FUNDAMENTO: O exercício físico promove estresse hemodinâmico. OBJETIVO: Testar se programas de treinamento com corridas voluntária e forçada induzem níveis distintos de expressão de Hsp72 no miocárdio de ratas Wistar. MÉTODOS: Ratas Wistar foram alocadas em três grupos (n = 6, cada): treinadas com corrida voluntária (TCV), treinadas com corrida forçada (TCF) e grupo controle (C). Os animais do TCV tiveram livre acesso à roda de corrida voluntária, enquanto os do TCF foram submetidos à corrida forçada em esteira (18 m/min, 0% inclinação, 60 m/min, 5 dias/sem) durante oito semanas. Fragmentos dos ventrículos esquerdo (VE) e direito (VD) foram coletados para análise dos níveis de Hsp72. RESULTADOS: As ratas do grupo TCV correram, em média, 4,87 km, e as do TCF, 4,88 km por semana. Os animais dos grupos TCV e TCF ganharam menos peso (p < 0,05) que os do grupo C (81,67 ± 11,95 g vs 81,17 ± 10,18 g vs 111,50 ± 2,26 g, respectivamente). O peso relativo do coração não foi diferente (p > 0,05) entre os grupos TCV, TCF e C (4,54 ± 0,79 mg/g vs 4,94 ± 0,89 mg/g vs 4,34 ± 0,87 mg/g, respectivamente). Ratas treinadas com corrida forçada apresentaram níveis de Hsp72 maiores (p < 0,05) que as que correram voluntariamente, no VE (287,45 ± 35,86% vs 135,59 ± 5,10%, respectivamente) e no VD (241,31 ± 25,83% vs 137,91 ± 45,20%, respectivamente). CONCLUSÃO: Os programas de treinamento com corrida voluntária e forçada induziram níveis distintos de expressão de Hsp72 no miocárdio de ratas Wistar.
ARTIGO ORIGINAL
BIOLOGIA MOLECULAR
Níveis distintos de Hsp72 no miocárdio de ratas em resposta aos exercícios voluntário e forçado
Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG - Brasil
A exposição de células a diferentes situações de estresse induz a expressão de proteínas de choque térmico (HSP), também conhecidas como proteínas de estresse. Tais proteínas conferem às células tolerância a vários agentes estressores, exercem proteção ao organismo contra a desnaturação protéica e auxiliam na eliminação de proteínas danificadas1,2.
O exercício físico, tanto agudo quanto crônico, é um desses agentes estressores que podem induzir a expressão de Hsp72, forma induzível da família das Hsp de peso molecular 70kDa (Hsp70), em vários tecidos, entre os quais os músculos esquelético e cardíaco3-10. Há evidências de que a expressão de Hsp72 no miocárdio, induzida por exercício, está associada à proteção cardíaca contra eventos de estresse cardiovascular7,11-14, apesar de alguns resultados em contrário15. Todavia, a indução da expressão de Hsp72 em resposta ao exercício parece ser dependente do gênero do animal16-18 e da intensidade do exercício6.
Considerando-se que os modelos de exercício forçado para animais provocam alterações nas respostas neuroendócrinas e imunológicas comumente associadas ao estresse19-21, a indução da expressão de Hsp72 pelo exercício forçado pode sofrer interferência de fatores estressantes adversos ao exercício. Ao contrário, a corrida voluntária, modelo em que os animais têm livre acesso ao equipamento a partir da gaiola e correm voluntariamente22, provoca níveis mais baixos de estresse aos animais, em comparação à corrida forçada e à natação4,23.
Assim, este estudo teve como objetivo testar se programas de treinamento com corrida voluntária e forçada induzem níveis distintos de expressão de Hsp72 no miocárdio de ratas Wistar.
Dezoito ratas Wistar jovens (sete semanas de idade) foram usadas. Formaram-se três grupos em tempos diferentes, a saber: treinadas com corrida voluntária (TCV, n = 6); treinadas com corrida forçada (TCF, n = 6) e grupo controle (C, n = 6). Todos os animais foram manejados identicamente, porém o grupo C não executou exercício. Os animais foram alojados em gaiolas individuais de aço inox (25 x 20 x 18 cm), receberam água e ração própria
Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Federal de Viçosa, e foram seguidas as normas estabelecidas no
O primeiro grupo a exercitar-se foi o TCV, cujas ratas tiveram livre acesso à roda de corrida voluntária, acoplada às suas respectivas gaiolas de aço inox (25 x 20 x 18 cm), por oito semanas.
Essa roda de corrida voluntária tem uma circunferência interna de 1,53 m, e o número de voltas foi registrado por um contador de voltas mecânico. Dessa forma, a distância percorrida pelos animais foi calculada pelo número de voltas realizadas.
Observa-se que os roedores são animais de hábitos noturnos e, portanto, exercitam-se normalmente durante a fase de escuridão do ciclo de luminosidade.
Conhecidas as metragens médias semanais e totais percorridas pelas ratas do grupo TCV, elaborou-se o protocolo de treinamento para o outro grupo de ratas (TCF), de forma que as metragens não fossem diferentes entre os dois grupos.
Assim, as ratas do grupo TCF foram submetidas a um regime de corrida forçada em esteira rolante motorizada (Insight Instrumentos Científicos, Ribeirão Preto, SP, Brasil) por oito semanas (adaptado de Samelman)5. Os animais iniciaram o programa de exercício correndo à velocidade de 15 m/min, 0% inclinação, por 15 minutos no primeiro dia, cinco dias por semana. Essa duração foi aumentada em cinco minutos por dia, de maneira que, no último dia da segunda semana, os animais correram durante 60 minutos. A partir do primeiro dia da terceira semana, a velocidade passou para 17 m/min. Da quarta à oitava semana, a sessão de exercício foi mantida com a duração de 60 minutos por dia, 18 m/min, 0 % de inclinação, cinco dias por semana.
Esse programa de corrida em esteira foi aplicado durante a fase de escuridão do ciclo de luminosidade para não diferir do grupo TCV. Os animais foram motivados a correr com leves toques no dorso. Observa-se que esses animais foram alojados em gaiolas individuais de aço inox (25 x 20 x 18 cm), da mesma forma que os animais dos grupos TCV e C. Assim, considera-se que a movimentação (voluntária) dos animais nessas gaiolas, fora do período de treinamento, não é suficiente para provocar adaptações que possam confundir aquelas provocadas pelas corridas voluntária e forçada.
Portanto, em nenhum dos três grupos é necessário contabilizar a movimentação dos animais nas suas respectivas gaiolas, por considerar-se que é semelhante para todos os animais.
Para evitar a resposta aguda do exercício e preservar a resposta crônica, a eutanásia dos animais foi realizada 48 horas após a última sessão de exercício. Coletaram-se fragmentos dos ventrículos esquerdo e direito, que foram envolvidos em papel alumínio, identificados, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80º C para análise posterior.
