FUNDAMENTO: Estudos recentes demonstram que a expressão de mediadores inflamatórios, como as citocinas, é um importante fator de desenvolvimento e progressão da insuficiência cardíaca (IC), principalmente na presença de disfunção ventricular esquerda. Essas alterações têm sido demonstradas tanto no plasma como no músculo cardíaco e, mais recentemente, no músculo esquelético de ratos e pacientes com IC. OBJETIVO: Investigar a produção e expressão do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-10 (IL-10) no músculo sóleo e extensor digital longo (EDL) em animais com disfunção ventricular pós-infarto do miocárdio (IM). MÉTODOS: Utilizaram-se ratos Wistar machos que foram submetidos à ligadura da artéria coronária esquerda sem posterior reperfusão. Quatro semanas após esse procedimento, os animais foram submetidos à análise ecocardiográfica e divididos nos seguintes grupos experimentais: falso operado (Sham) e IM. Mantiveram-se em observação por um período adicional de 8 semanas. RESULTADOS: O nível da citocina TNF-α aumentou 26,5% (p < 0,05), e sua expressão gênica, 3 vezes (p < 0,01). O nível de IL-10 apresentou diminuição de 38,2% (p < 0,05). Ambas as alterações ocorreram apenas no músculo sóleo, sem alterações no EDL. A diminuição (36,5%, p < 0,05) na razão IL-10/ TNF-α deveu-se tanto ao aumento dos níveis teciduais do TNF-α quanto à diminuição da IL-10 dos níveis teciduais. CONCLUSÃO: Nossos resultados demonstraram alterações relevantes na razão IL-10/ TNF-α, o que pode ter um papel aditivo na avaliação da deterioração e progressão do quadro da disfunção ventricular esquerda pós-IM. Além disso, nosso estudo sugere que essas alterações parecem estar relacionadas ao tipo de fibra muscular.
ARTIGO ORIGINAL
BIOLOGIA MOLECULAR
IUniversidade de São Paulo, São Paulo
IIUniversidade Federal de São Paulo
IIIUniversidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes
IVDuke Clinical Research Institute, Durham- North Caroline, USA
RESULTADOS: O nível da citocina TNF-α aumentou 26,5% (p < 0,05), e sua expressão gênica, 3 vezes (p < 0,01). O nível de IL-10 apresentou diminuição de 38,2% (p < 0,05). Ambas as alterações ocorreram apenas no músculo sóleo, sem alterações no EDL. A diminuição (36,5%, p < 0,05) na razão IL-10/ TNF-α deveu-se tanto ao aumento dos níveis teciduais do TNF-α quanto à diminuição da IL-10 dos níveis teciduais.
A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica de fisiopatologia complexa que pode ser resultante de qualquer disfunção funcional ou estrutural que atinja o coração e, consequentemente, comprometa a capacidade dos ventrículos de encherem e bombearem sangue satisfatoriamente1,2. As manifestações cardinais da IC são dispneia e fadiga, as quais podem limitar a capacidade de realização de esforço físico (intolerância ao exercício físico) e culminar em processos que levem à congestão pulmonar e sistêmica e ao aumento da resistência vascular periférica1,3. As principais causas da IC, de origem cardíaca, são as doenças das artérias coronárias, hipertensão, cardiomiopatias dilatadas e doenças das valvas cardíacas1,4.
Atualmente, as alterações deteriorativas envolvidas na progressão da IC com disfunção ventricular não dependem somente dos parâmetros hemodinâmicos, mas também dos processos que culminam na ativação inflamatória local (coração) e sistêmica5-7, evidenciadas pelo aumento, tanto na expressão gênica como na proteica, de citocinas pró-inflamatórias, tais como: fator α de necrose tumoral (TNF-α), interleucinas 1β (IL-1β) e 6 (IL-6), entre outras. Essas alterações têm sido demonstradas tanto no plasma como nos músculos esquelético e cardíaco de ratos e pacientes com IC. Esses mediadores inflamatórios podem, além de contribuir para a fisiopatologia e progressão da IC, influenciar diretamente no aparecimento das manifestações clínicas da síndrome da IC, principalmente nas alterações relacionadas à diminuição e ao funcionamento da massa muscular8,9.
Por conseguinte, apesar de, nos últimos anos, a grande maioria dos estudos sobre IC ter se concentrado nas citocinas pró-inflamatórias, atualmente as citocinas anti-inflamatórias, em especial a IL-10, têm ganhado destaque e podem ter um papel importante na fisiopatologia da IC10,11. Em pacientes com IC e, principalmente, nos casos de disfunção ventricular esquerda, uma diminuição na concentração plasmática de IL-10 tem sido relatada e correlacionada positivamente com uma piora na fração de ejeção do ventrículo esquerdo12. Além disso, em animais com IC pós-IM, a utilização da relação da produção da IL-10 e do TNF-α (razão IL-10/ TNF-α) tem sido recentemente demonstrada como um indicador que se relaciona com maior precisão com o grau de disfunção ventricular12.
De fato, nos modelos animais e em pacientes com IC, a distribuição de fibras musculares esqueléticas em tipo I (aeróbias), tipo IIa (aeróbias e anaeróbias) e tipo IIb (anaeróbias) apresenta alterações na sua composição. Notadamente, as fibras musculares esqueléticas do tipo I são as mais afetadas, pois desenvolvem algumas características similares às do tipo IIA13, além da redução da densidade capilar3 e diminuição da atividade máxima da enzima citocromo C oxidase9, quando comparado ao mesmo tipo de fibra muscular em indivíduos sem alterações patológicas no músculo esquelético. Da mesma forma, estudos realizados em ratos com disfunção ventricular pós-IM têm reproduzido essas mesmas alterações14, demonstrando, dessa forma, que as fibras do tipo I do músculo esquelético perecem ser as mais afetadas nessa condição.
