ORIGINAL ARTICLE

Study of mutations causing hypertrophic cardiomyopathy in a group of patients from Espirito Santo, Brazil

Júlia Daher Carneiro Marsiglia^I; Maria do Carmo Pimentel Batitucci^I; Flávia de Paula^I; Clara Barbirato^I; Edmundo Arteaga^II; Aloir Queiroz de Araújo^I

^IUniversidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES

^IIUniversidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil

Mailing address

ABSTRACT

BACKGROUND: Hypertrophic cardiomyopathy (HC) is the most frequent cardiac hereditary disease, caused by mutations in sarcomere protein coding genes. Although more than 430 mutations have been identified in several continents and countries, there have been no reports of mutations in Brazil.

OBJECTIVES: : To carry out a genetic study to identify genetic mutations that cause HC in a group of patients in Espirito Santo, Brazil.

METHODS: Using the SSCP technique, 12 exons from the three main genes involved in HC were studied: exons 15, 20, 21, 22 and 23 of the β-myosin heavy chain gene (MYH7), exons 7, 16, 18, 22 and 24 of the myosin binding protein C gene (MYBPC3) and exons 8 and 9 of troponin T gene (TNNT2).

RESULTS: 16 alterations were found, including two mutations, one of them possibly pathogenic in the MYBPC3 gene (p. Glu441Lys) and another pathogenic one, previously described in the TNNT2 gene (p.Arg92Trp), 8 rare sequence variations and 6 sequence variations with allelic frequency higher than 1% (polymorphisms).

CONCLUSION: These data allow the conclusion that the genotyping of patients is feasible in our country. It is possible that the isolated p.Glu441Lys variant identified in exon 16 of the MYBPC3 gene is pathogenic, promoting a milder phenotype than that found when in association with other mutations. The p.Arg92Trp variant in the exon 9 of TNNT2 gene does not promote such a homogeneous phenotype as previously described and it can lead to severe hypertrophy.

Key words: cardiomyopathy, hypertrophic; myosin; protein C; genes; Espirito Santo; Brazil.

Introduction

The hypertrophic cardiomyopathy (HC) is a primary cardiac disease, characterized by left ventricle (LV) hypertrophy, without dilatation, usually asymmetrical and mainly septal, in the absence of any other cardiac or systemic diseases that can lead to myocardial hypertrophy^1,2. In addition to the myocardial fiber hypertrophy, the histological disarrangement of these fibers occurs and variable degrees of interstitial as well as perivascular fibrosis, contributing to the development of heart failure, myocardial ischemia, ventricular arrhythmias and sudden death³.

HC is the most common genetic cardiac disease, but only in the beginning of the 90s the causes of the genetic mutations were identified^4,5. So far, 13 sarcomere protein coding genes have been identified, which led to the definition of HC as a sarcomere disease. However, the mutations found in the β-myosin heavy chain (MYH7), myosin binding protein C (MYBPC3) and troponin T (TNNT2) genes are responsible for 60 to 80% of the HC cases^2,6. The only genetic study available for HC in Brazil was conducted by Tirone et al⁷. It was a pioneer study and the prevalence of HC in Brazil remains unknown; in consequence, even less is known about the prevalence of the disease-causing mutations. In the state of Espirito Santo, where the estimated population, by the Brazilian Institute of Geography and Statistics (IBGE) in 2008, was of approximately 3.500.000 inhabitants⁸, and considering a HC prevalence similar to the one found in other continents (1:500), it is probable that there are about 7,000 patients with the disease, which justifies efforts to identify them properly, as well as the family carriers.

Methods

Patients

The patients included in the study were selected from a review of the echocardiography sector files in the University Hospital Cassiano Antonio Moraes - Federal University of Espirito Santo (HUCAM - UFES). Patients with an echocardiographic diagnosis of HC were contacted and invited to come to the hospital, where they were informed about the research objectives, in which they could be immediately included, if agreed.

Clinical evaluation

Each individual was submitted to a clinical-cardiac directed examination, including history, physical examination and echocardiography, all performed by cardiologists with experience in HC.

Doppler echocardiography

The echocardiograms were performed by an experienced cardiologist, using an Acuson Sequoia model 512 (Mountain View, CA, USA) equipment, with a multifrequency transducer (2.0 to 3.5 MHz), second harmonic and tissue Doppler. Patients were examined in left lateral position and the tracks were recorded in unforced expiration. The echocardiographic measurements in unidimensional-mode were obtained during the examinations, as well as the measurements of velocity and myocardial flow (pulsed Doppler, tissue Doppler and continuous Doppler). The main criterion for diagnosis of HC was the echocardiography, through the unequivocal demonstration of myocardial thickness equal to or greater than 15 mm in any segment of the LV in the absence of another cardiac or systemic disease that could cause ventricular hypertrophy.

DNA Extraction

The total DNA was extracted from 2 to 5ml of peripheral blood based on the methodology described by Miller et al⁹. The extracted DNA was quantified in a Thermo Scientific NanoDropTM ^® 1000 spectrophotometer and diluted to the concentration of 10 ng/μl with ultrapure water.

Polymerase chain reaction (PCR)

The exons 15, 20, 21, 22 and 23 from the MYH7 gene (β-myosin heavy chain), 7, 16, 18, 22 and 24 from the MYBPC3 gene (myosin binding protein C) and 8 and 9 from the TNNT2 gene (troponin T) were amplified through PCR in an Applied Biosystems thermal cycler, model Veriti^®, using primers described in the Cardio Genomics database⁶.

Screening of mutations

After amplification by PCR, the screening of mutations was performed by the Single-Strand Conformation Polymorphism technique (SSCP). Approximately 10μl of each PCR product was mixed with 2μl of SSCP-loading buffer. The samples were denatured at 94° C for 10 minutes, kept on ice and applied to the gels. The gels were subjected to electrophoresis at 6W for 12 to 16 hours. After the run, the gels were stained with silver nitrate, based on the methodology described by Bassam et al¹⁰.

Sequencing and alterations analysis

The fragments with abnormal migration on the gel were sequenced by the DNA sequencing platform of the Embrapa - Cenargen laboratory in Brasilia, DF, Brazil. The analysis of the changes was made based on the reference sequence (MYH7: NG_007884, MYBPC3: NG_007667, TNNT2: NG_007556) available in the database of gene sequences of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) available online¹¹, and compared with the changes already described in the Cardio Genomics database, available online⁶.

Control group

A control group consisting of 64 unrelated adult volunteers, with apparently normal health, no family history of cardiomyopathies, normotensive, with normal physical examination and normal electrocardiogram, gave blood samples, which were submitted to the same processes as the samples from patients with phenotypically demonstrated HC.