Fragmentos das amostras foram retirados do
Após esse período de incubação, os restos celulares foram descartados por centrifugação a 14.000 g, a 4º C, durante 20 minutos, e o sobrenadante foi armazenado a - 20º C. Os extratos de proteínas totais foram quantificados de acordo com o método de Bradford24, utilizando-se as três réplicas preconizadas.
Eletroforese em géis de poliacrilamida (PAGE) com detergente dodecil sulfato sódio (SDS) foi realizada, essencialmente, como descrita por Laemmli25. O extrato de proteína foi incubado por cinco minutos, a 100º C, em tampão da amostra [glicerol 10% (v/v), SDS 2,3%, azul-de-bromofenol 0,25%, 2-mercaptoetanol 5% (v/v) e Tris-HCl 0,0625 mol/L, pH 6,8], antes de ser aplicado no gel. A eletroforese foi conduzida por, aproximadamente, 16 horas, a 48 V, no tampão de corrida [Tris-HCl 0,025 mol/L, glicina 0,2 mol/L, EDTA 1 mmol/L e SDS 3,5 mmol/L].
Esse procedimento foi realizado para obtenção de três géis. Um desses foi corado com solução corante [metanol 40% (v/v), CH3COOH 7,5% (v/v) e
As proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, usando-se o sistema de transferência da Biorad (EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Após a transferência (em aproximadamente uma hora, a 0,70 Amperes constantes), a membrana de nitrocelulose foi imersa em solução de bloqueio (caseína – Non-fat Dry Milk, BIORAD) por uma hora.
Em seguida, foram realizadas quatro lavagens, por 15 minutos cada, à temperatura ambiente, com TBS-T [Tris-HCl 0,01 mol/L, NaCl 1,5 mmol/L, Tween-20 0,1% (v/v), pH 7,6]. A membrana foi incubada com o anticorpo Monoclonal
Após o período de incubação, a membrana foi lavada com TBS-T quatro vezes, por 15 minutos cada, e, em seguida, foi incubada com o anticorpo Anti-Mouse IgG [fosfatase alcalina – SIGMA], em uma diluição de 1:10.000 por, aproximadamente, duas horas. A membrana foi lavada extensivamente com TBS-T, novamente por quatro vezes, de 15 minutos cada. Subsequentemente, foi incubada com tampão da enzima [Tris-HCl 0,1 mol/L, pH 9,8, NaCl 0,1 mol/L, MgCl2 0,5 mol/L] por dez minutos.
A atividade da fosfatase alcalina foi detectada, usando-se os substratos NBT [azul-nitro-tetrazolium, GIBCO/BRL] e BCIP [5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, GIBCO/BRL]. As bandas dos
As comparações das médias do peso corporal, ganho de peso e do peso relativo do coração foram feitas utilizando-se ANOVA
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG – CDS nº 947/2002).
Os animais do grupo TCV percorreram, voluntariamente, distâncias distintas, de acordo com a capacidade individual, enquanto no grupo TCF todos os animais foram forçados a percorrer a mesma distância. Dessa forma, a distância percorrida pelos animais do grupo TCV será apresentada como média (média ± EPM), e a dos animais do grupo TCF, como valor absoluto para o grupo.
Os animais do grupo TCV percorreram 4,87 ± 0,55 km/semana e um total de 38,96 ± 3,55 km, enquanto os do grupo TCF percorreram, no mesmo período, 4,88 km/semana e um total de 39,03 km. Não houve, portanto, diferença entre as distâncias percorridas nos dois modelos.
Ao final das oito semanas de treinamento, os animais dos grupos TCV e TCF exibiram um ganho de peso significativamente menor que os animais do grupo controle (
A
Observou-se, porém, que houve indução da expressão de Hsp72 em resposta aos programas de exercícios voluntário e forçado, mas em níveis distintos. O VE e o VD dos animais do grupo controle mostraram expressão de pequena quantidade de Hsp72, apresentada como unidade arbitrária (282,19 ± 20,02
Esses valores foram usados como
Observou-se que as ratas apresentaram uma variação interindividual na distância total percorrida de, aproximadamente, 3,5 km, mas não houve correlação significativa (p = 0,22) entre a distância total percorrida e a indução da expressão de Hsp72 (
Investigamos se programas de treinamento com corridas voluntária e forçada induzem níveis distintos de expressão de Hsp72 no miocárdio de ratas Wistar. Os dados demonstraram que os protocolos de exercício usados foram capazes de induzir a expressão de Hsp72 no miocárdio das ratas de forma distinta, tanto no VE quanto no VD, sendo maior na corrida forçada em esteira do que na corrida voluntária.
Os animais dos grupos exercitados, TCV e TCF, percorreram distâncias similares. Entretanto, deve salientar-se que a forma de execução da corrida é diferente entre os dois modelos. A corrida na esteira é realizada pelos animais de forma contínua, pois a velocidade da esteira permanece constante durante a sessão de treino. Porém, na roda de corrida voluntária, os animais exercitam de forma intermitente, pois correm períodos curtos (60 a 90 s), por, aproximadamente, cinco minutos, com períodos intercalados de descanso26. Assim, é possível calcular o trabalho realizado pelas ratas apenas na corrida forçada, pois esse é dado pela relação da massa corporal do animal com o tempo de execução da corrida, a velocidade da corrida e a inclinação da esteira27.
Embora o peso corporal, as distâncias percorridas e a inclinação tenham sido similares nos dois modelos, a velocidade e o tempo de execução da corrida foram diferentes. Consideramos essa falta de precisão na equivalência do trabalho realizado entre os animais dos grupos TCV e TCF uma limitação do presente estudo. Todavia, os programas de exercício utilizados reduziram o ganho de peso dos animais, comparado ao dos animais sedentários do grupo controle.
Isso indica uma interferência dos programas de corrida no organismo das ratas, pois a redução de peso corporal pode refletir o aumento da taxa de metabolismo ou do gasto energético28. Fisiologicamente, sabe-se que peso corporal similar não significa, necessariamente, composição corporal e metabolismo energético equivalentes. Entretanto, estudos prévios demonstram que treinamentos com exercício aeróbico de diferentes intensidades resultaram em diferentes alterações no peso corporal de ratos29, mas também que diferentes modelos de exercício provocaram reduções similares no ganho de peso de ratos, em comparação aos sedentários (corrida em esteira
O peso relativo do coração não foi diferente entre os três grupos experimentais. Isso sugere que os protocolos de exercício usados no presente estudo não foram suficientes para promover hipertrofia cardíaca. Entretanto, adaptações do músculo cardíaco ao exercício crônico, inclusive a indução da expressão de Hsp72, foram observadas em animais com e sem hipertrofia cardíaca12,31.