Além disso, essas alterações têm sido correlacionadas ao aumento na expressão dos genes e produção de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-6) no músculo quadríceps em humanos15 e animais7. Apesar de as alterações deletérias ocorrerem predominantemente nas fibras do tipo I, estudos recentes têm demonstrado a presença de uma condição inflamatória crônica nesse tecido. Entretanto, até o momento, nenhum estudo avaliou a produção dessas citocinas nos diferentes tipos de fibra muscular, fato que se torna ainda mais relevante ao considerarmos que esse tecido pode ser um importante "fornecedor" sistêmico de citocinas pró-inflamatórias na presença de disfunção ventricular esquerda. Por sua vez, a análise da expressão gênica e a consequente produção dessas citocinas podem ser um indicador mais preciso e/ou adicional para uma avaliação da presença de marcadores inflamatórios alterados cronicamente na disfunção ventricular.
Dado o exposto, propomo-nos a estudar a relação dos níveis de citocinas pró-TNF-α e anti-inflamatória (IL-10) no músculo esquelético em um modelo experimental em ratos com disfunção ventricular pós-IM. Ainda, utilizamos o músculo sóleo (fibra do tipo I, predominantemente) e o extensor digital longo (EDL) (fibra do tipo IIb, predominantemente) para comparar o perfil dessas citocinas em diferentes tipos musculares.
Os procedimentos experimentais estão de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea), tendo sido o protocolo para o uso de animais em experimentação (009/2005) aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (Ceea) em reunião realizada em 17 de fevereiro de 2005.
Utilizaram-se ratos Wistar machos, com idade de 8 semanas. Durante o período experimental, foram mantidos em gaiolas coletivas para 5 ratos em biotério com ciclo claro/escuro de 12/12 horas, com início do período claro às 7 horas, do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento no Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. A temperatura ambiente da sala foi mantida em 25 ± 2°C. A umidade do ar foi mantida em 60 ± 5%. A todos os grupos, ofereceu-se ração comercial balanceada (Nuvilab? CR1 - Nutrivital Nutrientes Ltda.) e água
Esse procedimento cirúrgico foi realizado por meio das técnicas do laboratório de fisiologia celular e do exercício (KCM ou MAC). Os animais foram submetidos à anestesia com uma solução de Ketalar® (80 mg/kg) + Rompun® (12 mg/kg). Depois da intubação orotraqueal, o animal era submetido à ventilação mecânica com ventilador Harvard, modelo 683 (frequência de 90 m/min e volume corrente de 2,0 ml). Após tricotomia, realizava-se toracotomia no hemitórax esquerdo, no espaço intercostal do
Promovida a ligadura coronariana, os animais eram mantidos no biotério por mais 3 semanas. A partir da quarta semana, realizava-se o ecodopplercardiograma (ECO) para confirmação da presença do infarto, avaliação do tamanho deste e realização de medidas ecocardiográficas, incluindo fração de ejeção do ventrículo esquerdo.
Durante 4 e 12 semanas após o IM, os animais foram submetidos à anestesia com uma solução de Ketalar® (50 mg/kg) + Rompun® (10 mg/kg) por via intraperitoneal para o ecocardiograma.
O ecocardiograma foi realizado com aparelho HP Sonos 5500 (Hewlett Packard, Andover, MA, USA) utilizando transdutor de frequência fundamental de 12 MHz, com as imagens obtidas com profundidade de 2 cm. Após anestesia e usando o mesmo esquema anterior, os animais eram posicionados em decúbito lateral esquerdo, e colocavam-se três eletrodos nas patas para obtenção do eletrocardiograma.
As imagens em cortes transversais do ventrículo esquerdo eram gravadas em fitas de vídeo para posterior análise. Foram utilizadas as janelas paraestenal esquerda (corte longitudinal e transversal) e apical (quatro e duas câmaras). As medidas lineares, realizadas nas imagens obtidas pelo modo-M, foram: diâmetros do VE ao final da diástole (DDVE) e da sístole (DSVE), o diâmetro anteroposterior do átrio esquerdo (AE) e o diâmetro de parede anterior do ventrículo esquerdo em diástole (Paved). A extensão do infarto (%IM), avaliada pela medida do comprimento das regiões acinética e/ou hipocinética (RAH) das paredes ventriculares, foi expressa como porcentagem do perímetro total do contorno endocárdico (PE) em três cortes transversais do VE (nível das bordas das cúspides da valva mitral, dos músculos papilares e da região apical), segundo padronizações anteriores caracterizadas pelo grupo do professor Paulo J. F. Tucci16,17, utilizando a fórmula: IIM (%) = (RAH/PE) x 100.
A função sistólica foi avaliada pela fração de ejeção (FE). Os volumes ventriculares diastólico (Vd) e sistólico (Vs) do VE foram obtidos pelo método de Simpson biplano (apical, quatro e duas câmaras), e calculou-se a FE pela fórmula: FE = (Vd - Vs / Vd) x 100. A função diastólica foi analisada utilizando-se os índices derivados da curva de velocidade do fluxo diastólico mitral obtido pela técnica de Doppler pulsátil. Obteve-se a curva de velocidade do fluxo diastólico a partir da imagem apical de quatro câmaras, posicionando-se a amostragem de volume próximo à face ventricular da valva mitral. Foram determinadas onda E, onda A e razão E/A. Ao final do estudo por ECO, os animais em que o IM assumia tamanho maior do que 40% do VE foram selecionados para o grupo infarto do miocárdio (IM). Após 12 semanas, os animais do grupo IM foram reavaliados conforme os parâmetros supracitados.
