Quantificação de vasos linfáticos na cardiomiopatia dilatada e chagásica crônica
Instituto do Coração do Hospital das Clínicas (InCor) - FMUSP, Instituto de Medicina Tropical (LIM 06) - FMUSP, São Paulo, SP - Brasil
O recente desenvolvimento de anticorpos específicos para o endotélio linfático tem permitido sua detecção por técnica imuno-histoquímica1. Apesar desse avanço metodológico, o estudo morfológico dos vasos linfáticos do miocárdio tem sido negligenciado e muito pouco se sabe sobre isso nas diferentes cardiopatias.
A insuficiência cardíaca congestiva acarreta edema intersticial em diferentes órgãos e tecidos, incluindo o miocárdio, devendo esse excesso de fluido ser drenado pelo sistema linfático. O edema do miocárdio está implicado no desenvolvimento de fibrose intersticial e prejudica o desempenho cardíaco2.
O objetivo deste estudo é comparar os vasos linfáticos do miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca congestiva secundária a cardiomiopatia dilatada idiopática ou a cardiomiopatia chagásica crônica com os vasos linfáticos do miocárdio normal.
Foram previamente avaliadas algumas características morfológicas de biópsias endomiocárdicas de pacientes portadores de insuficiência cardíaca congestiva classe funcional III ou IV, secundária a cardiomiopatia dilatada idiopática (CDI) ou cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), essa última caracterizada por testes sorológicos positivos para a doença de Chagas e pela presença de miocardite linfo-histiocitária crônica3,4. Neste estudo foram reavaliadas as biópsias de 31 pacientes com CDI (média de idade: 40,65 ±12,14 anos; 22 do sexo masculino) e 24 pacientes com CCC (média de idade: 43,71 ± 9,29 anos; 21 do sexo masculino), em que foi possível obter novos cortes histológicos que apresentassem ao menos 1,25 mm2 de área analisável (cinco campos microscópicos de 400 x). Como grupo-controle, coletamos pequenas amostras do endomiocárdio do ventrículo direito normal de 11 indivíduos falecidos por causas não cardiovasculares e submetidos a necropsia (média de idade: 50,82 ± 15,39; 3 do sexo masculino). Essas amostras foram rotineiramente processadas e incluídas em parafina. Cortes seriados a 4 µm foram corados pela hematoxilina-eosina, tricrômico de Masson ou submetidos à técnica imuno-histoquímica para detecção de vasos linfáticos.
Cortes histológicos foram incubados com anticorpo monoclonal D2-40 (Dako Corporation, CA) diluído 1:100, overnight, a 4ºC. As reações foram desenvolvidas com o polímero marcado com peroxidase EnVision (Dako Corporation, CA) por 30 minutos à temperatura ambiente e visualizados com 3,3' diaminobenzidina. Cortes histológicos de pele normal foram usados como controles positivos e negativos, omitindo-se o anticorpo primário nos últimos.
Foram avaliados o diâmetro médio dos miócitos, a área fracional de colágeno, a área fracional dos vasos linfáticos e o diâmetro do vaso linfático de maior calibre de cada amostra. Miocardite foi caracterizada pela presença de infiltrado inflamatório mononuclear associado a degeneração e/ou necrose dos miócitos, de acordo com o critério de Dallas5. O diâmetro dos miócitos e a área fracional de colágeno foram avaliados conforme previamente descrito3,4. A área total ocupada pelo corte histológico, a área total ocupada pelos vasos linfáticos e o diâmetro do vaso linfático de maior calibre foram medidos com ajuda de sistema computadorizado de análise de imagens. A área fracional dos linfáticos foi calculada pela razão entre a área total ocupada pelos vasos linfáticos e a área total ocupada pelo corte histológico, multiplicada por 100.