O principal achado do presente estudo diz respeito aos protocolos de exercício usados, que foram capazes de induzir a expressão de Hsp72 no miocárdio das ratas de forma distinta, no VE e no VD, sendo significativamente maior na corrida forçada em esteira do que na corrida voluntária. Esses níveis de Hsp72 aumentados refletem o maior nível de estresse intracelular gerado pelo programa de corrida forçada, em comparação ao de corrida voluntária.
Apesar de nossos dados não permitirem especificar os mecanismos responsáveis pelo aumento da expressão de Hsp72 observado, durante o exercício, vários eventos fisiológicos e metabólicos ocorrem em nível celular (por exemplo, aumento da temperatura, hipoxia, estresse oxidativo, aumento da concentração de cálcio e redução do pH) e podem, isoladamente ou em conjunto, induzir a expressão de Hsp7210,32.
Alguns estudos têm creditado altos níveis de expressão de Hsp72, em resposta à corrida na esteira, à intensidade do exercício31. De fato, Milne e Noble6 demonstraram que a indução da expressão de Hsp72 em músculos esquelético e cardíaco é dependente da intensidade do exercício, apresentando as velocidades acima de 24 m/min como as mais eficientes na indução da expressão de Hsp72.
Entretanto, sabendo-se que, no presente estudo, a velocidade durante a corrida em esteira foi 18 m/min, que a distância percorrida nos dois protocolos foi similar e que os animais podem correr a velocidades superiores a 40 m/min33 na corrida voluntária, a maior expressão de Hsp72 observada nos animais do grupo TCF parece ter sido provocada por outros fatores além da carga de exercício.
Um desses fatores poderia ser o nível de estresse proporcionado ao animal pelo modelo de exercício. Existem evidências de que, na corrida voluntária, o nível de estresse sofrido pelo animal é menor se comparado ao da corrida em esteira4,23. No presente estudo, não usamos choque elétrico para forçar os animais a correr na esteira, o que aumenta a expressão de Hsp7234, mas os animais foram estimulados com toques no dorso.
Além disso, o exercício forçado crônico pode causar estresse mental ao animal35 e outras adaptações negativas indicativas de estresse crônico (por exemplo, redução de globulinas ligantes de corticosteróides séricas, hipertrofia adrenal, involução do timo, supressão da proliferação de linfócitos e de IgM antígeno-específico)20. Na corrida voluntária, ao contrário, os animais não foram forçados a correr. Há relatos de que o treinamento com corrida voluntária reduziu os níveis de danos oxidativos ao DNA4 e reduziu a depressão comportamental induzida por estresse em ratos36.
Adicionalmente, observamos que as ratas apresentaram uma variação interindividual de, aproximadamente, 3,5 km na distância total percorrida. Todavia, a distância percorrida não apresentou correlação significativa com a indução da expressão de Hsp72 (
De fato, tem sido reportado que a corrida voluntária pode neutralizar a supressão da função imune induzida por estresse, assim como os impactos negativos do estresse no comportamento e na função imune adquirida de ratos36,37. Recentemente, Hill e cols.38 demonstraram que a corrida voluntária crônica foi capaz de aumentar a capacidade de síntese de GABA no cérebro de ratos, o que pode implicar alterações na sensibilidade ao estresse durante o exercício.
Observamos que não houve distinção regional significativa (VE
Nossos resultados evidenciam que ratas também respondem ao estresse provocado pelo exercício, aumentando a indução da expressão de Hsp72 no miocárdio. Tem sido observado que a indução da expressão de Hsp72 em resposta ao exercício é maior em ratos, o que sugere que a presença de estrogênio nas ratas é suficiente para inibir a expressão de Hsp7216-18. Entretanto, o miocárdio de ratas Sprague-Dawley exibiu duas vezes mais Hsp72 do que o de ratos39, e o músculo cardíaco de ratos não demonstrou dimorfismo sexual na expressão de Hsp72 em resposta ao choque elétrico35.
Por fim, a despeito de não termos avaliado os efeitos dos protocolos de exercício na proteção cardíaca, o aumento da expressão de Hsp72 observado aqui pode ter impactos fisiologicamente importantes na proteção do miocárdio contra eventos de estresse (por exemplo, isquemia ou reperfusão). Apesar de estudos16,18 terem reportado que a resposta da Hsp70 ao exercício físico agudo e crônico (corrida em esteira), mediada por hormônios sexo-específicos, resultou em cardioproteção, preferencialmente em ratos, Chicco e cols.40 demonstraram que ratas que correram voluntariamente por oito semanas apresentaram níveis elevados de Hsp72, os quais estavam associados a uma melhora da disfunção cardíaca induzida pela doxorubicina.
Concluímos que os programas de treinamento com corridas voluntária e forçada adotados no presente estudo induziram níveis distintos de expressão de Hsp72 no miocárdio de ratas Wistar.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado por FAPEMIG.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Correspondência: Antonio Jose Natali Avenida PH Rolfs s/n Departamento de Educação Física – Campus Universitário Universidade Federal de Viçosa – UFV Viçosa/MG – 36570-000 – Brasil E-mail:
Artigo recebido em 26/09/08; revisado recebido em 03/11/08; aceito em 02/12/08.
FUNDAMENTO: El ejercicio físico promueve estrés hemodinámico. OBJETIVO: Probar si programas de entrenamiento con carreras voluntaria y forzada inducen niveles distintos de expresión de Hsp72 en el miocardio de ratas hembra Wistar. MÉTODOS: Ratas hembra Wistar fueron distribuidas en tres grupos (n = 6, cada uno): entrenadas con carrera voluntaria (ECV), entrenadas con carrera forzada (ECF) y grupo control (C). Los animales del ECV tuvieron libre acceso a la rueda de carrera voluntaria, mientras que los del ECF fueron sometidos a carrera forzada en cinta sin fin (18 m/min, 0% inclinación, 60 m/min, 5 días/sem) durante ocho semanas. Fragmentos de los ventrículos izquierdo (VI) y derecho (VD) se recolectaron para análisis de los niveles de Hsp72. RESULTADOS: Las ratas del grupo ECV corrieron, en promedio 4,87 km, y las del ECF, 4,88 km por semana. Los animales de los grupos ECV y ECF ganaron menos peso (p<0,05) que los del grupo C (81,67 ± 11,95 g vs. 81,17 ± 10,18 g vs. 111,50 ± 2,26 g, respectivamente). El peso relativo del corazón no fue diferente (p>0,05) entre los grupos ECV, ECF y C (4,54 ± 0,79 mg/g vs. 4,94 ± 0,89 mg/g vs. 4,34 ± 0,87 mg/g, respectivamente). Las ratas entrenadas con carrera presentaron niveles de Hsp72 mayores (p<0,05) que las que corrieron voluntariamente, en el VI (287,45 ± 35,86% vs. 135,59 ± 5,10%, respectivamente) y en el VD (241,31 ± 25,83% vs. 137,91 ± 45,20%, respectivamente). CONCLUSIÓN: Los programas de entrenamiento con carreras voluntaria y forzada inducen niveles distintos de expresión de Hsp72 en el miocardio de ratas Wistar.
Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG - Brasil
Correspondencia
La exposición de células a diferentes situaciones de estrés induce la expresión de proteínas de choque térmico (HSP), también conocidas como proteínas de estrés. Tales proteínas le otorgan a las células tolerancia a varios agentes estresantes, ejercen protección del organismo contra la desnaturalización proteica y auxilian en la eliminación de proteínas dañadas1,2.
El ejercicio físico, tanto agudo como crónico, es uno de esos agentes estresantes que pueden inducir la expresión de Hsp72, forma inducible de la familia de las Hsp de peso molecular 70kDa (Hsp70), en varios tejidos, entre los cuales se encuentran los músculos esquelético y cardíaco3-10. Hay evidencias de que la expresión de Hsp72 en el miocardio, inducida por ejercicio, está asociada a la protección cardíaca contra eventos de estrés cardiovascular7,11-14, a pesar de algunos resultados en contrario15. No obstante, la inducción de la expresión de Hsp72 en respuesta al ejercicio parece ser dependiente del género del animal16-18 y de la intensidad del ejercicio6.
Considerando que los modelos de ejercicio forzado para animales provocan alteraciones en las respuestas neuroendócrinas e inmunológicas comúnmente asociadas al estrés19-21, la inducción de la expresión de Hsp72 por el ejercicio forzado puede sufrir interferencia de factores estresantes adversos al ejercicio. Al contrario, la carrera voluntaria, modelo en que los animales tiene libre acceso al equipamiento a partir de la jaula y corren voluntariamente22, provoca niveles más bajos de estrés a los animales, en comparación con la carrera forzada y la natación4,23.
Así, este estudio tuvo como objetivo probar si programas de entrenamiento con carreras voluntaria y forzada inducen niveles distintos de expresión de Hsp72 en el miocardio de ratas Wistar.
Se usaron dieciocho ratas Wistar jóvenes (siete semanas de edad). Se formaron tres grupos en tiempos diferentes, a saber: entrenadas con carrera voluntaria (ECV), entrenadas con carrera forzada (ECF) y grupo control (C). Todos los animales se manejaron de forma idéntica, sin embargo, el grupo C no realizó ejercicio. Los animales se alojaron en jaulas individuales de acero inoxidable (25 x 20 x 18 cm), recibieron agua y ración propia ad libitum, se mantuvieron en ambiente con temperatura promedio de 22ºC y se sometieron a un régimen de luminosidad de 12 horas de oscuridad por 12 horas de claridad durante el período del experimento.
Los animales fueron proporcionados por el Bioterio Central del Centro de Ciencias Biológicas y de la Salud, de la Universidad Federal de Viçosa, y se siguieron las normas establecidas en el
El primer grupo en ejercitarse fue el ECV, cuyas ratas tuvieron libre acceso a la rueda de carrera voluntaria, acoplada a sus respectivas jaulas de acero inoxidable (25 x 20 x 18 cm), por ocho semanas.
Esta rueda de carrera voluntaria tiene una circunferencia interna de 1,53 m y el número de vueltas se registró con un contador de vueltas mecánico. De esta forma, la distancia recorrida por los animales se calculó por el número de vueltas realizadas.
Se observa que los roedores son animales de hábitos nocturnos y por lo tanto, se ejercitan normalmente durante la fase de oscuridad del ciclo de luminosidad.
Conocidos los metrajes promedio semanales y totales recorridos por las ratas del grupo ECV, se elaboró el protocolo de entrenamiento para el otro grupo de ratas (ECF), de forma que los metrajes no fueron diferentes entre los dos grupos.
Así, las ratas del grupo ECF se sometieron a un régimen de carrera forzada en cinta sin fin motorizada (Insight Instrumentos Científicos, Ribeirão Preto, SP, Brasil) por ocho semanas (adaptado de Samelman)5. Los animales iniciaron el programa de ejercicio corriendo a velocidad de 15 m/min, 0% inclinación, por 15 minutos el primer día, cinco días por semana. Esta duración se aumento en cinco minutos por día, de forma que, el último día de la segunda semana, los animales corrieron durante 60 minutos. A partir del primer día de la tercera semana, la velocidad pasó para 17 m/min. De la cuarta a la octava semana, la sesión de ejercicio se mantuvo con la duración de 60 minutos por día, 18 m/min, 0% de inclinación, cinco días por semana.
Este programa de carrera en cinta se aplicó durante la fase de oscuridad del ciclo de luminosidad para no diferir del grupo ECV. Los animales eran motivados a correr con leves toques en el dorso. Debe observarse que estos animales se alojaron en jaulas individuales de acero inoxidable (25 x 20 x 18 cm), al igual que los animales de los grupos ECV y C. Así, se considera que el movimiento (voluntario) de los animales en esas jaulas, fuera del período de entrenamiento, no es suficiente para provocar adaptaciones que puedan confundir aquellas probadas por las carreras voluntaria y forzada.
Por lo tanto, en ninguno de los tres grupos es necesario contabilizar el movimiento de los animales en sus respectivas jaulas, por considerarse que es similar para todos los animales.
Para evitar la respuesta aguda del ejercicio y preservar la respuesta crónica, la eutanasia de los animales se realizó 48 horas después de la última sesión de ejercicio. Se recolectaron fragmentos de los ventrículos izquierdo y derecho, que fueron envueltos en papel aluminio, identificados, inmediatamente congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC para posterior análisis.
Se retiraron fragmentos de las muestras del freezer y, después de pesados, se maceraron para la obtención de un extracto tisular, al cual se le agregó el respectivo tampón (composición 15 mM Tris HCL; 600 mM de NaCl; 1 mM PMSF, pH 7,5). A 60 mg del extracto se agregaron 1200 µl de tampón de extracción (proporción de 1: 20). A seguir, las muestras se colocaron en
Tras ese período de incubación, los restos celulares se descartaron por centrifugación a 14.000 g, a 4ºC, durante 20 minutos, y el sobrenadante se almacenó a - 20ºC. Los extractos de proteínas totales se cuantificaron de acuerdo con el método de Bradford24, utilizando las tres réplicas preconizadas.