Após a análise ecocardiográfica, os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais: falso operado (Sham, n = 13) e infarto do miocárdio (IM, n = 17). Os animais Sham foram submetidos a todos os procedimentos cirúrgicos, com exceção da ligadura da artéria coronária. Após esse período, os animais foram mantidos durante 8 semanas para observação. Depois desse período, os animais foram sacrificados por decapitação sem anestesia.
Imediatamente após o sacrifício, os tecidos e órgãos (fígado, pulmões, coração, músculo sóleo e extensor digital longo - EDL) foram removidos, pesados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C para dosagens posteriores.
Para dosagem das citocinas TNF-α (DY510) e IL-10 (DY522), utilizou-se o método
Para isolar o RNA total do músculo sóleo e EDL (pata posterior direita), as amostras pesando entre 0,2 e 0,5 g foram homogeneizadas em TRIZOL ®Reagent, de acordo com as normas descritas pelo fabricante19. As amostras de RNA foram transcritas para DNA em um termociclador (Techne, Cambridge, UK). Para a síntese do cDNA, utilizaram-se 2 µg de RNA total de cada amostra. As amostras foram incubadas com 0,5 µg/ml de oligo dT12-18 (Invitrogen, USA) a 65°C por 5 minutos, para se obter a primeira fita de cDNA.
Os
A expressão dos genes foi quantificada por PCR em tempo real por Higuchi e cols.21, utilizando os aparelhos 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA) e Syber
• Músculo sóleo: TNF-α e IL-10 (200 nM) e 18S (300 nM).
• EDL - TNF-α: IL-10 (200 nM) e 18S (200 nM).
A análise dos dados foi realizada por meio do
A mortalidade pós-operatória foi de 23,8% (n = 5, animais que evoluíram ao óbito durante as 24 horas após o procedimento cirúrgico) no grupo IM e de 13,3% (n = 2) no grupo Sham. O peso corporal total dos pulmões, do fígado, dos músculos sóleo e EDL, em valor absoluto, não foi diferentes em nenhum dos grupos avaliados (
Nos 17 animais com IM, observaram-se alterações contráteis segmentares do ventrículo em estudo anatomopatológico, após 4 semanas do procedimento cirúrgico (
O grupo de animais submetidos ao IM apresentou aumento significativo de 26,5% (p < 0,05) na produção de TNF-α no músculo sóleo, quando comparado ao grupo Sham (
O grupo de animais submetidos ao IM apresentou diminuição significativa de 38,2% (p < 0,05) na produção de IL-10 no músculo sóleo, quando comparado ao grupo Sham-S (
O grupo de animais submetidos ao IM apresentou diminuição significativa na razão IL-10/TNF-α de 36,5% (p < 0,05), quando comparado ao grupo Sham. Na
No presente estudo, a concentração da citocina pró-inflamatória (TNF-α), bem como sua expressão gênica no músculo sóleo, apresentou-se aumentada em animais com disfunção ventricular pós-IM. Tal fato foi evidenciado apenas nesse músculo, sem alteração detectada no músculo EDL. Além disso, essas alterações foram acompanhadas por uma redução na concentração da citocina anti-inflamatória (IL-10), também evidenciada apenas no músculo sóleo, e, por sua vez, a razão IL-10/ TNF-α apresentou-se alterada, sugerindo o predomínio do TNF-α em detrimento da IL-10 nesse tecido.
A cirurgia de ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda tem sido utilizada como modelo experimental de IM em animais, por meio da indução da isquemia do miocárdio, com ou sem reperfusão7,22,23. Entretanto, dados a respeito da função do ventrículo esquerdo são insuficientes para a caracterização clínica de IC, uma vez que essa síndrome é definida pela presença de anormalidades hemodinâmicas, retenção hídrica (congestão) e intolerância ao exercício físico24,25. Assim, mesmo nosso estudo apresentando dados sobre o quadro congestivo, tais como a razão do peso seco pelo peso úmido do fígado e pulmão, o que nos sugere a presença de edema pulmonar e congestão hepática, optamos por classificar o grupo IM como animais com disfunção ventricular pós-IM e não com IC. É possível que a maioria dos animais do grupo IM tenha também alterações clínicas de IC, mas isso não foi estudado no presente trabalho.
Inicialmente, postulou-se que a produção de TNF-α era exclusivamente executada por monócitos e macrófagos quando estimulados adequadamente26. Recentemente, a expressão gênica e proteica de TNF-α no músculo esquelético foi caracterizada em humanos27, em um estudo que demonstrou, pela primeira vez, a presença dessa citocina na ausência de monócitos infiltrados ou macrófagos. Isso indicou que a própria fibra muscular esquelética pode produzi-la, e assim esta poderia atuar de maneira autócrina e parácrina, em quantidade suficiente para mediar uma série de alterações morfológicas e funcionais no tecido3,28.
