FUNDAMENTO: A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL-ox) induz à formação de epítopos imunogênicos na molécula. A presença de autoanticorpos contra a LDL-ox tem sido demonstrada no soro de pacientes com doença arterial coronariana (DAC). Contudo, o papel desses autoanticorpos na fisiopatologia das síndromes coronarianas agudas (SCA) e o seu significado clínico permanecem indefinidos. OBJETIVO: Avaliar a associação entre autoanticorpos contra a LDL-ox e SCA. MÉTODOS: Os títulos de imunoglobulina G autoanticorpos contra a LDL-ox por cobre (antiLDL-ox) e contra o peptídeo sintético D derivado da apolipoproteína B (antipeptD) foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA) em 90 pacientes, nas primeiras 12h de SCA (casos) e em 90 pacientes com DAC crônica (controles). RESULTADOS: Os resultados mostraram que os títulos de antiLDL-ox foram significativamente mais elevados (p = 0,017) nos casos (0,40 ± 0,22), do que nos controles (0,33 ± 0,23). Por outro lado, os títulos de antipeptD foram significativamente menores (p < 0,01) nos casos (0,28 ± 0,23) do que nos controles (0,45 ± 0,30). A diferença dos títulos de ambos anticorpos entre os dois grupos estudados foi independente de idade, sexo, hipertensão arterial, diabete melito, dislipidemia, índice de massa corporal, tabagismo, perfil lipídico, uso de estatinas e história familiar de DAC. CONCLUSÃO: Os resultados mostraram que os títulos de antiLDL-ox foram significativamente mais elevados nos pacientes com síndrome coronariana aguda quando comparados aos pacientes com doença arterial coronariana e podem estar associados à instabilidade da placa aterosclerótica.
IFaculdade de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - Hospital São Lucas da PUCRS
IIPorto Alegre, RS; Universidade de São Paulo - USP, São Paulo, SP - Brasil
A lipoproteína de baixa densidade (LDL) é a principal partícula carreadora de colesterol do plasma humano. A LDL possui um núcleo lipofílico formado de ésteres de colesterol e triglicerídios e uma superfície polar constituída de colesterol não esterificado e fosfolipídios. Os fosfolipídios estão envoltos pela apolipoproteína B-100 (apoB). A molécula de LDL contém ainda antioxidantes lipossolúveis, como vitamina E, α e β caroteno, ubiquinol, entre outros1. Entretanto, sob condições de estresse oxidativo as partículas da LDL, que contêm ácidos graxos poliinsaturados (PUFA), são facilmente oxidadas e, consequentemente, a apoB é modificada através da oxidação lipídica2.
Devido às suas propriedades pró-inflamatórias e pró-aterogênicas, a lipoproteína de baixa densidade oxidada (LDL-ox) é um marcador de risco para as doenças cardiovasculares (DCV), podendo sua ação ocorrer no espaço subendotelial3,4. Embora atrativas, evidências relevantes de que a hipótese da LDL-ox contribui para aterosclerose humana permanecem ainda não definitivamente estabelecidas, merecendo novos estudos bem delineados, que possam estabelecer a sua contribuição na fisiopatologia da aterosclerose5.
Algumas evidências sugerem que autoanticorpos IgG para a LDL-ox estão associados com propriedades pró-aterogênicas e autoanticorpos IgM para a LDL-ox desempenham um papel ateroprotetor6. A classe IgM, que reconhece epítopos específicos para a oxidação, pode estar envolvida na captação e detoxicação de lipídeos oxidados pró-inflamatórios3. Deste modo, os autoanticorpos IgG e IgM podem ter ações antagônicas.
Estudos recentes mostraram que pacientes com síndrome coronariana aguda (SCA), incluindo infarto agudo do miocárdio (IAM) e angina instável (AI), apresentam níveis mais elevados de antiLDL-ox do que pacientes com angina estável (AE) e controles (p < 0,05)7. Outros estudos questionam a efetiva contribuição dos antiLDL-ox na aterogênese, não tendo sido observado diferenças significativas entre os títulos destes anticorpos em controles normais e em pacientes com doença arterial coronariana (DAC) crônica ou aguda8.
Dentro desse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre autoanticorpos contra a LDL-ox e SCA.
Realizou-se um estudo transversal controlado, no qual foram incluídos indivíduos de ambos os sexos, com mais de 40 anos de idade, com diagnóstico de DAC, aguda ou crônica, atendidos no Hospital São Lucas da PUCRS, de maneira consecutiva, no período de mar/2001 a dez/2003.
Também foram incluídos pacientes com quadro clínico de SCA sem supradesnivelamento persistente do segmento ST (SCASSST). O diagnóstico de SCASSST foi definido assim: dois episódios de
Foram definidos como pacientes inelegíveis aqueles que apresentaram: presença de bloqueio completo do ramo esquerdo; supradesnivelamento acima de 0,05 mV do segmento ST no ECG de repouso, cirurgia há menos de três meses, incluindo cirurgia de revascularização miocárdica; angioplastia coronariana percutânea há menos de três meses; neoplasias; distúrbios hematológicos e imunológicos conhecidos; doenças do tecido conjuntivo ou inflamatórias associadas à elevação de marcadores séricos. Excluíram-se, ainda, pacientes em uso de medicação imunossupressora, doenças imunologicamente ativas, neoplasias, SIDA, doenças da tireóide e doenças gastrointestinais debilitantes e indivíduos que se negaram a assinar o termo de consentimento livre e esclarecido.
Sexo, idade, índice de massa corporal (IMC), hipertensão arterial (HA), diabete melito (DM), dislipidemia, exposição crônica ao fumo (tabagismo ativo), história familiar de DAC, uso de estatinas e dosagem sérica da proteína-C-reativa ultra-sensível(PCR-us).
O IMC foi calculado pela fórmula: peso, em quilogramas, dividido pela altura ao quadrado, em metros. Foi considerado obeso o indivíduo com índice
Os tabagistas foram estratificados em: fumantes ativos, aqueles indivíduos com hábito de fumar atual e que haviam fumado no último ano; ex-fumantes, os indivíduos que haviam abandonado o hábito de fumar há mais de um ano; e não fumantes.
A história familiar de DAC foi considerada positiva naqueles indivíduos cujos familiares em primeiro grau tivessem apresentado mortalidade cardiovascular precoce (< 55 anos em homens e < 65 anos em mulheres).
Anticorpos IgG contra a LDL-ox e contra o peptD e PCR-us foram medidos no plasma de casos e de controles por ensaio imunoenzimático (ELISA).
O perfil lipídico e a composição protéica da LDL foram determinados pelo método de Lowry11. O conteúdo de colesterol total e de triacetilglicerol foi dosado por método enzimático12. A detecção de anticorpos IgG contra a LDL-ox gerados no soro de casos e controles, bem como a anticorpos IgG contra o peptídeo sintético D derivado da apoB (antipeptD IgG) e a dosagem da IgG total, foi feita por técnica de
As análises laboratoriais foram determinadas por ensaio imunoenzimático nas primeiras 12 horas após definido o quadro clínico de SCA, armazenadas em freezer -70º C e posteriormente encaminhadas para análise no Instituto de Imunofisiopatologia da Universidade de São Paulo.
O tamanho da amostra foi calculado a priori. Para detectar uma diferença de pelo menos 70 unidades na densidade ótica do título sérico médio de IgG antiLDL-ox entre casos e controles, foi estimado um tamanho de amostra de 86 pacientes por grupo de estudo, considerando-se o desvio padrão para IgG antiLDL-ox de 140 unidades, α = 0,05 e poder estatístico de 90% (β = 0,10).
A aderência à distribuição normal (gaussiana) da distribuição dos valores de antiLDL-ox e de antipeptD nos dois grupos de estudo foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov (K-S). O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar os resultados da determinação sérica média de anticorpos IgG contra a LDL-ox, IgG contra o peptídio
A significância das associações entre variáveis categóricas foi analisada pelo teste exato de Fischer e, entre variáveis contínuas, pelo teste de Mann-Whitney. As variáveis intervenientes foram controladas por regressão linear múltipla. As análises de sensibilidade e de especificidade de valores de corte de antiLDL-ox para diagnóstico de SCA foram feitas por curva ROC (
Os resultados foram expressos como médias, mais ou menos o desvio padrão da média. As diferenças foram consideradas significativas quando o valor de p < 0,05.