Se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) con detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), esencialmente, como la describe Laemmli25. El extracto de proteína se incubó por cinco minutos, a 100º C, en tampón de la muestra [glicerol 10% (v/v), SDS 2,3%, azul de bromofenol 0,25%, 2-mercaptoetanol 5% (v/v) y Tris-HCl 0,0625 mol/L, pH 6,8], antes de ser aplicado en el gel. La electroforesis se condujo por, aproximadamente, 16 horas, a 48 V, en el tampón de corrida [Tris-HCl 0,025 mol/L, glicina 0,2 mol/L, EDTA 1 mmol/L y SDS 3,5 mmol/L].
Este procedimiento se realizó para obtención de tres geles. Uno de ellos se coloreó con solución colorante [metanol 40% (v/v), CH3COOH 7,5% (v/v) y
Las proteínas se transfirieron para la membrana de nitrocelulosa, usando el sistema de transferencia de BIORAD (EEUU), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transferencia (en aproximadamente una hora, a 0,70 Amperios constantes), la membrana de nitrocelulosa fue sumergida en solución de bloqueo (caseína – Non-fat Dry Milk, BIORAD) por una hora.
A seguir, se realizaron cuatro lavados, de 15 minutos cada uno, a temperatura ambiente, con TBS-T [Tris-HCl 0,01 mol/L, NaCl 1,5 mmol/L, Tween-20 0,1% (v/v), pH 7,6]. La membrana se incubó con el anticuerpo Monoclonal
Después de ese período de incubación, la membrana se lavó con TBS-T cuatro veces, 15 minutos cada una, y a seguir se incubó con el anticuerpo Anti-Mouse IgG [fosfatasa alcalina – Sigma], en una dilución de 1:10.000 por, aproximadamente, dos horas. La membrana fue lavada extensivamente con TBS-T, nuevamente cuatro veces, de 15 minutos cada una. A continuación, se incubó con tampón de la enzima [Tris-HCl 0,1 mol/L, pH 9,8, NaCl 0,1 mol/L, MgCl2 0,5 mol/L] por diez minutos.
La actividad de la fosfatasa alcalina fue detectada usando los sustratos NBT [azul de nitrotetrazolio, GIBCO/BRL] y BCIP [5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, GIBCO/BRL]. Las bandas de los
Las comparaciones de los promedios de peso corporal, ganancia de peso y del peso relativo del corazón se realizaron utilizando ANOVA
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de Minas Gerais (FAPEMIG – CDS nº 947/2002).
Los animales del grupo ECV recorrieron, voluntariamente, distancias diferentes, de acuerdo con la capacidad individual, mientras que en el grupo ECF todos los animales fueron forzados a recorrer la misma distancia. De esta forma, la distancia recorrida por los animales del grupo ECV será presentada como promedio (promedio ± SEM), y la de los animales del grupo ECF, como valor absoluto para el grupo.
Los animales del grupo ECV recorrieron 4,87 ± 0,55 km/semana y un total de 38,96 ± 3,55 km, mientras que los del grupo ECF recorrieron, en el mismo período, 4,88 km/semana y un total de 39,03 km. No hubo, por lo tanto, diferencia entre las distancias recorridas en los dos modelos.
Al final de las ocho semanas de entrenamiento, los animales de los grupos ECV y ECF exhibieron una ganancia de peso significativamente menor que los animales del grupo control (
La
Se observó, con todo, que hubo inducción de la expresión de Hsp72 en respuesta a los programas de ejercicios voluntarios y forzado, pero en niveles diferentes. El VI y el VD de los animales del grupo control mostraron expresión de pequeña cantidad de Hsp72, presentada como unidad arbitraria (282,19 ± 20,02
Estos valores se usaron como
Se observó que las ratas presentaron una variación interindividual en la distancia total recorrida de, aproximadamente, 3,5 km, pero no hubo correlación significativa (p=0,22) entre la distancia total recorrida y la inducción de la expresión de Hsp72 (
Investigamos si programas de entrenamiento con carreras voluntaria y forzada inducen niveles distintos de expresión de Hsp72 en el miocardio de ratas Wistar. Los datos demostraron que los protocolos de ejercicio usados fueron capaces de inducir la expresión de Hsp72 en el miocardio de las ratas en forma diferente, tanto en el VI como en el VD, siendo mayor en la carrera forzada en cinta sin fin que en la carrera voluntaria.
Los animales de los grupos ejercitados, ECV y ECF, recorrieron distancias similares. No obstante, debe destacarse que la forma de ejecución de la carrera es diferente entre los dos modelos. La carrera en la cinta es realizada por los animales de forma continua, pues la velocidad de la estera permanece constante durante la sesión de entrenamiento. Sin embargo, en la rueda de carrera voluntaria, los animales se ejercitan de forma intermitente, pues corren períodos cortos (60 a 90 s), por aproximadamente cinco minutos, con períodos intercalados de descanso26. Así, es posible calcular el trabajo realizado por las ratas sólo en la carrera forzada, pues éste está dado por la relación de la masa corporal del animal con el tiempo de ejecución de la carrera, la velocidad de la carrera y la inclinación de la cinta27.
Aunque el peso corporal, las distancias recorridas y la inclinación hayan sido similares en los dos modelos, la velocidad y el tiempo de ejecución de la carrera fueron diferentes. Consideramos esta falta de precisión en la equivalencia del trabajo realizado entre los animales de los grupos ECV y ECF una limitación del presente estudio. Con todo, los programas de ejercicio utilizados redujeron la ganancia de peso de los animales, al compararla a la de los animales sedentarios del grupo de control.
Esto indica una interferencia de los programas de carrera en el organismo de las ratas, pues la reducción de peso corporal puede reflejar el aumento de la tasa de metabolismo y del gasto energético28. Fisiológicamente, se sabe que peso corporal similar no significa, necesariamente, composición corporal y metabolismo energético equivalentes. No obstante, estudios previos demuestran que entrenamientos con ejercicio aeróbico de diferentes intensidades resultaron en diferentes alteraciones en el peso corporal de las ratas29, pero también que diferentes modelos de ejercicio provocaron reducciones similares en la ganancia de peso de ratas, en comparación con las sedentarias (carrera en cinta
El peso relativo del corazón no fue diferente entre los tres grupos experimentales. Ello sugiere que los protocolos de ejercicio usados en el presente estudio no fueron suficientes para promover hipertrofia cardíaca. Sin embargo, adaptaciones del músculo cardíaco al ejercicio crónico, inclusive la inducción de la expresión de Hsp72, fueron observadas en animales con y sin hipertrofia cardíaca12,31.
El principal hallazgo del presente estudio tiene relación con los protocolos de ejercicio usados, que fueron capaces de inducir la expresión de Hsp72 en el miocardio de las ratas en forma diferente, en el VI y en el VD, siendo significativamente mayor en la carrera forzada en cinta sin fin que en la carrera voluntaria. Estos niveles de Hsp72 aumentados reflejan el mayor nivel de estrés intracelular generado por el programa de carrera forzada, en comparación al de carrera voluntaria.
