FUNDAMENTO: O gene ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1 (ENPP1) é um gene candidato à resistência insulínica. A resistência à insulina é um componente importante da síndrome metabólica e tem sido implicada no desenvolvimento de doença cardíaca isquêmica (DCI). OBJETIVO: Avaliar a associação entre o polimorfismo K121Q do gene ENPP1 e a presença da DCI em pacientes caucasianos com diabete melito (DM) tipo 2. MÉTODOS: Estudo transversal foi realizado em pacientes com DM tipo 2 (n=573; 50,6% homens; idade 59,5±10,4 anos). DCI foi definida pela presença de angina ou infarto agudo do miocárdio pelo questionário cardiovascular da Organização Mundial da Saúde e/ou alterações compatíveis no ECG (código Minnesota) ou cintilografia miocárdica. O polimorfismo K121Q foi genotipado através da técnica de PCR e digestão enzimática. RESULTADOS: DCI esteve presente em 209 (36,5%) pacientes. A frequência dos genótipos KK, KQ e QQ entre os pacientes com DCI foi 60,8%, 34,4% e 4,8%, semelhante à distribuição dos genótipos entre os pacientes sem DCI (64,0%, 32,7% e 3,3%, P = 0,574). Não se observou diferença nas características clínicas ou laboratoriais entre os três genótipos, nem em relação à presença de síndrome metabólica. CONCLUSÃO: Nenhuma associação foi encontrada entre o polimorfismo K121A do gene ENPP1 e a presença de DCI ou características fenotípicas de resistência insulínica.
ARTIGO ORIGINAL
BIOLOGIA MOLECULAR
IHospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS - Brasil
IIUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS - Brasil
IIIUniversidade Luterana do Brasil, Canoas, RS - Brasil
IVHospital São Vicente de Paula, Rio Grande, RS - Brasil
A resistência à ação da insulina é um dos principais mecanismos envolvidos na patogênese tanto do diabete melito (DM) tipo 2 quanto da Síndrome Metabólica (SM)1. Além disso, a resistência à ação da insulina é também associada a fenótipos envolvidos na definição de SM, tais como obesidade central, hipertensão arterial, dislipidemia e tolerância diminuída à glicose. O estado de resistência à ação da insulina é mais frequente em indivíduos idosos, obesos e sedentários, e sua presença é provavelmente o resultado da interação entre o ambiente e fatores genéticos.
A influência genética na ação da insulina foi descrita em estudos de famílias. Reinhard e cols.2 avaliaram o impacto do diagnóstico de SM no risco de doenças cardiovasculares em famílias alemãs com grande base genética para doença cardíaca isquêmica (DCI). Os autores mostraram que a SM é um preditor independente de morbidade e mortalidade cardiovascular, especialmente em pacientes jovens com histórico familiar de DCI precoce.
O gene ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1 (ENPP1) é proeminente entre os possíveis candidatos para o desenvolvimento de SM, pois seu polimorfismo K121Q parece estar associado à ação da insulina3-5. O ENPP1 codifica uma glicoproteína de membrana de classe 2 que influencia negativamente a sensibilidade à ação da insulina inibindo o sinal do receptor de insulina tirosina quinase. A variante 121Q (alelo de risco) se liga ao receptor de insulina tirosina quinase com mais afinidade se comparado com seu alelo selvagem 121K, resultando em menor autofosforilação do receptor. Em um estudo multicêntrico, a variante 121Q foi associada com maior risco de desenvolvimento precoce de DM tipo 2 e infarto agudo do miocárdio se comparado ao alelo 121K6. Em uma meta-análise recente de 15.801 pacientes com DM do tipo 2 e 26.241 indivíduos-controle, o alelo 121Q foi associado com um crescente risco de DM do tipo 2, que foi modulado pelo índice de massa corporal (IMC)7. No entanto, o papel preciso do polimorfismo K121Q no desenvolvimento de complicações vasculares da DM do tipo 2, especialmente em relação à doença cardiovascular aterosclerótica, ainda não foi plenamente analisado.
Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a associação da variante 121Q do gene ENPP1 em pacientes brancos com DM do tipo 2 com a presença de DCI, SM e fenótipos relacionados.
Foi realizado um estudo transversal com uma amostra composta por 573 pacientes brancos com DM tipo 28 em acompanhamento ambulatorial no Serviço de Endocrinologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil. Estes pacientes são participantes de um estudo que se iniciou em 2002 e está sendo conduzido no estado do Rio Grande do Sul objetivando estudar DM e suas complicações crônicas. Além do Serviço de Endocrinologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, outros três hospitais participaram do Projeto, conforme a seguir: Grupo Hospitalar Nossa Senhora da Conceição, Hospital São Vicente de Paula e Hospital Universitário de Rio Grande.
