Vários estudos destacam as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs) como importantes contribuintes na patogênese de numerosas doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão, aterosclerose e falência cardíaca. Tais espécies são moléculas altamente bioativas e com vida curta derivadas, principalmente, da redução do oxigênio molecular. O complexo enzimático da NADPH oxidase é a maior fonte dessas espécies reativas na vasculatura. Sob condições fisiológicas, a formação e eliminação destas substâncias aparecem balanceadas na parede vascular. Durante o desbalanço redox, entretanto, há um aumento na atividade da NADPH oxidase e predomínio de agentes pró-oxidantes, superando a capacidade de defesa orgânica antioxidante. Além disso, tal hiperatividade enzimática reduz a biodisponibilidade do óxido nítrico, crucial para a vasodilatação e a manutenção da função vascular normal. Apesar de a NADPH oxidase relacionar-se diretamente à disfunção endotelial, foi primeiramente descrita por sua expressão em fagócitos, onde sua atividade determina a eficácia dos mecanismos de defesa orgânica contra patógenos. As sutis diferenças existentes entre as unidades estruturais das NADPH oxidases, a depender do tipo celular que as expressa, podem ter implicações terapêuticas, permitindo a inibição seletiva do desequilíbrio redox induzido pela NADPH oxidase, sem comprometer, entretanto, sua participação nas vias fisiológicas de sinalização celular que garantem a proteção contra microorganismos.
IUniversidade Federal de Alagoas, Maceió, AL - Brasil
IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG - Brasil
IIICentro Universitário de Belo Horizonte - Uni-BH3, Belo Horizonte, MG - Brasil
Vários estudos destacam as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs) como importantes contribuintes na patogênese de numerosas doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão, aterosclerose e falência cardíaca. Tais espécies são moléculas altamente bioativas e com vida curta derivadas, principalmente, da redução do oxigênio molecular. O complexo enzimático da NADPH oxidase é a maior fonte dessas espécies reativas na vasculatura. Sob condições fisiológicas, a formação e eliminação destas substâncias aparecem balanceadas na parede vascular. Durante o desbalanço redox, entretanto, há um aumento na atividade da NADPH oxidase e predomínio de agentes pró-oxidantes, superando a capacidade de defesa orgânica antioxidante. Além disso, tal hiperatividade enzimática reduz a biodisponibilidade do óxido nítrico, crucial para a vasodilatação e a manutenção da função vascular normal. Apesar de a NADPH oxidase relacionar-se diretamente à disfunção endotelial, foi primeiramente descrita por sua expressão em fagócitos, onde sua atividade determina a eficácia dos mecanismos de defesa orgânica contra patógenos. As sutis diferenças existentes entre as unidades estruturais das NADPH oxidases, a depender do tipo celular que as expressa, podem ter implicações terapêuticas, permitindo a inibição seletiva do desequilíbrio redox induzido pela NADPH oxidase, sem comprometer, entretanto, sua participação nas vias fisiológicas de sinalização celular que garantem a proteção contra microorganismos.
Vários estudos demonstram que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs) contribuem efetivamente para a patogênese de agravos cardiovasculares, como hipertensão, aterosclerose, hipertrofia e falência cardíacas e reestenose, além de lesões decorrentes de isquemia e reperfusão. Múltiplos sistemas enzimáticos produzem ERONs e seus derivados na vasculatura, incluindo ciclooxigenase, lipoxigenase, citocromo P450, xantina oxidase (XO), mieloperoxidase (MPO), óxido nítrico sintase (NOS) e NADPH oxidase - esta última uma das mais importantes fontes destas substâncias, tanto em células endoteliais como musculares lisas1-22.
Desde as observações de Baehner e cols.23 há cerca de 40 anos - que permitiram a descoberta da NADPH oxidase24 - vários foram os estudos desenvolvidos para compreender a relação entre o referido complexo enzimático e o desbalanço redox (estresse oxidativo). O aumento da produção de ânion superóxido (•O2-) e outras ERONs está implicado na aterosclerose, hipertensão arterial, proliferação celular e hipertrofia. Entretanto, o papel da NADPH oxidase em tais processos permanece incerto devido, principalmente, à presença de múltiplas isoformas de Nox (subunidades constituintes da NADPH oxidase) e seus ligantes, bem como à falta de inibidores específicos25,26. O complexo enzimático atua como doador de elétron para a redução do O2 a •O2-, segundo a reação 2O2 + NAD(P)H → 2O2- + NAD(P) + H+10,16,22,25,27.
Os experimentos pioneiros de Furchgott e Zawadzki28 primeiro demonstraram a existência de um fator relaxante derivado de endotélio que foi subsequentemente identificado como •NO29, produzido a partir da L-arginina pela ação do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)29-32 na presença de cofatores, principalmente a tetrahidrobiopterina (H4B;
Fisiologicamente, certa quantidade de •O2- intracelular é requerida para a sinalização normal desempenhada pelo •NO. Todavia, patologicamente, o aumento extracelular da primeira espécie diminui a biodisponibilidade do •NO, reduzindo sua difusão para o músculo liso vascular38,39. Em determinadas circunstâncias, a produção crônica de ERONs (aumento da atividade da NADPH oxidase, por exemplo) excede a capacidade dos antioxidantes celulares enzimáticos (como a glutationa peroxidase-1 - principal enzima antioxidante no citosol e nas mitocôndrias35,36 - e as formas de superóxido dismutase ligadas à membrana, responsáveis por dismutar o ânion superóxido em H2O2) e não enzimáticos, contribuindo para a doença vascular por indução da ativação endotelial sustentada29,40. Grandes quantidades de •O2- formadas captam a maior parte ou todo o •NO, promovendo a formação de •ONOO-34,41. O •O2- gerado pode ainda ser transformado em radical hidroxil, que se difunde para o músculo liso vascular e induz a produção de endoperóxidos vasoconstrictores, como a prostaglandina H2 e prostanoides41, derivados da peroxidação do ácido aracdônico catalisada por radicais livres, considerados marcadores do aumento sistêmico do desbalanço redox
Estudos de Wiggers e cols.45 demonstraram, em ratos, que a exposição a baixas concentrações de mercúrio induz disfunção endotelial tanto em vasos de condutância como de resistência. Os autores sugerem que esse evento decorre, provavelmente, da redução da biodisponibilidade do •NO devido ao aumento na produção vascular de •O2-. Dessa forma, é possível que o tratamento com o mercúrio afete a expressão proteica ou, mais especificamente, a atividade da NADPH oxidase.
Tal desequilíbrio relaciona-se às ERONs pelo fato de o O2 ser fundamental à respiração celular, havendo diversos sistemas enzimáticos que utilizam este substrato como um aceptor de elétrons1,20. A família dessas espécies inclui moléculas altamente bioativas com vida curta derivadas, principalmente, da redução do O2. Fisiologicamente, a formação e a eliminação das ERONs são balanceadas na parede vascular46, cujo papel chave é desempenhando pelo endotélio na manutenção do tônus vascular e na pressão sanguínea pela liberação de substâncias vasoativas, como o •NO47. O aumento de ERONs devido ao desbalanço redox foi constatado em aorta, carótida, mesentérica e coronárias de ratos e camundongos idosos, sugerindo que este desequilíbrio está associado ao envelhecimento, com o aumento da atividade da NADPH oxidase48. Evidências experimentais indicam que o dano oxidativo induzido por espécies reativas decorre do aumento da produção de •O2- e seu metabolismo e/ou da redução da biodisponibilidade de •NO25,49. Contudo, apesar do excesso de ERONs ser tóxico, concentrações fisiológicas dessas espécies podem funcionar como sinal mediador de diversas respostas, incluindo migração celular e crescimento20,22,50, já que, sob condições normais e na maioria das artérias, a produção de •NO predomina, de modo que este radical retira pequenas quantidades de •O2- formado40,51-53, garantindo a manutenção do equilíbrio no estado oxidativo orgânico.
