted to repeated centrifugation, chloroform purification, isopropanol precipitation, and cleaned with 75% ethanol.
4 μL RNA diluted in 196 μl of milliQ water. Total solution volume was 200 μl. The samples were placed in specific cuvettes and analyzed on the Spectrophotometer (UV-1601 - UV Visible Spectrophotometer - Shimadzu Corporation). Absorbance values found were analyzed following the formula: [RNA (μg/ml)] = 40 x A260 x dilution / 1000 (Maniattis). Purity was assessed through the ratio between absorbance values obtained at 260 nm and 280 nm (A260 / A280). Samples between 1.6 and 2.6 were considered viable.
cDNA was obtained from the 27 patients under study through reverse transcriptase (RT). RNA - Trizol method extraction - was used and adjusted to a final concentration at 1 μg/μl through simple rule of three. It was followed by recommended procedure for Promega ImProm-II™ Reverse Transcriptase kit. OligodT (dT18) oligonucleotide concentration was 0.5 μg.
From the cDNAs, CRP reactions were performed to detect gene expressions of interest in the valvular fragments of patients under study. Specific primers were then created for ET-1 (sequence NM 001955 gi110624717 - NCBI), ETA (sequence NM 001957 gi4503464 - NCBI) and ETB (sequence NM 000115 gi4557546 - NCBI). Gene GAPDH (BC029640) was used as sample control. All primers were diluted to 10mM concentration. Invitrogen reagents were used for the reaction, when 1.25 U
After amplifications, 5 μl from each sample was analyzed through 1% agarose gel electrophoresis, had ethidium bromate added (5 mg/ml) and sample buffer (bromophenol blue) 6x.
Data statistical analysis was performed through Fisher's Exact Test. This is a statistical test where
Twenty-seven patients submitted to surgical treatment between March, 2006 and September, 2007, following previously determined inclusion and exclusion criteria. Two of them were operated on at the
From the individual data collected, patients were observed to be in the four functional classifications (FC) (NYHA), as follows: One patient in Class I (patient 21 - 3.7% of the population); 14 patients in Class II (patients 1, 2, 3, 7, 9, 10, 11, 16, 17, 18, 19, 20, 24 and 26 - 51.8%); 11 patients in Class III (patients 4, 5, 6, 8, 13, 14, 15, 22, 23, 25 and 27 - 40.7%), and 1 patient in Class IV (patient 12 - 3.7%). As for valvular lesion prevalence, 19 patients reported double lesion (70.3%); 5 patients reported pure valvular insufficiency (18.5%); and the 3 remaining patients (11.2%), pure valvular stenosis (
Echocardiographic data obtained were valvular area, mitral transvalvular gradient, and pulmonary artery systolic pressure (in mitral stenosis cases), and regurgitant volume and effective regurgitant orifice. The findings showed mean valvular area to be 1.1 cm2 (SD: 5.3; 0.6-1.9 cm2 - data from all 22 patients), mean transvalvular gradient =14.8 mmHg (SD: 6.9; 6-32 mmHg - data from 20 out of the 22 patients = 90.9%); mean pulmonary artery systolic pressure = 55.9 mmHg (SD: 16.4; 21-100 mmHg - data from 21 out of the 22 patients = 95.4%); mean regurgitant volume = 88 mmHg (SD: 61.3; 58-209 ml - data from 6 out of the 24 patients = 25%); mean effective regurgitant orifice = 0.47 cm2 (SD: 0.26; 0.27-1 - data from 6 our of 24 patients = 25% -
Most commonly found clinical manifestations were dyspnea (25 out of the 27 patients = 92.5%); chest pain (9 patients = 33.3%); nocturnal paroxysmal dyspnea (7 patients = 25.9%); edema in the lower limbs (3 patients =11.1%), and orthopnea (3 patients = 11.1%). Two patients (7.4%) presented palpitations, 1 patient (3.2%) presented tachypnea and hemoptoic sputum. One patient declared to be asymptomatic at hospital (
As for surgical approach, 5 patients (18.5% - patients 2, 4, 8, 22 and 23) were submitted to reoperation, whereas the remaining (22 patients = 81.5%) had surgical intervention for the first time. From those reoperated on, mean time from first surgery was 12.2 years (SD: 6.3; patient 22 = 5 years, patient 2 = 9 years; patient 23 = 10 years; patient 8 = 16 years; patient 4 = 21 years).
