IFaculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA, Belém, PA
IIUniversidade Federal do Sergipe –UFS, Aracajú, SE
IIIUniversidade Feral do Piauí – UFPI, Teresina, PI
IVFaculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ/USP, São Paulo, SP, Brasil
VInstituto do Coração – Incor, São Paulo, SP, Brasil
Células-tronco têm sido utilizadas no tratamento de doenças cardíacas, estando relacionadas à possível neovascularização e formação de tecido1. O transplante de células-tronco tem sido realizado através das técnicas intracoronária, intramiocárdica, e de infusão retrógrada2-4; entretanto, ela apresenta limitações e tem aplicação reduzida na prática clínica.
Estudos anteriores testaram o espaço pericárdico para administração de fármacos5. Em teoria, a abordagem transpericárdica apresenta vantagens potenciais para a administração de células, incluindo a característica não-vascular do saco pericárdico, o que pode permitir procedimentos repetidos. O espaço pericárdico pode servir como um compartimento de armazenagem, dessa forma aumentando a biodisponibilidade local das células infundidas. Entretanto, a abordagem transpericárdica para terapia de células-tronco tem sido pouco explorada.
Este estudo preliminar avalia se a administração de Células Mononucleares de Medula Óssea (CMMO) autólogas no saco pericárdico resulta em
O presente estudo objetivou avaliar se o
Os animais foram pré-medicados com cloridrato de quetamina intramuscular (5mg/kg) e Midazolan (0,5 mg/kg). A indução foi realizada com propofol IV (5mg/kg) e a manutenção com isofluorano. Uma amostra de 60 mL de aspirado de medula óssea foi obtida utilizando-se uma agulha para punção óssea introduzida na crista ilíaca.
O aspirado de medula óssea foi diluído em solução salina e as CMMO foram separadas por gradiente de densidade utilizando-se Ficoll-PaqueTM Plus® (Amersham Pharmacia). Após 20 minutos de centrifugação a 2.000 rpm (20ºC), formou-se um halo de CMMO. As células da medula óssea foram aspiradas e adicionadas à solução salina para posterior centrifugação (7 minutos a 2.000 rpm e 20ºC). O aglomerado de células foi suspenso em solução salina e filtrado em um Mesh de Aço Inoxidável. O filtrado foi re-suspenso em solução salina e re-centrifugado como descrito acima. Uma alíquota da solução foi submetida à coloração com azul-de-tripan e avaliada em uma câmara de Neubauer para determinar viabilidade. Separamos um total de 108 células, as quais foram marcadas com 1
O espaço pericárdico foi acessado através da região sub-xifóide usando uma agulha de epidural (
Segundo as descrições anteriores6, um infarto agudo do miocárdio foi induzido em 3 animais imediatamente antes da injeção de CMMO. Após o acesso da artéria femoral através de dissecção romba, um cateter-guia 6F de Judkins foi manipulado sob orientação fluoroscópica até a coronária esquerda e seletivamente canulado. Um fio guia de 0,014" foi inserido na artéria descendente anterior esquerda, sobre o qual um cateter-balão foi posicionado exatamente distal à origem do primeiro ramo diagonal. Um infarto agudo do miocárdio da parede anterior foi induzido através da oclusão total da artéria por um período de 45 minutos.
Os animais foram sacrificados após 21 dias. O coração foi removido e os ventrículos separados dos átrios no nível do sulco atrioventricular. Os ventrículos foram fatiados e os fragmentos coletados para análise das regiões basal, medial e apical. As amostras foram processadas para microscopia ótica padrão e análise imunohistoquímica. Os fragmentos utilizados na análise imunohistoquímica foram embebidos em uma solução de 3 partes de PBS e 7 partes de glicerol e crio-preservadas em nitrogênio e armazenadas em um freezer a -80ºC. As análises foram realizadas em fatias congeladas usando-se um microscópio epifluorescente (microscópio Leica® DM 50). O
Variáveis contínuas são apresentadas como média ± desvio-padrão e variáveis discretas como quantidades e porcentagens. O teste T de Student foi utilizado para comparar a contagem de células entre os grupos do estudo.