Em nosso estudo, ratos com disfunção ventricular pós-IM apresentaram um aumento no conteúdo da citocina pró-inflamatória TNF-α que foi apenas evidente no músculo sóleo, sem alteração no músculo EDL (não foi detectado pelo ELISA). Essa mesma condição foi evidenciada pelo aumento na expressão gênica do TNF-α, sugerindo que o aumento do conteúdo proteico de TNF-α pode ter sido resultante do aumento dos níveis de mRNA. Esse resultado está de acordo com outro estudo7 que utilizou o mesmo modelo experimental e demonstrou aumento tanto na expressão gênica como nos níveis musculares do TNF-α. Porém, esses parâmetros foram avaliados no músculo quadríceps (misto com relação à composição tipo de fibra muscular).
Dessa forma, apesar de o aumento de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-6) no músculo esquelético ser bem caracterizado tanto em pacientes com IC15 como em ratos com IC e disfunção ventricular esquerda pós-IM7, ambas as análises foram realizadas no músculo quadríceps, e pouco se sabe sobre qual é o tipo de fibra muscular mais afetado na IC. Isso se torna ainda mais evidente quando se leva em consideração que, além de essas alterações degenerativas no músculo esquelético terem sido relacionadas à presença desses marcadores, a maioria dos estudos também tem demonstrado que o a fibra mais afetada, em termos morfológicos e funcionais na IC, é do tipo I3. Assim, mostramos, pela primeira vez, que essa condição parece ser específica ao tecido muscular com o predomínio de fibras do tipo I. Como não separamos o total do homogenato em fração solúvel e ligada à membrana celular, não podemos inferir que a proteína avaliada foi aquela produzida exclusivamente pelo tecido avaliado.
Níveis plasmáticos dessas citocinas em pacientes com IC têm sido relacionados tanto com o prognóstico como com a severidade dessa doença, fato que tem sido demonstrado ser ainda mais evidente em pacientes com IC mais avançada (classe funcional IV, NYHA)6,29. Dessa forma, esse aumento tem sido apontado como resultante de um quadro inflamatório periférico, o qual seria idealmente desencadeado no músculo esquelético, por causa do fluxo sanguíneo reduzido e consequente aumento de espécies reativas do oxigênio5. Essa hipótese vem ganhando consistência, uma vez que os estudos, tanto em animais7,12,23,30,31 como em humanos2,32,33, demonstraram que o aumento no
Em ratos com disfunção ventricular pós-IM, os níveis teciduais de IL-10 foram reduzidos apenas no músculo sóleo. Nesses animais, a expressão gênica apresentou-se aumentada no mesmo tecido, demonstrando que a diminuição em sua produção pode não estar relacionada, pelo menos neste aspecto, às alterações expressão do mRNA. Isso sugere que o efeito desse modelo experimental na concentração de IL-10 pode ter sido mediado em um nível pós-transcricional, como a produção de IL-10 por elementos regulatórios transcricionais, como os
Por conseguinte, o que apresentamos de novo é o fato de ter havido aumento não só na expressão gênica, mas também no conteúdo da proteína, no caso da TNF-α, e uma diminuição da proteína IL-10, sugerindo, nesta condição, o direcionamento ao desequilíbrio na produção delas. Essa condição pode tender ao predomínio de um
Apesar de os mecanismos moleculares não estarem bem caracterizados, estudos que utilizaram a IL-10 como terapêutica (rhIL-10, em humanos), assim como em camundongos nocautes (IL-10-/-), evidenciaram a importância dessa citocina em reverter as alterações provenientes da inflamação local, notadamente as mediadas pelo TNF-α10. Esse resultado vai ao encontro do nosso, uma vez que a razão IL-10/ TNF-α diminuiu por causa de um aumento do TNF-α e, principalmente, pela diminuição da IL-10, o que sugere um importante papel da IL-10 no "controle" inflamatório local no músculo sóleo.
Em pacientes com IC, a perda ou atrofia de massa muscular começa nos estágios precoces do desenvolvimento do quadro de IC8, relacionados mais às alterações intrínsecas no músculo esquelético3,38 do que às provenientes da inatividade física (fator mais determinante em mulheres). Recentemente, tem sido demonstrado que, nessa condição, ocorre uma ativação imune, notadamente por meio de mediadores inflamatórios, que pode contribuir para o desenvolvimento desse quadro3,7,8,39. Em ratos com IC e disfunção ventricular esquerda pós-IM, essa condição tem sido reproduzida tanto pela diminuição na área de secção transversa como pelo aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias (músculo quadríceps)7, da mesma maneira que nosso estudo demonstrou uma redução do peso relativo ao peso corporal no músculo esquelético, condição que se mostrou dependente do tipo de fibra muscular predominante, uma vez que essa condição somente esteve presente no músculo sóleo, sem alteração no músculo EDL. Essas alterações afetam direta e indiretamente o músculo esquelético, e estudos recentes13,14, realizados em ratos com IC e disfunção ventricular esquerda pós-IM, demonstraram que o tecido muscular - quando comparado aos tecidos em que predominam as fibras do tipo IIa e IIb (por exemplo, EDL) - em que predominam as fibras do tipo I (por exemplo, sóleo) apresenta uma sensibilidade maior às alterações, que são características desse modelo experimental e que comprometem o aporte sanguíneo e de oxigênio. Por conseguinte, as alterações avaliadas nas citocinas pró e anti-inflamatórias demonstraram a presença de um estado inflamatório crônico no músculo sóleo, avaliada pela relação IL-10/TNF-α, a qual foi paralela a uma redução na massa do muscular, condição apenas evidenciada no músculo com predominância de fibras do tipo I (sóleo).