A NADPH oxidase melhor caracterizada é a fagocítica, presente em macrófagos e neutrófilos, sendo um complexo proteico multimérico com componentes na membrana celular e no citoplasma. O componente associado à membrana é o citocromo b558-oxidase, formado por uma subunidade maior, a gp91phox (o termo "phox" deriva de "
A NADPH oxidase expressa nas células vasculares difere daquela encontrada em fagócitos, tanto pela estrutura bioquímica quanto pelas funções5. Foi inicialmente encontrada em neutrófilos, reconhecidamente essenciais na defesa contra microorganismos eliminados pela combinação de diversos mecanismos que incluem a geração d-•O2- produzido pelas subunidades endoteliais p40phox, p47phox e gp91phox da NADPH oxidase54. Curiosamente, os grupamentos catalíticos gp91phox, p22phox, p47phox e p67phox também foram encontrados em fibroblastos da adventícia7,13,22,55.
A identificação de subunidades homólogas à gp91phox resultou na formação da família Nox (de "
Várias características das NADPH oxidases são notáveis. Primeiro, a enzima vascular produz •O2- em baixos níveis por longos períodos de tempo, a maior parte intracelularmente, onde desempenha papel na sinalização celular1,5,14,16,46,50,59 (
Há também evidências de que a NADPH oxidase é encontrada no núcleo celular, envolvendo-se na expressão gênica. Vários grupos identificaram subunidades de NADPH oxidase em membranas internas. Entretanto, as consequências da ativação da NADPH oxidase em regiões perinucleares ainda não são claras20.
O evento inicial mais relevante para a ativação da NADPH oxidase envolve a fosforilação da p47phox e a consequente interação com a gp91phox1,16. A ligação entre domínios homólogos de duas estruturas Src autoinibem a ligação com a p22phox. Tal interação autoinibitória é perdida na fosforilação, permitindo a ligação entre as subunidades p47phox e p22phox1, ocorrendo a ativação da NADPH oxidase. Corroborando, a deleção gênica da subunidade gp91phox confere proteção contra acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos, por evitar disfunção da barreira hematoencefálica64.
As NADPH oxidases são ativadas e reguladas por diversos fatores, como forças mecânicas, hormônios e citocinas, dentre os quais se destacam a trombina, o Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta (PDGF), o Fator de Necrose Tumoral a (TNF-a), a lactosilceramida, a Interleucina-1 e a LDL oxidada (
Em células musculares lisas vasculares, a angiotensina II (Ang II) é um potente estimulador da atividade da NADPH oxidase. Este peptídeo angiotensinérgico é conhecido fator na patogênese da maioria das desordens cardiovasculares, podendo induzir a formação de •O2-, em parte, pelas NADPH oxidases vasculares5. A ativação mediada pela Ang II foi demonstrada inicialmente por Griendling e cols.66, destacando a importância das concentrações de Ang II no aumento da atividade da NADPH oxidase nas células musculares lisas vasculares1,15,16. Apesar da sinalização pela qual a Ang II estimula a NADPH oxidase não ter sido elucidada por completo, as vias da PLD, da PKC, da PLA2, PI3K e tiol-oxiredutases parecem estar envolvidas67-69. No músculo liso vascular, a tirosina quinase Src regula a atividade da NADPH oxidase estimulada pela Ang II, induzindo a fosforilação e translocação da subunidade p47phox15. Além disso, a Src é essencial para os efeitos da Ang II na síntese das subunidades da NADPH, estimulando o aumento na expressão da gp91phox, p22phox, p47phox e p67phox60. Somando-se a isso, a fosforilação da Src antecede a ativação das cascatas ERK1/2 e JNK no músculo liso vascular, levando à migração, crescimento celular, apoptose e deposição de colágeno70, ativando complexos de adesão focal, com importante participação na resposta inflamatória vascular71. Essas vias proliferativas e inflamatórias retroalimentam positivamente a ativação da NADPH oxidase na vasculatura. No músculo liso vascular, a transativação do receptor EGF parece estar envolvida, levando à ativação da PI3 quinase e da proteína RacG pequena minutos após a ativação do receptor AT1 de angiotensina5,11,14,16,20,46,72,73. A Ang II atua aumentando a expressão das subunidades da NADPH oxidase em horas ou dias5,11,14,15,46. Em modelos animais propostos por Rajagopalan e cols.11, a produção de •O2- vascular, a atividade da NADPH oxidase e os níveis de expressão de p22phox, gp91phox, p67phox e Nox1 estavam aumentados (para a NADPH oxidase, houve aumento de 100%).
Quando da ativação pela Ang II, o H2O2, gerado a partir do •O2- produzido pela NADPH oxidase, é essencial para a hipertrofia das células musculares lisas vasculares54, atuando ainda como um vasoconstrictor (
Estudos clínicos demonstraram que as ERONs desempenham importante papel na hipertensão. A produção dessas espécies sofre aumento em pacientes com hipertensão essencial, hipertensão renovascular, hipertensão maligna e pré-eclâmpsia25. Além disso, a produção aumentada de •O2- pela NADPH oxidase em vasos relaciona-se a fatores de risco para a aterosclerose (
A disfunção endotelial relaciona-se com o aumento da atividade da NADPH oxidase (pelo aumento da expressão de suas subunidades catalíticas14,53,79), já que lesões ateroscleróticas em coronárias humanas mostram intensa expressão de gp91phox na região vulnerável da placa. Além disso, a Nox4 está aumentada durante a fase de formação do ateroma, cujo aparecimento se dá em forma reduzida em lesões avançadas. Veias safenas magnas e artérias mamárias internas de pacientes com diabete melito apresentam aumento da atividade da NADPH oxidase e da eNOS desacoplada (neste estado, a enzima atua como produtora de •O2- em vez de •NO) quando comparadas com grupo controle, evidenciando a relação existente entre a NADPH oxidase e as lesões ateroscleróticas14.
A suplementação vitamínica pode reduzir o desbalanço redox vascular e melhorar o estado oxidativo total. Como exemplo, alguns modelos animais nos quais as propriedades antioxidantes das vitaminas C e E associam-se ao decréscimo na ativação da NADPH oxidase42,80 e o aumento da atividade da SOD (o maior sistema de defesa celular contra o •O2- na vasculatura46). Postula-se que a vitamina E, hidrofóbica, poderia inibir a formação do complexo enzimático das subunidades da NADPH oxidase49. Apesar dessas observações, testes clínicos com vitaminas antioxidantes não demonstraram benefícios terapêuticos quanto à mortalidade em eventos cardiovasculares25,46. Além disso, dependendo, principalmente, da posologia, tais substâncias podem apresentar propriedades pró-oxidantes, com interações orgânicas deletérias. Como os dados de grandes estudos clínicos prospectivos falharam em demonstrar os efeitos benéficos dos antioxidantes25, o que se recomenda é a manutenção de uma dieta balanceada sem suplementação vitamínica, visto que os danos potenciais de tal suplementação ainda não estão bem definidos.
Na hipertensão, o produto da ativação da NADPH oxidase, o •O2-, promove a oxidação da H4B, ocasionando um aumento no desacoplamento da eNOS, elevando-se os níveis desta espécie de oxigênio, reduzindo-se a biodisponilidade do •NO14. Assim, acredita-se que a H4B possa estar deficiente em condições associadas à função endotelial alterada, como hipercolesterolemia, diabete, hipertensão e tabagismo. Stroes e cols.81 mostraram que o tratamento com H4B aumenta a vasodilatação em humanos com hipercolesterolemia, ao passo que a remoção desta biopterina implica o desacoplamento da eNOS40. Reforçando esses achados, a superexpressão da eNOS previne o remodelamento da vasculatura pulmonar induzido por hipóxia crônica52, ocasionando mudanças estruturais e alterações nos processos celulares que resultam em aumento da relação camada média: lúmen vascular82,83.