RNA quantification showed absorbance ratio within the range seen as appropriate in 91.3% of patients (21 out of 23 samples) in M1; in 87.5% of patients in M2 (21 out of 24 samples ); and in 92% the samples in M3 (23 out of 25 samples). The samples were submitted to cDNA.
Agarose gel analysis was performed in 21 out of the 27 collected samples (77.8%). ET-1 gene was shown in 40.7% (11 out of the 27 samples - patients 1, 2, 3, 8, 9, 12, 14, 22, 23, 24, 26). A receptor (ETrA) was shown in all 27 samples under investigation (100%). B receptor corresponding gene (ETrB) was identified in 6 samples (28.6% - patients 1, 9, 13, 21, 22 and 26).
After valvular fragments were collected, twelve were paraffin-embedded, with coloring performed through hematoxylin and eosin procedure. Afterwards, each fragment was analyzed for fibrosis, calcification, ossification, vascular neoformation, and mononuclear infiltrate. Plates were then done and identified as M1, M2 and M3, depending on material availability, which was prioritized for RNA extraction stage and subsequent stages.
High level of fibrocytes, dense connective tissue, collagen fibers (eosinophilic) and extracellular fundamental substance could be observed. The tissue is roughly avascular. No Anitschkow myocytes or Aschoff nodules were found.
The M3 fragments showed high cellularity inflammatory process, tissue vascularization - with permeating capillaries (and higher tissue vascularization as compared to the other areas), collagen transformation or neoformation (collagen hialinization). Fibroblasts, lymphocytes, and dystrophic calcification areas were observed (deposit tissue necrosis). The findings in M2 plates were similar: healing areas, small inflammation foci, and cells more drawn apart. Ossification could also be observed. M1 segment histologic analysis showed the same characteristics as described earlier, except for the absence of calcification or ossification. The individual histologic findings were the following:
Fibrosis in all patients on M3 sample (2, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 22); in 10 patients in sample M2 and M1 (2, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 22) - 83.3% of total number of patients under analysis.
Vascular neoformation in 9 patients (2, 5, 6, 8, 9, 11, 14, 15, 22) - 75% of the total number of patients under analysis; in two M1 samples (22.2%); in four M2 samples (44.4%), in five M3 samples (55.5%) and in two patients (11 and 15 - 22.2%) it could be observed in two fragments concurrently (M1/M3 and M2/M3, respectively).
Mononuclear infiltrate was found in 6 patients (2, 5, 6, 8, 9, 22) - 50% of the total number of patients under analysis; in one M1 sample (16.6%), in three M2 samples (50%), in two M3 samples (33.3%); and in no patient in two or more fragments concurrently.
Calcification was observed in 3 patients (9, 13, 22) - 25% of the total number of patients under analysis; not observed in M1 samples, found in one M2 sample (33.3%), in two M3 samples (66.6%). Concurrent calcification in two or more fragments was not observed in any of the patients.
Ossification was observed in only one sample (M2) - patient 9 - 8.3% of the total number of patients under analysis.
The study showed endothelin-1 gene expression in 40.7% specimens (11 of the 27 valves) and A receptor in all samples of rheumatic valves for the population described; receptor gene B showed lower expression (6 of the 27 samples - 22.2%).
Patients were selected based on the indication for valvular surgery correction6. The information from medical records - many times quite relevant - were irreversibly lost, and therefore could not be taken into consideration in the present study.
Individuals who had been submitted to previous valvuloplasty - patients with valvular fragments affected by artificially increased inflammatory reaction from previous surgery manipulation - were not excluded due to their relevance in the group - to be compared with patients who were being submitted to the first surgical intervention. The number of patients submitted to reoperation corresponded to 18.5% of all cases (5 patients) - a significant percentage from the total number of cases.