A pesar de que nuestros datos no permitieron especificar los mecanismos responsables por el aumento de la expresión de Hsp72 observado, durante el ejercicio, varios eventos fisiológicos y metabólicos ocurren a nivel celular (por ejemplo, aumento de la temperatura, hipoxia, estrés oxidativo, aumento de la concentración de calcio y reducción de pH) y pueden, aisladamente o en conjunto, inducir la expresión de Hsp7210,32.
Algunos estudios han atribuido altos niveles de expresión de Hsp72, en respuesta a la carrera en la cinta, a la intensidad del ejercicio31. De hecho, Milne y Noble6 demostraron que la inducción de la expresión de Hsp72 en músculos esquelético y cardíaco es dependiente de la intensidad del ejercicio, presentando las velocidades superiores a 24 m/min como las más eficientes en la inducción de la expresión de Hsp72.
Sin embargo, sabiendo que, en el presente estudio, la velocidad durante la carrera en cinta fue 18 m/min, que la distancia recorrida en los dos protocolos fue similar y que los animales pueden correr a velocidades superiores a 40 m/min33 en la carrera voluntaria, la mayor expresión de Hsp72 observada en los animales del grupo ECF parece haber sido provocada por otros factores además de la carga de ejercicio.
Uno de esos factores podría ser el nivel de estrés proporcionado al animal por el modelo de ejercicio. Existen evidencias de que, en la carrera voluntaria, el nivel de estrés sufrido por el animal es menor al compararlo con la carrera en cinta4,23. En el presente estudio no usamos choque eléctrico para forzar los animales a correr en la cinta, lo que aumenta la expresión de Hsp7234, pero los animales fueron estimulados con toques en el dorso.
Además de ello, el ejercicio forzado crónico puede causar estrés mental al animal35 y otras adaptaciones negativas indicadoras de estrés crónico (por ejemplo, reducción de globulinas ligantes de corticosteroides séricas, hipertrofia adrenal, involución del timo, supresión de la proliferación de linfocitos y de IgM antígeno específico)20. En la carrera voluntaria, al contrario, los animales no fueron forzados a correr. Hay relatos de que el entrenamiento con carrera voluntaria redujo los niveles de daños oxidativos al ADN4 y redujo la depresión comportamental inducida por estrés en ratas36.
Además, observamos que las ratas presentaron una variación interindividual de, aproximadamente, 3,5 km en la distancia total recorrida. Con todo, la distancia recorrida no presentó correlación significativa con la inducción de la expresión de Hsp72 (
De hecho, se ha reportado que la carrera voluntaria puede neutralizar la supresión de la función inmune inducida por estrés, así como los impactos negativos del estrés en el comportamiento y en la función inmune adquirida de ratas36,37. Recientemente, Hill et al. 38 demostraron que la carrera voluntaria crónica fue capaz de aumentar la capacidad de síntesis de GABA en el cerebro de ratas, lo que puede implicar alteraciones en la sensibilidad al estrés durante el ejercicio.
Observamos que no hubo distinción regional significativa (VI
Nuestros resultados evidencias que ratas también responden al estrés provocado por el ejercicio, aumentando la inducción de la expresión de Hsp72 en el miocardio. Se ha observado que la inducción de la expresión de Hsp72 en respuesta al ejercicio es mayor en ratas macho, lo que sugiere que la presencia de estrógeno en las ratas es suficiente para inhibir la expresión de Hsp7216-18. No obstante, el miocardio de las ratas hembra Sprague-Dawley mostró dos veces más Hsp72 que el de las ratas macho39, y el músculo cardíaco de ratos macho no mostró dimorfismo sexual en la expresión de Hsp72 en respuesta al choque eléctrico35.
Finalmente, a pesar de no haber evaluado los efectos de los protocolos de ejercicio en la protección cardíaca, el aumento de la expresión de Hsp72 observado aquí puede tener impactos fisiológicamente importantes en la protección del miocardio contra eventos de estrés (por ejemplo, isquemia o reperfusión). A pesar de que estudios16,18 han reportado que la respuesta de la Hsp70 al ejercicio físico agudo y crónico (carrera en cinta), mediada por hormonas específicas de sexo, resultó en cardioprotección, preferentemente en ratas macho, Chicco et al. 40 demostraron que ratas que corrieron voluntariamente por ocho semanas presentaron niveles elevados de Hsp72, los cuales estaban asociados a una mejora de la disfunción cardíaca inducida por la doxorubicina.
Concluimos que los programas de entrenamiento con carreras voluntaria y forzada adoptados en el presente estudio indujeron niveles distintos de expresión de Hsp72 en el miocardio de ratas Wistar.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue financiado por FAPEMIG.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.
BACKGROUND: Physical exercise induces hemodynamic stress. OBJECTIVE: To evaluate if voluntary running and forced running induced different levels of stress protein (Hsp72) in the myocardium of female Wistar rats. METHODS: Female rats were randomly assigned to the following groups: forced treadmill running group (FR; n= 6), voluntary running group (VR; n=6) and control group (C; n=6). VR group animals had free access to running wheels, and those from FR group underwent a running program on a treadmill (18 m/min, 60 min/day, 5 days/wk) for 8 weeks. Left ventricle (LV) and right ventricle (RV) fragments were collected at sacrifice, and the relative immunoblot contents of stress protein (Hsp72) were determined. RESULTS: VR animals ran on average 4.87 km/wk, and FR rats ran 4.88 km/wk. Animals from VR and FR groups had less body weight gain (p<0.05) than those from C group (81.67 ± 11.95g vs 81.17 ± 10.18g vs 111.50 ± 2.26g, respectively). Heart weight/body weight ratio was not significantly different (p>0.05) among VR, FR and C groups (4.54 ± 0.79 mg/g vs 4.94 ± 0.89 mg/g vs 4.34 ± 0.87 mg/g, respectively). FR group animals had levels of Hsp72 (p<0.05) higher than those from VR, both in LV (287.45 ± 35.86 % vs 135.59 ± 5.10 %, respectively) and RV (241.31 ± 25.83 % vs 137.91 ± 45.20 %, respectively). CONCLUSION: Voluntary running and forced running induced different levels of Hsp72 in the myocardium of female Wistar rats.
Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG - Brazil
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Exposure of cells to various stressful situations induces the expression of heat shock proteins (HSP), also known as stress proteins. These proteins confers cellular tolerance to multiple stress agents, provide protection against protein denaturation and help remove damaged proteins1,2.