Outro fator implicado no aumento do desbalanço redox é a endotoxemia. Durante seu curso, a liberação de lipopolissacárides promove aumento da expressão e da atividade de xantina oxidase e da NADPH oxidase46. O aumento de ERONs dependentes de NADPH oxidase em endossomos é importante para a resposta imune pró-inflamatória20. Neutrófilos ativados produzem •O2-, radical hidroxil (•OH) e ácido hipocloroso (HOCl), além de peptídeos microbicidas e proteases84 responsáveis pela resposta imune eficaz. A ativação neutrofílica na fagocitose de pneumococos induz a produção de ERONs pela NADPH oxidase. Além disso, o bloqueio da ativação da NADPH oxidase durante meningite bacteriana aguda em animais experimentais acarreta defesa deficiente contra
Quanto à produção do •NO, estudos clínicos e experimentais demonstram que a administração da L-arginina restabelece a síntese deste radical e a função vascular em várias doenças cardiovasculares, sugerindo que o prejuízo na disponibilidade do aminoácido precursor está presente nestes agravos. Os níveis reduzidos de L-arginina também promovem o desacoplamento da eNOS, resultando em aumento das ERONs34.
Drogas doadoras de •NO (nitrodilatadores) têm sido usadas no tratamento de doença coronariana, hipertensão e falência cardíaca, tendo ações antiinflamatórias na parede vascular como supressoras da oxidação de lipoproteínas, inibidoras da migração e proliferação de células musculares lisas vasculares e inibidoras da agregação plaquetária. Atuam ainda como supressoras da expressão de moléculas de adesão e quimiocinas após a estimulação com fatores pró-inflamatórios. Tais aspectos previnem a infiltração de células inflamatórias na parede vascular, onde também há oposição às ações pró-inflamatórias das ERONs. Além disso, descobriu-se recentemente que o •NO parece exercer efeito anti-inflamatório na parede arterial por supressão de enzimas geradoras de ERONs, particularmente a NADPH oxidase5.
As proteínas Nox relacionam-se ainda com outras numerosas desordens orgânicas, incluindo câncer, reabsorção óssea e Doença de Alzheimer, por serem expressas em diversos tecidos1,80,86. Evidências demonstram o papel da Nox2 em processos neurodegenerativos, como Doença de Parkinson, acidente vascular encefálico, trauma cerebral e meningite, devido, principalmente, à neurotoxicidade das ERONs57,87. Dessa forma, os inibidores da Nox apresentam potencial clínico notável, particularmente se não inibirem a atividade dos fagócitos1.
Inibidores farmacológicos da NADPH oxidase que bloqueiam diretamente a atividade desta enzima têm sido descritos compreendendo estruturas peptídicas e não peptídicas. O DIP-difenileneiodônio5,10 e 4'-hidroxi-3-metoxiacetofenona (a apocinina, isolada da planta medicinal
Os leucócitos são capazes de mediar o efeito inibitório da apocinina. Sugere-se que a mieloperoxidase (MPO), seletivamente expressa em leucócitos, é necessária para a ocorrência do efeito inibitório desta substância. Em células HEK293, desprovidas de MPO, a formação de dímeros de apocinina não ocorre mesmo após superexpressão das isoformas Nox6. Quando MPO humana é adicionada, os dímeros são identificados nas células com superexpressão de isoformas Nox ou nas células coincubadas com H2O2. Na ausência de H2O2 ou Nox, a produção dimérica pelas células HEK293 é inibida. Em leucócitos estimulados, os dímeros são prontamente detectáveis, ao passo que em células vasculares estimuladas não ocorre tal produção, mesmo na presença de MPO. Dessa forma, os autores sugerem que a apocinina atuaria como antioxidante e não como inibidor da NADPH oxidase em células não fagocíticas6,88, sendo a ação inibitória para a NADPH oxidase restrita a leucócitos que expressam MPO6 (
Pagano e cols.90 desenvolveram o peptídeo quimérico gp91ds-Tat, composto de nove aminoácidos da capa proteica do HIV e nove aminoácidos da gp91phox1,10. Essa substância reage com a p47phox e interfere na ligação desta subunidade com a gp91phox. A porção "Tat" permite ao gp91ds-Tat penetrar na célula, sendo um efetivo inibidor de oxidases que contêm gp91phox. Contudo, apesar de peptídeos como o referido serem úteis em intervenções experimentais, os processos de biotransformação dificultam sua administração por via oral, limitando seu potencial na terapêutica clínica1.
Inibidores peptídicos da NADPH oxidase são também descritos, como o antibiótico PR-39, secretado endogenamente por células intestinais e neutrófilos de humanos e suínos. Além de atuarem em células imunitárias, inibem a atividade da NADPH oxidase não fagocítica. Inicialmente, o PR-39 era visto como inibidor específico da NADPH oxidase. No entanto, estudos recentes mostraram que o antibiótico apresenta vários efeitos, em parte porque se liga a domínios SH3 de outras proteínas e em parte porque interage com lipídios de membrana5.
Identifica-se que a NADPH oxidase emergiu como uma das principais estruturas envolvidas no desbalanço redox vascular. Como o •NO também é capaz de suprimir a atividade da NADPH oxidase, acredita-se que este evento apresente implicações diretas não apenas no desenvolvimento da doença vascular, mas também na recuperação aguda da lesão de isquemia e reperfusão, na qual o desbalanço dependente de NADPH tem grande contribuição1,5.
O desenvolvimento de inibidores específicos de oxidases, baseado nas unidades Nox, pode fornecer ferramentas para elucidar os papéis destas enzimas experimentalmente. Também pode ser útil no tratamento de diversas doenças1, principalmente no que se refere à inibição enzimática
Os autores agradecem ao CNPq, à FAPEAL e ao PPSUS-2006/Ministério da Saúde-FAPEAL pelo apoio financeiro concedido.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq, PROCAD-NF/CAPES e FAPEAL.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Correspondência: Luiza A. Rabêlo Praça Afrânio Jorge SN Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Prado - 5701-002 - Maceió, AL - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 28/02/09; revisado recebido em 22/05/09; aceito em 08/06/09.
Varios estudios destacan las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ERON) como importantes contribuyentes en la patogénesis de numerosas enfermedades cardiovasculares, incluyendo hipertensión, aterosclerosis y falla cardíaca. Tales especies son moléculas altamente bioactivas y con vida corta derivadas, principalmente, de la reducción del oxígeno molecular. El complejo enzimático de la NADPH oxidasa es la mayor fuente de esas especies reactivas en la vasculatura. En condiciones fisiológicas, la formación y eliminación de esas sustancias aparecen balanceadas en la pared vascular. Durante el desbalance redox, sin embargo, hay un aumento en la actividad de la NADPH oxidasa y predominio de agentes prooxidantes, superando la capacidad de defensa orgánica antioxidante. Además de ello, tal hiperactividad enzimática reduce la biodisponibilidad del óxido nítrico, crucial para la vasodilatación y el mantenimiento de la función vascular normal. A pesar de que la NADPH oxidasa se relaciona directamente con la disfunción endotelial, fue primeramente descrita por su expresión en fagocitos, en los que su actividad enzimática determina la eficacia de los mecanismos de defensa orgánica contra patógenos. Las diferencias sutiles entre las unidades estructurales de las NADPH oxidasas, dependiendo del tipo celular que las expresa, pueden tener implicaciones terapéuticas, permitiendo la inhibición selectiva del desequilibrio redox inducido por la NADPH oxidasa, sin comprometer, con todo, su participación en las vías fisiológicas de señalización celular que garantizan la protección contra microorganismos.