Uma morte experimental ocorreu no grupo de infarto induzido devido à fibrilação ventricular durante o inflar do balão. O animal morreu antes da administração das CMMO e não foi considerado na análise. Todos os outros 6 animais completaram o procedimento sem complicações.
O acesso ao espaço pericárdico foi realizado sem intercorrências e a dose completa das CMMO foi administrada em todos os casos. Não houve complicações decorrentes da punção, perfuração da câmara cardíaca, arritmia ou instabilidade hemodinâmica durante a manipulação intrapericárdica e infusão das células.
Não houve mortes pós-procedimento. Todos os animais sobreviveram ao procedimento índex, completando o protocolo de 21 dias do estudo sem eventos adversos ou sinais de insuficiência cardíaca.
Em todos os animais, a superfície pericárdica parecia normal à inspeção visual, sem depósitos de fibrina, fibrose, aderências ou neovascularizações visíveis. Nos animais com infarto induzido, uma cicatriz miocárdica era claramente identificável na parede anteroapical.
Em ambos os grupos (infartado e não-infartado), a avaliação microscópica mostrou uma média de 109.494 ± 46.505 CMMO em
Em nosso estudo preliminar, demonstramos que a administração intrapericárdica é capaz de induzir o
Nossos resultados sugerem que as CMMO são capazes de penetrar no miocárdio, através do pericárdio visceral, após a sua administração no espaço pericárdico. Nossos achados são similares àqueles descritos para as técnicas intracoronária, retrógrada e intramiocárdica6,7. Entretanto, a injeção intrapericárdica apresenta características que podem traduzir-se em vantagens para o uso clínico, relacionadas à sua natureza minimamente invasiva e a não-necessidade de entrada arterial. A segurança do acesso transpericárdico foi relatada anteriormente para outras aplicações, muito embora o treinamento em punção cardíaca seja altamente necessário. Entretanto, a abordagem transpericárdica pode teoricamente ser pelo menos tão segura quanto a administração intramiocárdica de células comumente relatada8. Além disso, os custos da aplicação da técnica transpericárdica são mais baixos do que as técnicas intracoronária, retrograda e intramiocárdica3,9.
Tem sido relatado que o fluido pericárdico tem uma baixa taxa de
Em nosso estudo, observamos uma penetração difusa das CMMO através do miocárdio, o que contrasta com a natureza mais localizada das técnicas intracoronária, intramiocárdica ou retrógrada3,7,8. É possível, portanto, prever possíveis aplicações da abordagem transpericárdica para formas difusas de cardiomiopatia. Por outro lado, a concentração de células foi significantemente mais alta nas regiões com infarto agudo do miocárdio. Esse achado sugere que fatores locais na região infartada podem interagir para aumentar a migração e/ou sobrevivência celular no miocárdio lesionado.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado por FAPESP e Incor-SP.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Érika Renata Branco pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo - FMVZ/USP - Departamento de Cirurgia
Érika Branco Av. Pte. Tancredo Neves, 2501 – Montese Caixa Postal: 917 66077-530 - Belém – PA - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 09/07/08; revisado recebido 21/10/08; aceito em 21/10/08.
IFaculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA, Belém, PA - Brasil
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Correspondencia
Las células madre se utilizan en el tratamiento de enfermedades cardíacas, estando relacionadas a la posible neovascularización y formación de tejido1. El transplante de células madre se realiza mediante técnicas intracoronaria, intramiocárdica, y de infusión retrógrada2-4; con todo, ésta presente limitaciones y tiene aplicación reducida en la práctica clínica.
Estudios anteriores probaron el espacio pericárdico para la administración de fármacos5. En teoría, el abordaje transpericárdico presenta ventajas potenciales para la administración de células, incluyendo la característica no vascular del saco pericárdico, lo que puede permitir procedimientos repetidos. El espacio pericárdico puede servir como un compartimiento de almacenaje, aumentando de esa forma la biodisponibilidad local de las células infundidas. No obstante, el abordaje transpericárdico para terapia de células madre ha sido poco explorada.