Ethical considerations

This study was approved without restrictions by the Research Ethics Committee of the Federal University of Espirito Santo (Research Protocol No. 058/07). All patients and all volunteers from the control group received information on the procedures, risks and benefits of the study, and those who agreed to participate signed the consent form, also approved by the Ethics Committee.

Results

The study sample consisted of 20 patients, 10 males, mean age of 45.7 years. The control group consisted of 64 patients (23 males), aged 19 to 65 years (mean 44.3 ± 11.7). Echocardiographic measurements obtained from patients are shown in Table 1. All patients present asymmetric septal hypertrophy > 15 mm, left atrial enlargement as a result of the LV diastolic dysfunction (normal up to 40 mm), normal internal ventricular diameters (range 55 mm), except in 2 patients with mild dilatation and decreased ejection fraction in only one patient (normal > 55%). At rest, only 25% of patients presented gradients > 30mmHg in the LV outflow tract (obstructive HC).

The results of the analysis of the SSCP and sequencing showed 14 alterations, including two mutations, 6 rare sequence variations and 6 polymorphisms. The exons studied are involved in 139 of the 441 mutations described for all the genes, just over 31%.

In the MYH7 gene, we identified two polymorphisms in intron 19, both substitutions A> G. The first was identified at position c.13615-64 and appeared with a frequency of 25% in patients and 19.5% in controls. The second polymorphism was identified at position c.13615-64 and appeared with a frequency of 100% in controls and tested patients. In intron 22, a rare sequence variation was identified, a T> C substitution at position c.14663 +32. In exon 22, one rare sequence variation was also found, an A> C substitution at position c.14537, which changes the codon from TCC to TCA, both serine codons. In exon 23, two polymorphisms characterized by a T> C substitution were found: the first one at position c.15355, which modifies the codon GCT to GCC, both alanine codons and appeared with a frequency of 5% among patients and 1.56% in controls. The second, in position c.15431, changes the codon from CTG to TTG, both leucine codons and were identified with a frequency of 2.5% in patients and 0.78% in controls.

In the MYBPC3 gene, a mutation was identified, a G> A substitution in one patient (Figure 1). The mutation is located at position c.11642 in exon 16 and changes the codon from GAG> AAG, thus altering the amino acid, from glutamic acid to lysine. Furthermore, a rare variation of sequence and a polymorphism were found in intron 22. The alteration was identified at c.13999+118 position and it is a G> A substitution. The polymorphism was characterized by a C> G substitution and was identified at position c.15130+19. It showed a frequency of 5% in patients and 3.125% in controls.

A mutation, a C> T substitution in exon 9, was identified in a patient at position c.8772 in the TNNT2 gene (Figure 2). This substitution changes the codon from CGG to TGG, thus changing the amino acid from arginine to tryptophan. In addition to the mutation, two rare sequence variations in intron 8 and a polymorphism were identified in exon 9. The first alteration was a G> C substitution at position c.8459+130 and the second was a C> T substitution at position c.8762-20. The polymorphism identified was a C> T substitution at position c.8816, which changes the codon from ATC> ATT, both isoleucine codons. The polymorphism showed a frequency of 69.44% in patients and 71.88% in controls. The summary of the results can be seen in Table 2.

Discussion

Mutations

MYBPC3 gene, exon 16

The G → ! A substitution found in exon 16 of MYBPC3 gene of patient P4 changes the codon from GAG, which encodes a glutamic acid to AAG, which determines lysine. This mutation was first described by Seidman et al¹² in compound heterozygosity, with the p.E258K mutation in exon 7 of the MYBPC3 gene. Olivotto et al¹³ also described this mutation in compound heterozygosity with the p.E258K mutation. Although it is unlikely that the patients studied by the researchers mentioned above are the same individual, we cannot affirm that they are not related (personal communication). Thus, the p.E441K mutation has not been described alone, so it is not clear whether it is capable of causing the disease when expressed in isolation.

Olivotto et al¹³ mentioned in their study that the double mutation carriers have a more severe phenotype than those bearing a single mutation. The Seidman group's patient is 29 years of age and has a severe phenotype, although they did not have more detailed information on the case (personal communication). The P4 patient in the present study has moderate hypertrophy, with no family history of sudden death, with no reports of syncope, and does not present nonsustained ventricular tachycardia on dynamic ECG. The patient complained of angina at exertion, and the coronary angiography showed coronary arteries with no obstructive processes.

Niimura et al¹⁴ observed in their study that the survival of patients with mutations in the MYBPC3 gene was longer than that observed in those bearing mutations in the TNNT2 gene or malignant changes in the MYH7 gene. Overall, the data indicate that mutations in the MYBPC3 gene are related to more mild forms of HC in many patients with the disease.

In another independent study of 22 families, Richard et al¹⁵ reported that 90% of the families carrying mutations in the MYBPC3 gene presented a benign or intermediate prognosis. Furthermore, they found some patients with double heterozygous or homozygous mutations and in these cases the phenotype was described as more severe. Thus, in these families, the age of disease development, the degree of hypertrophy and prognosis were related to the number of mutations.

Thus, it is unlikely that patients from the Seidman et al¹² and Olivotto et al¹³ groups have the more severe phenotype due to p.E258K mutation, only. Based on the clinical data, we suggest that the combination of the two mutations, the p.E258K and the p.E441K, was responsible for the phenotype and that both, in isolation, are capable of causing the disease, but in its milder form, as is often seen with the MYBPC3 gene mutations.

In addition to the clinical evidence, there are some data from molecular studies that support the hypothesis that the p.E441K mutation is pathogenic. Several described substitutions of a glutamic acid by a lysine have shown to be involved with HC and dilated cardiomyopathy (DC) in the Cardio Genomics database available online⁶. There are 3 Glu → ! Lys substitutions involved with the disease in the MYBPC3 gene alone. In the MYH7 gene, there are 7 such substitutions involved with HC and one involved with the dilated form. There are two substitutions in each the TNNT2 and the α-tropomyosin genes, and there is one substitution in each the α-actin, the essential myosin light chain and the myosin regulatory light chain genes.

Moreover, when comparing the amino acid sequence of the MYBPC3 protein available in the NCBI database¹¹ in several animals, it appears that the region where the substitution occurred is quite conserved in men (Homo sapiens), mice (Mus musculus), rats (Rattus norvegicus), dogs (Canis lupus familiaris), Oxen (Bos taurus) and chimpanzees (Pan troglodytes), which suggests that this is an important region in the protein.

To undoubtedly affirm that this mutation in the isolated form is able to cause the disease is only possible if the mutations in other exons of this gene and other sarcomeric genes are discarded through family studies. Together, however, the clinical and molecular data suggest that the p.E441K mutation is a pathogenic one.