Os dados morfométricos dos três grupos foram comparados usando o teste de análise de variância de postos de Kruskal-Wallis. O valor de p
Os vasos linfáticos estavam presentes entre os miócitos, ao redor dos vasos sanguíneos ou, mais raramente, no endocárdio. Os vasos linfáticos apresentavam-se esparsos, em muito menor número que os vasos sanguíneos, e sua densidade variou grandemente de amostra para amostra e mesmo em diferentes áreas da mesma amostra. Ocasionalmente havia numerosos vasos linfáticos colapsados, ramificados e agrupados, particularmente ao redor de arteríolas (
A investigação dos vasos linfáticos nas diversas cardiopatias humanas tem sido negligenciada. Isso se deve em grande parte à dificuldade em diferenciar esses vasos dos sanguíneos, o que até há pouco tempo só era possível a partir do exame pela microscopia eletrônica. Entretanto, o recente desenvolvimento de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer especificamente o endotélio linfático1 tem mudado esse panorama, e alguns estudos morfológicos sobre as alterações dos vasos linfáticos na doença isquêmica do coração e no transplante cardíaco foram relatados6,7.
O coração dos mamíferos apresenta um plexo linfático subendocárdico, vasos linfáticos no miocárdio (em muito menor número que os capilares sanguíneos) e um plexo linfático subepicárdico, este último contendo vasos coletores de maior calibre que acompanham os ramos epicárdicos das artérias coronárias2,8.
Em nossas amostras os vasos linfáticos apareceram focalmente colapsados, ramificados e agrupados, impedindo sua contagem fidedigna. Assim, optamos por avaliar sua área fracional, que, ao contrário do número absoluto, sofre influência do estado de distensão vascular.
Até onde é do nosso conhecimento, há apenas um relato abordando os vasos linfáticos do miocárdio em cardiomiopatias: analisando por microscopia eletrônica amostras de coração de pacientes com CDI, os autores relataram dilatação dos linfáticos em áreas de edema intersticial e rarefação e irregularidade dos mesmos em áreas de fibrose intersticial9. O presente estudo é o primeiro a realizar exame imuno-histoquímico morfométrico dos vasos linfáticos do miocárdio em cardiomiopatias. Apesar de esperarmos aumento de sua área fracional, condicionadas pela insuficiência cardíaca congestiva dos pacientes e também pelo processo inflamatório crônico (miocardite linfo-histiocitária) no grupo CCC, as medidas morfométricas não confirmaram essa hipótese. Pelo contrário, apesar de estatisticamente não significante, pacientes dos grupos CDI e CCC apresentaram menor área fracional de linfáticos que o grupo controle. Além disso, pacientes do grupo CDI apresentaram menor diâmetro do vaso linfático de maior calibre comparado aos indivíduos do grupo controle. É possível que tais resultados inesperados possam estar relacionados à maior área fracional de colágeno (fibrose) dos grupos CDI e CCC, o que acarretaria rarefação e atrofia dos vasos linfáticos, conforme previamente relatado9.
Os resultados deste estudo são preliminares, pois a relativa escassez e a grande variabilidade regional dos vasos linfáticos do miocárdio tornam difícil a interpretação conclusiva de dados obtidos pela avaliação de amostras pequenas, como a biópsia endomiocárdica. Nossos resultados devem ser confirmados por estudos posteriores, utilizando-se amostras amplas de corações de pacientes submetidos a transplante cardíaco ou necropsia.
Ao Prof. Dr. Thales de Brito, que gentilmente nos cedeu o anticorpo D2-40.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Não há vinculação deste estudo a programas de pósgraduação.
Luiz Alberto Benvenuti Rua Madalena, 477/31 - Vila Madalena 05434-090 - São Paulo, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 15/05/09; revisado recebido em 25/07/09; aceito em 07/10/09.
Instituto do Coração do Hospital das Clínicas (InCor) - FMUSP, Instituto de Medicina Tropical (LIM 06) - FMUSP, São Paulo, SP - Brasil
Correspondencia
El reciente desarrollo de anticuerpos específicos para el endotelio linfático ha permitido su detección por técnica inmunohistoquímica1. Pese a este avance metodológico, no se viene tratando con la debida atención el estudio morfológico de los vasos linfáticos del miocardio y muy poco se sabe sobre esto en las diferentes cardiopatías.
La insuficiencia cardiaca congestiva conlleva edema intersticial en diferentes órganos y tejidos, incluido el miocardio, con el drenaje de este exceso de fluido por el sistema linfático. El edema del miocardio está implicado en el desarrollo de fibrosis intersticial y perjudica el desempeño cardiaco2.