O estudo foi submetido e aprovado pelo CEP do Hospital São Lucas da PUCRS (ID: 03/01533, aprovado em 13/06/2003).
A
A distribuição por sexo entre os grupos foi igualmente comparável, sendo que 49,0% dos casos e 53,0% dos controles eram do sexo masculino (p = 0,65). Os dois grupos também não diferiram em relação à obesidade, sendo que um quarto dos casos e um quinto dos controles apresentavam índices de massa corporal > 30 kg/m2 (p = 0,59). Da mesma forma, não se observou diferença estatisticamente significativa entre os grupos com relação ao hábito atual de fumar (12,0% de fumantes ativos em casos e 12,0% também em controles) e nem quanto à história familiar de DAC (p = 0,17).
O diagnóstico prévio de dislipidemia (p = 0,12), os valores médios da colesterolemia (p = 0,09), da trigliceridemia (p = 0,76) e o uso de fármacos redutores da colesterolemia (estatinas) (p = 0,11) também não diferiram significativamente entre casos e controles.
A frequência de HA foi significativamente maior nos casos do que nos controles, 80,0% e 45,0%, respectivamente (p < 0,01), bem como o diagnóstico prévio de DM, presente em 35,0% dos casos e em 18,0% dos controles (p = 0,01). Mais da metade do grupo controle e um quinto do grupo dos casos eram ex-fumantes (p < 0,01). Os valores séricos da PCR-us foram significativamente maiores nos casos do que nos controles (p < 0,01).
A concentração de IgG total não diferiu significativamente entre os grupos (p = 0,74), como se vê na
O título médio de IgG antiLDL-ox foi significativamente maior nos casos (0,40 ± 0,22) do que nos controles (0,33 ± 0,22), (p = 0,017) (
A
A diferença entre os valores médios dos títulos séricos de antiLDL-ox nos dois grupos estudados (
A análise da curva ROC (
Os conhecimentos contemporâneos questionam e sugerem novos paradigmas sobre a fisiopatologia e a história natural da aterosclerose e suas complicações clínicas. Considerando-se as evidências de estudos de biologia celular e molecular e de pesquisas clínicas e experimentais, a aterosclerose entendida como um processo resultante do depósito crônico, passivo e focal de lipídios na parede arterial, deu lugar à noção de uma resposta inflamatória, imunomediada e sistêmica3,6,14.
Ao conceito atual de placa vulnerável, associa-se a caracterização do paciente vulnerável, com alta probabilidade de apresentar um evento cardiovascular futuro, e cuja identificação é um dos principais desafios clínicos15.
Um terço dos casos de morte súbita e de IAM ocorre em indivíduos previamente assintomáticos, que têm doença silenciosa e/ou fatores de risco associados. Estudos epidemiológicos, observacionais e de intervenção evidenciaram a contribuição de fatores como HA, fumo, DM e dislipidemias para o risco de doença vascular, especialmente para a DAC. Contudo, 20% dos indivíduos com DAC não apresentam quaisquer dos fatores de risco clássicos16. Além disso, cerca de metade dos casos de IAM ocorre em pessoas com níveis de colesterol plasmático dentro dos limites considerados normais17.
No estudo da história natural da aterosclerose e de seus determinantes, muitos marcadores inflamatórios foram identificados e, em amostras populacionais selecionadas, várias destas substâncias mostram-se capazes de exercer um papel modulador no risco da doença e de suas complicações. Entre elas, citam-se a PCR-us, CD40 ligante, V-CAM-1, MCP-1, IL-6 e IL-718.
Recentemente, um número crescente de evidências sugere que a ativação local e sistêmica do sistema imunológico possa estar relacionada com o processo de instabilidade da placa aterosclerótica e de suas manifestações clínicas. Embora haja uma elevação crônica de imunoglobulinas circulantes em pacientes com DAC crônica estável, um incremento transitório de ativação das células T tem sido descrito por vários autores em pacientes com SCA, levando-os a crer que isso possa ser um dos determinantes na fisiopatologia das complicações agudas19.
Ammirati e cols.19 observaram que pacientes com SCA tinham um número restrito de segmentos gênicos, na cadeia β dos receptores de células T(RCT) ativadas, em relação a controles com DAC crônica.
No grupo controle, os RCT eram altamente polimórficos. Além disso, somente linfócitos T de pacientes com SCA proliferavam em resposta a proteínas autólogas, presentes em espécimes das lesões culpadas pelo evento agudo e/ou em resposta à LDL-ox. A proliferação linfocitária em resposta à LDL-ox era mais intensa nos pacientes com SCA que apresentaram maior morbidade do que naqueles com evolução clínica favorável.
Os autores sugerem que, na fase aguda de instabilidade da lesão, a resposta imunológica policlonal, característica da DAC crônica, dê lugar à ativação mediada por um número restrito de epítopos imunogênicos presentes na placa, e diferentes daqueles relacionados à ativação linfocitária observada na fase crônica da doença. Também chama a atenção, o fato de 68,0% dos segmentos gênicos monotípicos ou oligotípicos, encontrados na fase aguda, não terem sido mais detectados três meses após o evento coronariano, reforçando a ideia de que uma população antígeno-específica de células T havia sido transitoriamente ativada nesse período.
Utilizando anticorpos monoclonais contra epítopos da LDL-ox oriundos de camundongos geneticamente modificados, vários autores observaram que os títulos de LDL-ox eram significativamente mais elevados em pacientes com SCA do que em portadores de DAC crônica7,20.
Tsimikas e cols.21 encontraram uma elevação de 60,0% nos títulos de autoanticorpos contra uma série de epítopos gerados em modelos de oxidação da LDL, em pacientes durante a fase aguda e em até um mês após o IAM. Admite-se que, na fase aguda do evento coronariano, o substrato antigênico origine-se da liberação direta da lipoproteína modificada, quer pela ruptura ou aumento de permeabilidade da placa, quer por ruptura das membranas celulares decorrente de lesão isquêmica aguda ou após reperfusão22.
A LDL-ox desempenha um papel crucial no desenvolvimento da aterosclerose e dados experimentais suportam que está associada a múltiplos fatores de risco cardiometabólicos23. Esses autores reportaram que altas concentrações de LDL-ox foram associadas com o aumento da incidência de síndrome metabólica, bem como seus componentes, obesidade abdominal, hiperglicemia e hipertrigliceridemia.
A modificação oxidativa da LDL induz a formação de epítopos imunogênicos na molécula de LDL, o qual leva a formação de anticorpos contra a LDL-ox, que pode ser detectada no soro24. Estudos têm demonstrado que a molécula de antiLDL-ox pode bloquear a captação de LDL-ox pelos macrófagos em lesões ateroscleróticas, sugerindo um possível papel protetor para a formação de células espumosas25.
No presente estudo, observou-se que os títulos séricos médios de antiLDL-ox foram significativamente superiores em pacientes com SCA em relação a indivíduos com DAC crônica. A diferença encontrada permaneceu significativa e independente de fatores de risco cardiovascular estabelecidos, como HA, fumo, DM e dislipidemia. Tal diferença foi específica para os anticorpos IgG antiLDL-ox, uma vez que a concentração de IgG total não diferiu significativamente entre casos e controles.
Por outro lado, os títulos séricos médios de antipeptD foram significativamente menores em pacientes com SCA do que nos indivíduos com DAC crônica, e a diferença encontrada foi também independente dos fatores de risco cardiovascular e da concentração de IgG total entre os dois grupos estudados.
Tendo em vista o delineamento da investigação, e por se desconhecerem os valores do antiLDL-ox e do antipeptD, antes do início do quadro isquêmico agudo, não se pode afirmar que tais anticorpos contribuam para a instabilidade das lesões coronarianas, ou mesmo se sua elevação represente um epifenômeno resultante da ruptura da placa.
Contudo, algumas hipóteses são geradas para interpretar o comportamento da resposta imunológica observada. É possível que ocorra, durante a fase aguda do evento coronariano,
Shoenfeld e cols.26 imunizaram camundongos
É possível que a resposta monoclonal contra alguns epítopos antigênicos seja mais específica27, o que explicaria a razão pela qual, no presente estudo, houve elevação dos títulos de LDL-ox (resposta policlonal) e redução dos títulos de antipeptD (resposta monoclonal) nos pacientes com SCA em relação aos controles com DAC crônica. Presume-se que a redução dos títulos de antipeptD, associada aos eventos isquêmicos agudos, traduza a maior velocidade com que esses antígenos complexam.