TNNT2 gene, exon 9

The C → ! T substitution found in exon 9 of patient P5 generates a change of codon from CGG to TGG, changing the amino acid from arginine to tryptophan. This mutation, p.Arg92Trp or p.R92W, was first described by Moolman et al¹⁶, with a high frequency among the patients studied, suggesting a founder effect. The clinical data of their patients showed a small hypertrophy, often undetectable, the mean maximum thickness of the wall of the patients was within the normal range and this was reflected in the low penetrance of the disease. However the prognosis associated with the disease was extremely poor, particularly for male adolescents and young adults. Furthermore, data from this study suggested that mutations in the TNNT2 gene lead to congestive heart failure at a lower frequency than the mutations in the MYH7 gene.

In a later study, Moolman-Smook et al¹⁷ investigated 40 unrelated patients and again the p.Arg92Trp mutation appeared with a high frequency and clinical data were similar to those seen in the previous study. According to the authors, the reduced life expectancy associated with this mutation and the well-preserved haplotype in many families, suggested a recent mutational event.

In 2001, Varnava et al¹⁸ also published a study performed in London, in which patients with mutations in the TNNT2 gene presented greater myocardial disarrangement, reduced fibrosis and reduced heart weight in comparison to patients with mutations in other genes. The study therefore suggests that the risk of sudden death in patients with mutations in this gene should be related to increased myocardial disarrangement, regardless of the hypertrophy degree.

However, according to Ackerman et al¹⁹, there are exceptions to all genotype-phenotype associations and this is the largest impediment to use genotyping alone as a clinical and prognostic tool for individual patients. In their study, one patient who had the p.Arg92Trp mutation presented extreme hypertrophy and his mother, who also had the mutation, did not present hypertrophy and there were no records of sudden deaths in the family. The authors mentioned that there are still many factors that may confound the phenotype, such as phenotypic expression and variability within families, the small size of the studied families, modifier genes, the role of polymorphisms and other non-genetic factors. These combined factors can weaken the premise that the risk of sudden death is associated to a particular mutation. They believe that the necessary knowledge to determine which HC mutation, combination of mutations and environmental factors may influence the clinical outcome is yet to be acquired. In 2003, Van Driest et al²⁰ presented a study with TNNT2 gene mutations in which the patients did not present significantly lower hypertrophy than that in patients with mutations in other genes and none of them had family history of sudden death.

In our patient (P5), the p.Arg92Trp mutation led to a phenotype that can be considered severe, as the patient is very symptomatic, presenting moderate to severe hypertrophy and recurrence of syncope. Furthermore, we had access to an echocardiogram of his 18-year-old son, who presents massive hypertrophy (33 mm), corroborating the reports by Ackerman et al¹⁹.

Allele variants with frequencies lower than 1%

Each of the alterations classified as allelic variants with a frequency lower than 1% appeared in only one individual (patient or control) among the 84 individuals analyzed. We found 5 alterations, 4 in intron regions and one in the exon, a silent-type polymorphism, which does not change the synthesized amino acid.

Changes in introns may or may not affect the protein. To correctly identify and bind RNA sequences that encode proteins, the exons must be differentiated from the introns. There are several preserved motifs in nucleotides sequences near the intron-exon boundaries that act as essential signals for splicing. These signals are involved with pre-messenger RNA intron excision and exon junction. Additional elements known as promoters and silencers are required to allow a normal splicing of the exonic sequences. These regulatory elements may be close to (to 50-100 bp) or far from (thousands of bp) splicing sites²¹.

Among the changes found, two were in regions close to the exon boundary (+32 to -20) and two were in more distant regions (+118 and +130). With the techniques used in this study only, there is no evidence that these changes affect the protein. Genomic variants that affect the splicing (or splicing-affecting genomic variants - SpaGVs) may occur in exonic or intronic regulatory elements and are very difficult to be defined only by the sequence of nucleotides. However, these changes can lead to catastrophic splicing abnormalities. In particular, SpaGVs can induce the exclusion of exons, the activation of alternative splicing sites, or they may alter the balance of alternative splicing isoforms produced and thus cause disease phenotypes. The importance of functional genomic variants (GV) which are located far away from the splicing sites is even more difficult to be identified than those that are adjacent. Although they are not near any obvious regulatory sequences, such variants can cause, for instance, the activation of a new splicing site, which defines the boundaries of the exon²¹.

The other rare sequence variation found was of the silent type. Such changes are usually disregarded because they do not affect the synthesized protein, but studies show they may be important.

Silent mutations are normally classified as allelic polymorphisms and are considered neutral. These definitions may be correct in some cases, but when they are not based on the characterization of the mRNA level they can lead to errors, because mutations affecting the sequence are important for splicing modulation and may lead to a profound effect on the translated product. Many studies have correlated specific point mutations in coding regions to the exclusion of the exon containing the mutation. The fact that silent mutations theoretically cause exon exclusion is particularly significant, as these mutations must act at the RNA level. These mutations probably alter regulatory elements that are important for correct splicing. Still, it is likely that these mutations are infrequently reported, because they may be incorrectly perceived as neutral polymorphisms that do not deserve further characterization²².

It is not possible to affirm that the variations found here are pathogenic, as RNA studies would be needed in order to do that. However, even with sensitive techniques such as direct sequencing and the complete study of all 13 exons of the genes involved in the HC, the detection of mutations in patients is only successful in approximately 70% of the cases^2,15. Thus, it is possible that some splicing mutations in introns or exons are being underestimated and that is one of the reasons why it is important to study and publish these alterations.

Variants with allele frequencies greater than 1% (polymorphisms)

A total of 6 polymorphisms, 3 in the intron region and 3 within the exon, were found in this study. Recently, it has been suggested that the genetic causes for susceptibility to complex diseases may be beyond the missense and nonsense mutations, which are commonly studied in simple genetic disorders. Within this spectrum, polymorphisms that alter the gene expression are suspected to play an important role²³.

One study has evaluated a frequent polymorphism (more than 50%), characterized by a 5bp deletion in intron 3 of the TNNT2 gene in cardiac hypertrophy and found that the frequency of the allele was significantly higher in people with left ventricular hypertrophy than in the normal population²⁴. The study also suggests that the homozygous genotype for the deletion may be associated with greater left ventricular wall thickness and increased mass in the hypertrophied population. However, only the presence of the allele does not seem enough to cause significant cardiac hypertrophy. The results suggest therefore that the genotype predisposes individuals to cardiac hypertrophy.

Several studies have shown that polymorphisms in regions distant from the splicing site may be related to diseases, affecting regulatory elements. Hoogendoorn et al²³ studied in vitro the effect of polymorphisms on splicing promoters and found that a surprisingly high proportion of polymorphisms, approximately one third in their study, altered the expression of the gene in 50% or more of the cases.