El objetivo de este estudio es comparar los vasos linfáticos del miocardio de pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva secundaria en la cardiomiopatía dilatada idiopática o la cardiomiopatía chagásica crónica, con los vasos linfáticos del miocardio normal.
Se evaluaron previamente algunas características morfológicas de biopsias endomiocárdicas de pacientes portadores de insuficiencia cardíaca congestiva clase funcional III ó IV, secundaria a la cardiomiopatía dilatada idiopática (CDI) o cardiomiopatía chagásica crónica (CCC), ésta última caracterizada por pruebas serológicas positivas para la enfermedad de Chagas y por la presencia de miocarditis linfohistiocitária crónica3,4. En este estudio se reevaluaron las biopsias de 31 pacientes con CDI (promedio de edad: 40,65 ± 12,14 años; 22 del sexo masculino) y 24 pacientes con CCC (promedio de edad: 43,71 ± 9,29 años; 21 del sexo masculino), en que fue posible obtener nuevos cortes histológicos que presentaran como mínimo 1,25 mm2 de área analizable (cinco campos microscópicos de 400 ´). Como grupo-control, recolectamos pequeñas muestras del endomiocardio del ventrículo derecho normal de 11 individuos muertos por causas no cardiovasculares y sometidos a necropsia (promedio de edad: 50,82 ±15,39; 3 del sexo masculino). Estas muestras se procesaron rutinariamente y las incluyeron en parafina. Cortes seriados a 4 mm se colorearon con hematoxilina-eosina, tricrómico de Mason o sometieron a la técnica inmunohistoquímica para detección de vasos linfáticos.
Cortes histológicos se incubaron con anticuerpo monoclonal D2-40 (Dako Corporation, CA) diluido 1:100, overnight, a 4º C. Las reacciones se desarrollaron con el polímero marcado con peroxidasa EnVision (Dako Corporation, CA) por 30 minutos a temperatura ambiente y las visualizaron con 3,3' diaminobenzidina. Cortes histológicos de piel normal se utilizaron como controles positivos y negativos, omitiéndose el anticuerpo primario en los últimos.
Se evaluaron el diámetro promedio de los miocitos, el área fraccional de colágeno, el área fraccional de los vasos linfáticos y el diámetro del vaso linfático de mayor calibre de cada muestra. Miocarditis se caracterizó por la presencia de infiltrado inflamatorio mononuclear asociado a degeneración y/o necrosis de los miocitos, de acuerdo al criterio de Dallas5. El diámetro de los miocitos y el área fraccional de colágeno se evaluaron de conformidad a lo previamente descripto3,4. El área total ocupada por el corte histológico, el área total ocupada por los vasos linfáticos y el diámetro del vaso linfático de mayor calibre se midieron con ayuda de sistema computarizado de análisis de imágenes. El área fraccional de los linfáticos se calculó por medio de la razón entre el área total ocupada por los vasos linfáticos y el área total ocupada por el corte histológico, multiplicada por 100.
Los datos morfométricos de los tres grupos se compararon utilizando la prueba de análisis de varianza de puestos de Kruskal-Wallis. El valor de p £ 0,05 se consideró estadísticamente significante.
Los vasos linfáticos estaban presentes entre los miocitos, alrededor de los vasos sanguíneos o, de modo más escaso, en el endocardio. Los vasos linfáticos se hallaban esparcidos, en un número mucho menor que los vasos sanguíneos, y su densidad varió grandemente de muestra para muestra y aun en diferentes áreas de la misma muestra. Ocasionalmente había numerosos vasos linfáticos colapsados, ramificados y agrupados, particularmente alrededor de arteriolas (
No se viene prestando la debida atención a la investigación de los vasos linfáticos en las diversas cardiopatías humanas. Esto se debe en gran parte a la dificultad en distinguir estos vasos de los sanguíneos, lo que hasta hace poco tiempo sólo era posible a partir del examen por la microscopia electrónica. No obstante, el reciente desarrollo de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer específicamente el endotelio linfático1 ha cambiado este panorama, y se relataron6,7 algunos estudios morfológicos sobre las alteraciones de los vasos linfáticos en la enfermedad isquémica del corazón y en el trasplante cardiaco.