Por outro lado, não se pode excluir que o aumento na formação de imunocomplexos associe-se diretamente ao processo de instabilização da placa. Virella e cols.28 sugerem que, em humanos, complexos antiLDL-ox/LDL-ox seriam avidamente digeridos por macrófagos, criando um acúmulo maciço de ésteres de colesterol intracelular, responsável pela instabilidade da placa.
Mangueira e cols.29 avaliaram os títulos de antipeptD e de antiLDL-ox em 66 pacientes com diagnóstico de artrite reumatóide, doença inflamatória crônica, cuja principal causa de mortalidade é a DAC. Os autores observaram boa correlação entre os títulos dos dois anticorpos, mas somente os títulos de antiLDL-ox foram mais elevados nos doentes em relação aos controles.
Trabalhos que analisam elevações nos títulos de antiLDL-ox, relacionam o aumento desses títulos com a ruptura da placa, e sua redução com a fase de estabilização das lesões30.
Em estudo recente, Doo e cols.31 avaliaram o valor prognóstico dos antiLDL-ox como preditores de eventos coronarianos em uma coorte de 60 pacientes hospitalizados por AI. Observaram que os indivíduos cujos títulos de anticorpos eram mais elevados na admissão hospitalar tiveram um número significativamente maior de novos eventos coronarianos, durante o período de observação de 16 meses, concluindo que a determinação de antiLDL-ox pode ser útil como forma de identificação de grupos de maior risco.
A maioria dos estudos comparam a resposta imunológica à LDL-ox em pacientes com SCA em relação a controles sem evidências clínicas de coronariopatia7. Contudo, mesmo indivíduos assintomáticos podem apresentar formas subclínicas da doença com comprometimento vascular severo e difuso32. Optou-se por comparar os títulos de anticorpos entre indivíduos com SCA e com DAC crônica, estável e bem definida, uma vez que o objetivo é, não o diagnóstico, mas o papel da resposta autoimune na caracterização de quadros clínicos distintos da doença.
Outra diferença é que alguns trabalhos comparam formas agudas e crônicas de DAC por meio da determinação dos títulos da LDL-ox circulantes. Tal metodologia utiliza anticorpos monoclonais contra epítopos específicos na molécula da LDL-ox, não estando disponível em nosso meio e apresentando dificuldades previsíveis.
A determinação direta da LDL-ox no plasma, ou no soro, complica-se pela possibilidade de modificações
Em indivíduos sadios, estima-se que a concentração plasmática média de LDL-ox seja de aproximadamente 0,1 ng/μg da porção protéica da LDL33. Assim, a localização primária da análise de interesse poderia não ser a circulação.
As amostras analisadas parecem ser representativas da população de cardiopatas isquêmicos severos, atendidos em serviços de atenção terciária da doença. Contudo, certas diferenças entre os dois grupos devem ser consideradas. A exposição a alguns fatores de risco para DAC diferiu significativamente entre casos e controles. Sabe-se que os títulos de antiLDL-ox são mais elevados em diabéticos34 e em hipertensos35 do que em indivíduos sem tais diagnósticos. Pacientes com essas patologias foram mais prevalentes no grupo com SCA. Assim, os títulos médios de antiLDL-ox, significativamente mais elevados nos casos, poderiam estar associados não ao evento agudo, mas à maior frequência de fatores de risco nesse grupo. Da mesma forma, sugere-se que os títulos de antiLDL-ox sejam mais elevados em indivíduos com síndrome metabólica36.
Embora, no presente estudo, o IMC não tenha diferido significativamente entre casos e controles, não se pode excluir que diferenças de resistência à insulina entre os dois grupos possam ter contribuído para os resultados encontrados. Fármacos inibidores da HMG-CoA redutase (estatinas) têm propriedades imunomodulatórias e reduzem os níveis de antiLDL-ox circulantes.
Uma vez que o uso de estatinas não diferiu entre os grupos, presume-se que a diferença encontrada nos títulos médios de antiLDL-ox não decorra da utilização dessa terapêutica, embora não se disponha de dados relativos às formulações, posologia e tempo de utilização desses fármacos nas amostras estudadas, tampouco a colesterolemia média diferiu entre casos e controles, o que confirma o resultado de investigações prévias que não encontraram correlação positiva entre as concentrações séricas de lipoproteínas e os títulos de antiLDL-ox.
O valor médio da PCR-us foi, como esperado, mais elevado em casos do que em controles. A PCR-us é considerada um marcador inflamatório e seus níveis séricos podem ter aplicabilidade clínica na detecção e prevenção da doença cardiovascular37. O estudo JUPITER, recentemente concluído, demonstrou que pacientes com risco cardiovascular, mas com níveis normais de LDL (< 130 mg/dl) e com PCR-us elevada (> 2 mg/dl), que fizeram uso de rosuvastatina, comparados contra placebo, tiveram significativamente menos desfechos cardiovasculares38.
Os antiLDL-ox seriam marcadores de autoimunidade e estudos que correlacionam valores de PCR-us com títulos de antiLDL-ox, em SCA, mostram que ambos são independentes entre si. No entanto, quando simultaneamente elevados, aumentam o valor preditivo para o diagnóstico do evento coronariano agudo39.
Procurou-se controlar os diferentes vieses de confusão pela análise estatística. O modelo de regressão incluiu variáveis que diferiram ou não significativamente entre os grupos, e evidenciou que tanto os títulos de antiLDL-ox quanto os de antipeptD associavam-se de forma independente aos eventos coronarianos agudos na amostra analisada.
O melhor conhecimento da inflamação e aterotrombose, bem como a evidência de autoanticorpos LDL-ox, poderá estabelecer novas estratégias preventivas, entre elas a
Na amostra estudada, não se estabeleceu um valor de corte dos títulos de antiLDL-ox, acima do qual poder-se-ia discriminar com suficiente sensibilidade e especificidade os casos de SCA. O método imunoenzimático para dosagem dos antiLDL-ox é de difícil padronização e execução, o que pode induzir a resultados discrepantes, conforme se observa em diferentes estudos. A aplicabilidade clínica de sua determinação dependerá de futuras investigações, bem como de avaliação custo-benefício.
Os resultados mostraram que os títulos de antiLDL-ox foram significativamente mais elevados nos pacientes com SCA comparados aos pacientes com DAC e podem estar associados à instabilidade da placa aterosclerótica.
Agradecemos ao Dr. Daniel Francisco Jacob Ketelhuth, pelo valoroso apoio logístico na realização dos testes sorológicos.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Ana Maria Brito Medeiros pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Correspondência: Luiz Carlos Bodanese Rua Artur Rocha, 920/702 - Auxiliadora 90450-170 - Porto Alegre, RS - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 17/12/09
Revisado recebido em 30/11/09
Aceito em 28/12/09.
BACKGROUND: The oxidation of low-density lipoprotein (oxLDL) induces the formation of immunogenic epitopes in molecules. The presence of autoantibodies against oxLDL has been demonstrated in the serum of patients with coronary artery disease (CAD). However, the role of these autoantibodies in the pathophysiology of acute coronary syndromes (ACS) and their clinical significance remain undefined. OBJECTIVE: To evaluate the association between antibodies against oxLDL and ACS. METHODS: Titers of IgG autoantibodies against oxLDL by copper (anti-oxLDL) and anti-D synthetic peptide derived from apolipoprotein B (antipeptD) were determined by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 90 patients, in the first 12 hours of ACS (cases) and in 90 patients with chronic CAD (controls). RESULTS: The results showed that the titers of anti-oxLDL were significantly higher (p = 0.017) in cases (0.40 ± 0.22) than in controls (0.33 ± 0.23). On the other hand, the titers of antipeptD were significantly lower (p < 0.01) in cases (0.28 ± 0.23) than in controls (0.45 ± 0.30). The difference in the titers of both antibodies between the two groups was independent of age, sex, hypertension, diabetes mellitus, dyslipidemia, body mass index, smoking, lipid profile, statin use and family history of CAD. CONCLUSION: The results showed that the titers of anti-oxLDL were significantly higher in patients with acute coronary syndrome as compared to patients with coronary artery disease and may be associated with atherosclerotic plaque instability.