The allelic frequency of the polymorphisms identified in this study was not statistically significant between patients and controls in this study. This suggests that the polymorphisms do not affect the phenotype. Furthermore, clinical data of patients who had and who did not have the polymorphism were similar.

Our knowledge of regulatory elements of the human genome is still limited and functional polymorphisms of these elements cannot be clearly distinguished from those with no effect, if considering only its sequence²⁴. Therefore we have considered the study and the publication of the polymorphisms as being relevant, even though they are in intronic regions distant from the splicing sites.

Sensitivity of the method

In this study, mutations were identified in 2 of 20 patients, 10% of the sample. A higher proportion would be expected, as the studied exons account for approximately 31% of the mutations already described. Several possibilities can be suggested to explain the sensitivity below the expected and among them, three deserve attention.

Firstly, the method itself does not have 100% sensitivity and it markedly decreases with the increase in fragment size²⁵. Studies suggest that, for fragments smaller than 200 base pairs, more than 90% of the sequence variations will be detected. When the fragment increases to 300 to 350 nucleotides, more than 80% of mutations will be detected. In our study, only two fragments had less than 350 bp. The SSCP was able to detect several substitutions, including the in larger fragments, but the sensitivity of the test can be improved by using smaller fragments or by changing other conditions, such as varying bisacrylamide, and glycerol concentrations, etc. Secondly, the sample size must be taken into account. In the case of a pilot project, with the use of a laborious method of genetic screening, involving several laboratory steps, the sample was initially considered sufficient, given the logistics available, but it has an impact when the sensitivity of the method is evaluated.

A third possibility is the local population profile. Most genotyping studies in patients with HC are from the northern hemisphere and the frequencies of mutations that cause the disease in South American countries such as Brazil are yet to be known; additionally, little is known about their frequency in developing countries. Considering the miscegenation of the Brazilian population, some similarity with other populations worldwide is expected, but this is speculative at present and it is possible that the prevalence of affected genes in Brazil is different than that described for other populations. In 1999, a study in South Africa showed that the mutations described as predominant worldwide were apparently rare in the country¹⁷. A study of Spanish patients showed that, compared to other populations, mutations in the MYH7 and TNNT2 genes were rare among the studied patients²⁶ and a very low rate of mutations in the MYH7 gene was found in a study with patients in Finland²⁷. These data suggest that each region may have a single mutation profile and that may have important effects on the implementation of population screening.

Conclusions

Given the objectives of the study, we concluded that the genotyping of patients with HC is feasible in our country. With respect to the mutations, we concluded that it is possible that the p.E441K (p.Glu441Lys) mutation in exon 16 of the MYBPC3 gene is pathogenic in isolation, resulting in a less severe phenotype than when associated to another mutation, and the p.R92W (Arg92Trp) mutation in exon 9 of the TNNT2 gene has a phenotype that is not as homogeneous as previously described and may lead to severe hypertrophy. To the best of our knowledge, this is the first time that a HC-causing mutation has been described in Brazil. Depending on further analysis, one of the patients in this sample population may be carrying a novel mutation, when compared to the available databases.

Acknowledgments

To Fundação de Apoio à Pesquisa do Espirito Santo (FAPES) and the State Health Secretariat of the state of Espirito Santo, Brazil.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was partially funded by Secretaria de Saúde do Espírito Santo e Fundação de Apoio à Pesquisa do Espírito Santo (FAPES).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Júlia Daher Carneiro Marsiglia, from Universidade Federal do Espírito Santo.

References

ARTÍCULO ORIGINAL

Estudio de mutaciones causadoras de cardiomiopatía hipertrófica en un grupo de pacientes en Espírito Santo, Brasil

Júlia Daher Carneiro Marsiglia^I; Maria do Carmo Pimentel Batitucci^II; Flávia de Paula^I; Clara Barbirato^I; Edmundo Arteaga^II; Aloir Queiroz de Araújo^I

^IUniversidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES - Brasil

^IIUniversidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: La cardiomiopatía hipertrófica (CH) es la enfermedad cardíaca hereditaria más frecuente, causada por mutaciones en los genes codificadores para proteínas del sarcómero. Aunque se hayan identificado más de 430 mutaciones en varios continentes y países, no hay relato de que esto se haya estudiado en Brasil.

OBJETIVO: Conducir un estudio genético para identificar mutaciones genéticas que causan la CH en un grupo de pacientes en el estado de Espírito Santo, Brasil.

MÉTODOS: Usando la técnica SSCP, se estudiaron 12 exones de los tres principales genes involucrados con la CH: exones 15, 20, 21, 22 y 23 del gen de la cadena pesada de la β-miosina (MYH7), exones 7, 16, 18, 22 y 24 del gen de la proteína C unida a la miosina (MYBPC3) y exones 8 y 9 del gen de la troponina T (TNNT2).

RESULTADOS: Se encontraron 16 alteraciones, incluyendo dos mutaciones, una de ellas posiblemente patogénica en el gen MYBPC3 gen (p. Glu441Lys) y otra patogénica ya descrita en el gen TNNT2 (p. Arg92Trp); 8 variaciones de secuencia raras y 6 variaciones de secuencia con frecuencia alélica mayor que el 1% (polimorfismos).

CONCLUSIONES: Con estos datos, es posible concluir que el genotipaje de los pacientes es factible en nuestro medio. Es posible que la variante p.Glu441Lys en el exón 16 del gen MYBPC3 sea patogénica, resultando en un fenotipo más leve que el encontrado en asociación con otras mutaciones. La variante p.Arg92Trp en el exón 9 del gen TNNT2 no resulta en un fenotipo tan homogéneo como el descrito anteriormente y puede llevar a hipertrofia grave. (Arq Bras Cardiol 2010; 94(1) : 10-17)

Palabras clave: Cardiomiopatía hipertrófica, miosina, proteína C, genes, Espírito Santo, Brasil.

Introducción

La cardiomiopatía hipertrófica (CH) es una enfermedad cardíaca primaria, caracterizada por hipertrofia del ventrículo izquierdo (VI), sin dilatación, generalmente asimétrica y principalmente septal, en ausencia de cualquier otra enfermedad cardíaca o sistémica que puede llevar a la hipertrofia miocárdica^1,2. Además de la hipertrofia de las fibras miocárdicas, se produce un desarreglo histológico de esas fibras y grados variados de fibrosis intersticial y perivascular, contribuyendo para el desarrollo de insuficiencia cardíaca, isquémica miocárdica, arritmia ventricular y muerte súbita³.