Este estudio preliminar evalúa si la administración de Células Mononucleares de Médula Ósea (CMMO) autólogas en el saco pericárdico resulta en
El presente estudio tuvo por objetivo evaluar si el
Los animales fueron premedicados con clorhidrato de ketamina intramuscular (5mg/kg) y Midazolam (0,5 mg/kg). La inducción se realizó con propofol IV (5mg/kg) y el mantenimiento con isofluorano. Se obtuvo una muestra de 60 ml de aspirado de médula ósea utilizando una aguja para punción ósea introducida en la cresta ilíaca.
El aspirado de médula ósea se diluyó en solución salina y se separaron las CMMO por gradiente de densidad utilizando Ficoll-PaqueTM Plus® (Amersham Pharmacia). Después de 20 minutos de centrifugación a 2.000 rpm (20ºC), se formó un halo de CMMO. Las células de médula ósea se aspiraron y se agregaron a la solución salina para posterior centrifugación (7 minutos a 2.000 rpm y 20ºC). El aglomerado de células se suspendió en solución salina y se filtró con malla de acero inoxidable. El filtrado se resuspendió en solución salina y se recentrifugó como se describió anteriormente. Una alícuota de la solución se sometió a coloración con azul tripán y se evaluó en una cámara de Neubauer para determinar su viabilidad. Separamos un total de 108 células, las cuales se marcaron con 1
Se accedió al espacio pericárdico a través de la región subxifoidea usando una aguja de epidural (
Según las descripciones anteriores6, se indujo infarto agudo de miocardio en 3 animales inmediatamente antes de la inyección de CMMO. Tras el acceso de la arteria femoral mediante disección roma, se manipuló un catéter guía 6F de Judkins bajo orientación fluoroscópica hasta la coronaria izquierda y fue selectivamente canulado. Un hilo guía de 0,014" se insertó en la arteria descendente anterior izquierda, sobre el cual se posicionó un catéter balón, exactamente distal al origen de la primera rama diagonal. Se indujo un infarto agudo de miocardio de la pared anterior mediante la oclusión total de la arteria por un período de 45 minutos.
Los animales fueron sacrificados después de 21 días. El corazón fue removido y se separaron los ventrículos de los atrios en el nivel del surco atrioventricular. Los ventrículos se cortaron en rebanadas y los fragmentos se recolectaron para análisis de las regiones basal, media y apical. Las muestras se procesaron para microscopía óptica estándar y análisis inmunohistoquímico. Los fragmentos utilizados en el análisis inmunohistoquímico fueron embebidos en una solución de 3 partes de PBS y 7 partes de glicerol y se preservaron criogénicamente en nitrógeno, y se almacenaron en freezer a -80ºC. Los análisis se realizaron en rebanadas congeladas usando un microscopio epifluorescente (microscopio Leica® DM 50). El
Las variables continuas se presentan como promedio ± desviación estándar y las variables discretas como cantidades y porcentajes. El test
Una muerte experimental ocurrió en el grupo de infarto inducido debido a fibrilación ventricular al inflar el balón. El animal se murió antes de la administración de las CMMO y no se consideró en el análisis. Los otros 6 animales completaron el procedimiento sin complicaciones.
El acceso al espacio pericárdico se realizó son complicaciones y la dosis completa de las CMMO se administró en todos los casos. No hubo complicaciones derivadas de la punción, perforación de la cámara cardíaca, arritmia o inestabilidad hemodinámica durante la manipulación intrapericárdica e infusión de las células.
No se registraron muertes post procedimiento. Todos los animales sobrevivieron al procedimiento index, completando el protocolo de 21 días del estudio sin eventos adversos o señales de insuficiencia cardíaca.
En todos los animales, la superficie pericárdica parecía normal a la inspección visual, sin depósitos de fibrina, fibrosis, adherencias o neovascularizaciones visibles. En los animales con infarto inducido, una cicatriz miocárdica era claramente identificable en la pared anteroapical.