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Varios estudios destacan las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ERON) como importantes contribuyentes en la patogénesis de numerosas enfermedades cardiovasculares, incluyendo hipertensión, aterosclerosis y falla cardíaca. Tales especies son moléculas altamente bioactivas y con vida corta derivadas, principalmente, de la reducción del oxígeno molecular. El complejo enzimático de la NADPH oxidasa es la mayor fuente de esas especies reactivas en la vasculatura. En condiciones fisiológicas, la formación y eliminación de esas sustancias aparecen balanceadas en la pared vascular. Durante el desbalance redox, sin embargo, hay un aumento en la actividad de la NADPH oxidasa y predominio de agentes prooxidantes, superando la capacidad de defensa orgánica antioxidante. Además de ello, tal hiperactividad enzimática reduce la biodisponibilidad del óxido nítrico, crucial para la vasodilatación y el mantenimiento de la función vascular normal. A pesar de que la NADPH oxidasa se relaciona directamente con la disfunción endotelial, fue primeramente descrita por su expresión en fagocitos, en los que su actividad enzimática determina la eficacia de los mecanismos de defensa orgánica contra patógenos. Las diferencias sutiles entre las unidades estructurales de las NADPH oxidasas, dependiendo del tipo celular que las expresa, pueden tener implicaciones terapéuticas, permitiendo la inhibición selectiva del desequilibrio redox inducido por la NADPH oxidasa, sin comprometer, con todo, su participación en las vías fisiológicas de señalización celular que garantizan la protección contra microorganismos.
Varios estudios demuestran que las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ERON) contribuyen efectivamente para la patogénesis de agravamientos cardiovasculares, como hipertensión, aterosclerosis, hipertrofia y falla cardíaca, y reestenosis, además de lesiones derivadas de isquemia y reperfusión. Múltiples sistemas enzimáticos producen ERON y sus derivados en la vasculatura, incluyendo ciclooxigenasa, lipoxigenasa, citocromo P450, xantina oxidasa (XO), mieloperoxidasa (MPO), óxido nítrico sintasa (NOS) y NADPH oxidasa - esta última una de las más importantes fuentes de estas sustancias, tanto en las células endoteliales como musculares lisas1-22.
Desde las observaciones de Baehner et al23 hace cerca de 40 años - que permitieron el descubrimiento de la NADPH oxidasa24 - varios fueron los estudios desarrollados para comprender la relación entre el referido complejo enzimático y el desbalance redox (estrés oxidativo). El aumento de la producción de anión superóxido (•O2-) y otras ERON está implicado en la aterosclerosis, hipertensión arterial, proliferación celular e hipertrofia. No obstante, el papel de la NADPH oxidasa en tales procesos continúa incierto debido, principalmente, a la presencia de múltiples isoformas de Nox (subunidades constituyentes de la NADPH oxidasa) y sus ligantes, así como a la falta de inhibidores específicos25,26. El complejo enzimático actúa como donante de electrones para la reducción del O2 a •O2-, según la reacción 2O2 + NAD(P)H è 2O2- + NAD(P) + H+10,16,22,25,27.
Los experimentos pioneros de Furchgott y Zawadzki28 primero demostraron la existencia de un factor relajante derivado de endotelio que fue posteriormente identificado como •NO29, producido a partir de la L-arginina por la acción de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)29-32 en la presencia de cofactores, principalmente la tetrahidrobiopterina (H4B;
Fisiológicamente, cierta cantidad de •O2- intracelular se requiere para la señalización normal desempeñada por el •NO. No obstante, patológicamente, el aumento extracelular de la primera especie disminuye la biodisponibilidad del NO, reduciendo su difusión para el músculo liso vascular38,39. En determinadas circunstancias, la producción crónica de ERON (aumento de la actividad de la NADPH oxidasa, por ejemplo) excede la capacidad de los antioxidantes celulares enzimáticos (como la glutatión peroxidasa-1 - principal enzima antioxidante en el citosol y en las mitocondrias35,36 - y las forma superóxido dismutasa enlazadas a la membrana, responsables por dismutar el anión superóxido en H2O2) y no enzimáticos, contribuyendo para la enfermedad vascular por inducción de la activación endotelial sostenida29,40. Grandes cantidades de •O2- formadas formadas captan la mayor parte o todo el •NO, promoviendo la formación de •ONOO-34,41. El •O2- generado puede además ser transformado en radical hidroxilo, que se difunde hacia el músculo liso vascular e induce la producción de endoperóxidos vasoconstrictores, como la prostaglandina H2 y prostanoides41, derivados de la peroxidación del ácido araquidónico catalizada por radicales libres, considerados marcadores del aumento sistémico del desbalance redox
Estudios de Wiggers et al45 demostraron, en ratones, que la exposición a bajas concentraciones de mercurio induce disfunción endotelial tanto en vasos de conducción como de resistencia. Los autores sugieren que este evento se deriva, probablemente, de la reducción de la biodisponibilidad del •NO debido al aumento en la producción vascular de •O2-. De esta forma, es posible que el tratamiento con el mercurio afecte la expresión proteica o, más específicamente, la actividad de la NADPH oxidasa.
Tal desequilibrio se relaciona a las ERON por el hecho de ser el O2 fundamental para la respiración celular, habiendo diversos sistemas enzimáticos que utilizan este sustrato como un aceptor de electrones1,20. La familia de estas especies incluye moléculas altamente bioactivas con vida corta derivadas, principalmente, de la reducción del O2. Fisiológicamente, la formación y la eliminación de las ERON son balanceadas en la pared vascular46, cuyo papel clave es desempeñado por el endotelio en el mantenimiento del tono vascular y en la presión sanguínea por la liberación de sustancias vasoactivas, como el •NO47. El aumento de ERON debido al desbalance redox fue constatado en aorta, carótida, mesentérica y coronarias de ratas y ratones viejos, sugiriendo que este desequilibrio está asociado al envejecimiento, con el aumento de la actividad de la NADPH oxidasa48. Evidencias experimentales indican que el daño oxidativo inducido por especies reactivas se deriva del aumento de la producción de •O2- y su metabolismo y/o de la reducción de la biodisponibilidad de •NO25,49. Con todo, a pesar de que el exceso de ERON es tóxico, concentraciones fisiológicas de estas especies pueden funcionar como señal mediadora de diversas respuestas, incluyendo migración celular y crecimiento20,22,50, ya que, en condiciones normales y en la mayoría de las arterias, la producción de •NO predomina, de modo que este radical retira pequeñas cantidades de •O2- formado40,51-53, asegurando el mantenimiento del equilibrio en el estado oxidativo orgánico.
La NADPH oxidasa mejor caracterizada es la fagocítica, presente en macrófagos y neutrófilos, siendo un complejo proteico multimérico con componentes en la membrana celular y en el citoplasma. El componente asociado a la membrana es el citocromo b558-oxidasa, formado por una subunidad mayor, la gp91phox (el término "phox" deriva de "
La NADPH oxidasa expresada en las células vasculares difiere de aquella encontrada en fagocitos, tanto por su estructura bioquímica como por sus funciones5. Fue encontrada inicialmente en neutrófilos, que se sabe son esenciales en la defensa contra microorganismos eliminados por la combinación de diversos mecanismos que incluyen la generación de •O2- producido por las subunidades endoteliales p40phox, p47phox y gp91phox de la NADPH oxidasa54. Curiosamente, los agrupamientos catalíticos gp91phox, p22phox, p47phox y p67phox también fueron encontrados en fibroblastos de la adventicia7,13,22,55.
La identificación de subunidades homólogas a la gp91phox resultó en la formación de la familia Nox (de "
Varias características de las NADPH oxidasas son notables. Primero, la enzima vascular produce •O2- en niveles bajos por largos períodos de tiempo, la mayor parte intracelularmente, donde desempeña un papel en la señalización celular1,5,14,16,46,50,59 (
También hay evidencias de que la NADPH oxidasa se encuentra en el núcleo celular, involucrándose en la expresión génica. Varios grupos identificaron subunidades de NADPH oxidasa en membranas internas. No obstante, las consecuencias de la activación de la NADPH oxidasa en regiones perinucleares todavía no están claras20.