La CH es la enfermedad cardíaca genética más común, pero sólo a comienzos de los años 90 se identificaron las mutaciones genéticas causadoras de la enfermedad^4,5. Hasta ahora, se identificaron 13 genes codificadores para proteínas del sarcómero cardíaco, lo que lleva a la definición de CH como siendo una enfermedad del sarcómero. No obstante, las mutaciones encontradas en los genes de la cadena beta de miosina pesada (MYH7), de la proteína C cardíaca unida a miosina (MYBPC3) y de la troponina T cardíaca (TNNT2) son responsables por el 60 al 80% de los casos de CH^2,6. El único estudio genético disponible para la CH en Brasil fue conducido por Tirone et al. ⁷. Fue un estudio pionero y la prevalencia de la CH en Brasil permanece desconocida; en consecuencia, se sabe todavía menos al respecto de la prevalencia de las mutaciones causadoras de la enfermedad. En el estado de Espírito Santo, donde la población estimada por el Instituto Brasileño de Geografía y Estadística (IBGE) en 2008 es de aproximadamente 3.500.000 habitantes⁸, y admitiendo que la prevalencia de la CH sea similar a la encontrada en otros continentes (1:500), es probable que haya cerca de 7.000 pacientes con CH en el estado, lo que justifica los esfuerzos para identificarlos de forma adecuada, así como los portadores familiares.

Métodos

Pacientes

Los pacientes incluidos en el estudio se seleccionaron a partir de la revisión de los archivos del Sector de Ecocardiografía del Hospital Universitario Cassiano Antonio Moraes - Universidad Federal de Espírito Santo (HUCAM - UFES). Se contactaron pacientes con un diagnóstico ecocardiográfico de CH y se les invitó a visitar el hospital, donde recibieron informaciones sobre los objetivos de la investigación, en la cual podrían ser inmediatamente incluidos, sí así lo deseaban.

Evaluación clínica

Cada individuo fue sometido a un examen clínico y cardíaco, incluyendo historia, examen físico y ecocardiograma, conducido por cardiólogos con experiencia en CH.

Ecocardiograma con Doppler

Los ecocardiogramas fueron conducidos por cardiólogos experimentados, usando un equipamiento modelo Acuson Sequoia 512 (Mountain View, CA, USA), con transductor de multifrecuencia (2,0 a 3,5 MHz), segunda armónica y Doppler tisular. Los pacientes fueron examinados en la posición izquierda lateral y los registros fueron grabados en expiración no forzada. Las medidas ecocardiográficas en modo unidimensional se obtuvieron durante el examen, así como las medidas de la velocidad y flujo miocárdicos (Doppler pulsado, Doppler tisular y Doppler continuo). El principal criterio para el diagnóstico de la CH fue el criterio ecocardiográfico, a través de la demostración inequívoca de espesor miocárdico > 15 mm en cualquier segmento del VI en ausencia de otra enfermedad cardíaca o sistémica que cause hipertrofia ventricular.

Extracción de ADN

El ADN total se extrajo de 2 - 5 ml de sangre periférico, de acuerdo con la metodología descrita por Miller et al.⁹. El ADN extraído se cuantificó en un espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDropTM^® 1000 y se diluyó hasta la concentración de uso (10ng/μL) en agua ultrapurificada.

Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

Los exones 15, 20, 21, 22 y 23 del gen MYH7 (cadena beta de miosina pesada), 7, 16, 18, 22 y 24 del gen MYBPC3 (proteína C cardíaca unida a miosina) y 8 y 9 del gen TNNT2 (troponina T cardíaca) se amplificaron mediante PCR en un termociclador Applied Biosystems, modelo Veriti^®, usando primers descritos en el banco de datos CardioGenomics⁶.

Screening de mutaciones

Después de la amplificación por PCR, el screening de mutaciones se realizó por la técnica de polimorfismo de conformación de filamento único o polimorfismo de conformación de cinta simple (SSCP, del inglés "Single Strand Conformation Polymorphism"). Aproximadamente 10μL de cada producto de la PCR se mezcló con 2μL de tampón de carga para SSCP. Las muestras fueron desnaturalizadas a 94 °C por 10 minutos, mantenidas en hielo y aplicadas a los geles. Los geles se sometieron a electroforesis a 6W por 12-16 horas. Después de la corrida, los geles se colorearon con nitrato de plata, de acuerdo con la metodología descrita por Bassam et al.¹⁰.

Análisis de Secuenciamiento y alteraciones

Los fragmentos con migración anormal en el gel se secuenciaron en la plataforma de secuenciamiento de ADN de Embrapa - Laboratorio Cenargen - en Brasilia, DF, Brasil. El análisis de las alteraciones se realizó en base a la secuencia de referencia (MYH7: NG_007884, MYBPC3: NG_007667, TNNT2: NG_007556) del banco de datos de secuencias génicas del National Center for Biotechnology Information (NCBI) disponible online¹¹, y se compararon con las alteraciones ya descritas en el banco de datos Cardio Genomics, disponible online⁶.

Grupo control

Se recolectaron muestras de sangre de un grupo control, compuesto por 64 voluntarios adultos, no emparentados, con salud aparentemente normal, sin historia familiar de cardiomiopatías, normotensos, con examen físico normal y electrocardiograma normal, que fueron sometidos al mismo proceso de las muestras de pacientes con CH fenotípicamente demostrada.

Consideraciones éticas

Este estudio fue aprobado sin restricciones por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de Espírito Santo (Protocolo de Investigación No. 058/07). Todos los pacientes y voluntarios del grupo control recibieron informaciones sobre los procedimientos, riesgos y beneficios del estudio, y aquellos que consintieron en participar firmaron el Término de Consentimiento Libre e Informado, también aprobado por el Comité de Ética.

Resultados

El grupo de estudio estaba compuesto por 20 pacientes, 10 del sexo masculino, con edad promedio de 45,7 años. El grupo control estaba compuesto por 41 mujeres y 23 hombres, con edades variando entre 19 y 65 años (promedio 44,3 ± 11,7 años). Las medidas ecocardiográficas obtenidas de los pacientes se presentan en la Tabla 1. Todos los pacientes presentan hipertrofia septal asimétrica > 15 mm, aumento del atrio izquierdo como resultado de la disfunción diastólica del VI (normal hasta 40 mm), diámetros ventriculares internos normales (variación 55 mm), excepto en 2 pacientes con dilatación leve y disminución de la fracción de eyección en sólo 1 paciente (> 55% normal). En reposo, sólo el 25% de los pacientes presentaban gradientes > 30 mmHg en la vía de salida del VI (CH obstructiva).

Los resultados del análisis por SSCP y el secuenciamiento mostraron 14 alteraciones, incluyendo dos mutaciones, 6 variaciones raras de secuencia y 6 polimorfismos. Los exones estudiados están involucrados en 139 de las 441 mutaciones descritas para todos los genes, un poco por encima del 31%.