Os pacientes foram submetidos a uma avaliação padronizada descrita previamente9, que incluía: idade, a duração da DM e medicamentos em uso no momento. Exame físico e testes laboratoriais foram realizados para avaliar as complicações crônicas do DM e os fatores de risco cardiovascular. O peso e a altura foram medidos com os pacientes usando roupas leves e sem sapatos. O IMC foi calculado pela relação peso (kg)/altura2 (m). A circunferência da cintura foi medida na altura da cicatriz umbilical10. A hipertensão arterial foi definida como a pressão de
A DCI foi diagnosticada na presença de angina ou possível infarto do miocárdio de acordo com o questionário cardiovascular da Organização Mundial de Saúde (OMS) e/ou mudanças eletrocardiográficas compatíveis (Código de Minnesota: padrões Q e QS [1.1-2, 1.3]; junção e infradesnivelamento do segmento S-T [J] [4.1-4]; itens da onda T [5.1-3], e bloqueio completo do ramo esquerdo [7.1])12 e/ou anormalidades perfusionais (fixas ou variáveis) em cintilografia do miocárdio em repouso ou após uso de dipiridamol. Estas ferramentas de diagnóstico para isquemia do miocárdio em pacientes com DM tipo 2 foram previamente avaliadas em um estudo prospectivo13.
O diagnóstico de vasculopatia periférica foi baseado na presença de claudicação intermitente (questionário cardiovascular da OMS) ou ausência de pulso nos membros inferiores durante exame físico.
A retinopatia diabética (RD) foi avaliada por um oftamologista experiente a partir de fundoscopia direta sob midríase. A RD foi classificada como ausente e não-proliferativa (RDNP) (microaneurismas, exsudatos duros e hemorragia) ou RD proliferativa (RDP) (presença de neovasos e/ou tecido fibroso em cavidade vítrea). Nefropatia diabética (ND) foi definida pela taxa de excreção urinária de albumina (EUA) na ausência de infecção urinária ou outras anormalidades do trato urinário em pelo menos duas medições isoladas e foi classificada como microalbuminuria (EUA 20-199 μg/min) ou macroalbuminuria (EUA
SM foi definida de acordo com os critérios do Programa Nacional de Educação sobre Colesterol - Painel de Tratamento de Adultos III como a presença de dois ou mais dos seguintes fatores além de DM: obesidade abdominal (circunferência abdominal >102 cm em homens e >88 cm em mulheres); altos níveis de triglicerídeos no soro (
A EUA foi medida usando a técnica de imunoturbidimetria em amostra de urina estéril de 24h, sem o uso de inibidores da enzima conversora ou bloqueadores dos receptores de angiotensina. Níveis de glicose de jejum foram determinados pelo método da glicose-oxidase; creatinina pela reação de Jaffe, e HbA1c, por cromatografia líquida de alta performance (HPLC; Merck-Hitachi 9100; valores de referência: 4-6%); os níveis de triglicerídeos e colesterol foram medidos usando o método enzimático, e o LDL foi calculado pela equação de Friedewald. A insulina no soro foi medida por radio imuno ensaio (Elecsys R Systems 1010/2010/ modular analysis E170 - ROCHE) em uma amostra de pacientes que não estavam usando insulina e que possuíam creatinina no soro <1,3 mg/dl. A resistência à insulina foi estimada pelo Modelo de Avaliação da Homeostase {Índice
Os indivíduos foram genotipados para polimorfismo ENPP1 K121Q conforme descrito anteriormente17. O DNA foi isolado dos linfócitos usando procedimentos padrão18. Todas as RCPs foram realizadas em um volume final de 25 contendo 50 ng de DNA genômico, 20 mmol/l Tris-Cl, (pH 8.4), 50 mmol/l KCl, 1.5 mmol/l MgCl2, 0.2 mmol/l dNTPs, 1 unidade de
O teste
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, e todos os pacientes assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
A idade média dos 573 pacientes incluídos foi de 59,5 ± 10,4 anos com um tempo de duração de DM conhecido de 11,7 ± 9,2 anos e IMC de 28,9 ± 5,2 kg/m2. As mulheres somavam 49,4% (n = 283) da amostra. A DCI estava presente em 209 (36,5%) pacientes. As características clínicas e laboratoriais dos pacientes, divididos de acordo com a presença de DCI são descritas na
Pacientes com DCI apresentaram maior duração de DM e maior frequência de fumantes (P = 0,010) (
A presença de DCI foi mais frequente entre aqueles com qualquer grau de RD (RDNP/RDP) (44,2%
Os genótipos avaliados estavam em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (P >0,05), e a frequência do alelo de risco (alelo Q) era de 20,5%. As características clínicas e laboratoriais dos pacientes divididos de acordo com os diferentes genótipos não foram diferentes entre os três grupos (
Quando os pacientes foram divididos de acordo com a presença de DCI, a distribuição de genótipos KK, KQ e QQ foi de 60,8%, 34,4% e 4,8%, não diferente da distribuição genotípica observada no grupo sem DCI (64%, 32,7% e 3,3%, P = 0,574) (