IFaculdade de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - Hospital São Lucas da PUCRS, Porto Alegre, RS
IIUniversidade de São Paulo - USP, São Paulo, SP - Brazil
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The low-density lipoprotein (LDL) is the main carrier of cholesterol from human plasma. LDL has a lipophilic core that consists of esters of cholesterol and triglycerides and a polar surface composed of non-esterified cholesterol and phospholipids. Phospholipids are shrouded by apolipoprotein B-100 (apoB). The LDL molecule also contains fat-soluble antioxidants such as vitamin E, α and β carotene, ubiquinol, among others1. However, under conditions of oxidative stress, the LDL particles, which contain polyunsaturated fatty acids (PUFA), are easily oxidized and, consequently, apoB is modified by lipid oxidation2.
Because of its proinflammatory and pro-atherogenic properties, the oxidized low density lipoprotein (oxLDL) is a marker of risk for cardiovascular disease (CVD). It may act in the subendotelial space3,4. Although attractive, relevant evidence that the hypothesis of oxLDL contributes to human atherosclerosis are still not definitively established and deserves further well-designed studies that may establish its contribution in the pathophysiology of atherosclerosis5.
Some evidence suggests that IgG autoantibodies for oxLDL are associated with proatherogenic properties and IgM autoantibodies for oxLDL play an atheroprotective role6. The IgM class, which recognizes specific epitopes to oxidation, may be involved in the uptake and detoxification of pro-inflammatory oxidized lipids3. Thus, IgG and IgM autoantibodies may have antagonistic actions.
Recent studies showed that patients with acute coronary syndrome (ACS) including acute myocardial infarction (AMI) and unstable angina (UA), had higher levels of anti-oxLDL than patients with stable angina (SA) and controls (p < 0.05)7. Other studies have questioned the actual contribution of anti-oxLDL in atherogenesis, and had no significant differences between the titers of these antibodies in normal controls and in patients with chronic or acute coronary artery disease (CAD)8.
Within this context, the objective of this study was to evaluate the association between autoantibodies against oxLDL and ACS.
We conducted a controlled cross-sectional study, which included individuals of both sexes, older than 40, diagnosed with CAD, acute or chronic, treated at
It also included patients with clinical diagnosis of ACS without persistent ST segment elevation (ACSWSTE). The diagnosis of ACSWSTE was defined as: two episodes of angina pectoris, or one episode of angina pectoris at rest with more than 20 minutes duration in the 24 hours preceding admission, no persistent ST segment elevation above 0.05 mV; presence or absence of elevated serum markers of myocardial necrosis or micro-embolization (creatine kinase with MB fraction above 20 U/l and/or troponin I above 0.05 ng/ml). The clinical picture upon admission was stratified according to the Braunwald classification9. The control group consisted of patients with established CAD, asymptomatic or with stable angina pectoris class I, according to the Canadian Cardiovascular Society's classification10.
Ineligible patients were defined as those with: presence of left bundle branch block; ST-segment elevation above 0.05 mV at resting ECG, surgery performed less than three months before, including coronary artery bypass grafting, percutaneous coronary angioplasty less three months before; neoplasms; previously known hematological and immunological disorders; connective tissue diseases or inflammatory diseases associated with elevation of serum markers. The study also excluded patients on immunosuppressive medication, immunologically active diseases, neoplasms, AIDS, thyroid diseases and debilitating gastrointestinal disorders and individuals who refused to sign the informed consent.
Sex, age, body mass index (BMI), hypertension (HBP), diabetes mellitus (DM), dyslipidemia, chronic exposure to smoking (active smoking), family history of CAD, use of statins and serum high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP).
BMI was calculated by the formula: weight in kilograms divided by squared height in meters. Obese individuals were considered those with index
The smokers were stratified into: current smokers, those with a current smoking habit and who had smoked in the last year, former smokers, individuals who had quit smoking for over a year, and nonsmokers.
Family history of CAD was considered positive in those individuals whose first-degree relatives had presented early cardiovascular mortality (< 55 years in men and < 65 years in women).
IgG antibodies against oxLDL and anti-peptD and hs-CRP were measured in plasma from cases and controls by Enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA).
The lipid and protein composition of LDL were determined by Lowry method11. The contents of total cholesterol and triacetilglicerol was measured by the enzymatic method12. The detection of IgG antibodies against oxLDL generated in the serum of cases and controls, as well as IgG antibodies against synthetic peptide D derived from apoB (antipeptD IgG) and the dosage of total IgG was done by ELISA technique (Enzyme-linked immunosorbent assay)13.
Laboratory tests were determined by enzyme-linked immunosorbent assay in the first 12 hours after defining the clinical picture of ACS, stored in a freezer at -70ºC and subsequently sent for analysis at
The sample size was calculated first. To detect a difference of at least 70 units of optical density under average serum IgG anti-oxLDL titer between cases and controls, we estimated a sample size of 86 patients per cohort, considering standard deviation for IgG anti-oxLDL of 140 units, α = 0.05 and statistical power of 90% (β = 0.10).
Adherence to the normal distribution (Gaussian) of distribution of anti-oxLDL and antipeptD values in the two cohorts was assessed by Kolmogorov-Smirnov test (KS). The Mann-Whitney test was used to compare the results of determination of average serum of IgG antibodies against oxLDL, IgG against peptide D and total IgG between cases and controls.
The significance of associations between categorical variables was analyzed by Fisher exact test and, between continuous variables, Mann-Whitney test. The intervening variables were controlled by multiple linear regression. Analyses of sensitivity and specificity of cutoff values of anti-oxLDL for diagnosis of ACS were made by ROC (receiver operating characteristic).
The results were expressed as means plus or minus the standard deviation. Differences were considered significant when the p value < 0.05.
The study was approved by the Ethics Committee of
The sex distribution between groups was also comparable and 49.0% of cases and 53.0% of controls were male (p = 0.65). The two groups did not differ in relation to obesity and one quarter of cases and one fifth of controls had body mass index > 30 kg/m2 (p = 0.59). Likewise, there was no statistically significant difference between groups regarding current smoking habit (12.0% of active smokers in cases and 12.0% also in controls) nor conercing family history of CAD (p = 0.17).
The previous diagnosis of dyslipidemia (p = 0.12), mean blood cholesterol (p = 0.09), triglyceridemia (p = 0.76) and use of cholesterol-lowering drugs (statins) (p = 0, 11) also did not differ significantly between cases and controls.
The frequency of hypertension was significantly higher in cases than in controls, 80.0% and 45.0% respectively (p < 0.01) and prior diagnosis of DM, present in 35.0% of cases and for 18.0% of controls (p = 0.01). More than half of the control group and one-fifth group of cases were former smokers (p < 0.01). Serum values of hs-CRP were significantly higher in cases than in controls (p < 0.01).
Total IgG concentration did not differ significantly between groups (p = 0.74), as shown in
Mean IgG anti-oxLDL titers was significantly higher in cases (0.40 ± 0.22) than in controls (0.33 ± 0.22), (p = 0.017) (
The difference between the average values of serum titers of anti-oxLDL in both groups (
The ROC curve analysis (
Contemporary concepts challenge and suggest new paradigms on the pathophysiology and natural history of atherosclerosis and its clinical complications. Considering evidence from studies of cellular and molecular biology and clinical and experimental research, atherosclerosis understood as a process resulting from the chronic, passive and focal deposit of lipids on the arterial wall, gave rise to the notion of an, immune-mediated and systemic response3,6,14.
The current concept of vulnerable plaque is associated with the characterization of vulnerable patient, with high probability of having a future cardiovascular event, and whose identification is a major clinical challenge15.
One third of cases of sudden death and AMI occurs in previously asymptomatic individuals who have silent disease and/or associated risk factors. Epidemiological, observational and intervention studies highlighted the contribution of factors such as hypertension, smoking, DM and dyslipidemia for the risk of vascular disease, especially CAD. However, 20% of individuals with CAD do not present any of the classic risk factors16. In addition, about half of all cases of AMI occur in people with plasma cholesterol levels within normal limits17.
In the study of natural history of atherosclerosis and its determinants, several inflammatory markers have been identified, and in selected population samples, many of these substances are found to be capable of playing a modulating role in the risk of the disease and its complications. These include hs-CRP, CD40 ligand, V-CAM-1, MCP-1, IL-6 and IL-718.
Recently, a growing body of evidence suggests that local and systemic activation of the immune system may be related to the process of atherosclerotic plaque instability and its clinical manifestations. Although there is a chronic elevation of circulating immunoglobulins in patients with chronic stable CAD, a transient increase in T cell activation has been described by several authors in patients with ACS, leading them to believe that this may be a determining factor in the pathophysiology of acute complications19.
