FUNDAMENTO: Os mecanismos envolvidos na maior remodelação causada pelo betacaroteno após o infarto são desconhecidos. OBJETIVO: Analisar o papel da lipoperoxidação na remodelação ventricular após o infarto do miocárdio, em ratos suplementados com betacaroteno. MÉTODOS: Ratos foram infartados e distribuídos em dois grupos: C (controle) e BC (500mg/kg/dieta). Após seis meses, foram realizados ecocardiograma e avaliação bioquímica. Utilizamos o teste t, com significância de 5%. RESULTADOS: Os animais do grupo BC apresentaram maiores médias das áreas diastólicas (C = 1,57 ± 0,4 mm²/g, BC = 2,09 ± 0,3 mm²/g; p < 0,001) e sistólicas (C = 1,05 ± 0,3 mm²/g, BC = 1,61 ± 0,3 mm²/g; p < 0,001) do VE, ajustadas ao peso corporal do rato. A função sistólica do VE, avaliada pela fração de variação de área, foi menor nos animais suplementados com betacaroteno (C = 31,9 ± 9,3 %, BC = 23,6 ± 5,1 %; p = 0,006). Os animais suplementados com betacaroteno apresentaram valores maiores da relação E/A (C = 2,7 ± 2,5, BC = 5,1 ± 2,8; p = 0,036). Não foram encontradas diferenças entre os grupos em relação aos níveis cardíacos de GSH (C = 21 ± 8 nmol/mg de proteína, BC = 37 ±15 nmol/mg de proteína; p = 0,086), GSSG (C = 0,4 (0,3-0,5) nmol/g de proteína, BC = 0,8 (0,4-1,0; p = 0,19) de proteína; p = 0,246) e lipoperóxidos (C = 0,4 ± 0,2 nmol/mg de tecido, BC = 0,2 ± 0,1 nmol/mg de tecido; p = 0,086). CONCLUSÃO: A maior remodelação em animais infartados e suplementados com betacaroteno não depende da lipoperoxidação.
ARTIGO ORIGINAL
EXPERIMENTAL
IIDepartamento de Bioquímica - Instituto de Biociências - UNESP2, Botucatu, SP - Brasil
Após o infarto agudo do miocárdio (IAM), podem ocorrer alterações da arquitetura ventricular, envolvendo tanto a região infartada como a não infartada. É aceito que as alterações morfológicas sejam o reflexo de alterações celulares, moleculares e intersticiais cardíacas, que ocorrem em resposta à determinada agressão. O conjunto dessas adaptações - que são detectadas clinicamente por alterações na composição, massa, volume e geometria cardíaca -, é chamado de remodelação miocárdica1-4.
A intensidade do processo de remodelação ventricular está diretamente associada a um pior prognóstico, principalmente porque a remodelação está relacionada ao aparecimento e à progressão da disfunção ventricular. Assim, inúmeras estratégias vêm sendo utilizadas para prevenir ou atenuar o processo de remodelação ventricular após o IAM5-7.
Um dos principais moduladores do processo de remodelação é o estresse oxidativo. Entre outros mecanismos fisiopatológicos, uma das principais consequências do estresse oxidativo é a lipoperoxidação. Assim, se aceita que o estresse oxidativo possa ser um indutor de danos celulares que alteram variáveis funcionais e estruturais cardíacas, participando da fisiopatologia da insuficiência cardíaca secundária a vários estímulos, inclusive o IAM8-11.
Considerando que o betacaroteno, por possuir habilidade de inativar as espécies reativas de oxigênio, é considerado um antioxidante12,13, a suplementação de betacaroteno poderia ser benéfica após o IAM. Assim, em um trabalho anterior de nosso laboratório, foram avaliados os efeitos da suplementação de betacaroteno no processo de remodelação ventricular após o IAM. Contrariamente ao esperado, entretanto, a suplementação com betacaroteno resultou em intensificação da remodelação, acompanhada por piora da função cardíaca14. Os mecanismos responsáveis por esse fenômeno, no entanto, ainda não estão esclarecidos. Uma das possibilidades seria que o betacaroteno, em situação de grande estímulo oxidativo, deixaria de exercer atividade antioxidante e passaria a apresentar atividade pró-oxidante15.