Nesta amostra de pacientes brancos brasileiros com DM tipo 2, o alelo 121Q do gene ENPP1 não foi associado à presença de DCI, nem com características associadas à resistência à insulina, incluindo IMC, obesidade abdominal, hipertensão arterial, um pior perfil lipídico, controle glicêmico ou presença de SM. A ausência de uma associação deste polimorfismo a características de resistência à ação da insulina merece alguns comentários. Primeiramente, esta associação pode não existir, e as relações descritas em outros estudos são na verdade espúrias devido a um erro de tipo 2. Se esta hipótese é rejeitada, a relevância de uma associação positiva deveria ser discutida. Para detectar uma diferença significativa na frequência do alelo Q em pacientes com (22%) e sem DCI (19,6%) (α = 0,05 e β = 80%), seria necessário avaliar em torno de 4.500 pacientes. Mesmo que isso fosse significativamente diferente, sua aplicabilidade seria questionada por conta de seu pequeno efeito e dependeria de outros polimorfismos ou interações de genes. Uma explicação mais plausível é que a expressão do gene variante depende do grupo étnico que está sendo estudado. Na verdade, mesmo entre Europeus Caucasianos a expressão fenotípica deste polimorfismo varia. A relação entre o polimorfismo K121Q e a sensibilidade à ação da insulina foi demonstrada em indivíduos Caucasianos19-21, mas não em todos os estudos20,22,23. A ausência do efeito do alelo de risco demonstrado em alguns grupos pode ser o resultado de diferenças na base genética destas populações, ou pode ser devido ao fato que o polimorfismo está em desequilíbrio com outras variantes genéticas não identificadas.
A associação do alelo 121Q com o risco e o agravamento de DCI foi avaliada recentemente em um estudo caso-controle que incluiu indivíduos da Itália e dos Estados Unidos6. Naquele estudo, os autores não demonstraram uma associação significativa entre o polimorfismo K121Q e a presença de DCI em pacientes com DM tipo 2. No entanto, os eventos isquêmicos ocorreram em idade mais precoce no grupo de pacientes com alelo Q, mesmo com análise ajustada para sexo, IMC, fumo, hipertensão e local de recrutamento (P=0,04). O desenho transversal do presente estudo impede qualquer análise da influência deste polimorfismo no curso da DCI.
Uma possível limitação deste estudo é que apenas um polimorfismo do gene foi avaliado. Isso possibilita a exclusão da ideia de que este polimorfismo está ligado a DCI, mas não o gene ENPP1
Em conclusão, nesta amostra de pacientes Brasileiros brancos com DM tipo 2, o polimorfismo K121Q do gene ENPP1 não foi associado à presença de DCI nem com fenótipos relacionados à resistência à insulina ou SM.
Agradecemos ao Projeto de Núcleos de Excelência do Ministério de Ciência e Tecnologia (PRONEX), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e o Fundo de Incentivo à Pesquisa (FIPE) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre pelo apoio financeiro.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi parcialmente financiado por CNPq, FIPE - HCPA.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Correspondência: Luis Henrique Canani Av Montenegro 216/703, Petrópolis 90460-160, Porto Alegre, RS - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 29/07/08; revisado recebido em 02/09/08; aceito em 11/09/08.
BACKGROUND: The ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) gene is a candidate gene for insulin resistance. Insulin resistance is a major component of metabolic syndrome (MetS) and has been implicated in ischemic heart disease (IHD). OBJECTIVE: To evaluate the association between the K121Q polymorphism of the ENPP1 gene and IHD in white patients with type 2 diabetes mellitus (DM). METHODS: A cross-sectional study was performed in type 2 DM patients (n = 573, 50.6% males, age 59.5±10.4 years). IHD was defined by the presence of angina or myocardial infarction according to the Worth Health Organization cardiovascular questionnaire and/or compatible electrocardiographic (Minnesota Code), or perfusional abnormalities in myocardial scintigraphy. The K121Q polymorphism of ENPP1 gene was genotyped using PCR-based methods and restriction enzyme digestion. RESULTS: IHD was present in 209 (36.5%) patients. The distribution of KK, KQ and QQ genotypes among patients with IHD was 60.8%, 34.4% and 4.8%, not different from the genotype distribution in the group without IHD (64%, 32.7% and 3.3%, P=0.574). No difference was found in the clinical and laboratory characteristics between the three genotypes, neither regarding the prevalence of Metabolic Syndrome. CONCLUSION: No association was found between polymorphism K121A of ENPP1 gene and the presence of IHD.
IHospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS - Brazil
IIUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS - Brazil
IIIUniversidade Luterana do Brasil, Canoas, RS - Brazil
IVHospital São Vicente de Paula, Rio Grande, RS - Brazil
Mailing address
Insulin resistance is one of the main mechanisms implicated in the pathogenesis of both type 2 diabetes mellitus (DM) and metabolic syndrome (MetS)1. Furthermore, insulin resistance is also associated with the phenotypes involved in MetS definition, such as central obesity, arterial hypertension, dyslipidemia and impaired glucose tolerance. The state of resistance to the action of insulin is more frequent in older, obese, sedentary individuals, and its presence is probably the result of the interaction of environmental and genetic factors.
Genetic influence on insulin action was described in family studies. Reinhard et al2 evaluated the impact of the diagnosis of MetS on the risk of cardiovascular diseases in German families with a major genetic base for ischemic heart disease (IHD). The authors showed that MetS is an independent predictor of cardiovascular morbidity and mortality, especially in young patients with a family history of early-onset IHD.
The ecto-nucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase 1 (ENPP1) gene is outstanding among the possible candidate genes for the development of MetS, since its K121Q polymorphism appears to be associated with insulin resistance3-5. ENPP1 encodes a class 2 membrane glucoprotein which negatively influences sensitivity to insulin action by inhibiting the signal of the insulin tyrosine-kinase receptor. The variant 121Q (risk allele) binds to the insulin receptor with greater affinity compared with its wild allele 121K, resulting in less autophosphorylation of the receptor. In a multicentric study, variant 121Q was associated with a higher risk of early development of type 2 DM and acute myocardial infarction compared to the 121K allele6. In a recent meta-analysis of 15,801 patients with type 2 DM and 26,241 control subjects, the 121Q allele was associated with an increased risk for type 2 DM, which was modulated by body mass index (BMI)7. However, the precise role of polymorphism K121Q in the development of vascular complications of type 2 DM, especially atherosclerotic cardiac disease, has not yet been fully analyzed.
Thus, the purpose of this study was to analyze the association of variant 121Q of the gene ENPP1 in white patients with type 2 DM with the presence of IHD, MetS and related phenotypes.
A cross-sectional study was performed with 573 white type 2 DM patients8 seen at the outpatient clinic of the Endocrinology Division of
Patients were submitted to a previously described standardized evaluation9 that includes: age, DM duration, and current medications in use. Physical examination and laboratory tests were performed in order to evaluate diabetic chronic complications and cardiovascular risk factors. Weight and height were measured with patients wearing light clothes and without shoes on. BMI was calculated with the weight (kg)/height2 (m) ratio. Waist was measured at the level of the umbilical scar10. Arterial hypertension was defined as blood pressure
IHD was diagnosed in the presence of angina or possible myocardial infarction according to the Word Health Organization (WHO) cardiovascular questionnaire and/or compatible electrocardiographic changes (Minnesota Code: Q and QS [1.1-2, 1.3] patterns; S-T [J] junction and segment depression [4.1-4]; items of the T [5.1-3] wave, and complete left bundle block [7.1])12 and/or perfusional abnormalities (fixed or variable) in myocardial scintigraphy at rest and after dipyridamol. These diagnostic tools for myocardial ischemia in type 2 DM patients were previously evaluated in a prospective study13.
The diagnosis of peripheral vasculopathy was based on the presence of intermitted claudication (WHO cardiovascular questionnaire) and/or absence of lower limb pulses at physical examination.
Diabetic retinopathy (DR) was evaluated by an experienced ophthalmologist by direct fundoscopy on mydriasis. DR was classified as absent, non-proliferative DR (NPDR) (microaneurisms, hard exudates and hemorrhage) or proliferative DR (PDR) (presence of neovessels and/or fibrous tissue in the vitreous cavity). Diabetic nephropathy (DN) was defined by an increased urinary albumin excretion (UAE) in the absence of urinary infection or other renal abnormalities in at least two isolated measurements, and it was classified as microalbuminuria (UAE 20-199 μg/min) or macroalbuminuria (UAE
MetS was defined according to the criteria of the National Cholesterol Education Program - Adult Treatment Panel III as the presence of two or more of the following besides DM: abdominal obesity (waist circumference >102 cm in men and >88 cm in women); high serum triglycerides (
UAE was measured using the immunoturbidimetry technique in sterile timed 24-h urine samples, without the use of converting enzyme inhibitors or angiotensin receptor blockers. Fasting plasma glucose levels were determined by the glucose-oxidase method; creatinine by the Jaffe reaction, and HbA1c, by high performance liquid chromatography (HPLC; Merck-Hitachi 9100; reference values: 4-6%); triglycerides and cholesterol levels were measured using the enzymatic method, and LDL was calculated by the Friedewald equation. Serum insulin was measured by radioimmunoassay (Elecsys R Systems 1010/2010/ modular analysis E170 - ROCHE) in a sample of patients who were not using insulin and who had serum creatinine <1.3 mg/dl. Insulin resistance was estimated by Homeostasis Model Assessment {HOMA-IR = [fasting insulin (mUI/ml) X fasting plasma glucose (mmol/l)] / 22.5)}, as recently validated16.