El evento inicial más relevante para la activación de la NADPH oxidasa involucra la fosforilación de la p47phox y su consiguiente interacción con la gp91phox1,16. La unión entre dominios homólogos de dos estructuras Src autoinhiben la unión con la p22phox. Tal interacción autoinhibidora se pierde en la fosforilación, permitiendo el vínculo entre las subunidades p47phox y p22phox1, ocurriendo la activación de la NADPH oxidasa. Corroborando, la deleción génica de la subunidad gp91phox ofrece protección con el accidente vascular cerebral isquémico en ratones, por evitar la disfunción de la barrera hematoencefálica64.
Las NADPH oxidasas son activadas y reguladas por diversos factores, como fuerzas mecánicas, hormonas y citocinas, entre los cuales se destacan la trombina, el Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), el Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α), a lactosilceramida, la Interleucina-1 y la LDL oxidada (
En células musculares lisas vasculares, la angiotensina II (Ang II) es un potente estimulador de la actividad de la NADPH oxidasa. Este péptido angiotensinérgico es un conocido factor en la patogénesis de la mayoría de los desórdenes cardiovasculares, pudiendo inducir la formación de •O2-, en parte por las NADPH oxidasas vasculares5. La activación mediada por la Ang II fue demostrada inicialmente por Griendling et al66, destacando la importancia de las concentraciones de Ang II en el aumento de la actividad de la NADPH oxidasa en las células musculares lisas vasculares1,15,16. A pesar de que la señalización por la cual la Ang II estimula la NADPH oxidasa no ha sido elucidada por completo, las vías de la PLD, de la PKC, de la PLA2, PI3K y tiol oxidorreductasas parecen estar involucradas67-69. En el músculo liso vascular, la tirosina quinasa Src regula la actividad de la NADPH oxidasa estimulada por la Ang II, induciendo la fosforilación y translocación de la subunidad p47phox15. Además de ello, la Src es esencial para los efectos de la Ang II en la síntesis de las subunidades de la NADPH, estimulando el aumento en la expresión de la gp91phox, p22phox, p47phox y p67phox60. Sumándose a ello, la fosforilación de la Src antecede la activación de las cascadas ERK1/2 y JNK en el músculo liso vascular, llevando a la migración, crecimiento celular, apoptosis y deposición de colágeno70, activando complejos de adhesión focal, con importante participación en la respuesta inflamatoria vascular71. Esas vías proliferativas e inflamatorias retroalimentan positivamente la activación de la NADPH oxidasa en la vasculatura. En el músculo liso vascular, la transactivación del receptor EGF parece estar involucrada, llevando a la activación de la PI3 quinasa y de la proteína RacG pequeña minutos después de la activación del receptor AT1 de angiotensina5,11,14,16,20,46,72,73. La Ang II actúa aumentando la expresión de las subunidades de la NADPH oxidasa en horas o dias5,11,14,15,46. En modelos animales propuestos por Rajagopalan et al11, la producción de •O2- vascular, la actividad de la NADPH oxidasa y los niveles de expresión de p22phox, gp91phox, p67phox y Nox1 estaban aumentados (para la NADPH oxidasa, hubo aumento del 100%).
En la activación por la Ang II, el H2O2, generado a partir del •O2- producido por la NADPH oxidasa, es esencial para la hipertrofia de las células musculares lisas vasculares54, actuando también como un vasoconstrictor (
Estudios clínicos demostraron que las ERON desempeñan un importante papel en la hipertensión. La producción de estas especies sufre aumento en pacientes con hipertensión esencial, hipertensión renovascular, hipertensión maligna y preeclampsia25. Además de ello, la producción aumentada de •O2- por la NADPH oxidasa en vasos se relaciona con factores de riesgo para la aterosclerosis (
La disfunción endotelial se relaciona con el aumento de la actividad de la NADPH oxidasa (por el aumento de la expresión de sus subunidades catalíticas14,53,79), ya que lesiones ateroscleróticas en coronarias humanas muestran intensa expresión de gp91phox en la región vulnerable de la placa. Además de ello, la Nox4 está aumentada durante la fase de formación del ateroma, cuya aparición se da en forma reducida en lesiones avanzadas. Venas safenas magnas y arterias mamarias internas de pacientes con diabetes mellitus presentan aumento de la actividad de la NADPH oxidasa y del a eNOS desacoplada (en este estado, la enzima actúa como productora de •O2- en vez de •NO) al compararlas con el grupo control, poniendo de manifiesto la relación existente entre la NADPH oxidasa y las lesiones ateroscleróticas14.
La suplementación vitamínica puede reducir el desbalance redox vascular y mejorar el estado oxidativo total. Como ejemplo, algunos modelos animales en los cuales las propiedades antioxidantes de las vitaminas C y E se asocian a la disminución en la activación de la NADPH oxidasa42,80 y al aumento de la actividad de la SOD (el mayor sistema de defensa celular contra el •O2- en la vasculatura46). Se postula que la vitamina E, hidrofóbica, podría inhibir la formación del complejo enzimático de las subunidades de la NADPH oxidasa49. A pesar de esas observaciones, pruebas clínicas con vitaminas antioxidantes no mostraron beneficios terapéuticos con relación a la mortalidad en eventos cardiovasculares25,46. Además de ello, dependiendo principalmente de la posología, tales sustancias pueden presentar propiedades prooxidantes, con interacciones orgánicas perjudiciales. Como los datos de grandes estudios clínicos prospectivos fallaron en demostrar los efectos benéficos de los antioxidantes25, lo que se recomienda es el mantenimiento de una dieta balanceada sin suplemento vitamínico, visto que los daños potenciales de tal suplemento todavía no están bien definidos.
En la hipertensión, el producto de la activación de la NADPH oxidasa, el •O2-, promueve la oxidación de la H4B, ocasionando un aumento en el desacoplamiento de la eNOS, elevando los niveles de esta especie de oxígeno, reduciendo la biodisponibilidad del •NO14. Así, se cree que la H4B puede estar deficiente en condiciones asociadas a la función endotelial alterada, como hipercolesterolemia, diabetes, hipertensión y tabaquismo. Stroes et al81 mostraron que el tratamiento con H4B aumenta la vasodilatación en humanos con hipercolesterolemia, al tiempo que la remoción de esta biopterina implica el desacoplamiento de la eNOS40. Reforzando estos hallazgos, la sobreexpresión de la eNOS previene el remodelado de la vasculatura pulmonar inducido por hipoxia crónica52, ocasionando cambios estructurales y alteraciones en los procesos celulares que resultan en aumento de la relación capa media: lumen vascular82,83.
Otro factor implicado en el aumento del desbalance redox es la endotoxemia. Durante su curso, la liberación de lipopolisacáridos promueve un aumento de la expresión y de la actividad de xantina oxidasa y de la NADPH oxidasa46. El aumento de ERON dependientes de NADPH oxidasa en endosomas es importante para la respuesta inmune proinflamatoria20. Neutrófilos activados producen •O2-, radical hidroxilo (•OH) y ácido hipocloroso (HOCl), además de péptidos microbicidas y proteasas84 responsables por la respuesta inmune eficaz. La activación neutrofílica en la fagocitosis de neumococos induce la producción de ERON por la NADPH oxidasa. Además de ello, el bloqueo de la activación de la NADPH oxidasa durante la meningitis bacteriana aguda en animales experimentales conlleva una defensa deficiente contra
En cuenta a la producción del •NO, estudios clínicos y experimentales demuestran que la administración de la L-arginina restablece la síntesis de este radical y la función vascular en varias enfermedades cardiovasculares, sugiriendo que el perjuicio en la disponibilidad del aminoácido precursor está presente en estos agravamientos. Los niveles reducidos de L-arginina también promueven el desacoplamiento de la eNOS, resultando en aumento de las ERON34.