El corazón de los mamíferos presenta un plexo linfático subendocárdico, vasos linfáticos en el miocardio (en un número mucho menor que los capilares sanguíneos) y un plexo linfático subepicárdico, éste último con vasos recolectores de mayor calibre que acompañan las ramas epicárdicas de las arterias coronarias2,8.
En nuestras muestras los vasos linfáticos aparecieron focalmente colapsados, ramificados y agrupados, impidiendo su conteo fiable. Así, optamos por evaluar su área fraccional, que, al contrario del número absoluto, sufre influencia del estado de distensión vascular.
Sabemos que hay al menos un relato que abarca los vasos linfáticos del miocardio en cardiomiopatías: al analizar por microscopia electrónica muestras de corazón de pacientes con CDI, los autores relataron dilatación de los linfáticos en áreas de edema intersticial y rarefacción e irregularidad de los mismos en áreas de fibrosis intersticial9. El presente estudio es el primer a llevar a cabo el examen inmunohistoquímico morfométrico de los vasos linfáticos del miocardio en cardiomiopatías. A pesar de esperar el aumento de su área fraccional, condicionadas por la insuficiencia cardiaca congestiva de los pacientes y también por el proceso inflamatorio crónico (miocarditis linfohistiocitária) en el grupo CCC, las mediciones morfométricas no confirmaron esta hipótesis. Por lo contrario, a pesar de estadísticamente no significante, pacientes de los grupos CDI y CCC presentaron menor área fraccional de linfáticos que el grupo control. Además de esto, pacientes del grupo CDI presentaron menor diámetro del vaso linfático de mayor calibre comparado a los individuos del grupo control. Es posible que tales resultados inesperados puedan estar relacionados a la mayor área fraccional de colágeno (fibrosis) de los grupos CDI y CCC, lo que conllevaría la rarefacción y atrofia de los vasos linfáticos, según se ha relatado anteriormente9.
Los resultados de este estudio son preliminares, ya que la relativa escasez y la gran variabilidad regional de los vasos linfáticos del miocardio hacen difícil la interpretación conclusiva de datos obtenidos por la evaluación de muestras pequeñas, como la biopsia endomiocárdica. Nuestros resultados deben ser confirmados por estudios posteriores, con la utilización de muestras amplias de corazones de pacientes sometidos a trasplante cardíaco o necropsia.
Al Prof. Dr. Thales de Brito, que gentilmente nos cedió el anticuerpo D2-40.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio no tuvo fuentes de financiación externas.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.
Quantification of lymphatic vessels in dilated and chronic chagasic cardiomyopathy
Instituto do Coração do Hospital das Clínicas (InCor) - FMUSP, Instituto de Medicina Tropical (LIM 06) - FMUSP, São Paulo, SP - Brazil
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The recent development of specific antibodies for the lymphatic endothelium has allowed its detection by the immunohistochemical technique1. In spite of this methodological advancement, the morphological study of the myocardial lymphatic vessels has been neglected and very little is known about this in the different cardiopathies.
The congestive heart failure causes interstitial edema in different organs and tissues, including the myocardium, and this excess fluid must be drained by the lymphatic system. The myocardial edema is involved in the development of interstitial fibrosis and impairs the heart function2.
The objective of this study is to compare the myocardial lymphatic vessels of patients with congestive heart failure secondary to idiopathic dilated cardiomyopathy or chronic chagasic cardiomyopathy with normal myocardial lymphatic vessels.
Some morphological characteristics of endomyocardial biopsies from patients with congestive heart failure functional class III or IV, secondary to idiopathic dilated cardiomyopathy (IDC) or chronic chagasic cardiomyopathy (CCC) were previously evaluated; the latter was characterized by positive serological tests for Chagas disease and by the presence of chronic lymphohistiocytic myocarditis3,4. In this study, the biopsies of 31 patients with IDC (mean age 40.65 ± 12.14 years; 22 males) and 24 patients with CCC (mean age: 43.71 ± 9.29 years; 21 males) were re-evaluated, which supplied new histological sections that presented at least 1.25 mm2 of analyzable area (five microscopic fields of 400 ×). As the control group, we collected small samples of normal right ventricular endomyocardium of 11 individuals that died due to non-cardiovascular causes and were submitted to necropsy (mean age 50.82 ± 15.39; 3 males). These samples were routinely processed and paraffin-embedded. Serial 4-µm sections were stained by hematoxylin and eosin, Masson´s trichrome or submitted to the immunohistochemical technique for the detection of lymphatic vessels.