Vale destacar ainda que, diferentemente dos modelos supracitados, nossos animais ainda não apresentavam manifestações clínicas claras de IC, sugerindo que, mesmo antes do estabelecimento dessa síndrome, alterações no músculo esquelético já são evidentes em animais com disfunção ventricular esquerda, e, dessa forma, o músculo sóleo pode ser um sítio de produção de mediadores inflamatórios nessa condição.
Em resumo, nossos resultados sugerem um papel de destaque da razão IL-10/ TNF-α, que pode ter um papel aditivo na avaliação da deterioração e progressão do quadro da IC, uma vez que parece estar presente antes do estabelecimento da síndrome clínica da IC. No entanto, mais estudos são necessários para compreensão dos mecanismos moleculares que modulam os eventos supracitados.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado porFapesp nº 05/01445-0 de Marília C. L. Seelaender e 07/52782-1 de Miguel Luiz Batista Júnior.
Este artigo é parte de tese de doutorado de Miguel Luiz Batista Júnior pelo Departamento de Biologia Celular e de Desenvolvimento do TCBI/USP.
Miguel Luiz Batista Júnior Av. Lineu Prestes, 1524 05508-900 - Butantã São Paulo, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 15/04/09; revisado recebido em 14/07/09; aceito em 12/08/09
BACKGROUND: Recent studies show that the expression of inflammatory mediators, such as cytokines, is an important factor for the development and progression of heart failure (HF), especially in the presence of left ventricular dysfunction. These changes have been demonstrated both in the plasma and heart muscle and, more recently, in skeletal muscle of rats and in patients with HF. OBJECTIVE: To investigate the production and expression of tumor necrosis factor-α (TNF) and interleukin-10 (IL-10) in the soleus and the extensor digitorum longus (EDL) muscles of animals with left ventricular dysfunction after myocardial infarction (MI). METHODS: We used male Wistar rats that underwent ligation of the left coronary artery without reperfusion. Four weeks after this procedure, the animals underwent echocardiography and were divided into the following experimental groups: sham operated (sham) and IM. They remained under observation for a further period of 8 weeks. RESULTS: The level of the cytokine TNF-α increased by 26.5% (p <0.05), and its gene expression increased 3 times (p <0.01). The level of IL-10 decreased by 38.2% (p <0.05). Both changes occurred only in the soleus muscle, with no change in the EDL. The decrease (36.5%, p <0.05) in the IL-10/TNF-α ratio was due to both increased tissue levels of TNF-α and decreased tissue levels of IL-10. CONCLUSION: Our results showed significant changes in the IL-10/TNF-α ratio, which may have an additive role in the assessment of deterioration and progression of left ventricular dysfunction post-MI. Furthermore, our study suggests that these changes seem to be related to the muscle fiber type. (Arq Bras Cardiol 2010; 94(3):293-300)
IUniversidade de São Paulo, São Paulo
IIUniversidade Federal de São Paulo
IIIUniversidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes - Brazil
IVDuke Clinical Research Institute, Durham, North Caroline - USA
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Heart failure (HF) is a clinical syndrome of complex pathophysiology that may result from any structural or functional disorder that strikes the heart and consequently undermines the ability of the ventricles to satisfactorily fill and pump blood1,2. The cardinal manifestations of HF are dyspnea and fatigue, which may limit the ability to perform physical activity (exercise intolerance) and culminate in processes leading to pulmonary and systemic congestion and increased peripheral vascular resistance1,3. The main causes of HF of cardiac origin are coronary artery disease, high blood pressure, dilated cardiomyopathy and heart valve diseases1,4.
Currently, the deteriorative changes involved in the progression of HF with left ventricular dysfunction do not depend only on hemodynamic parameters, but also on the processes that culminate in local (heart) and systemic inflammatory activation5-7, which are evidenced by the increase in both gene and protein expression of pro-inflammatory cytokines, such as: tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β), and interleukin 6 (IL-6), among others. These changes have been demonstrated both in plasma and in skeletal and heart muscles of rats and patients with HF. These inflammatory mediators may contribute to the pathophysiology and progression of HF, and also directly influence the onset of clinical manifestations of the HF syndrome, particularly the changes related to the reduction and the functioning of muscle mass8,9.
Therefore, although in recent years the vast majority of studies on HF have focused on pro-inflammatory cytokines, the anti-inflammatory cytokines, especially IL-10, have currently gained prominence and may have an important role in the pathophysiology of HF10,11. In patients with HF, and especially in cases of left ventricular dysfunction, a decrease in plasma IL-10 has been reported and is positively correlated with a decline in the left ventricular ejection fraction.12 Moreover, in animals with post-MI HF, the production ratio of IL-10 and TNF-α (IL-10/TNF-α ratio) has recently been demonstrated as a more accurate indicator of the degree of ventricular dysfunction12.
In fact, in animal models and patients with HF, the distribution of muscle fibers into type I (aerobic), type IIa (aerobic and anaerobic) and type IIb (anaerobic) undergoes changes in its composition. Notably, the skeletal muscle fibers type I are the most affected, because they develop some characteristics similar to the type IIA13, besides a reduction in capillary density3 and a reduction in the maximum activity of the enzyme cytochrome c oxidase9, in comparison to the same muscle fiber type in individuals without pathological changes in skeletal muscle. Similarly, studies in rats with post-MI left ventricular dysfunction have reproduced this behavior14, showing thereby that the type I fibers in skeletal muscle seem to be the most affected in this condition.