Drogas donantes de •NO (nitrodilatadores) se han usado en el tratamiento de enfermedad coronaria, hipertensión y falla cardíaca, presentando acciones antiinflamatorias en la pared vascular como supresoras de la oxidación de lipoproteínas, inhibidoras de la migración y proliferación de células musculares lisas vasculares e inhibidoras de la agregación plaquetaria. Actúan además como supresoras de la expresión de moléculas de adhesión y quimiocinas después de la estimulación con factores proinflamatorios. Tales aspectos previenen la infiltración de células inflamatorias en la pared vascular, donde también hay oposición a las acciones proinflamatorias de las ERON. Además de ello, recientemente se descubrió que el •NO parece ejercer efecto antiinflamatorio en la pared arterial por supresión de enzimas generadoras de ERON, particularmente la NADPH oxidasa5.
Las proteínas Nox se relacionan además con otros numerosos desórdenes orgánicos, incluyendo cáncer, reabsorción ósea y Mal de Alzheimer, por ser expresadas en diversos tejidos1,80,86. Evidencias muestran el papel de la Nox2 en procesos neurodegenerativos, como Enfermedad de Parkinson, accidente vascular encefálico, trauma cerebral y meningitis, debido principalmente, a la neurotoxicidad de las ERON57,87. De esa forma, los inhibidores de la Nox presentan potencial clínico notable, particularmente si no inhibieran la actividad de los fagocitos1.
Inhibidores farmacológicos de la NADPH oxidasa que bloquean directamente la actividad de esta enzima se han descrito comprendiendo estructuras péptídicas y no peptídicas. El DIP- difenileneiodonio5,10 y la 4'-hidroxi-3-metoxiacetofenona (la apocinina, aislada de la planta medicinal
Los leucocitos son capaces de mediar el efecto inhibidor de la apocinina. Se sugiere que la mieloperoxidasa (MPO), expresada selectivamente en leucocitos, es necesaria para la ocurrencia del efecto inhibidor de esta sustancia. En células HEK293, desprovistas de MPO, la formación de dímeros de apocinina no ocurre, aun después de la sobreexpresión de las isoformas Nox6. Cuando se agrega MPO humana, los dímeros son identificados en las células con sobreexpresión de isoformas Nox o en las células co-incubadas con H2O2. En ausencia de H2O2 o Nox, la producción dimérica por las células HEK293 se inhibe. En leucocitos estimulados, los dímeros son rápidamente detectables, al tiempo que en células vasculares estimuladas no ocurre tal producción, aun en la presencia de MPO. De esa forma, los autores sugieren que la apocinina actuaría como antioxidante y no como inhibidor de la NADPH oxidasa en células no fagocíticas6,88, estando la acción inhibitoria de la NADPH oxidasa restringida a leucocitos que expresan MPO6 (
Pagano et al90 desarrollaron el péptido quimérico gp91ds-Tat, compuesto por nueve aminoácidos de la capa proteica del VIH y nueve aminoácidos de la gp91phox1,10. Esta sustancia reacciona con la p47phox e interfiere en la unión de esta subunidad con la gp91phox. La fracción "Tat" permite que el gp91ds-Tat penetre en la célula, siendo un inhibidor efecto de oxidasas que contienen gp91phox. Con todo, a pesar de que péptidos como el referido son útiles en intervenciones experimentales, los procesos de biotransformación dificultan su administración por vía oral, limitando su potencia en la terapéutica clínica1.
Inhibidores péptídicos de la NADPH oxidasa también se han descrito, con el antibiótico PR-39, secretado en forma endógena por células intestinales y neutrófilos de humanos y suinos. Además de actuar en células inmunitarias, inhiben la actividad de la NADPH oxidasa no fagocítica. Inicialmente, el PR-39 era visto como inhibidor específico de la NADPH oxidasa. No obstante, estudios recientes mostraron que el antibiótico presentaba varios efectos, en parte porque se une a dominios SH3 de otras proteínas y en parte porque interactúa con lípidos de membrana5.
Se identifica que la NADPH oxidasa surgió como una de las principales estructuras involucradas en el desbalance redox vascular. Como el •NO también es capaz de suprimir la actividad de la NADPH oxidasa, se cree que este evento presente implicaciones directas, no sólo en el desarrollo de la enfermedad vascular, sino también en la recuperación aguda de la lesión de isquemia y reperfusión, en al cual el desbalance dependiente de NADPH tiene gran contribución1,5.
El desarrollo de inhibidores específicos de oxidasas, basado en las unidades Nox, puede ofrecer herramientas para elucidar los papeles de estas enzimas experimentalmente. También puede ser útil en el tratamiento de diversas enfermedades1, principalmente en lo que se refiere a la inhibición enzimática
Los autores agradecen al CNPq (Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico), a la FAPEAL (Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de Alagoas) y al PPSUS(Programa de Investigación para el Sistema Único de Salud)-2006/Ministerio de la Salud-FAPEAL por el apoyo financiero concedido.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue parcialmente financiado por el CNPq.
Este artículo forma parte de la disertación de Maestría de la Universidad Federal de Bahía y Hospital Portugués.
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Correspondencia: Luiza A. Rabêlo Praça Afrânio Jorge SN Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Prado - 5701-002 - Maceió, AL - Brasil E-mail:
Artículo recibido el 28/02/09; revisado recibido el 22/05/09; aceptado el 08/06/09.
Several studies refer to reactive oxygen and nitrogen species (RONS) as important agents in the pathogenesis of a number of heart diseases, including high blood pressure, arteriosclerosis and heart failure. Such species are highly bioactive molecules and a short life due chiefly to reduction of molecular oxygen. The enzyme complex of NADPH oxidase is the main source of these reactive species in vascular system. Under physiological conditions, formation and elimination of these substances seem balanced in vascular wall. During redox Unbalance, nonetheless, there is increase in NADPH oxidase activity and predominance of pro-oxidizing agents, surpassing the anti-oxidant capacity of the organism self-defense. Besides this, such enzyme hyperactivity reduces the bioavailability of nitric oxide, capital for vasodilation and maintenance of normal vascular function. In spite of NADPH oxidase being directly connected to the endothelial dysfunction, it was firstly described as for its expression in phagocytes, where its activity determines efficiency of organism defense mechanisms against pathogens. Slight differences between structural units of NADPH oxidases, depending on the type of cell which expresses it, may create therapeutic implications, allowing to selectively inhibiting redox unbalance triggered by NADPH oxidase, without compromising, however, its participation in physiological cellular signaling which make sure protection against micro-organisms.
IUniversidade Federal de Alagoas, Maceió, AL
IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG
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Several studies refer to reactive oxygen and nitrogen species (RONS) as important agents in the pathogenesis of a number of heart diseases, including high blood pressure, arteriosclerosis and heart failure. Such species are highly bioactive molecules and a short life due chiefly to reduction of molecular oxygen. The enzyme complex of NADPH oxidase is the main source of these reactive species in vascular system. Under physiological conditions, formation and elimination of these substances seem balanced in vascular wall. During redox Unbalance, nonetheless, there is increase in NADPH oxidase activity and predominance of pro-oxidizing agents, surpassing the anti-oxidant capacity of the organism self-defense. Besides this, such enzyme hyperactivity reduces the bioavailability of nitric oxide, capital for vasodilation and maintenance of normal vascular function. In spite of NADPH oxidase being directly connected to the endothelial dysfunction, it was firstly described as for its expression in phagocytes, where its activity determines efficiency of organism defense mechanisms against pathogens. Slight differences between structural units of NADPH oxidases, depending on the type of cell which expresses it, may create therapeutic implications, allowing to selectively inhibiting redox unbalance triggered by NADPH oxidase, without compromising, however, its participation in physiological cellular signaling which make sure protection against micro-organisms.