Histological sections were incubated with the monoclonal antibody D2-40 (Dako Corporation, CA) diluted 1:100, overnight, at 4ºC. The reactions were developed with the EnVision peroxidase labeled polymer (Dako Corporation, CA) for 30 minutes at room temperature and visualized with 3,3´ diaminobenzidine. Histological sections of normal skin were used as positive and negative controls, omitting the primary antibody in the latter.
The mean diameter of the myocytes, the fractional area of collagen, the fractional area of the lymphatic vessels and the diameter of the largest-caliber lymphatic vessel of each sample were analyzed. Myocarditis was characterized by the presence of mononuclear inflammatory infiltrate associated to degeneration and/or necrosis of myocytes, according to the Dallas criteria5. The diameter of myocytes and the fractional area of collagen were assessed as previously described3,4. The total area occupied by the histological section, the total area occupied by the lymphatic vessels and the diameter of the largest-caliber lymphatic vessel were measured with the help of a computerized image analysis system. The fractional area of the lymphatic vessels was calculated through the ratio between the total area occupied by the lymphatic vessels and the total area occupied by the histological section, multiplied by 100.
The morphometric data of the three groups were compared using the Kruskal-Wallis analysis of variance by ranks. A p value
The lymphatic vessels were present among the myocytes, around the blood vessels or, more rarely, in the endocardium. The lymphatic vessels were sparse and at a lower number than the blood vessels, and their density varied greatly from sample to sample and even in different areas of the same sample. Occasionally, there were several collapsed, ramified and grouped lymphatic vessels, particularly around the arterioles (
The investigation of the lymphatic vessels in the several human cardiopathies has been neglected. This is greatly due to the difficulty in differentiating these vessels from blood vessels, which until recently was only possible through electron microscopy. However, the recent development of monoclonal antibodies capable of specifically recognizing the lymphatic endothelium1 has changed this scenario and some morphological studies on the alterations in the lymphatic vessels in ischemic heart disease and heart transplantation have been reported6,7.
The heart of the mammals presents a subendocardial lymphatic plexus, lymphatic vessels in the myocardium (at much lower numbers than blood capillaries) and a subepicardial lymphatic plexus, the latter containing larger caliber collecting vessels that follow the epicardial branches of the coronary arteries2,8.
In our samples, the lymphatic vessels appeared focally collapsed, ramified and grouped, preventing their accurate counting. Thus, we chose to assess their fractional area, which differently from the absolute number, is under the influence of the state of vascular distension.
To the best of our knowledge, there has been only one report on the lymphatic vessels of the myocardium in cardiomyopathies: analyzing samples of the heart of patients with IDC through electron microscopy, the authors reported dilation of lymphatic vessels in areas of interstitial edema and their rarefaction and irregularity in areas of interstitial fibrosis9. The present study is the first to perform a morphometric immunohistochemical assessment of the lymphatic vessels of the myocardium in cardiomyopathies. Although we expected the increase in their fractional area, caused by the congestive heart failure presented by the patients and also by the chronic inflammatory process (lymphohistiocytic myocarditis) in the CCC group, the morphometric measurements did not confirm this hypothesis. On the contrary, although statistically non-significant, the patients from the IDC and CCC groups presented a smaller fractional area of lymphatic vessels than the control group. Additionally, the patients from the IDC group presented a smaller diameter of the largest-caliber lymphatic vessels when compared with those from the control group. It is possible that such unexpected results might be related to the larger fractional area of collagen (fibrosis) in the IDC and CCC groups, which would result in lymphatic vessel rarefaction and atrophy, as previously reported9.
The present study results are preliminary ones, as the relative scarcity and the great regional variability of the lymphatic vessels in the myocardium make it difficult to achieve a conclusive interpretation of the data obtained through the assessment of small samples, such as the ones obtained at endomyocardial biopsies.
Our results must be confirmed by further studies, using larger samples of hearts of patients submitted to heart transplant or necropsy.
To Prof. Dr. Thales de Brito, who kindly provided the D2-40 antibody.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This study is not associated with any post-graduation program.