Furthermore, these changes have been correlated to the increase in gene expression and production of cytokines (TNF-α, IL-1β, and IL-6) in the quadriceps muscle of humans15 and animals7. Although the deleterious changes occur predominantly in type I fibers, recent studies have shown the presence of a chronic inflammatory condition in that tissue. However, to date, no studies have evaluated the production of these cytokines in the different muscle fiber types, a fact that becomes even more significant when we consider that this tissue may be an important systemic "supplier" of pro-inflammatory cytokines in the presence of left ventricular dysfunction. In turn, the analysis of the gene expression and the consequent production of these cytokines may be a more accurate and/or additional indicator of the presence of changed chronic inflammatory markers in ventricular dysfunction.
On this basis, we proposed to study the relationship between the levels of pro-TNF-α cytokines and anti-inflammatory (IL-10) cytokines in skeletal muscle in an experimental model in rats with post-MI left ventricular dysfunction. Still, we used the soleus muscle (fiber type I, predominantly) and the extensor digitorum longus (EDL) muscle (fiber type IIb, predominantly) to compare the profiles of these cytokines in different muscle types.
The experimental procedures were in accordance with the ethical principles for animal experimentation adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation (Cobea), and the protocol for the use of animals in experimentation (009/2005) was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (Ceea) at a meeting held on February 17th, 2005.
We used male Wistar rats aged 8 weeks. During the experimental period, they were kept in collective cages for 5 mice, in a vivarium with a light/dark cycle of 12/12 hours, with the light phase starting at 7 am, in the Department of Cell Biology and Development of the Institute of Biomedical Sciences of the University of São Paulo. Room temperature was maintained at 25 ± 2° C. Humidity was maintained at 60 ± 5%. All groups received a balanced commercial diet (Nuvilab CR1 - Nutrivital Nutrients Ltda.) and water
This surgical procedure was performed using the techniques of the exercise and cellular physiology laboratory (KCM or MAC). The animals were anesthetized with a solution of Ketalar ® (80 mg/kg) + Rompun ® (12 mg/kg). After intubation, the animals received mechanical ventilation with a Harvard ventilator, model 683 (frequency of 90 m/min, and tidal volume of 2.0 ml). After shaving the chest, a left thoracotomy was performed in the intercostal space of the apex beat, and the heart was quickly exposed. The anterior interventricular branch of the left coronary artery was identified and ligated between the edges of the left auricular appendage and the pulmonary artery with 6-0 prolene sutures. The lungs were hyperinflated, and the chest wall was closed with a previously performed purse-string suture. For the sham operation, we used the same surgical procedure but without the disruption of the pericardium and the ligation of the left anterior descending coronary artery.
After the coronary artery ligation, the animals were confined to the vivarium for 3 more weeks. By the fourth week, an echodopplercardiogram (ECHO) was performed to confirm the presence of infarction, to evaluate its size, and to conduct echocardiographic measurements, including left ventricular ejection fraction.
During 4 and 12 weeks after MI, the animals were anesthetized with a solution of Ketalar ® (50 mg/kg) + Rompun ® (10 mg/kg) intraperitoneally for echocardiography.
The echocardiography was performed in an HP Sonos 5500 (Hewlett Packard, Andover, MA, USA) using a transducer fundamental frequency of 12 MHz, to obtain images at 2 cm depth. After anesthesia and using the same procedure, the animals were placed in the left lateral position, and three electrodes were placed in their legs for the electrocardiogram.
Cross-sectional scans of the left ventricle were recorded on videotape for later analysis. We used the left paraesternal (longitudinal and transverse) and the apical (four and two chambers) views. The linear measurements taken from images obtained by M-mode were: LV diameters at end-diastole (LVDD) and systole (LVSD); the anteroposterior diameter of the left atrium (LA); and the diameter of the anterior wall of the left ventricle in diastole (Paved). The infarction size (% MI), assessed by measuring the length of the akinetic and/or hypokinetic (AHR) regions of the ventricular walls, was expressed as a percentage of the total perimeter of the endocardial contour (EP) in three transverse LV views (level of the edges of the leaflets of the mitral valve, papillary muscles, and apical region), according to earlier patterning characterized by the group of Professor Paul J. F. Tucci16,17, using the formula: MI (%) = (AHR / EP) x 100.
The cardiac function was evaluated by the ejection fraction (EF). The ventricular diastolic (DV) and systolic (SV) volumes were obtained using the Simpson biplane (apical, four and two chambers) method, and the EF was calculated by the formula EF = (DV-SV/DV) x 100. The diastolic function was assessed using indices derived from the velocity curve of the mitral diastolic flow obtained by the pulsed Doppler technique. We obtained the velocity curve of the mitral diastolic flow from the apical four-chamber view, placing the sample volume close to the ventricular face of the mitral valve. We determined the E wave, the A wave, and the E/A ratio. At the end of the ECHO assessment, the animals in which the MI was greater than 40% of the LV were selected for the group of myocardial infarction (MI). After 12 weeks, the animals in the MI group were reevaluated as to the aforementioned parameters.
After the echocardiography, the animals were divided into two experimental groups: sham operated (sham, n = 13) and myocardial infarction (MI, n=17). The sham group animals underwent all surgical procedures except the coronary artery ligation. After this, the animals were kept for 8 weeks under observation. Following this period, the animals were sacrificed by decapitation without anesthesia.
Immediately after sacrifice, tissues and organs (liver, lungs, heart, soleus and extensor digitorum longus-EDL muscles) were removed, weighed, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80° C for subsequent measurements.