Individuals were genotyped for polymorphism ENPP1 K121Q as previously described17. DNA was isolated from lymphocytes using standard procedures18. All the PCRs were run in a final 25 μl volume containing 50 ng of genomic DNA, 20 mmol/l Tris-Cl, (pH 8.4), 50 mmol/l KCl, 1.5 mmol/l MgCl2, 0.2 mmol/l dNTPs, 1 unit of
Student's t test for independent samples or Mann-Whitney U test were used to compare the characteristics of patients with and without IHD as appropriate. The chi-square test and One-Way ANOVA were used to compare the clinical and laboratory characteristics of patients divided according to genotypes. The Tukey test was used for multiple post hoc comparisons. Hardy-Weinberg Equilibrium was calculated using allele frequencies and the chi-square test. Variables with a non-normal distribution were submitted to logarithmic transformation. The continuous variables were described as mean ± standard deviation, or median and range, and the categorical variables were expressed as number of cases and percentage. A value of P <0.05 (two-tailed) was considered significant. The analyses were performed using the Statistical Package for the Social Science program (SPSS, version 14.0 for Windows).
The study protocol was approved by the Ethical Committee of the
The mean age of the 573 patients included was 59.5 ± 10.4 years with a known duration of DM of 11.7 ± 9.2 years and BMI of 28.9 ± 5.2 kg/m2. Women were 49.4% (n = 283) of the sample. IHD was present in 209 (36.5%) of the patients. The clinical and laboratory characteristics of the patients, divided according to the presence of IHD, are shown in
Patients with IHD had longer DM duration and the frequency of smokers was higher (P = 0.010) (
The presence of IHD was more frequent among those with any degree of DR (NPDR/PDR) (44.2%
The genotypes evaluated were in Hardy-Weinberg Equilibrium (P >0.05), and the frequency of the risk allele (allele Q) was 20.5%. The clinical and laboratory characteristics of patients divided according to the different genotypes were not different among the three groups (
When patients were divided according to the presence of IHD, the distribution of KK, KQ and QQ genotypes was 60.8%, 34.4% and 4.8%, not different from the genotype distribution observed in the group without IHD (64%, 32.7% and 3.3%, P = 0.574) (
In this study of white Brazilian patients with type 2 DM, allele 121Q of the gene ENPP1 was not associated with the presence of IHD, neither with characteristics associated with insulin resistance, including BMI, abdominal obesity, high blood pressure, worse lipid profile, glycemic control or presence of MetS. The absence of an association of this polymorphism with insulin resistance characteristics deserves some comments. First, this association may not exist, and relations described in other studies are in fact spurious due to a type 2 error. If this hypothesis is rejected, the relevance of a positive association should be discussed. In order to detect a significant difference in the frequency of Q allele in patients with (22%) and without IHD (19.6%) (α = 0.05 and β = 80%) it would be necessary to evaluate about 4500 patients. Even if this would be significantly different, its applicability would be questionable because of its small effect and might depend on other polymorphisms or gene interactions. A more plausible explanation is that the expression of this gene variant depends on the ethnic group that is being studied. Actually, even among European Caucasians, the phenotypic expression of this polymorphism varies. Indeed, the relationship between polymorphism K121Q and sensitivity to insulin action was shown in Caucasian individuals19-21, but not in all of them20,22,23. The absence of the risk allele effect shown in some groups may be the result of differences at the genetic base of these populations, or it may be due to the fact that this polymorphism is in linked disequilibrium with other unidentified gene variants.
The association of allele 121Q with risk and severity of IHD was evaluated recently in a case-control study, which included individuals from Italy and the United States6. In that study, the authors did not show a significant association between polymorphism K121Q and the presence of IHD in patients with type 2 DM. However, the ischemic events occurred at an earlier age in the group of patients with allele Q, even after analysis adjusted for sex, BMI, smoking, hypertension and site of recruitment (P=0.04). The cross-sectional design of the present study precludes any analysis of the influence of this polymorphism on the course of IHD.