Ammirati et al19 observed that patients with ACS had a limited number of gene segments in the β chain of T cell receptors (RCT) activated, compared to controls with chronic CAD.
In the control group, the RCT were highly polymorphic. Furthermore, only T lymphocytes from patients with ACS proliferated in response to autologous proteins present in culprit lesions by acute event and/or in response to oxLDL. Lymphocyte proliferation in response to oxLDL was more intense in patients with ACS with higher morbidity than those with favorable outcome.
The authors suggest that in the acute phase of lesion instability, the polyclonal antibody response, characteristic of chronic CAD, lead to the activation mediated by a limited number of immunogenic molecules found in the plaque, and different from those related to lymphocyte activation observed in the chronic phase of the disease. They also draw attention to the fact that 68.0% of monotypic or oligotipic gene segments found in the acute phase have not been detected three months after the coronary event, stressing the idea that an antigen-specific population of T cells had been transiently activated during this period.
Using monoclonal antibodies against epitopes of oxLDL derived from genetically modified mice, several authors observed that oxLDL titers were significantly higher in ACS patients than in patients with chronic CAD7,20.
Tsimikas et al21 found an increase of 60.0% in the titers of autoantibodies against a number of epitopes generated in LDL oxidation models in patients during the acute phase and within one month after AMI. It is assumed that, in acute coronary event, the antigenic substrate originates from the direct release of modified lipoproteins, either by breakage or increased permeability of the plaque, or by disruption of cell membranes resulting from acute ischemic injury or reperfusion22.
The oxLDL plays a critical role in the development of atherosclerosis and experimental data support that it is associated with multiple cardiometabolic risk factors23. These authors reported that high concentrations of oxLDL were associated with increased incidence of metabolic syndrome and its components, abdominal obesity, hyperglycemia and hypertriglyceridemia.
The oxidative modification of LDL induces the formation of immunogenic epitopes in the LDL molecule, which leads to the formation of antibodies against oxLDL, which can be detected in serum24. Studies have shown that the anti-oxLDL molecule can block the uptake of oxLDL by macrophages in atherosclerotic lesions, suggesting a possible protective role for the formation of foam cells25.
In this study, we found that average serum titers of anti-oxLDL were significantly higher in patients with ACS compared to individuals with chronic CAD. The difference found was significant and independent on cardiovascular risk factors established, such as hypertension, smoking, diabetes and dyslipidemia. This difference was specific for IgG anti-oxLDL antibodies, once the concentration of total IgG did not differ significantly between cases and controls.
On the other hand, average serum titers of antipeptD were significantly lower in patients with ACS than in those with chronic CAD, and the difference was also independent on cardiovascular risk factors and the concentration of total IgG between the two groups.
Considering the study design, and because the anti-oxLDL and antipeptD values are unknown, before the onset of acute ischemia, we cannot state that these antibodies contribute to the instability of coronary lesions, or even if their increase represents an epiphenomenon resulting from plaque rupture.
However, some hypotheses are generated to interpret the behavior of the antibody response observed. It is possible to occur, during acute coronary event, in vivo, greater and quicker formation of antibodies from specific clones of B lymphocytes, pre-existing during the chronic phase of CAD in response to increased antigens. The immune response could play a protective role and contribute to the development of the acute ischemic event. The protective role of anti-oxLDL is evaluated from experimental evidence.
Shoenfeld et al26 immunized knock out mice with homologous oxLDL, and observed that the procedure determined an increase in anti-oxLDL titers, and reduced the rate of progression of atherosclerotic lesions in these animals. Researchers propose the involvement of antibodies against oxLDL in clearing oxidized lipoproteins, both those from circulation and from the plaque, from the formation of immune complexes, which were eliminated by the monocyte-phagocytic system, via Fc receptor.
It is possible that the monoclonal response against some antigenic epitopes be more specific27, which would explain why, in this study, there was evidence of elevated oxLDL titers (polyclonal response) and reduction of antipeptD titers (monoclonal response) in patients with ACS compared to controls with chronic CAD. It is assumed that the reduction of antipeptD titers associated with acute ischemic events reflects the higher speed with which these antigens are complexed.
On the other hand, it is conceivable that the increase in the formation of immune complexes is directly related to the process of plaque unstabilization. Virella et al28 suggest that in humans, anti-oxLDL/oxLDL complexes would be eagerly digested by macrophages, creating a massive accumulation of intracellular cholesterol esters, responsible for plaque instability.
Mangueira et al29 evaluated the antipeptD and anti-oxLDL titers in 66 patients with rheumatoid arthritis, a chronic inflammatory disease whose main cause of mortality is the CAD. The authors observed a significant correlation between the titers of both antibodies, but only the titlers of anti-oxLDL were higher in patients compared to controls.
Studies that analyze elevations in anti-oxLDL titers relate the increase of such titers with plaque rupture, and its reduction with the phase of stabilization of such lesions30.
In a recent study, Doo et al31 evaluated the prognostic value of anti-oxLDL as predictors of coronary events in a cohort of 60 patients hospitalized for unstable angina. They observed that individuals whose antibody titers were higher at admission had a significantly greater number of new coronary events during the observation period of 16 months, concluding that the determination of anti-oxLDL can be a useful way of identifying groups at higher risk.
Most studies compare the immune response to oxLDL in patients with ACS compared to controls without clinical evidence of coronary artery disease7, However, even asymptomatic patients may have subclinical forms of the disease with severe and diffuse vascular involvement32. We chose to compare the antibody titers among individuals with ACS and chronic, stable and well-defined CAD, once the goal is not diagnosis, but the role of autoimmune response in characterizing different clinical pictures of the disease.
Another difference is that some studies compare acute and chronic CAD by determining titers of circulating oxLDL. This method uses monoclonal antibodies against specific epitopes in the oxLDL molecule, which is not available in our field and presents foreseeable difficulties.
The direct determination of oxLDL in plasma or serum is complicated by the possibility of in vivo modifications of samples and the variety of particles at different oxidation stages, which can be identified and whose significance in terms of predictive disease is also potentially variable. Thus, it is explained why the reproducibility of the reference preparation of oxLDL, used as standard in the test, delivers inconsistent results, even in the same population. Circulating levels of oxLDL are very low due to high concentration of antioxidants in the blood. Furthermore, they may not correlate with the amount of oxidized lipoprotein found in the atherosclerotic plaque, protected within the subendothelium.
In healthy individuals, it is estimated that the average plasma concentration of oxLDL is approximately 0.1 ng/μg of the protein portion of LDL33. Thus, the primary location of the analysis concerned could not be the circulation.
The samples analyzed seem to represent the population of patients with severe ischemic heart disease enrolled in tertiary care services. However, certain differences between the two groups should be considered. Exposure to some risk factors for CAD differed significantly between cases and controls. It is known that anti-oxLDL titers are higher in diabetics34 and hypertensive patients35 than in individuals without such diagnoses. Patients with these diseases were more prevalent in the group with ACS. Hence, average anti-oxLDL titers, significantly higher in cases, could be associated or not with the acute event, but to the greater frequency of risk factors in this group. Likewise, it is suggested that anti-oxLDL titers are higher in individuals with metabolic syndrome36.
Although in the present study BMI did not differ significantly between cases and controls, it is conceivable that differences in insulin resistance between the two groups may have contributed to these results. HMG-CoA reductase inhibitors (statin) have immunomodulatory properties and reduce levels of circulating anti-oxLDL.
Since the use of statins did not differ between groups, it is assumed that the difference found in the average anti-oxLDL titers does not derive from the use of this therapy, although no data are available regarding the formulation, dosage and duration of use of these drugs in the samples studied, neither the average cholesterol differed between cases and controls, which confirms the results of previous investigations that found no positive correlation between serum lipoproteins and evidence of anti-oxLDL.
Average hs-CRP values were, as expected, higher in cases than in controls. Hs-CRP is considered an inflammatory marker and its serum levels may have clinical applicability in the detection and prevention of cardiovascular disease37. The JUPITER study, recently completed, showed that patients with cardiovascular risk, but with normal levels of LDL (< 130 mg/dl) and high hs-CRP (> 2 mg/dl), who made use of rosuvastatin, compared with placebo, had significantly fewer cardiovascular events38.
Anti-oxLDL would be markers of autoimmunity and studies correlating hs-CRP values with anti-oxLDL titers, in ACS, shows that both are mutually independent. However, when both are high, they increase the predictive value for diagnosis of acute coronary event39.