As the authors could observe (based on
The authors have chosen to subdivide the valve into four different regions, following descriptions that show valvular heterogeneity when longitudinal sectioning is considered (from free end up to its insertion in the mitral ring). In that sense, the authors tried to show evidence of possible differences between segments (M1, M2, and M3) while identifying ET-1 genes and A and B receptors. ET-1 is known to play a key regulating function in collagen deposition in the tissues7. It is yet to be defined whether collagen tissue composition increase somehow affects the presence or the concentration level of ET-1 and its receptors8. However, the lack of samples did not allow enough valvular tissue to be collected for histological and molecular analysis, or even the analysis of the three segments of interest. Another difficulty faced by the authors - when fragments were collected from the three areas - was to find low cellularization samples, from which little nuclear content could be extracted.
The following stage - RNA extraction from the samples - had the purpose to show the expression of one gene. The process required minimal loss and degradation of the fragment (many times extremely small). The tissue under study was poorly cellularized, collagen and elastin-rich, and poor in mesenchymal cells (such as cardiac myofibroblasts and cardiac e myocytes). That was a key influence to obtain RNA, since RNA is obtained from the latter. The resulting RNA sample was invariably scarce.
RNA quantification was then performed through spectrophotometry. The variation considered adequate ranged from 1.6 and 2.6 of ratio mentioned.
The presence of ETrA in the samples is an interesting, expected result, since in addition of being the predominant receptor in cardiac myocytes9, this receptor is associated to exuberant inflammatory processes in rheumatic diseases exudative phase, and also present in the proliferative stage10. Although study subjects were at later stages - when only healing sequelae from earlier processes remain10 - the authors believe that residual cellular receptors may have remained even after the defervescence of the primary inflammatory activity.
B receptors (ETrB) were found in few samples of the series, as seen in
The authors believe the major study limitation is due to the absence of a control group that would be free of rheumatic disease or any other kind of disease, and from which similar information could be obtained on the presence of the peptides that are the object of study. However, such specimens would only be obtained if from normal - and still feasible - valvular tissue.
Statistical analysis was performed through Fisher's Exact Test. The test was used to assess the significance of the association between the contingency tables. This is a statistical test used in the categorical data analyses when sample size is small. The test showed a trend - male patients in the populational sample showed higher probability to present ET-1, in addition to the strong trend towards the association of that gene and the lower limbs edema variables (p = 0.056) and nocturnal paroxysmal dyspnea (p = 0.084). However, whether due to the small size sample or
The search for the cure of rheumatic valvular cardiopathy through pharmacological agents rather than valvular replacement or surgical valvuloplasty still requires further research, and permeates a number of public health sectors. Streptococcal outbursts control through sanitary actions would be a good start. Early diagnosis to determine low or no involvement of valvular and subvalvular apparatus impairment would allow the management of countless individuals in a less costly fashion. The identification of valvular cardiopathy patients under risk through regular outpatient unit follow-up would refer them to invasive treatment before complications arise.
The combination of proper strategies in health policies and medical research in basic and clinical areas may help find options to current therapies. Against such scenario, the endothelin system and its antagonists may help by limiting valvular inflammatory reaction, modulating vasoreactivity, and changing the pathophysiologic and clinical progress of rheumatic valvulopathy.
Although no statistical significance was found, there is a trend towards the presence of ET-1 in male patients; All patients - irrespective of individual characteristics (gender, age range, mitral valve changes) - expressed A receptor gene.
Out of reoperation patient, 4 were menopaused women, one was of childbearing age and expressed the three genes under study.
No statistic difference was shown as to disease severity expressed in functional class and subgroups under study (mitral valve cardiopathy, mitro-aortic, and reoperation patients).
No statistic difference was shown as to the expression of ET'1 genes and their receptors among the subgroups under study (mitral valve cardiopathy, mitro-aortic, and reoperation patients).
The population under study showed higher presence of ET-1 among patients with edema in lower limbs and nocturnal paroxysmal dyspnea. Among those, females showed higher numbers.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of master submitted by Edmilson Bastos de Moura, from