Both acute and chronic physical exercise are stress agents that may induce the Hsp72 expression, which is an inducible form of the HSP family with molecular weight of 70kDa (Hsp70), in various tissues, including skeletal muscle and cardiac muscle3-10. There are evidences that exercise-induced Hsp72 expression in the myocardium is associated with cardiac protection from cardiovascular stress events7,11-14, despite some opposite results15. However, exercise-induced Hsp72 expression appears to be gender specific16-18 and intensity dependent6.
Since forced exercise for animal models cause changes in the neuroendocrine and immunological responses commonly associated with stress19-21, forced exercise-induced Hsp72 expression may be affected by stress factors that are unrelated to exercise. The voluntary running model, in which the animals have free access to the exercise equipment from their cages and run voluntarily22, on the contrary, induces lower levels of stress in the animals, when compared to forced running and swimming4,23. Therefore, the objective of this study was to evaluate if voluntary and forced running training programs induce different levels of Hsp72 expression in the myocardium of female Wistar rats.
We used a total of 18 young female Wistar rats (7 weeks of age). Three groups were formed at different times, namely: voluntary running trained group (VR, n = 6) forced running trained group (FR, n = 6) and control group (C, n = 6). All animals were handled identically, but those of group C did not exercise. The animals were housed in individual stainless steel cages (25 x 20 x 18 cm) and received water and food ad libitum. The rats were kept in a controlled environment of a fixed 12:12-h light-dark cycle, with the room temperature maintained at approximately 22º C during the entire period of the experiment. The animals were provided by the Central Biotery of the Center for Biological Sciences and Health, Federal University of Viçosa, and we followed the rules established by the 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals' (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, DC 1996) and the Ethical Principles in Animal Experimentation of the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA).
The first group to be exercised was the voluntary running group, in which the rats had free access to rotating wheels attached to their stainless steel cages (25 x 20 x 18 cm), for 8 weeks. The rotating wheel had an inner circumference of 1.53 m, and the number of revolutions was recorded by a mechanical revolution counter, and the distances traveled by the animals were calculated by the number of revolutions. It is noteworthy that rodents are nocturnal animals, and, therefore, they normally exercise during the dark phase of the light-dark cycle.
The training protocol for the other group of rats (FR group) was established after the total distance and the weekly distances traveled by VR rats were recorded, so as to ensure that the distances traveled by both groups were similar. Thus, FR rats underwent a forced running program for eight weeks (adapted from Samelman)5. The animals initiated the running program on a motor treadmill (Insight Instrumentos Científicos, Ribeirão Preto, SP, Brazil) at an intensity of 15 m/min, 0% grade, for 15 minutes on the first day, five days a week. This period was increased by five minutes a day, so that in the last day of the second week, the animals ran for 60 minutes. So, by the first day of the third week, their speed had risen to 17 m/min. From the fourth to the eighth week, the exercise sessions lasted 60 minutes a day, at 18 m/min, 0% grade, five days a week. This running program was applied during the dark phase of the light-dark cycle, so as not to differ from the VR group. The animals were motivated to run by gentle tapping on their backs. It is noteworthy that these animals were housed in individual stainless steel cages (25 x 20 x 18 cm), in the same way as the VR and C groups. Thus, the voluntary movement of the animals in the cages, aside from the training period, was not considered sufficient enough to cause adaptations that could be confused with those caused by voluntary and forced running. Therefore, in none of the three groups was it necessary to take account of the movement of the animals in their cages, because they were considered similar for all animals.
To avoid the acute response to exercise and preserve the chronic response, all animals were euthanized 48 hours after the last exercise session. Fragments of the left and right ventricles were collected, wrapped in aluminum foil, identified and immediately frozen in liquid nitrogen, and stored at minus 80ºC for later analysis.
Specimen fragments were taken from the freezer and, after being weighed, they were macerated to obtain a tissue extract to which was added the buffer (composition: 15 mM Tris HCL, 600 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 7.5). 1200 µl of extraction buffer were added to 60 mg of extract (1:20 ratio). The samples were then placed in eppendorfs, which were identified and kept on ice for approximately 5 minutes. After this incubation period, the cell debris were discarded by centrifugation at 14,000 g, at 4ºC, for 20 minutes, and the supernatant was stored at minus 20ºC. Total protein extracts were quantified according to the Bradford method24, using the 3 recommended repetitions.
Electrophoreses in polyacrylamide (PAGE) gel containing the detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) have been conducted essentially as described by Laemmli25. The protein extract was incubated for 5 minutes at 100ºC in sample buffer [10% glycerol (v/v), 2.3% SDS, 0.25% bromophenol blue, 5% 2-mercaptoethanol (v/v) and 0.0625 mol/L Tris-HCl, pH 6.8] before it was loaded onto the gel. The electrophoresis was conducted for approximately 16 hours, at 48 V, in running buffer [0.025 mol/L Tris-HCl, 0.2 mol/L glycine, 1 mmol/L EDTA, and 3.5 mmol/L SDS]. This procedure was conducted to obtain 3 gels. One of these gels was stained with a staining solution [40% methanol (v/v), 7.5% CH3COOH (v/v) and 0.01% coomassie brilliant blue R-250], for approximately 12 hours, and decolorized with a decolorizing solution [10% methanol (v/v) and 7.5% acetic acid (v/v)]. The immunoblotting technique was applied to the other 2 gels to determine if the monoclonal anti-Heat Shock Protein 70 antibody against animal Hsp72 was able to recognize the protein of interest.
The proteins were transferred to a nitrocellulose membrane, using the BioRad (USA) transfer system, according to the manufacturer's instructions. After the transfer (for approximately 1 hour, at a constant amperage of 0.70A), the nitrocellulose membrane was immersed in a blocking solution (casein–non-fat dry milk, BioRad) for one hour. Then, four washes were performed for 15 minutes each, at room temperature with TBS-T [0.01 mol/L Tris-HCl, 1.5 mmol/L NaCl, 0.1% Tween-20 (v/v), pH 7.6]. The membrane was incubated with the monoclonal anti-Heat Shock Protein 70 (SIGMA) antibody at a 1:5,000 dilution for three hours under stirring. After the incubation period, the membrane was washed four times with TBS-T, for 15 minutes each, and then incubated with Anti-Mouse IgG antibody (alkaline phosphatase - SIGMA) at a 1:10,000 dilution, for approximately two hours. The membrane was extensively washed with TBS-T, four times again for 15 minutes each, and subsequently incubated with the enzyme buffer (0.1 mol/L Tris-HCl, pH 9.8, 0.1 mol/L NaCl, 0.5 mol/L MgCl2) for ten minutes. The alkaline phosphatase activity was detected, using the NBT (nitro-blue tetrazolium, GIBCO/BRL) and BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, GIBCO/BRL) substrates. The immunoblot bands were quantified by computerized densitometry using a Molecular Dynamics Personal Densitometer equipped with the program Image Quant, version 5.2 (Molecular Dynamics - USA).