We tried to control the different biases of confusion in the statistical analysis. The regression model included variables that differed or not significantly different between groups, and showed that both anti-oxLDL titers and those of antipeptD were independently associated with acute coronary events in the sample.
Better knowledge of inflammation and atherothrombosis, as well as evidence of oxLDL autoantibodies, may establish new preventive strategies, including the feasibility of vaccination for primary prevention in individuals with cardiovascular risk factors.
In this sample, we did not establish a cutoff value of anti-oxLDL titers, above which we could discriminate ACS cases with sufficient sensitivity and specificity. The immunoassay method for determination of anti-oxLDL is difficult to standardize and implement, which may lead to conflicting results, as seen in different studies. The clinical applicability of its determination will depend on further investigations, as well as cost-benefit evaluation.
The results showed that anti-oxLDL titers were significantly higher in ACS patients compared with patients with CAD and may be associated with atherosclerotic plaque instability.
We would like to thank Dr. Daniel Francisco Jacob Ketelhuth for the invaluable logistical support in carrying out the serological tests.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This study is part of the Doctoral Thesis of Ana Maria Brito Medeiros, from
FUNDAMENTO: La oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDL-ox) induce a la formación de epítopos inmunogénicos en la molécula. La presencia de autoanticuerpos contra la LDL-ox ha sido demostrada en el suero de pacientes con enfermedad arterial coronaria (EAC). No obstante eso, el papel de esos autoanticuerpos en la fisiopatología de los síndromes coronarios agudos (SCA) y su significado clínico permanecen indefinidos. OBJETIVO: Evaluar la asociación entre autoanticuerpos contra la LDL-ox y SCA. MÉTODOS: Los títulos de inmunoglobulina G autoanticuerpos contra la LDL-ox por cobre (antiLDL-ox) y contra el péptido sintético D derivado de la apolipoproteína B (antipeptD) fueron determinados por ensayo inmunoenzimático (ELISA) en 90 pacientes, en las primeras 12h de SCA (casos) y en 90 pacientes con EAC crónica (controles). RESULTADOS: Los resultados mostraron que los títulos de antiLDL-ox fueron significativamente más elevados (p =0,017) en los casos (0,40 ± 0,22), que en los controles (0,33 ± 0,23). Por otro lado, los títulos de antipeptD fueron significativamente menores (p < 0,01) en los casos (0,28 ± 0,23) que en los controles (0,45 ± 0,30). La diferencia de los títulos de ambos anticuerpos entre los dos grupos estudiados fue independiente de edad, sexo, hipertensión arterial, diabetes mellitus, dislipidemia, índice de masa corporal, tabaquismo, perfil lipídico, uso de estatinas e historia familiar de EAC. CONCLUSIÓN: Los resultados mostraron que los títulos de antiLDL-ox fueron significativamente más elevados en los pacientes con síndrome coronario agudo cuando fueron comparados a los pacientes con enfermedad arterial coronaria y pueden estar asociados a inestabilidad de la placa aterosclerótica.
IFaculdade de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - Hospital São Lucas da PUCRS, Porto Alegre, RS
IIUniversidade de São Paulo - USP, São Paulo, SP - Brasil
La lipoproteína de baja densidad (LDL) es la principal partícula transportadora de colesterol del plasma humano. La LDL posee un núcleo lipofílico formado de ésteres de colesterol y triglicéridos y una superficie polar constituida por colesterol no esterificado y fosfolípidos. Los fosfolípidos están envueltos por la apolipoproteína B-100 (apoB). La molécula de LDL contiene también antioxidantes liposolubles, como vitamina E, α y β caroteno, ubiquinol, entre otros1. Mientras, bajo condiciones de stress oxidativo las partículas de LDL, que contienen ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), son fácilmente oxidadas y, consecuentemente, la apoB es modificada a través de la oxidación lipídica2.
Debido a sus propiedades pro-inflamatorias y pro-aterogénicas, la lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL-ox) es un marcador de riesgo para las enfermedades cardiovasculares (ECV), pudiendo ocurrir su acción en el espacio subendotelial3,4. Aunque atractivas, evidencias relevantes de que la hipótesis de que la LDL-ox contribuye a la aterosclerosis humana permanecen todavía no definitivamente establecidas, mereciendo nuevos estudios bien delineados, que puedan establecer su contribución en la fisiopatología de la aterosclerosis5.
Algunas evidencias sugieren que autoanticuerpos IgG para la LDL-ox están asociados con propiedades pro-aterogénicas y autoanticuerpos IgM para la LDL-ox desempeñan un papel ateroprotector6. La clase IgM, que reconoce epítopos específicos para la oxidación, puede estar envuelta en la captación y desintoxicación de lípidos oxidados pro-inflamatorios3. De este modo, los autoanticuerpos IgG e IgM pueden tener acciones antagónicas.
Estudios recientes mostraron que pacientes con síndrome coronario agudo (SCA), incluyendo infarto agudo de miocardio (IAM) y angina inestable (AI), presentan niveles más elevados de antiLDL-ox que pacientes con angina estable (AE) y controles (p < 0,05)7. Otros estudios cuestionan la efectiva contribución de los antiLDL-ox en la aterogénesis, no habiendo sido observadas diferencias significativas entre los títulos de estos anticuerpos en controles normales y en pacientes con enfermedad arterial coronaria (EAC) crónica o aguda8.
Dentro de ese contexto, el objetivo de este estudio fue evaluar la asociación entre autoanticuerpos contra la LDL-ox y SCA.
Se realizó un estudio transversal controlado, en el cual fueron incluidos individuos de ambos sexos, con más de 40 años de edad, con diagnóstico de EAC, aguda o crónica, atendidos en el Hospital São Lucas de la PUCRS, de manera consecutiva, en el período de mar/2001-dec/2003.
También fueron incluidos pacientes con cuadro clínico de SCA sin supradesnivel persistente del segmento ST (SCASSST). El diagnóstico de SCASSST fue definido así: dos episodios de
Fueron definidos como pacientes inelegibles aquellos que presentaron: presencia de bloqueo completo de rama izquierda; supradesnivel encima de 0,05 mV del segmento ST en el ECG de reposo, cirugía hace menos de tres meses, incluyendo cirugía de revascularización miocárdica; angioplastía coronaria percutánea hace menos de tres meses; neoplasias; disturbios hematológicos e inmunológicos conocidos; enfermedades del tejido conjuntivo o inflamatorias asociadas a la elevación de marcadores séricos. Se excluyeron, aún, pacientes en uso de medicación inmunosupresora, enfermedades inmunológicamente activas, neoplasias, SIDA, enfermedades de la tiroides y enfermedades gastrointestinales debilitantes e individuos que se negaron a firmar el término de consentimiento libre y aclarado.
Sexo, edad, índice de masa corporal (IMC), hipertensión arterial (HA), diabetes mellitus (DM), dislipidemia, exposición crónica al tabaco (tabaquismo activo), historia familiar de EAC, uso de estatinas y dosaje sérico de la proteína-C-reactiva ultra-sensible(PCR-us).
El IMC fue calculado por la fórmula: peso, en quilogramos, dividido por la altura al cuadrado, en metros. Fue considerado obeso el individuo con índice
Los tabaquistas fueron estratificados en: fumantes activos, aquellos individuos con hábito de fumar actual y que habían fumado en el último año; ex-fumantes, los individuos que habían abandonado el hábito de fumar hace más de un año; y no fumantes.
La historia familiar de EAC fue considerada positiva en aquellos individuos cuyos familiares en primer grado tuviesen presentado mortalidad cardiovascular precoz (< 55 años en hombres y < 65 años en mujeres).
Anticuerpos IgG contra la LDL-ox y contra el peptD y PCR-us fueron medidos en el plasma de casos y de controles por ensayo inmunoenzimático (ELISA).
El perfil lipídico y la composición proteica de la LDL fueron determinados por el método de Lowry11. El contenido de colesterol total y de triacetilglicerol fue dosado por método enzimático12. La detección de anticuerpos IgG contra la LDL-ox generados en el suero de casos y controles, así como anticuerpos IgG contra el péptido sintético D derivado de la apoB (antipeptD IgG) y el dosaje de la IgG total, fue hecho por técnica de
Los análisis de laboratorio fueron determinados por ensayo inmunoenzimático en las primeras 12 horas después de definido el cuadro clínico de SCA, almacenadas en freezer a -70ºC y posteriormente encaminadas para análisis en el Instituto de Inmunofisiopatología de la Universidad de San Pablo.