For measurement of TNF-α (DY510) and IL-10 (DY522) cytokines, we used the enzyme-linked immunoabsorbent assay (DuoSet ELISA) capture method (R&D System, Inc., Minneapolis, USA). This assay was performed on homogenized samples from the different experimental groups, according to the standards described by the manufacturer. The results are expressed in pg/μg of total protein in the assessed tissues according to the colorimetric method described by Bradford18.
To isolate total RNA from the EDL and the soleus muscles (right hindpaw), samples weighing between 0.2 and 0.5g were homogenized in TRIZOL® Reagent, according to the standards described by the manufacturer19. The RNA samples were transcribed to DNA in a thermocycler (Techne, Cambridge, UK). To synthesize cDNA, we used 2μg of total RNA from each sample. The samples were incubated with 0.5 μg/ml of oligo DT12-18 (Invitrogen, USA) at 65° C, for 5 minutes, to obtain the first tape of cDNA.
Primers were synthesized by Integrated DNA Technologies (Prodimol Biotecnologia S/A). The sequence was determined using the software Primer 3, available at
The gene expression was quantified by real-time PCR (Higuchi et al21) using a
• soleus muscle: TNF-α and IL-10 (200 nM) and 18S (300 nM).
• EDL - TNF-α: IL-10 (200 nM) and 18S (200 nM).
Data analysis was performed using the software SigmaStat (version 3.1, SigmaStat, Systat, Point Richmond, CA). The mean and standard error of the mean (SEM) were calculated for all variables. After the trial period, the values of the different analyses of the results were performed by unpaired Student's t-test. The level of significance used in all tests was less than 5%, i.e., p <0.05.
The postoperative mortality was 23.8% (n = 5 animals that evolved to death during the 24 hours after surgery) in the MI group, and 13.3% (n = 2) in the sham group. The total weight of the lungs, liver, soleus and EDL, in absolute value, was not different in any of the groups evaluated (
In the 17 animals with MI, we observed segmental contractile alterations in ventricular pathological studies, 4 weeks after surgery (
The MI group animals showed a significant 26.5% increase (p <0.05) in the production of TNF-α in the soleus muscle when compared to the sham group (
The MI group animals showed a significant 38.2% decrease (p <0.05) of production of IL-10 in the soleus muscle, when compared to the sham-S group (
The MI group animals showed a significant 36.5% decrease (p <0.05) in the IL-10/TNF-α ratio when compared to the sham group. The chart 3B data show the participation of each cytokine in the IL-10/TNF-α ratio.
In this study, the concentration of pro-inflammatory cytokine (TNF-α) and its gene expression were increased in the soleus muscle of animals with ventricular dysfunction after MI. This was observed only in the soleus muscle, and no change was detected in the EDL muscle. Furthermore, these changes were accompanied by a reduction in the concentration of anti-inflammatory cytokine (IL-10) levels, also observed only in the soleus muscle, in turn, the IL-10/TNF-α ratio was altered, suggesting the predominance of TNF-α to the detriment of IL-10 in that tissue.
The ligation of the left anterior descending coronary artery was used as an experimental model of MI in animals, by the induction of myocardial ischemia, with or without reperfusion7,22,23. However, data on left ventricular function are insufficient for the clinical characterization of HF, because this syndrome is defined by the presence of hemodynamic abnormalities, fluid retention (congestion), and physical exercise intolerance24,25. Although our study showed data referring to the congestive picture, such as the dry weight/ wet weight ratio of liver and lungs, which suggests the presence of pulmonary edema and hepatic congestion, we chose to classify the MI group as animals with severe ventricular post-MI, and not with HF. It is possible that most of the animals in the MI group also had HF clinical changes, but this has not been studied in this paper.
Initially, it was assumed that the production of TNF-α was performed by monocytes and macrophages exclusively when appropriately stimulated26. Recently, TNF-α gene and protein expression in skeletal muscle has been characterized in humans27, in a study that showed for the first time the presence of this cytokine in the absence of infiltrating monocytes and macrophages. This indicated that the skeletal muscle fiber itself can produce it, and so it could act in an autocrine and paracrine manner, in sufficient quantity to mediate a series of morphological and functional changes in the tissue3,28.
In our study, rats with left ventricular dysfunction post-MI showed an increased content of pro-inflammatory cytokine TNF-α, which was only evident in the soleus muscle, with no change in the EDL muscle (not detected by ELISA). This condition was evidenced by the increase in TNF-α gene expression, suggesting that the increase in the TNF-α protein content may have been due to increased levels of mRNA. This result is consistent with another study7 that used the same experimental model and demonstrated an increase in both gene expression and muscle levels of TNF-α. However, these parameters were assessed in the quadriceps muscle, which is mixed with regard to its muscle fiber type.
Therefore, despite the fact that an increase in inflammatory mediators (TNF-α, IL-1 β, IL-6) in skeletal muscle is well characterized both in patients with HF15 and in rats with heart failure and left ventricular dysfunction post-MI7, both tests were performed in the quadriceps muscle, and little is known about what type of muscle fiber is more affected in HF. This becomes even more evident when one takes into account that, in addition to the fact that these degenerative changes in skeletal muscle have been related to the presence of these markers, most studies have also shown that, in HF, the most affected fiber, both morphologically and functionally, is the type I fiber3. Thus, we showed, for the first time, that this condition appears to be specific to muscle tissue with a predominance of type I fibers. As we did not separate the total homogenate in a soluble fraction bound to the cell membrane, we could not infer that the protein assessed was the one which was produced exclusively by the tissue evaluated.