En ambos grupos (infartado y no infartado), la evaluación microscópica mostró un promedio de 109.494 ± 46.505 CMMO en
En nuestro estudio preliminar demostramos que la administración intrapericárdica es capaz de inducir el
Nuestros resultados sugieren que las CMMO son capaces de penetrar en el miocardio, a través del pericardio visceral, después de su administración en el espacio pericárdico. Nuestros hallazgos son similares a aquellos descritos para las técnicas intracoronaria, retrógrada e intramiocárdica6,7. No obstante, la inyección intrapericárdica presenta características que pueden traducirse en ventajes para el uso clínico, relacionadas a su naturaleza mínimamente invasiva y la no necesidad de entrada arterial. La seguridad del acceso transpericárdico fue relatada anteriormente para otras aplicaciones, aunque el entrenamiento en punción cardíaca sea altamente necesario. Con todo, el abordaje transpericárdico puede teóricamente ser, como mínimo, tan seguro como la administración intramiocárdica de células comúnmente relatada8. Además de ello, los costos de la aplicación de la técnica transpericárdica son más bajos que las técnicas intracoronaria, retrógrada e intramiocárdica3,9.
Hay relatos de que el fluido pericárdico tiene una baja tasa de
En nuestro estudio observamos una penetración difusa de las CMMO a través del miocardio, lo que se contrapone con la naturaleza más localizada de las técnicas intracoronaria, intramiocárdica o retrógrada3,7,8. Es posible, por lo tanto, prever posibles aplicaciones del abordaje transpericárdico para formas difusas de cardiomiopatía. Por otro lado, la concentración de células fue significativamente más alta en las regiones con infarto agudo de miocardio. Este hallazgo sugiere que factores locales en la región infartada pueden interactuar para aumentar la migración y/o supervivencia celular en el miocardio lesionado.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue financiado por FAPESP e Incor-SP.
Este artículo es parte de la tesis de Doctorado de Érika Renata Branco de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de São Paulo - FMVZ/USP - Departamento de Cirugía.
IFaculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA, Belém, PA, Brasil
IIUniversidade Federal do Sergipe –UFS, Aracajú, SE, Brasil
IIIUniversidade Feral do Piauí – UFPI, Teresina, PI, Brasil
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Stem cells have been explored as a treatment for cardiac diseases, being related to possible neovascularization and tissue formation1. Stem cell transplantation has been performed through intracoronary, intramyocardial and retrograde infusion techniques2-4; however, it presents limitations and has reduced applications in clinical practice.
Previous studies tested the pericardial space for drug administration5. Theoretically, the transpericardial approach presents potential advantages for cell administration, including the pericardial sac's non-vascular characteristic that may permit repeated procedures. The pericardial space may serve as a depot compartment, thereby enhancing local bioavailability of infused cells. However, the transpericardial approach for stem cell therapy has been poorly explored.
This preliminary study evaluates whether the administration of autologous Bone Marrow Mononuclear Cells (BMMC) into the pericardial space is followed by myocardial cell homing in control and myocardial infarction-induced cases.
This study aimed at evaluating whether myocardial cell homing occurs after the injection of autologous BMMC into pericardial space. Seven domestic female swine were divided into two groups: induced myocardial infarction (n=3) and non-myocardial infarction (n=3). One animal from the induced myocardial infarction group died before the BMMC injection. Animals were euthanized for heart examination 21 days after BMMC injection. Protocols were approved by the local Bioethics Committee.
Animals were pre-medicated with intramuscular chloridrate of ketamine (5mg/kg) and midazolam (0.5 mg/kg). Induction was performed with intravenous propofol (5mg/kg) followed by maintenance with isofluorane. A 60-ml bone marrow aspirate was obtained using a bone puncture needle introduced in iliac crest.
The aspirated bone marrow was diluted into saline and BMMC were separated by density gradient using Ficoll-PaqueTM Plus® (Amersham Pharmacia). After 20-minute centrifugation at 2000 rpm (20ºC), a halo of BMMC cells was formed. Bone marrow cells were aspirated and added to saline for further centrifugation (7 minutes at 2000 rpm and 20ºC). Agglomerated cells were suspended in saline and filtrated in a 150 Mesh stainless steel mesh. The filtrate was re-suspended in saline and re-centrifuged as described above. An aliquot of the solution was Trypan-blue stained and evaluated in a Neubauer chamber to determine viability. We separated 1x108 cells and DNA stained with 1
Pericardial space was accessed through the subxiphoid region using an epidural needle (
Following the previously described procedures 6, an acute myocardial infarction was induced in 3 animals immediately before BMMC injection. After accessing the femoral artery by blunt dissection, a 6F right Judkins guiding catheter was manipulated under fluoroscopic guidance up to the left coronary and selectively cannulated. A 0.014" guide-wire was inserted into the left anterior descending artery, over which a balloon catheter was positioned just distal to the origin of the first diagonal branch. An acute myocardial infarction of anterior wall was induced by a 45-minute total occlusion of artery.