En el gen MYH7, identificamos dos polimorfismos en el intrón 19, ambos sustituciones A>G. El primero se identificó en la posición c.13615-64 y presentó una frecuencia del 25% en los pacientes y el 19,5% en los controles. El segundo polimorfismo se identificó en la posición c.13615-64 y presentó una frecuencia del 100% en los controles y pacientes estudiados. En el intrón 22, se identificó una variación rara de secuencia, una sustitución T> C en la posición c.14663 +32. En el exón 22, también se encontró una variación rara de secuencia, una sustitución A> C en la posición c.14537, que altera el codón de TCC para TCA, ambos serina. En el exón 23, se encontraron dos polimorfismos caracterizados por una sustitución T> C: el primero se identificó en la posición c.15355 y modifica el codón GCT para GCC, ambos alanina, y presentaban una frecuencia del 5% en los pacientes y 1,56% en los controles. El segundo, en la posición c.15431, altera el codón de CTG para TTG, ambos leucina, y fue identificado con una frecuencia del 2,5% en pacientes y del 0,78% en los controles.

En el gen MYBPC3, se identificó en un paciente la mutación G> A del tipo sustitución (Figura 1). La mutación está localizada en la posición c.11642 en el exón 16 y altera el codón de GAG> AAG, de esa forma alterando el aminoácido, de ácido glutámico para lisina. Además de ello, se encontraron en el intrón 22 una variación rara de secuencia y un polimorfismo. La alteración se identificó en la posición c.13999+118 y es una sustitución G> A. El polimorfismo se caracterizó por una sustitución C> G y se identificó en la posición c.15130+19, con una frecuencia del 5% en pacientes y del 3,125% en controles. Una mutación tipo sustitución de C> T se encontró en el exón 9 de un paciente en la posición c.8772 del gen TNNT2 (Figura 2). Esta sustitución altera el codón de CGG para TGG, cambiando así el aminoácido de arginina para triptofano. Además de la mutación, se identificaron dos variaciones raras de secuencia en el intrón 8 y se identificó un polimorfismo en el exón 9. La primera alteración era una sustitución G> C en la posición c.8459+130 y la segunda era una sustitución C> T en la posición c.8762-20. El polimorfismo identificado era una sustitución C> T en la posición c.8816, que altera el codón de ATC> ATT, ambos isoleucina. El polimorfismo presentaba una frecuencia del 69,44% en pacientes y del 71,88% en los controles. El resumen de los resultados puede verse en la Tabla 2.

Discusión

Mutaciones Gen MYBPC3, exón 16

La sustitución G → A encontrada en el exón 16 del gen MYBPC3 del paciente P4 altera el codón de GAG, que codifica acido glutámico, para AAG, que determina lisina. Esta mutación fue inicialmente descrita por Seidman et al.¹² en heterozigosis compuesta con la mutación p.E258K en el exón 7 del gen MYBPC3. Olivotto et al.¹³ también describieron esta mutación en heterozigosis compuesta con la mutación p.E258K. Aunque sea poco probable que los pacientes de los estudios mencionados anteriormente sean el mismo individuos, no podemos afirmar que no estén emparentados (comunicación personal). Así, la mutación p.E441K todavía no fue descrita sola, entonces no está claro si ésta es capaz de causar la enfermedad cuando se expresa aisladamente.

Olivotto et al.¹³ relatan en su estudio que los portadores de la mutación doble presentaban un fenotipo más grave que aquellos con mutación simple. El paciente del grupo de Seidman tenía 29 años, presentaba fenotipo grave, aunque ellos no tuvieran más informaciones detalladas sobre el caso1^*

. El paciente P4 del presente estudio tiene hipertrofia moderada, sin historia familiar de muerte súbita, sin relatos de síncope y no presenta taquicardia ventricular no sostenida en el ECG dinámico. El paciente se quejaba de angina de esfuerzo y la angiografía coronaria mostró arterias coronarias sin procesos obstructivos.

Niimura et al.¹⁴ observaron en su estudio que la supervivencia de pacientes con mutaciones en el gen MYBPC3 era mayor que aquella observada con mutaciones en el gen TNNT2 o alteraciones malignas en el gen MYH7. De forma general, los datos indican que las mutaciones en el gen MYBPC3 están relacionadas con formas más leves de CH en muchos pacientes con la enfermedad. En otro estudio independiente con 22 familias, Richard et al.¹⁵ relataron que el 90% de las familias que presentaban mutaciones en el gen MYBPC3 presentaban pronóstico benigno o intermediario. Además de ello, en su estudio, éstos encontraron algunos pacientes con heterozigosis doble u homozigosis para mutaciones y en tales casos, el fenotipo era descrito como siendo más grave. Así, en esas familias, la edad del desarrollo de la enfermedad, el grado de hipertrofia y el pronóstico estaban relacionados al número de mutaciones. Así, es improbable que los pacientes de los grupos de Seidman et al.¹² y Olivotto et al.¹³ tengan un fenotipo más grave solamente debido a la mutación p.E258K. Con base en los datos clínicos, sugerimos que la combinación de las dos mutaciones, la p.E258K y la p.E441K, es responsable por el fenotipo y ambas, aisladamente, son capaces de causar la enfermedad pero en su forma más leve, como es típico en las mutaciones del gen MYBPC3.

Además de las evidencias clínicas, algunos datos de estudios moleculares apoyan la hipótesis de que la mutación p.E441K es patogénica. Varias sustituciones de ácido glutámico por lisina fueron descritas como estando involucradas en la CH y en la cardiomiopatía dilatada (CD) en el banco de datos del CardioGenomics, disponible online⁶. Solamente en el gen MYBPC3, hay 3 sustituciones Glu → Lis involucradas con la enfermedad. En el gen MYH7, hay 7 de esas sustituciones involucradas con CH y una involucrada con la forma dilatada. Hay dos sustituciones en cada uno de los genes TNNT2 y α-tropomiosina, y hay una sustitución en cada uno de los genes de la α-actina, de la cadena leve esencial de la miosina y de la cadena leve reguladora de la miosina.

Además de ello, al comparar la secuencia de aminoácidos de la proteína MYBPC3 disponible en el banco de datos NCBI¹¹ en varios animales, es evidente que la región donde ocurrió la sustitución está bastante conservada en el hombre (Homo sapiens), ratón (Mus musculus), rata (Rattus norvegicus), perro (Canis lupus familiaris), buey (Bos taurus) y chimpancé (Pan troglodytes), lo que sugiere que ésta es una región importante de la proteína.

Sólo es posible asegurar que esta mutación, en la forma aislada, puede causar la enfermedad si la mutación en otros exones de ese gen y otros genes del sarcómero fueran descartadas a través de estudios familiares. Juntos, los datos clínicos y moleculares sugieren que la mutación p.E441K es patogénica.