A possible limitation of this study is that only one polymorphism of the gene was evaluated. This allows the exclusion of the idea that this polymorphism is connected to IHD, but not the gene ENPP1 per se, since polymorphism K121Q is only one among the most studied. Another aspect could be related the adopted IHD criteria. Patient was diagnosed with IHD when one of the evaluated tests (WHO cardiovascular questionnaire, rest ECG, myocardial scintigraphy) was positive. We did not have detail information about witch test was positive in all 573 patients in this multicentre cross-sectional study. However, since all studied patients underwent the WHO cardiovascular questionnaire and rest ECG, we can state that in the group of patients without IHD 100% of these tests were negative. Furthermore, we had previously demonstrated13 that the presence of IHD according the WHO cardiovascular questionnaire had a RR for cardiac events of 2.13 (95%CI 1.11-4.07; P = 0.022) even better than the risk conferred by resting ECG or myocardial scintigraphy. Furthermore, when WHO cardiovascular questionnaire was associated with a normal ECG the negative predictive value for cardiac events was 82.1%. In this situation, further additional tests are probably not necessary.
In conclusion, in this sample of white Brazilian patients with type 2 DM, polymorphism K121Q of the gene ENPP1 was not associated with the presence of IHD neither with phenotypes related to insulin resistance or MetS.
We thank
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was partially funded by CNPq, FIPE - HCPA.
This study is not associated with any post-graduation program.
FUNDAMENTO: El gen ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1 (ENPP1) es un gen candidato a la resistencia insulínica. La resistencia a la insulina es un componente importante del síndrome metabólico y ha sido involucrada en el desarrollo de enfermedad cardiaca isquémica (ECI). OBJETIVO: Evaluar la asociación entre el polimorfismo K121Q del gen ENPP1 y la presencia de ECI en pacientes caucásicos con diabetes melitus (DM) tipo 2. MÉTODOS: SE Realizó un estudio transversal en pacientes con DM tipo 2 (n=573; 50,6% hombres; edad 59,5±10,4 años). Se definió la ECI por la presencia de angina o infarto agudo de miocardio mediante el cuestionario cardiovascular de la Organización Mundial de la Salud y/o alteraciones compatibles en el ECG (código Minnesota) o centellograma miocárdico. El polimorfismo K121Q fue genotipificado mediante la técnica de PCR y digestión enzimática. RESULTADOS: La ECI estuvo presente en 209 (36,5%) pacientes. La frecuencia de los genotipos KK, KQ y QQ entrel os pacientes con ECI fue del 60,8%, 34,4% y 4,8%, semejante a la distribución de los genotipos entre los pacientes sin ECI (64,0%, 32,7% y 3,3%, P = 0,574). No se observó diferencia en las características clínicas o de laboratorio entre los tres genotipos, ni en relación con la presencia de síndrome metabólico. CONCLUSIÓN: No se encontró ninguna asociación entre el polimorfismo K121A del gen ENPP1 y la presencia de ECI o características fenotípicas de resistencia insulínica.
IHospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS
IIUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
IIIUniversidade Luterana do Brasil, Canoas, RS
IVHospital São Vicente de Paula, Rio Grande, RS - Brasil
Correspondencia
La resistencia a la acción de la insulina es uno de los principales mecanismos involucrados en la patogénesis tanto de la diabetes melitus (DM) tipo 2 como del Síndrome Metabólico (SM)1. Además, la resistencia a la acción de la insulina se asocia también a fenotipos implicados en la definición de SM, tales como obesidad central, hipertensión arterial, dislipidemia y tolerancia disminuida a la glucosa. El estado de resistencia a la acción de la insulina es más frecuente en individuos mayores, obesos y sedentarios, y su presencia es probablemente el resultado de la interacción entre el ambiente y factores genéticos.
La influencia genética en la acción de la insulina fue descrita en estudios de familias. Reinhard et al2 evaluaron el impacto del diagnóstico de SM en el riesgo de enfermedades cardiovasculares en familias alemanas con gran carga genética para enfermedad cardiaca isquémica (ECI). Los autores mostraron que el SM es un predictor independiente de morbilidad y mortalidad cardiovascular, especialmente en pacientes jóvenes con historia familiar de ECI precoz.
El gen ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1 (ENPP1) es prominente entre los posibles candidatos para el desarrollo de SM, pues su polimorfismo K121Q parece estar asociado a la acción de la insulina3-5. El ENPP1 codifica una glucoproteína de membrana de clase 2, que influencia negativamente la sensibilidad a la acción de la insulina inhibiendo la señal del receptor de insulina tirosina quinasa. La variante 121Q (alelo de riesgo) se liga al receptor de insulina tirosina quinasa con mayor afinidad que su alelo salvaje 121K, resultando en menor autofosforilación del receptor. En un estudio multicéntrico, la variante 121Q se asoció con mayor riesgo de desarrollo precoz de DM tipo 2 e infarto agudo de miocardio, comparado con el alelo 121K6. En un metaanálisis reciente de 15.801 pacientes con DM tipo 2 y 26.241 individuos control, el alelo 121Q se asoció a un creciente riesgo de DM tipo 2, que fue modulado por el índice de masa corporal (IMC)7. No obstante, aún no ha sido plenamente analizado el rol preciso del polimorfismo K121Q en el desarrollo de complicaciones vasculares de la DM tipo 2, especialmente en relación a la enfermedad cardiovascular aterosclerótica.