Mean body weights, mean weight gains and mean relative heart weights were compared using one-way ANOVA followed by post hoc Tukey's test. Hsp72 level comparisons were performed using the Mann-Whitney test because the data did not follow the normal distribution (Kolmogorov-Smirnov, p <0.05). The tests were performed using SigmaStat (version 3.0 - Richmond - Ca) up to a 5% level of significance.
This study was funded by the Foundation for the Support of Research of the State of Minas Gerais (FAPEMIG - CDS 947/2002).
VR group animals voluntarily traveled different distances, according to their individual capacities, whereas in the FR group all animals were forced to travel the same distance. Thus, the distances traveled by the animals in the VR group are presented as mean values (mean ± SEM), and the distances traveled by the animals in the FR group as absolute values. VR group animals traveled 4.87 ± 0.55 km/week and a total of 38.96 ± 3.55 km, whereas FR group animals, in the same period, traveled 4.88 km/week and a total of 39.03 km, so there were no differences between the distances traveled in both models.
After eight weeks of training, VR group and FR group animals had significantly lower weight gain than those in the control group (
It was observed that the rats had an interindividual variation in total distance traveled of approximately 3.5 kilometers, but there was no significant correlation (p = 0.22) between the total distance traveled and the induction of Hsp72 expression (
We investigated if voluntary and forced running training programs induced different levels of Hsp72 expression in the myocardium of female Wistar rats. The data showed that the exercise protocols used in this study induced different levels of Hsp72 expression in the myocardium of female rats, both in LV and RV, and this expression was higher in the forced treadmill running program than in the voluntary running program.
VR group and FR group animals traveled similar distances. However, it should be noted that the implementation of the running programs was different in each model. In the treadmill forced running program, the animals ran on a continuous basis because the speed of the treadmill remained constant during the whole training session. In the voluntary running program, the animals exercised intermittently, by running short periods (60-90s) for about 5 minutes, interspersed with periods of rest26. Therefore, only in the forced running program it was possible to calculate the work done by the rats, which is a function of animal body mass, running time and treadmill speed and incline27. Although body mass, distances traveled and treadmill incline were similar in both models, speed and running time were different. We considered this lack of precision in the equivalence between the work done by VR and FR groups as a limitation of this study. However, the exercise programs reduced weight gain in these animals when compared to that of sedentary control animals. This indicates that exercise programs affect rat bodily functions because weight reduction may reflect an increase in metabolic rates or in energy expenditure28. Physiologically it is known that similar body weight does not necessarily mean equivalent body composition and energy metabolism. However, previous studies showed that aerobic exercise training at different intensities resulted in different changes in body weight of rats29 ;it also showed that different types of exercise caused similar weight gain reductions in rats, in comparison to sedentary rats (running on a treadmill versus swimming 30; running on a treadmill versus voluntary running)4,31. Therefore, it is reasonable to speculate that our voluntary and forced running protocols resulted in similar metabolic rates, which enables us to make comparisons between the two groups.
Relative heart weight did not differ in the three experimental groups. This suggests that the exercise protocols used in this study were not sufficient enough to promote cardiac hypertrophy. However, adaptations of cardiac muscle to chronic exercise, including the induction of Hsp72 expression were observed in animals with and without cardiac hypertrophy12,31.
The main finding of this study was that the exercise protocols used induced Hsp72 expression in the myocardium of female rats, differently in LV and RV, and significantly higher in forced running than in voluntary running. These increased levels of Hsp72 reflect an increase in the level of intracellular stress generated by the forced running program, when compared to the voluntary running program. Although our data did not specify the mechanisms responsible for the observed increase in Hsp72 expression, several physiological and metabolic events occur at cellular level (e.g. increased temperature, hypoxia, oxidative stress, increased concentration of calcium and pH reduction) during exercise, and they can induce Hsp72 expression10,32.
Some studies have credited the high levels of Hsp72 expression in response to forced running to the intensity of the exercise31. Indeed, Milne and Noble6 showed that the induction of Hsp72 expression in cardiac and skeletal muscles is dependent on the intensity of the exercise, and speeds above 24 m/minute are the most efficient for inducing Hsp72 expression. However, since in this study the speed during forced treadmill running was 18 m/min, the distances traveled in both protocols were similar, and the animals could run voluntarily at speeds exceeding 40 m/min33 the increased Hsp72 expression observed in FR group animals appears to have been caused by other factors besides the exercise load. One of these factors could be the level of stress provided by the animal model of exercise. There is evidence that the level of stress suffered by animals in voluntary running is lower in comparison to that of running on a treadmill4,23. In the present study, we did not use electric shock to force the animals to run on a treadmill, which increases Hsp72 expression34, but the animals were stimulated with taps on the back.Furthermore, chronic forced exercise can cause mental stress to the animals35 and other negative changes that are indicative of chronic stress (e.g. reduction of serum corticosteroid-binding globulin, adrenal hypertrophy, thymus involution, suppression of lymphocyte proliferation, and antigen-specific IgM)20. In voluntary running, on the other hand, the animals were not forced to run. There are reports that voluntary running training reduced the levels of oxidative damage to the DNA4 and reduced the behavioral depression induced by stress in rats36.
Furthermore, we observed that the rats showed an interindividual variation in total distance traveled of approximately 3.5 km. However, the distance traveled showed no significant correlation with the induction of Hsp72 expression (
We noticed that there was no significant regional distinction (LV
Our results provide evidence that female rats also respond to the stress caused by exercise, by increasing the induction of Hsp72 expression in the myocardium. It has been observed that the induction of Hsp72 expression in response to exercise is greater in male rats, suggesting that the presence of estrogen in female rats is sufficient to inhibit Hsp72 expression16-18. However, the myocardium of female Sprague-Dawley rats exhibited two times more Hsp72 than those of male rats39, and the heart muscle of rats showed no sexual dimorphism in the Hsp72 expression in response to electric shock35.
Finally, even though we did not evaluate the effects of exercise protocols on cardiac protection, the increased Hsp72 expression observed here may have physiologically significant effects on myocardial protection against stress events (e.g. ischemia/reperfusion)16,18. Although some studies have reported that the Hsp70 response to acute and chronic exercise (running on a treadmill), mediated by gender-specific hormones, resulted in cardiac protection, preferably in male rats, Chicco et al40 demonstrated that female rats that voluntarily ran for eight weeks showed elevated levels of Hsp72, which were associated with an improvement in the cardiac dysfunction, induced by doxorubicin.
We concluded that the training programs with the voluntary and forced running programs used in this study induced different levels of Hsp72 expression in the myocardium of female Wistar rats.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPEMIG.
This study is not associated with any post-graduation program.