El tamaño de la muestra fue calculado a priori. Para detectar una diferencia de por lo menos 70 unidades en la densidad óptica del título sérico medio de IgG antiLDL-ox entre casos y controles, fue estimado un tamaño de muestra de 86 pacientes por grupo de estudio, considerándose el desvío estándar para IgG antiLDL-ox de 140 unidades, α = 0,05 y poder estadístico de 90% (β = 0,10).
La adherencia a la distribución normal (gaussiana) de la distribución de los valores de antiLDL-ox y de antipeptD en los dos grupos de estudio fue evaluada por el test de Kolmogorov-Smirnov (K-S). El test de Mann-Whitney fue usado para comparar los resultados de la determinación sérica media de anticuerpos IgG contra la LDL-ox, IgG contra el péptido
La significancia de las asociaciones entre variables categóricas fue analizada por el test exacto de Fischer y, entre variables continuas, por el test de Mann-Whitney. Las variables intervinientes fueron controladas por regresión lineal múltiple. Los análisis de sensibilidad y de especificidad de valores de corte de antiLDL-ox para diagnóstico de SCA fueron hechos por curva ROC (
Los resultados fueron expresados como medias, más o menos el desvío estándar de la media. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando el valor de p < 0,05.
El estudio fue sometido y aprobado por el CEP del Hospital São Lucas de la PUCRS (ID: 03/01533, aprobado el 13/06/2003).
La
La distribución por sexo entre los grupos fue igualmente comparable, siendo que 49,0% de los casos y 53,0% de los controles eran del sexo masculino (p = 0,65). Los dos grupos tampoco difirieron en relación a la obesidad, siendo que un cuarto de los casos y un quinto de los controles presentaban índices de masa corporal > 30 kg/m2 (p = 0,59). De la misma forma, no se observó diferencia estadísticamente significativa entre los grupos con relación al hábito actual de fumar (12,0% de fumantes activos en casos y 12,0% también en controles) y ni en referencia a la historia familiar de EAC (p = 0,17).
El diagnóstico previo de dislipidemia (p = 0,12), los valores medios de la colesterolemia (p = 0,09), de la trigliceridemia (p = 0,76) y el uso de fármacos reductores de la colesterolemia (estatinas) (p = 0,11) tampoco difirieron significativamente entre casos y controles.
La frecuencia de HA fue significativamente mayor en los casos que en los controles, 80,0% y 45,0%, respectivamente (p < 0,01), así como el diagnóstico previo de DM, presente en 35,0% de los casos y en 18,0% de los controles (p = 0,01). Más de la mitad del grupo control y un quinto del grupo de los casos eran ex-fumantes (p < 0,01). Los valores séricos de la PCR-us fueron significativamente mayores en los casos que en los controles (p < 0,01).
La concentración de IgG total no difirió significativamente entre los grupos (p = 0,74), como se ve en la
El título medio de IgG antiLDL-ox fue significativamente mayor en los casos (0,40 ± 0,22) que en los controles (0,33 ± 0,22), (p = 0,017) (
La
La diferencia entre los valores medios de los títulos séricos de antiLDL-ox en los dos grupos estudiados (
El análisis de la curva ROC (
Los conocimientos contemporáneos cuestionan y sugieren nuevos paradigmas sobre la fisiopatología y la historia natural de la aterosclerosis y sus complicaciones clínicas. Considerando las evidencias de estudios de biología celular y molecular y de investigaciones clínicas y experimentales, la aterosclerosis entendida como un proceso resultante del depósito crónico, pasivo y focal de lípidos en la pared arterial, dio lugar a la noción de una respuesta inflamatoria, inmunomediada y sistémica3,6,14.
Al concepto actual de placa vulnerable, se asocia la caracterización del paciente vulnerable, con alta probabilidad de presentar un evento cardiovascular futuro, y cuya identificación es uno de los principales desafíos clínicos15.
Un tercio de los casos de muerte súbita y de IAM ocurre en individuos previamente asintomáticos, que tienen enfermedad silenciosa y/o factores de riesgo asociados. Estudios epidemiológicos, de observación y de intervención evidenciaron la contribución de factores como HA, tabaco, DM y dislipidemias para el riesgo de enfermedad vascular, especialmente para la EAC. Con todo, 20% de los individuos con EAC no presentan ninguno de los factores de riesgo clásicos16. Además de eso, cerca de la mitad de los casos de IAM ocurre en personas con niveles de colesterol plasmático dentro de los límites considerados normales17.
En el estudio de la historia natural de la aterosclerosis y de sus determinantes, muchos marcadores inflamatorios fueron identificados y, en muestras poblacionales seleccionadas, varias de estas sustancias se muestra capaces de ejercer un papel modulador en el riesgo de la enfermedad y de sus complicaciones. Entre ellas, se citan la PCR-us, CD40 vinculante, V-CAM-1, MCP-1, IL-6 y IL-718.
Recientemente, un número creciente de evidencias sugiere que la activación local y sistémica del sistema inmunológico pueda estar relacionada con el proceso de inestabilidad de la placa aterosclerótica y de sus manifestaciones clínicas. Aunque haya una elevación crónica de inmunoglobulinas circulantes en pacientes con EAC crónica estable, un incremento transitorio de activación de las células T ha sido descripto por varios autores en pacientes con SCA, llevándolos a creer que eso pueda ser uno de los determinantes en la fisiopatología de las complicaciones agudas19.
Ammirati et al19 observaron que pacientes con SCA tenían un número restricto de segmentos génicos, en la cadena β de los receptores de células T(RCT) activadas, en relación a controles con EAC crónica.
En el grupo control, los RCT eran altamente polimórficos. Además de eso, solamente linfocitos T de pacientes con SCA proliferaban en respuesta a proteínas autólogas, presentes en especímenes de las lesiones culpadas por el evento agudo y/o en respuesta a la LDL-ox. La proliferación linfocitaria en respuesta a la LDL-ox era más intensa en los pacientes con SCA que presentaron mayor morbilidad que en aquellos con evolución clínica favorable.
Los autores sugieren que, en la fase aguda de inestabilidad de la lesión, la respuesta inmunológica policlonal, característica de la EAC crónica, de lugar a la activación mediada por un número restricto de epítopos inmunogénicos presentes en la placa, y diferentes de aquellos relacionados a la activación linfocitaria observada en la fase crónica de la enfermedad. También llama la atención, el hecho de que 68,0% de los segmentos génicos monotípicos u oligotípicos, encontrados en la fase aguda, ya no hayan sido detectados tres meses después del evento coronario, reforzando la idea de que una población antígeno-específica de células T había sido transitoriamente activada en ese período.
Utilizando anticuerpos monoclonales contra epítopos de la LDL-ox oriundos de ratones genéticamente modificados, varios autores observaron que los títulos de LDL-ox eran significativamente más elevados en pacientes con SCA que en portadores de EAC crónica7,20.
Tsimikas et al21 encontraron una elevación de 60,0% en los títulos de autoanticuerpos contra una serie de epítopos generados en modelos de oxidación de la LDL, en pacientes durante la fase aguda y en hasta un mes después del IAM. Se admite que, en la fase aguda del evento coronario, el sustrato antigénico se origine de la liberación directa de la lipoproteína modificada, sea por la ruptura o aumento de permeabilidad de la placa, o sea por ruptura de las membranas celulares decurrente de lesión isquémica aguda o después de reperfusión22.
La LDL-ox desempeña un papel crucial en el desarrollo de la aterosclerosis y datos experimentales sostienen que está asociada a múltiples factores de riesgo cardiometabólicos23. Esos autores reportaron que altas concentraciones de LDL-ox fueron asociadas con el aumento de la incidencia de síndrome metabólico, así como sus componentes, obesidad abdominal, hiperglicemia e hipertrigliceridemia.
La modificación oxidativa de la LDL induce la formación de epítopos inmunogénicos en la molécula de LDL, lo cual lleva a la formación de anticuerpos contra la LDL-ox, que puede ser detectada en el suero24. Estudios han demostrado que la molécula de antiLDL-ox puede bloquear la captación de LDL-ox por los macrófagos en lesiones ateroscleróticas, sugiriendo un posible papel protector para la formación de células espumosas25.
En el presente estudio, se observó que los títulos séricos medios de antiLDL-ox fueron significativamente superiores en pacientes con SCA en relación a individuos con EAC crónica. La diferencia encontrada permaneció significativa e independiente de factores de riesgo cardiovascular establecidos, como HA, tabaco, DM y dislipidemia. Tal diferencia fue específica para los anticuerpos IgG antiLDL-ox, una vez que la concentración de IgG total no difirió significativamente entre casos y controles.