Así, el objetivo de este estudio fue analizar la asociación entre la variante 121Q del gen ENPP1 en pacientes blancos con DM tipo 2 y la presencia de ECI, SM y fenotipos relacionados.
Se llevó a cabo un estudio transversal con una muestra compuesta por 573 pacientes blancos con DM tipo 28 en seguimiento ambulatorio en el Servicio de Endocrinología del Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil. Estos pacientes son participantes de un estudio que se inició en 2002 y está siendo realizado en el estado de Rio Grande do Sul, con el objetivo de estudiar la DM y sus complicaciones crónicas. Además del Servicio de Endocrinología del Hospital de Clínicas de Porto Alegre, otros tres hospitales participaron del Proyecto: Grupo Hospitalario Nossa Senhora da Conceição, Hospital São Vicente de Paula y Hospital Universitario de Rio Grande.
Los pacientes fueron sometidos a una evaluación estandarizada descrita previamente9, que incluía: edad, duración de la DM y medicamentos en uso en el momento. Para evaluar las complicaciones crónicas de la DM y los factores de riesgo cardiovascular, se realizaron el examen físico y los test de laboratorio. El peso y la altura se tomaron con los pacientes vestidos con ropa liviana y sin zapatos. El IMC fue calculado mediante la relación peso (kg)/altura2 (m). El perímetro de cintura se midió a la altura de la cicatriz umbilical10. Se definió la hipertensión arterial como la presión de
La ECI fue diagnosticada en presencia de angina o posible infarto de miocardio de acuerdo el cuestionario cardiovascular de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y/o cambios electrocardiográficos compatibles (Código de Minnesota: patrones Q y QS [1.1-2, 1.3]; unión e infradesnivel del segmento S-T [J] [4.1-4]; ítems de la onda T [5.1-3], y bloqueo completo de rama izquierda [7.1])12 y/o anormalidades en la perfusión (fijas o variables) en el centellograma de miocardio en reposo o luego del uso de dipiridamol. Estas herramientas de diagnóstico para isquemia de miocardio en pacientes con DM tipo 2 fueron evaluadas previamente en un estudio prospectivo13.
El diagnóstico de vasculopatía periférica se basó en la presencia de claudicación intermitente (cuestionario cardiovascular de la OMS) o ausencia de pulso en los miembros inferiores durante el examen físico.
La retinopatía diabética (RD) fue evaluada por un oftalmólogo experimentado mediante fundoscopía directa bajo midriasis. La RD fue clasificada como ausente y no proliferativa (RDNP) (microaneurismas, exudados duros y hemorragia) o RD proliferativa (RDP) (presencia de neovasos y/o tejido fibroso en cavidad vítrea). La nefropatía diabética (ND) fue definida por la tasa de excreción urinaria de albúmina (EUA) en ausencia de infección urinaria u otras anormalidades del tracto urinario, en por lo menos dos mediciones aisladas, y se clasificó como microalbuminuria (EUA 20-199 μg/min) o macroalbuminuria (EUA
El SM fue definido, de acuerdo a los criterios del Programa Nacional de Educación sobre Colesterol - Panel de Tratamiento de Adultos III, como la presencia de dos o más de los siguientes factores además de DM: obesidad abdominal (circunferencia abdominal >102 cm en hombres y >88 cm en mujeres); altos niveles de triglicéridos en suero (
La EUA se midió utilizando la técnica de inmunoturbidimetría en muestra de orina estéril de 24h, sin utilización de inhibidores de la enzima convertidora o bloqueantes de los receptores de angiotensina. El nivel de glucosa en ayuno se determinó mediante el método de la glucosa oxidasa; la creatinina, mediante la reacción de Jaffe, y la HbA1c, por cromatografía líquida de alta performance (HPLC; Merck-Hitachi 9100; valores de referencia: 4-6%); los niveles de triglicéridos y colesterol fueron medidos usando el método enzimático, y el LDL se calculó mediante la ecuación de Friedewald. Para medir la insulina en suero se utilizó radioimunoensayo (Elecsys R Systems 1010/2010/ modular analysis E170 - ROCHE) en una muestra de pacientes que no estaban usando insulina y que poseían creatinina en suero en un nivel <1,3 mg/dl. La resistencia a la insulina fue estimada mediante el Modelo de Evaluación de la Homeostasis {Índice
Los individuos fueron genotipificados para polimorfismo ENPP1 K121Q, conforme lo descrito anteriormente17. Se aisló el DNA de los linfocitos usando procedimientos estándar18. Todas las RCPs fueron realizadas en un volumen final de 25 conteniendo 50 ng de DNA genómico, 20 mmol/l Tris-Cl, (pH 8.4), 50 mmol/l KCl, 1.5 mmol/l MgCl2, 0.2 mmol/l dNTPs, 1 unidad de
Para comparar las características de pacientes con o sin ECI se utilizaron el teste
El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Clínicas de Porto Alegre, y todos los pacientes firmaron el Consentimiento Informado.