Several studies show that reactive oxygen and nitrogen species (RONS) effectively contribute to pathogenesis of cardiovascular disorders, such as high blood pressure, arteriosclerosis, hypertrophy and heart failure and restenosis, in addition to lesions arising out ischemia and reperfusion. Multiple enzyme systems produce RONS and their derivatives in the vascular system, including cyclo-oxigenase, lipoxigenase, P450 cytochrome, xanthine oxidase (XO), myeloperoxidase (MPO), nitric oxide synthase (NOS) and NADPH oxidase - this latter one of the most important sources of this substance, both in endothelial cells as in smooth muscle cells1-22.
Since the findings of Baehner et al23 40 years ago - which allowed the discovery of NADPH oxidase24 - several studies addressed the relation between said enzyme complex and the redox unbalance (oxidative stress). Increase in production of superoxide anion (•O2-) and other RONS is implied in arteriosclerosis, arterial high blood pressure, cell proliferation and hypertrophy. However, the role of NADPH oxidase in such processes remain unknown, which is mainly attributable to occurrence of multiple isoforms of Nox (subunits which form the NADPH oxidase) and their vehicles, as well as to the lack of specific inhibitors25,26. The enzyme complex act as electron donor for reduction of O2 into •O2-, following the reaction 2O2 + NAD(P)H è 2O2- + NAD(P) + H+10,16,22,25,27.
Groundbreaking experiments of Furchgott and Zawadzki28 first demonstrated the existence of endothelium-derived relaxing factor which was subsequently identified as •NO29, produced based on L-arginine by the action of endothelial nitric oxide synthase (eNOS)29-32 in the presence of co-factors, mainly the tetrahydrobiopterin (H4B;
Physiologically, a certain amount of intracellular •O2- is required for normal signaling performed by •NO. Nevertheless, pathologically, the extracellular increase of the first species decreases the bioavailability of •NO, reducing its diffusion into the vascular smooth muscle38,39. In certain circumstances, chronic production of RONS (increase in the NADPH oxidase activity, for instance) exceeds the capacity of cell enzymatic antioxidants (such as the glutathione peroxidase-1 - main oxidant enzyme in cytosol and in mitochondria35,36 - and the forms of superoxide dismutase linked to the membrane, responsible for dismuting the superoxide anion into H2O2) and cell non-enzymatic antioxidants, contributing to vascular disease due to sustained endothelial activation29,40. Large amounts of •O2- formed capture most or all the •NO, promoting the formation of •ONOO-34,41. The •O2- generated may also be transformed into hydroxyl radical, which diffuses into the vascular smooth muscle and induces the production of vasoconstrictive endoperoxides, such as prostaglandin H2 and prostanoids41, derived from the peroxidation of the arachidonic acid catalyzed by free radical, considered as indicators of systemic increase of redox unbalance
Studies by Wiggers et al45 showed that the exposure of rats to low concentrations of mercury induces endothelial dysfunction both in conductance and resistance vessels. Authors imply this event is likely arisen out of reduction of •NO's bioavailability due to the increase of vascular production of •O2-. Thus, it is possible that treatment with mercury affect the protein expression or, more specifically, the activity of NADPH oxidase.
Such unbalance is related to RONS due to the fact that the O2 is germane to cell respiration, and there are several enzyme systems which use this substrate as an electron acceptor1,20. Family of such species includes highly bioactive molecules with short life due chiefly to O2 reduction. Physiologically, the formation and elimination of RONS are balanced in the vascular wall46, whose key role is played by the endothelium in maintenance of vascular tone and in blood pressure by releasing vasoactive substances, such as the •NO47. The increase of RONS due to redox unbalance was found in elder rats' and mice's aorta, carotid, mesenteric and coronaries, implying that this unbalance is associated to ageing, with the increase of NADPH oxidase activity48. Experimental evidences indicate that the oxidative damage induced by reactive species derives from the increase of •O2- production and its metabolism and/or reduction of •NO25,49 bioavailability. However, in spite of the excess of RONS being toxic, physiological concentrations of these species may function as mediator signs of several responses, including cell migration and growth20,22,50, once, under normal conditions and in most arteries, the production of •NO is predominant, in such a way that this radical takes small amounts of formed •O2-40,51-53, making sure the maintenance of balance in organic oxidative status.
Better categorized NADPH oxidase is the phagocytic, present in macrophages and neutrophils, being a multimeric protein complex with components in cell membrane and cytoplasm. The component associated to the membrane is the cytochrome b558-oxidase, formed by a larger sub-unit, the gp91phox (the term "phox" comes from "
NADPH oxidase expressed in vascular cells differs from those found in phagocytes, both for its biochemical structure and for its functions5. It was initially found in neutrophils, which are well-known as essential defenders against micro-organisms released by a combination of several mechanisms, including the generation of •O2- produced by endothelial subunits p40phox, p47phox and gp91phox of the NADPH oxidase54. Intriguingly, the catalytic groups gp91phox, p22phox, p47phox and p67phox were also found in adventitial fibroblasts7,13,22,55.
Identification of subunits homologous to gp91phox resulted in the formation of Nox family (from "
Several characteristics of the NADPH oxidases are striking. First, the vascular enzyme produces •O2- in low levels and for long periods, mostly intracellularly, where it plays the role of cell signalling1,5,14,16,46,50,59 (
There is also evidence that the NADPH oxidase is found in the cell nucleus, acting in the gene expression. Several groups identified subunits of NADPH oxidase in internal membranes. However, consequences of the NADPH oxidase activation in between are not clear as of yet20.
The most relevant beginning event for the activation of NADPH oxidase involves the phosphorylation of p47phox and the consequent interaction with gp91phox1,16. Bond between homologous domains of two structures Src produce self-inhibition of bond with p22phox. Such self-inhibiting interaction is lost in phosphorylation, allowing bond between the subunits p47phox and p22phox1, and the activation of NADPH oxidase is made. Confirming this, a gene deletion of subunit gp91phox provides protection against ischemic stroke in mice, as it helps to prevent hematoencephalic barrier dysfunction64.
NADPH oxidases are activated and regulated by several factors, as mechanical forces, hormones and cytokines, considering the thrombin, the Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), the a Tumor Necrosis Factor (TNF-a), the lactosylceramide, the Interleukin-1 and the oxidized LDL stand out among these factors (
In vascular smooth muscle cells, the angiotensin II (Ang II) is a potent stimulator of NADPH oxidase activity. This angiotensinergic peptide is a known aspect in pathogenesis of most cardiovascular disorders, and it may induce formation of •O2-, partly due to vascular NADPH oxidases5. The activation mediated by Ang II was first demonstrated by Griendling et al66, underscoring the importance of Ang II concentrations in the increase of NADPH oxidase's activities in vascular smooth muscle cells1,15,16. Despite the signaling by Ang II stimulating NADPH oxidase is not thoroughly studied, PLD, PKC, PLA2, PI3K and thiol oxireductases pathways seem to be involved67-69. In vascular smooth muscle, Src tyrosine kinase regulates the NADPH oxidase activity stimulated by Ang II, inducing phosphorylation and translocation of subunit p47phox15. Besides this, Src is capital for the effects of Ang II in the NADPH's subunits synthesis, stimulating the increase in the expression of gp91phox, p22phox, p47phox and p67phox60. In addition to this, phosphorylation of Src precedes the activation of ERK1/2 and JNK cascades in vascular smooth muscle, leading to migration, cell growth, apoptosis and deposition of collagen70, activating focal adhesion complexes, and has important participation in vascular inflammatory response71. These proliferative and inflammatory pathways provide positive feedback to the activation of NADPH oxidase in the vascular system. In vascular smooth muscle, the EGF receptor transactivation seems to be involved, leading to activation of PI3 kinase and small RacG protein minutes after the receptor AT1 of angiotensin is activated5,11,14,16,20,46,72,73. Ang II acts by increasing the NADPH oxidase subunits' expression in hours or days5,11,14,15,46. In animal models proposed by Rajagopalan et al11, the production of vascular •O2-, the NADPH oxidase activity and the level of expression of p22phox, gp91phox, p67phox and Nox1 have increased (there was 100% for the NADPH oxidase).