GenTNNT2, exón 9

La sustitución C → T encontrada en el exón 9 del paciente P5 genera una alteración de codón de CGG para TGG, alterando el aminoácido de arginina para triptofano. Esta mutación, a p.Arg92Trp o a p.R92W, fue descrita primero por Moolman et al.¹⁶, con alta frecuencia entre los pacientes estudiados, sugiriendo un efecto fundador. Los datos clínicos de sus pacientes mostraron pequeña hipertrofia, frecuentemente indetectable, el espesor medio máximo de la pared de los pacientes estaba dentro de la variación normal, y ello se reflejaba en la baja penetración de la enfermedad. No obstante, el pronóstico asociado con la enfermedad era extremadamente malo, particularmente para jóvenes adolescentes del sexo masculino y adultos jóvenes. Además de ello, datos de este estudio sugiere que las mutaciones en el gen TNNT2 llevan a la insuficiencia cardíaca congestiva, a una frecuencia más baja que las mutaciones en el gen MYH7.

En un estudio posterior, Moolman-Smook et al.¹⁷ investigaron 40 pacientes no emparentados y nuevamente la mutación p.Arg92Trp presentó alta frecuencia y los datos clínicos eran similares a los del estudio anterior. De acuerdo con los autores, la reducción en la expectativa de vida asociada con esta mutación y el haplotipo bien preservado en muchas familias sugiere un evento mutacional reciente.

En 2001, Varnava et al.¹⁸ también publicaron un estudio realizado en Londres, en el cual los pacientes con mutaciones en el gen TNNT2 presentaban mayor desarreglo miocárdico, menor fibrosis y peso del corazón reducido en comparación con pacientes que tenían mutaciones en otros genes. El estudio, por lo tanto, sugiere que el riesgo de muerte súbita en pacientes con mutaciones en este gen debe estar relacionado al aumento del desarreglo miocárdico, independiente del grado de hipertrofia. No obstante, de acuerdo con Ackerman et al.¹⁹, hay excepciones para todas las asociaciones genotipo-fenotipo y éste es el mayor impedimento para utilizar el genotipaje aisladamente como herramienta clínica y pronóstica para pacientes individuales. En su estudio, un paciente con la mutación p.Arg92Trp presentaba hipertrofia externa y su madre, afectada de forma similar, no presentaba hipertrofia, y no había relatos de muerte súbita en la familia. Los autores mencionan que hay además muchos factores que pueden confundir el fenotipo, tales como la expresión y la variabilidad fenotípicas dentro de familias, el pequeño tamaño de las familias estudiadas, genes modificadores, el papel de los polimorfismos y otros factores no genéticos. Estos factores combinados pueden debilitar la premisa de que el riesgo de muerte súbita está asociado con una mutación en particular. Éstos creen no todavía no hay conocimiento suficiente para determinar qué mutaciones causadoras de CH, combinación de mutaciones y factores ambientales pueden influenciar el desenlace clínico. En 2003, Van Driest et al.²⁰ presentaron un estudio con mutaciones en el gen TNNT2, en el cual los pacientes no presentaban hipertrofia significante menor que pacientes con mutaciones en otros genes y ninguno de ellos tenía historia familiar de muerte súbita.

En nuestro pacientes P5, la mutación p.Arg92Trp llevó a un fenotipo que puede ser considerado grave, pues el paciente es bastante sintomático, presentando hipertrofia moderada a grave y relatos de recurrencia de síncope. Además de ello, tuvimos acceso al ecocardiograma de su hijo de 18 años, que presenta hipertrofia masiva (33 mm), corroborando los relatos de Ackerman et al.¹⁹.

Variantes alélicas con frecuencias < 1%

Cada una de las alteraciones clasificadas como variantes alélicas con frecuencia menor que el 1% fueron identificadas en apenas 1 individuo (paciente o control), entre los 84 individuos analizados. Encontramos 5 alteraciones, 4 intrónicas y una exónica del tipo silencioso, que no altera el aminoácido sintetizado.

Alteraciones en los intrones pueden o no afectar la proteína. A fin de identificar correctamente y vincular las secuencias de ARN que codifican las proteínas, los exones se deben diferencias de los intrones. Hay varios motivos preservados en secuencias de nucleóticos cerca de los límites exón-intrón que actúan como señales esenciales de splicing. Estas señales están involucradas con la escisión de intrones de ARN pre-mensajeros y la unión de exones. Elementos adicionales conocidos como promotores y silenciadores son necesarios para permitir un splicing normal de las secuencias exónicas. Estos elementos regulatorios pueden estar próximos (hasta 50-100 pb) o distantes (millares de PB) de los locales de splicing²¹.

Entre los cambios encontrados, dos estaban en regiones próximas al límite del exón (+32 a -20) y dos estaban en regiones más distantes (+118 e +130). Sólo con las técnicas utilizadas en este estudio, no hay evidencia que estas alteraciones afecten la proteína. Variantes genómicas que afecta el splicing (SpaGVs) pueden ocurrir en elementos regulatorios exónicos o intrónicos y son difíciles de ser definidas sólo por la secuencia de nucleótidos. Con todo, estas alteraciones pueden llevar a anormalidades de splicing catastróficas. En particular, SpaGVs pueden inducir la exclusión de exones, activación de locales alternativos de splicing, o pueden alterar el equilibrio de formas alterativas de splicing (isoformas) producidas y así, resultar en fenotipos de la enfermedad. La importancia de las variantes genómicas (VG) funcionales que están localizadas lejos de los locales de splicing es todavía más difícil de ser identificada que la de las adayacentes. Aunque no estén cerca de ninguna secuencia regulatoria obvia, tales variantes pueden, por ejemplo, causar la activación de un nuevo sitio de splicing, que define los límites del exón²¹.

Las otras variaciones raras de secuencia encontradas eran de tipo silencioso. Tales alteraciones generalmente no se considerar por que no afectan la proteína sintetizada, pero estudios han mostrado que éstas pueden ser importantes.

Mutaciones silenciosas son normalmente clasificadas como polimorfismos alélicos y son consideradas neutras. Estas definiciones pueden estar correctas en algunos casos, pero cuando no se basan en la caracterización del nivel del mARN, éstas pueden conducir a errores, porque mutaciones que afectan la secuencia son importantes para la modulación del splicing y pueden llevar a efectos profundos en la traducción del producto. Muchos estudios han correlacionado mutaciones de punto específicas en regiones codificadoras con la exclusión del exón que contiene la mutación. El hecho de que las mutaciones silenciosas teóricamente causan la exclusión de un exón es particularmente significativo, porque esas mutaciones tienen que actuar a nivel del ARN. Estas mutaciones probablemente alteran los elementos regulatorios que son importantes para el splicing correcto. Aun así, es probable que esas mutaciones sean sub-relatadas, porque éstas pueden ser percibidas incorrectamente como polimorfismos neutros que no merecen mayor caracterización²².