Por otro lado, los títulos séricos medios de antipeptD fueron significativamente menores en pacientes con SCA que en los individuos con EAC crónica, y la diferencia encontrada fue también independiente de los factores de riesgo cardiovascular y de la concentración de IgG total entre los dos grupos estudiados.
Teniendo en vista el delineamiento de la investigación, y por desconocerse los valores del antiLDL-ox y del antipeptD, antes del comienzo del cuadro isquémico agudo, no se puede afirmar que tales anticuerpos contribuyan a la inestabilidad de las lesiones coronarias, aunque su elevación represente un epifenómeno resultante de la ruptura de la placa.
Con todo, algunas hipótesis son generadas para interpretar el comportamiento de la respuesta inmunológica observada. Es posible que ocurra, durante la fase aguda del evento coronario,
Shoenfeld et al26 inmunizaron ratones
Es posible que la respuesta monoclonal contra algunos epítopos antigénicos sea más específica27, lo que explicaría la razón por la cual, en el presente estudio, hubo elevación de los títulos de LDL-ox (respuesta policlonal) y reducción de los títulos de antipeptD (respuesta monoclonal) en los pacientes con SCA en relación a los controles con EAC crónica. Se presume que la reducción de los títulos de antipeptD, asociada a los eventos isquémicos agudos, traduzca la mayor velocidad con que esos antígenos se agrupan.
Por otro lado, no se puede excluir que el aumento en la formación de inmunocomplejos se asocie directamente al proceso de inestabilización de la placa. Virella et al28 sugieren que, en humanos, complejos antiLDL-ox/LDL-ox serían ávidamente digeridos por macrófagos, creando un acúmulo macizo de ésteres de colesterol intracelular, responsable por la inestabilidad de la placa.
Mangueira et al29 evaluaron los títulos de antipeptD y de antiLDL-ox en 66 pacientes con diagnóstico de artritis reumatoidea, enfermedad inflamatoria crónica, cuya principal causa de mortalidad es la EAC. Los autores observaron buena correlación entre los títulos de los dos anticuerpos, pero solamente los títulos de antiLDL-ox fueron más elevados en los enfermos en relación a los controles.
Trabajos que analizan elevaciones en los títulos de antiLDL-ox, relacionan el aumento de esos títulos con la ruptura de la placa, y su reducción con la fase de estabilización de las lesiones30.
En estudio reciente, Doo et al31 evaluaron el valor pronóstico de los antiLDL-ox como predictores de eventos coronarios en una cohorte de 60 pacientes hospitalizados por AI. Observaron que los individuos cuyos títulos de anticuerpos eran más elevados en la admisión hospitalaria tuvieron un número significativamente mayor de nuevos eventos coronarios, durante el período de observación de 16 meses, concluyendo que la determinación de antiLDL-ox puede ser útil como forma de identificación de grupos de mayor riesgo.
La mayoría de los estudios comparan la respuesta inmunológica a la LDL-ox en pacientes con SCA en relación a controles sin evidencias clínicas de coronariopatía7. Con todo, aún individuos asintomáticos pueden presentar formas subclínicas de la enfermedad con compromiso vascular severo y difuso32. Se optó por comparar los títulos de anticuerpos entre individuos con SCA y con EAC crónica, estable y bien definida, una vez que el objetivo es, no el diagnóstico, sino el papel de la respuesta autoinmune en la caracterización de cuadros clínicos distintos de la enfermedad.
Otra diferencia es que algunos trabajos comparan formas agudas y crónicas de EAC por medio de la determinación de los títulos de la LDL-ox circulantes. Tal metodología utiliza anticuerpos monoclonales contra epítopos específicos en la molécula de la LDL-ox, no estando disponible en nuestro medio y presentando dificultades previsibles.
La determinación directa de la LDL-ox en el plasma, o en el suero, se complica por la posibilidad de modificaciones
En individuos sanos, se estima que la concentración plasmática media de LDL-ox sea de aproximadamente 0,1 ng/µg de la porción proteica de la LDL33. Así, la localización primaria del análisis de interés podría no ser la circulación.
Las muestras analizadas parecen ser representativas de la población de cardiópatas isquémicos severos, atendidos en servicios de atención terciaria de la enfermedad. Con todo, ciertas diferencias entre los dos grupos deben ser consideradas. La exposición a algunos factores de riesgo para EAC difirió significativamente entre casos y controles. Se sabe que los títulos de antiLDL-ox son más elevados en diabéticos34 y en hipertensos35 que en individuos sin tales diagnósticos. Pacientes con esas patologías fueron más prevalentes en el grupo con SCA. Así, los títulos medios de antiLDL-ox, significativamente más elevados en los casos, podrían estar asociados no al evento agudo, sino a la mayor frecuencia de factores de riesgo en ese grupo. De la misma forma, se sugiere que los títulos de antiLDL-ox sean más elevados en individuos con síndrome metabólico36.
Aunque, en el presente estudio, el IMC no haya diferido significativamente entre casos y controles, no se puede excluir que diferencias de resistencia a la insulina entre los dos grupos puedan haber contribuido a los resultados encontrados. Fármacos inhibidores de la HMG-CoA reductasa (estatinas) tienen propiedades inmunomodulatorias y reducen los niveles de antiLDL-ox circulantes.
Una vez que el uso de estatinas no difirió entre los grupos, se presume que la diferencia encontrada en los títulos medios de antiLDL-ox no surge de la utilización de esa terapéutica, aunque no se disponga de datos relativos a las formulaciones, posología y tiempo de utilización de esos fármacos en las muestras estudiadas, tampoco la colesterolemia media difirió entre casos y controles, lo que confirma el resultado de investigaciones previas que no encontraron correlación positiva entre las concentraciones séricas de lipoproteínas y los títulos de antiLDL-ox.
El valor medio de la PCR-us fue, como esperado, más elevado en casos que en controles. La PCR-us es considerada un marcador inflamatorio y sus niveles séricos pueden tener aplicabilidad clínica en la detección y prevención de la enfermedad cardiovascular37. El estudio JUPITER, recientemente concluido, demostró que pacientes con riesgo cardiovascular, pero con niveles normales de LDL (< 130 mg/dl) y con PCR-us elevada (> 2 mg/dl), que hicieron uso de rosuvastatina, comparados contra placebo, tuvieron significativamente menos desenlaces cardiovasculares38.
Los antiLDL-ox serían marcadores de autoinmunidad y estudios que correlacionan valores de PCR-us con títulos de antiLDL-ox, en SCA, muestran que ambos son independientes entre sí. Mientras tanto, cuando son simultáneamente elevados, aumentan el valor predictivo para el diagnóstico del evento coronario agudo39.
Se procuró controlar los diferentes sesgos de confusión por el análisis estadística. El modelo de regresión incluyó variables que difirieron o no significativamente entre los grupos, y evidenció que tanto los títulos de antiLDL-ox como los de antipeptD se asociaban de forma independiente a los eventos coronarios agudos en la muestra analizada.
El mejor conocimiento de la inflamación y aterotrombosis, así como la evidencia de autoanticuerpos LDL-ox, podrá establecer nuevas estrategias preventivas, entre ellas la
En la muestra estudiada, no se estableció un valor de corte de los títulos de antiLDL-ox, encima del cual se podría discriminar con suficiente sensibilidad y especificidad los casos de SCA. El método inmunoenzimático para dosaje de los antiLDL-ox es de difícil estandarización y ejecución, lo que puede inducir a resultados discrepantes, según se observa en diferentes estudios. La aplicabilidad clínica de su determinación dependerá de futuras investigaciones, así como de evaluación costo-beneficio.
Los resultados mostraron que los títulos de antiLDL-ox fueron significativamente más elevados em los pacientes con SCA comparados a los pacientes con EAC y pueden estar asociados a la inestabilidad de la placa aterosclerótica.
Agradecemos al Dr. Daniel Francisco Jacob Ketelhuth, por el valioso apoyo logístico en la realización de los tests suerológicos.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio no tuvo fuentes de financiamiento externas.
Este artículo es parte de tesis de Doctorado de Ana Maria Brito Medeiros por la Pontifícia Universidade Católica de Rio Grande do Sul.
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Artículo recibido el 17/12/09; revisado recibido el 30/11/09; aceptado el 28/12/09.