Plasma levels of these cytokines in patients with HF have been related to both prognosis and severity of the disease, a fact which has been shown to be even more evident in patients with more advanced HF (functional class IV, NYHA)6,29. Therefore, it has been suggested that this increase results from a peripheral inflammatory process, which would ideally be initiated in skeletal muscle, because of reduced blood flow and a consequent increase in reactive oxygen species5. This hypothesis has gained consistency, as studies conducted both in animals7,12,23,30,31 and humans2,32,33 have shown that the increase in local inflammatory milieu occurs independently of plasma levels changes, especially in patients in functional classes II and III (NYHA). Therefore, the increased gene and protein expression of these cytokines, even without plasma levels changes, confirms the results obtained by studies that suggest that local inflammation precedes the increase in plasma and may be a more accurate indicator with respect to the progression of HF.
The effects of IL-10 in vivo have been observed in models of inflammation, autoimmunity, tolerance and parasitic infections in animals34. In mice, IL-10 attenuated the deleterious effects induced by lipopolysaccharide (LPS) and SEB (staphylococcal enterotoxin B). Furthermore, these effects were correlated with decreased TNF-α circulating levels. In macrophages cultured in the presence of LPS, besides the increase in production of proinflammatory cytokines, this condition is also followed by an increase in IL-10, and TNF-α is an important inducer of IL-10 gene expression and production34,35. Therefore, IL-10 is the main anti-inflammatory cytokine and plays an important role in modulating the production of TNF-α.
In rats with left ventricular dysfunction post-MI, IL-10 tissue levels were reduced only in the soleus muscle. In these animals, the gene expression was increased in the same tissue, showing that perhaps the decrease in its production is not related to changes in mRNA expression, at least in this aspect. This suggests that the effects of this experimental model in the concentration of IL-10 may have been mediated in a post-transcriptional level, like the production of IL-10 transcriptional regulatory elements, such as enhancers and/or mechanisms of post-transcriptional control. The last possibility is described in T cell clones, which express IL-10, with no detectable changes in mRNA levels36. Therefore, a combination of post-transcriptional mechanisms and ubiquitination for the expression of IL-10 may have a crucial role for this cytokine37. Furthermore, although TNF-α can induce IL-10 gene expression34 and consequently its protein expression, this effect seems to be dependent on the intensity of the inflammatory condition, and thus the increase in the IL-10 gene expression could have occurred because of a decrease in protein production (mRNA/protein ratio) toward the restoration of a balanced condition.
Therefore, the new fact we present is that there was an increase not only in gene expression, but also in protein content, in the case of TNF-α, and a decrease in IL-10 protein, suggesting, in this condition, a tendency towards an imbalance in their production. This condition may tend to the predominance of a pro-inflammatory milieu at the expense of the anti-inflammatory milieu, especially through an increased production of TNF-α and a decreased production of IL-10. This association was observed by Stumpf et al10 who used the IL-10/TNF-α ratio to characterize the pro/anti-inflammatory "balance". In this study, patients with HF (NYHA functional class III/IV) showed increased levels of TNF-α and decreased levels of IL-10 when compared with control subjects (without IC) of the same age.
Although the molecular mechanisms are not well characterized, studies using IL-10 as treatment (rhIL-10) in humans and in knocked out mice (IL-10-/-) stressed the importance of this cytokine in reversing the alterations caused by local inflammation, especially those mediated by TNF-α10. This result is consistent with ours, since the IL-10/TNF-α ratio decreased because of an increase in TNF-α and, especially, a decrease in IL-10, suggesting an important role of IL - 10 in the local inflammatory "control" in the soleus muscle.
In patients with HF, muscle mass loss or atrophy of begins in the early stages of HF8 development, and this is more specifically related to intrinsic changes in skeletal muscle3,38 than in those resulting from physical inactivity (a more determining factor in women). Recently, it has been shown that, in this condition, there is an immune activation, especially by inflammatory mediators, which may contribute to the development of this condition3,7,8,39. In rats with heart failure and left ventricular dysfunction after MI, this condition has been reproduced both by the decrease in cross-sectional area and by increased production of proinflammatory cytokines (quadriceps muscle)7. Similarly, our study showed a skeletal muscle weight reduction relative to body weight, a condition that proved to be dependent on the predominant type of muscle fiber, since it was present only in the soleus muscle, with no change in the EDL muscle. These changes directly and indirectly affect skeletal muscle, and recent studies13,14 in rats with heart failure and left ventricular dysfunction after MI showed that muscle tissues with predominantly type I fibers (e.g., soleus muscle) may be more sensitive to changes that are characteristic of this experimental model and that compromise the blood and oxygen supply, when compared to tissues in which type IIa and IIb fibers are predominant (e.g., EDL muscle). Therefore, the changes found in proinflammatory and anti-inflammatory cytokines have demonstrated the presence of a chronic inflammatory state in the soleus muscle, as assessed by the IL-10/TNF-α ratio, which was paralleled by a reduction in muscle mass, a condition which was only observed in muscle tissue with a predominance of type I fibers (soleus).
Also noteworthy is that, unlike the above, our animals still had no clear clinical manifestations of HF, suggesting that even before the establishment of this syndrome, changes in skeletal muscle are evident in animals with left ventricular dysfunction, and thus the soleus muscle may be a site of production of inflammatory mediators in this condition.
In summary, our results suggest an important role of the IL-10/TNF-α ratio, which may have an additive role in assessing the damage and progression of HF, since it seems to be present even before the establishment of the clinical HF syndrome. However, more studies are needed for the understanding of the molecular mechanisms that modulate the events mentioned above.