No es posible afirmar que las variaciones encontradas aquí son patogénicas, ya que serían necesarios estudios de ARN para ello. No obstante, aun con técnicas sensibles como las de secuenciamiento directo y el estudio completo de todos los 13 exones de los genes involucrados en la CH, la detección de mutaciones en pacientes es exitosa sólo en el 70% de los casos^2,15. Así, es posible que algunas mutaciones de splicing en intrón o exón estén subestimadas y es por ello que creemos ser importante estudiar estas alteraciones y publicar los resultados.

Variantes con frecuencia alélica > 1% (polimorfismos)

En este estudio encontramos 6 polimorfismos, 3 en la región intrónica y 3 dentro del exón. Recientemente, se ha sugerido que las causas genéticas de la susceptibilidad a las enfermedades complejas pueden estar más allá de mutaciones missense y nonsense, las cuales son comúnmente estudiadas en disturbios genéticos simples. Dentro de este especto, se sospecha que polimorfismos que alteran la expresión génica tengan un papel importante²³.

Un estudio evaluó un polimorfismo frecuente (más del 50%), caracterizado por una deleción de 5pb en el intrón 3 del gen TNNT2 en hipertrofia cardíaca y descubrió que la frecuencia del alelo era significativamente más alta en personas con hipertrofia ventricular izquierda que en la población normal²⁴. El estudio también sugiere que el genotipo en homozigosis para la deleción puede estar asociado con mayor espesor de pared y aumento de la masa ventricular del VI en la población con hipertrofia. Con todo, sólo la presencia del alelo no parece suficiente para causar la acentuada hipertrofia cardíaca. Los resultados sugieren, por lo tanto, que el genotipo predispone a los individuos a hipertrofia cardíaca.

Varios estudios han mostrados que los polimorfismos en regiones distantes del local de splicing pueden estar relacionados a enfermedades, afectando elementos regulatorios. Hoogendoorn et al.²³ estudiaron in vitro el efecto de los polimorfismos en promotores de splicing y descubrieron que una proporción sorprendentemente alta de polimorfismos, aproximadamente 1/3 en su estudio, podían alterar la expresión del gen en el 50% de los casos o más. La frecuencia alélica de los polimorfismos identificados en este estudio entre pacientes y controles no fue estadísticamente significativa. Ello sugiere que los polimorfismos no afectar el fenotipo. Además de ello, los datos clínicos de los pacientes que tenía o no tenían polimorfismos eran similares.

Nuestro conocimiento de los elementos regulatorios del genoma humano todavía es limitado y los polimorfismos funcionales de esos elementos no pueden ser distinguidos de forma clara de aquellos que no presentan efecto, solamente considerando su secuencia²⁴. De esta forma, consideramos relevante el estudio y la publicación de los polimorfismos, aun cuando éstos estén en regiones distantes de los locales de splicing.

Sensibilidad del método

En este estudio, se identificaron mutaciones en 2 de 20 pacientes, el 10% de la muestra, por lo tanto. Sería de esperar una proporción más alta, ya que los exones estudiados son responsables por aproximadamente el 31% de las mutaciones ya descritas. Varias posibilidades pueden sugerirse para explicar la sensibilidad debajo de lo esperado y entre ellas, tres merecen atención.

Primeramente, el método en si no tiene una sensibilidad del 100% y ésta disminuye mucho con el aumento del tamaño del fragmento²⁵. Estudios sugieren que para fragmentos menores que 200 pares de bases, más del 90% de las variaciones de secuencias serán detectados. Cuando el fragmento aumenta para 300-350 nucleóticos, más del 80% de las mutaciones serán detectadas. En nuestro estudio, sólo dos fragmentos tenían menos de 350 pb. La técnica de SSCP fue capaz de detectar varias sustituciones, incluyendo los fragmentos mayores, pero la sensibilidad del test puede mejorarse utilizando fragmentos menores o variando otras condiciones tales como la concentración de bisacrilamida, glicerol etc.

Segundo, debe considerarse el tamaño de la muestra. En el caso de un proyecto piloto, con el uso de un método trabajoso de screening genético, involucrando varias etapas de laboratorio, el tamaño de la muestra fue inicialmente considerado suficiente, dada la logística disponible, pero éste genera un impacto cuando se evalúa la sensibilidad del método.

Una tercera posibilidad es el perfil de la población local. La mayoría de los estudios de genotipaje en pacientes con CH son del hemisferio Norte y las frecuencias de las mutaciones que causan la enfermedad en países de Sudamérica, como Brasil, son todavía desconocidas y poco se sabe sobre su frecuencia en países en desarrollo. Dado el mestizaje de la población brasileña, se espera alguna similitud con otras poblaciones mundiales, pero esto es especulación y es posible que la prevalencia de genes afectadas sea diferente de lo descrito para otras poblaciones. En 1999, un estudio en Sudáfrica mostró que las mutaciones descritas como predominantes en el mundo eran aparentemente raras en el país¹⁷. Un estudio de pacientes españoles mostró que, en comparación con otras poblaciones, las mutaciones en los genes MYH7 y TNNT2 eran raras entre los pacientes estudiados²⁶ y se encontró una tasa muy baja de mutaciones en un estudio con pacientes en Finlandia²⁷. Estos datos sugieren que cada región puede tener un perfil de mutación único y ello puede tener efectos importantes en la implementación del screening poblacional.

Conclusiones

Considerando los objetivos del estudio, concluimos que el genotipaje de los pacientes con CH es factible en nuestro país. Con relación a las mutaciones, concluimos que es posible que la mutación p.E441K (p.Glu441Lys) en el exón 16 del gen MYBPC3 sea patogénica en su forma aislada, promoviendo un fenotipo menos grave que cuando se asocia con otra mutación, y que la mutación p.R92W (Arg92Trp) en el exón 9 del gen TNNT2 tiene un fenotipo que no es tan homogéneo como fuera descrito anteriormente y que puede conducir a hipertrofia grave.

Hasta donde sabes, ésta es la primera vez que una mutación causadora de CH se describe en Brasil. Dependiendo del análisis adicional, uno de los pacientes en esta muestra poblacional puede estar cargando una nueva mutación, cuando se la compara con los bancos de datos disponibles.

Agradecimientos

A la Fundación de Apoyo a la Investigación de Espírito Santo (FAPES, por su sigla en portugués) y a la Secretaría de Estado de Salud de Espírito Santo.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

El presente estudio fue parcialmente financiado por la Secretaría de Salud de Espírito Santo y la Fundación de Apoyo a la Investigación de Espírito Santo (FAPES).

Vinculación Académica

Este artículo forma parte de la disertación de Maestría de Júlia Daher Carneiro Marsiglia de la Universidad Federal de Espírito Santo.

Referencias