Animals were euthanized after 21 days. The heart was collected and the ventricles were separated from the atria at the level of the atrioventricular groove. Ventricles were sliced and the fragments were collected for analysis from the basal, medial, and apical regions. Specimens were processed for standard optical microscopy, and immunohistochemical analysis. Immunohistochemistry fragments were embedded in a solution of 3 parts of PBS and 7 parts of glycerol, and cryopreserved in nitrogen, and stored in a -80ºC freezer. Analyses were performed on frozen slices using an epifluorescence microscope (Leica® DM 50 microscope). BMMC myocardial homing was estimated by total number of BMMC stained with Hoechst® present in the ventricular myocardium.
Continuous variables are presented as averages ± standard deviation and discrete variables as counts and percentages. Student's T test was used to compare cell counting between the study groups.
One experimental death in the infarction group occurred due to ventricular fibrillation during the balloon inflation. The animal died before the administration of BMMC and was not considered for the analysis. All other 6 animals completed the procedure without complications.
Pericardial space access was attained without accidents and the full dose of BMMC was administered in all cases. No puncture complications, heart chamber perforation, arrhythmia, or hemodynamic instability occurred during intrapericardial manipulation and cell infusion.
There were no post-procedure deaths. All animals survived to index procedure completing 21 study-days protocol without adverse events or signs of heart failure.
In all animals, pericardial surface seemed normal at visual inspection, without fibrin deposition, fibrosis, adherences or visible neovascularization. In animals with induced infarction, a clear myocardial scar was identified at the anteroapical wall.
In both groups (infarcted and non-infarcted pigs), microscopic evaluation showed an average of 109494 ± 46505 BMMC homing in the myocardium. Furthermore, myocardial homing was significantly pronounced in the infarction group than in animals without infarction (150342±22456 vs. 68645±19421; p<0.01). Degrees of penetration of BMMC into the myocardium varied throughout the heart. The largest penetration of BMMC in the myocardium occurred in the infarcted area. BMMC were observed adhered to the wall epithelia of small vessels in the infarcted area (
In our preliminary study, we demonstrated that the intrapericardial administration of BMMC is able to induce myocardial homing in swine. Moreover, after 21 days, cell homing was more extensive in animals with induced acute myocardial infarction.
Our results suggest that BMMC are able to penetrate the myocardium through the visceral pericardium, following the administration at the pericardial space. Our findings are similar to those described for the intracoronary, retrograde and intramyocardial techniques6,7. However, the intrapericardial injection presents characteristics that may translate into advantages for clinical use, related to its minimally invasive nature and non-necessity of arterial entry. The safety of transpericardial access has been reported previously for other applications, even though training in cardiac punction is highly necessary. Nevertheless, the transpericardial approach might theoretically be at least as safe as the commonly reported intramyocardial cell administration8. Moreover, costs of application of the transpericardial technique are lower than intracoronary, retrograde and intramyocardial ones3,9.
Pericardial fluid has been reported to present a low turnover rate, indicating the potential of the pericardial space to function as a reservoir for delayed delivery of pharmacological agents, which can be administered at high concentrations without systemic effects5,10. Accordingly, the depot ability of the pericardial space may prove beneficial for cell therapy, as it may prolong the bioavailability of viable cells for myocardial penetration.
In our study, we observed a diffuse penetration of BMMC across the myocardium, which contrasts with the more localized nature of intracoronary, intramyocardial, or retrograde techniques3,7,8. It is possible, therefore, to foresee possible application of transpericardial approach to diffuse forms of cardiomyopathy. On the other hand, cell concentration was significantly higher in regions with acute myocardial infarction. This finding suggests that local factors at the infarcted region may interact to increase either cell migration and/or cell survival at the injured myocardium.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP and Incor-SP.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Érika Renata Branco, from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo - FMVZ/USP - Departamento de Cirurgia.