In the event of activation by Ang II, the H2O2, generated from the •O2- produced by NADPH oxidase, is capital for the hypertrophy of vascular smooth muscle cells54, also acting as a vasoconstrictor (
Clinical studies show that RONS play a significant role in high blood pressure. The production of these species undergoes increase in patients suffering from essential high blood pressure, renovascular hypertension, malignant hypertension and preeclampsia hypertension25. Besides this, increased production of •O2- by NADPH oxidase in vessels is related to risk factors for arteriosclerosis (
The endothelial dysfunction is related to the increase in the NADPH oxidase activity (by increase of expression of its catalytic subunits14,53,79), ever since atherosclerotic lesions in human coronaries show strong expression of gp91phox in the vulnerable area of the plaque. Besides this, Nox4 increases during the stage of formation of atheroma, whose appearance happens in a reduced form in advanced lesions. Great saphenous veins and internal mammary arteries of patients with diabetes mellitus present an increase in the NADPH oxidase activity and in decoupled eNOS (in this status, the enzyme acts as producer of •O2- instead of •NO) when compared to control group, evincing the relationship between NADPH oxidase and the atherosclerotic lesions14.
Vitamin supplementing may reduce vascular redox unbalance and improve total oxidative status. For instance, some animal models in which antioxidant properties of vitamins C and E are associated to decrease in activation of NADPH oxidase42,80 and increase in SOD activity (the largest system of cellular defense against •O2- in vascular system46). It may be advocated that hydrophobic vitamin E could inhibit the formation of enzyme complex of the NADPH oxidase subunits49. Despite these observations, clinical tests with antioxidant vitamins have not shown therapeutic benefits as for mortality in cardiovascular events25,46. Besides this, depending mainly on the posology, such substances may present pro-oxidant properties with harmful organic interactions. As the data from major prospective clinical studies has failed to demonstrate beneficial effects of antioxidants25, a balanced diet without vitamin supplementing is commonly recommended, ever since potential harms of supplementing are still undefined.
In high blood pressure, the product of the activation of NADPH oxidase, the •O2-, produces the oxidation of H4B, leading to an increase in the eNOS decoupling, and the levels of this type of oxygen increase, causing the bioavailability of •NO14 to drop. Thus, H4B is believed to be deficient in condition associated with altered endothelial function, such as hypercholesterolemia, diabetes, high blood pressure and tobacco addiction. Stroes et al81 showed that the treatment with H4B increase vasodilation in human with hypercholesterolemia, insofar the removal of this biopterine implies in eNOS40 decoupling. In support to these findings, the eNOS superexpression prevents hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling52, causing structural changes and alterations in cellular processes that result in increase of the median layer: vascular lumen ratio82,83.
Another factor implied in the redox unbalance is the endotoxemia. During its progress, release of lipopolysaccharides promotes increase of expression and activity of xanthine oxidase and of NADPH oxidase46. The increase of NADPH oxidase-dependent RONS in endosomes is important to pro-inflammatory immune response20. Activated neutrophils produce •O2-, hydroxyl radical (•OH) and hypochlorous acid (HOCl), in addition to microbicide peptides and proteases84 responsible for the efficient immune response. Neutrophillic activation in phagocytosis of pneumococci induces the production of RONS by NADPH oxidase. In addition to this, the block of NADPH oxidase activation during acute bacterial meningitis in experimental animals provokes deficient defense against
As for the production of •NO, clinical and experimental studies have shown that administering L-arginine recovers the synthesis of this radical and the vascular function in several cardiovascular diseases, implying that impairment of precursor amino acids availability is present in these disorders. Reduced levels of L-arginine also promote eNOS decoupling, resulting in increase of RONs34.
•NO-donor drugs (nitrodilators) have been used to treat coronary heart diseases, high blood pressure and heart failure, having anti-inflammatory actions on vascular wall as suppressors of lipoprotein oxidation, inhibitors of migration and proliferation of vascular smooth muscle cells and platelet aggregation inhibitors. They act as suppressors of the expression of adhesion molecules and chemiokines after the stimulation with proinflammatory factors. Such aspects prevent the inflammatory cell infiltration into the vascular wall, where there is also opposition to pro-inflammatory actions of RONS. In addition to this, it was recently found that •NO seems to have anti-inflammatory effect of artery wall due to its suppression of RONS generator enzymes, particularly the NADPH oxidase5.
Nox proteins are also related to other countless organic disorders, including cancer, bone reabsorption and Alzheimer Disease, as they are expressed in several tissues1,80,86. Evidences demonstrate the role of Nox2 in neurodegenerative processes, such as Parkinson's disease, stroke, cerebral trauma and meningitis, mainly due to neurotoxicity of RONS57,87. Thus, the Nox inhibitors present significant clinical potential, particularly if they do not inhibit the activity of phagocytes1.
Pharmacological inhibitors of NADPH oxidase which block directly the activity of this enzyme have been described as consisting of peptide and non-peptide structures. The DIP-diphenyleneiodonium5,10 and 4'-hydroxy-3-methoxyacetophenone (the apocynin, isolated from the medicinal plant
Leukocytes are capable of mediating the apocynin inhibiting effect. It may be suggested that myeloperoxidase (MPO), selectively expressed in leukocytes, is necessary for the occurrence of the inhibiting effect of this substance. In HEK293 cells with no MPO, the formation of apocynin dimers does not occur even with superexpression of Nox isoforms6. When human MPO is added, dimers may be identified in cells with superexpression of Nox isoforms or in cells co-incubated with H2O2. In absence of H2O2 or Nox, dimer production by HEK293 cells is inhibited. In stimulated leukocytes, dimers are promptly detectable, insofar as in stimulated vascular cells, there is not such production, even in presence of MPO. Thus, the authors suggest that the apocynin would act as anti-oxidant and not as inhibitor of NADPH oxidase in non-phagocytic cells6,88, and the inhibiting action for the NADPH oxidase would be restricted to leukocytes which express MPO6 (
Pagano et al90 developed the chimeric peptide gp91ds-Tat, comprised of nine amino acids of HIV protein coat and nine amino acids of gp91phox1,10. This substance presents reaction with p47phox and interferes in bond of this subunit with the gp91phox. The "Tat" portion allows the gp91ds-Tat to penetrate into the cell, and, thus, it is effective inhibitor of oxidases which contain gp91phox. However, despite the peptides as the one referred to are useful in experimental interventions, biotransformation processes render its oral administration difficult, limiting its potential in clinical therapeutics1.
Peptidic inhibitors of NADPH oxidase are also described, such as the antibiotic PR-39, endogenously secreted by intestine cells and neutrophils of humans and swines. They act both as immunity cells and as inhibitors to the non-phagocytic NADPH oxidase activity. Initially, the PR-39 was seen as a specific inhibitor of the NADPH oxidase. However, recent studies have shown that the antibiotic presents several effects, partly because it binds to SH3 domains of other proteins and also because it interacts with membrane lipides5.
This study identified that the NADPH oxidase emerged as one of the main structures involved in vascular redox unbalance. As the •NO is also capable of suppressing the NADPH oxidase activity, this event is believed to present direct implications not only in the development of vascular disease, but also acute recovery of ischemia and reperfusion lesion, in which NADPH-dependent unbalance is of major contribution1,5.
The development of oxidase specific inhibitors, based on Nox units, may experimentally provide tools to enlighten on the role of these enzymes. It may also be useful in the treatment of several diseases1, mainly when it comes to
The authors would like to thank the CNPq, the FAPEAL and the PPSUS-2006/Ministry of Health-FAPEAL for the financial support for this project.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was partially funded by CNPq, PROCAD-NF/CAPES and FAPEAL.
This study is not associated with any post-graduation program.