La edad promedio de los 573 pacientes incluidos fue de 59,5 ± 10,4 años con un tiempo de duración de DM conocido de 11,7 ± 9,2 años e IMC de 28,9 ± 5,2 kg/m2. Las mujeres constituían el 49,4% (n = 283) de la muestra. La ECI estaba presente en 209 (36,5%) pacientes. En la
Los pacientes con ECI tenían DM de más larga data y había mayor frecuencia de fumadores (P = 0,010) (
La presencia de ECI fue más frecuente entre aquellos con cualquier grado de RD (RDNP/RDP) (44,2%
Los genotipos evaluados estaban en Equilibrio de Hardy-Weinberg (P >0,05), y la frecuencia del alelo de riesgo (alelo Q) era de 20,5%. Las características clínicas y de laboratorio de los pacientes divididos de acuerdo a los diferentes genotipos no se diferenciaron entre los tres grupos (
Cuando los pacientes fueron divididos de acuerdo a la presencia de ECI, la distribución de genotipos KK, KQ y QQ fue del 60,8%, 34,4% y 4,8%, no diferente de la distribución genotípica observada en el grupo sin ECI (64%, 32,7% y 3,3%, P = 0,574) (
En esta muestra de pacientes blancos brasileros con DM tipo 2, el alelo 121Q del gen ENPP1 no fue asociado a la presencia de ECI, ni a características asociadas a la resistencia a la insulina, incluyendo IMC, obesidad abdominal, hipertensión arterial, un peor perfil lipídico, control glucémico o presencia de SM. La ausencia de una asociación de este polimorfismo a características de resistencia a la acción de la insulina merece algunos comentarios. Primeramente, esta asociación puede no existir, y las relaciones descritas en otros estudios son en verdad dudosas debido a un error de tipo 2. Si esta hipótesis es rechazada, la relevancia de una asociación positiva deberla ser discutida. Para detectar una diferencia significativa en la frecuencia del alelo Q en pacientes con (22%) y sin ECI (19,6%) (α = 0,05 e β = 80%), sería necesario evaluar alrededor de 4.500 pacientes. Aún cuando ello fuera significativamente diferente, su aplicabilidad seria cuestionada a causa de su pequeño efecto y dependería de otros polimorfismos o interacciones de genes. Una explicación más plausible es que la expresión del gen variante depende del grupo étnico que está siendo estudiado. En verdad, aún entre Europeos Caucásicos la expresión fenotípica de este polimorfismo varía. La relación entre el polimorfismo K121Q y la sensibilidad a la acción de la insulina fue demostrada en individuos Caucásicos19-21, pero no en todos los estudios20,22,23. La ausencia del efecto del alelo de riesgo demostrado en algunos grupos puede ser el resultado de diferencias en la carga genética de estas poblaciones, o puede deberse al hecho de que el polimorfismo está en desequilibrio con otras variantes genéticas no identificadas.
La asociación del alelo 121Q con el riesgo y el agravamiento de la ECI fue evaluada recientemente en un estudio caso-control que incluyó individuos de Italia y de los Estados Unidos6. En ese estudio, los autores no demostraron una asociación significativa entre el polimorfismo K121Q y la presencia de ECI en pacientes con DM tipo 2. No obstante, los eventos isquémicos aparecieron en edad más temprana en el grupo de pacientes con alelo Q, aún con análisis ajustado según sexo, IMC, tabaquismo, hipertensión y lugar de reclutamiento (P=0,04). El diseño transversal del presente estudio impide cualquier análisis sobre la influencia de este polimorfismo en el curso de la ECI.
Una posible limitación de este estudio es que se evaluó sólo un polimorfismo del gen. Ello permite excluir la idea de que este polimorfismo está ligado a la ECI, pero no el gen ENPP1
En conclusión, en esta muestra de pacientes brasileros blancos con DM tipo 2, el polimorfismo K121Q del gen ENPP1 no estuvo asociado a la presencia de ECI ni a fenotipos relacionados a la resistencia a la insulina o SM.
Agradecemos al Proyecto de Núcleos de Excelencia del Ministerio de Ciencia y Tecnología (PRONEX), Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) y el Fondo de Incentivo a la Investigación (FIPE) del Hospital de Clínicas de Porto Alegre por el apoyo financiero.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
EL CNPq, FIPE - HCPA finació parcialmente el presente estudio.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.