Pelo exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a participação da lipoperoxidação nas alterações morfológicas e funcionais cardíacas, induzidas pela suplementação de betacaroteno em ratos infartados.
O protocolo experimental do presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal de nossa instituição, estando em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 200 e 250 gramas. O infarto agudo foi produzido de acordo com o método previamente descrito16. Em resumo, os ratos (n = 120) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50mg/kg) e cloridrato de xilidino (1mg/kg), e então submetidos à toracotomia lateral esquerda. Durante o experimento, os animais respiraram espontaneamente, com suplementação de oxigênio a 100%, ofertado por cateter. Após a exteriorização do coração, o átrio esquerdo foi afastado e a artéria coronária esquerda ligada com fio mononáilon 5.00, entre a saída da artéria pulmonar e o átrio esquerdo. A seguir, o coração retornou ao tórax, os pulmões foram inflados com pressão positiva e o tórax foi fechado por suturas com algodão 10.
Os animais foram mantidos em gaiolas para recuperação; alimentados com ração comercial padrão e livre acesso a água; com controle de luz, ciclos de 12 horas; temperatura de aproximadamente 250C e umidade controlada.
Após 48 horas do infarto, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos: grupo C (n = 25), formado pelos animais infartados alimentados com ração comercial padrão; e grupo BC (n = 27), formado pelos animais infartados que receberam dieta suplementada com betacaroteno na dose de 500mg/kg/dieta. Todas as análises foram feitas por examinadores sem conhecimento dos grupos dos animais.
Após seis meses de tratamento, os animais sobreviventes foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50mg/kg) e cloridrato de xilidino (1mg/kg), para o estudo ecocardiográfico. Após a tricotomia da região anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito dorsal em canaleta especialmente projetada, que permite a leve rotação lateral esquerda para realização do exame, utilizando-se equipamento da Philips (modelo TDI 5500) dotado de transdutor eletrônico multifrequencial até 12 MHz. A avaliação dos fluxos transvalvares mitral e aórtico foi realizada com o mesmo transdutor operando em 5,0 MHz. As medidas das estruturas cardíacas foram efetuadas nas imagens monodimensionais, obtidas com o feixe de ultrassom orientado pela imagem bidimensional, na posição paraesternal eixo menor. A imagem da cavidade ventricular esquerda foi obtida posicionando o cursor do modo-M entre os músculos papilares, logo abaixo do plano da valva mitral. As imagens da aorta e do átrio esquerdo foram obtidas na posição paraesternal eixo menor, com o cursor do modo-M posicionado ao nível da valva aórtica. O registro da imagem monodimensional (velocidade: 100 mm/s) foi realizado por meio da impressora modelo UP-890MD da Sony Co. Todas as medidas foram efetuadas de acordo com as recomendações da
Após o estudo ecocardiográfico, os animais foram sacrificados com pentobarbital; os corações dos animais foram retirados, dissecados e os ventrículos direito e esquerdo, incluindo o septo interventricular, foram separados e pesados.
Amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol a 10% por período de 48 horas, segundo método já descrito19,20. Os cortes histológicos foram corados em lâmina com solução de Hematoxilina-Eosina (HE) para aferição de áreas da secção transversa dos miócitos, empregando-se microscópio LEICA DM LS acoplado a uma câmera de vídeo, que envia imagens digitais a um computador dotado do programa de análise de imagens Image Pro-plus (
Lâminas com cortes histológicos coronais de 6 micras - corados pela técnica de Picro Sirius
Para avaliação bioquímica, foram realizadas dosagens dos níveis de glutationa reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSH), relação GSH/GSSG e lipoperóxidos, segundo técnica já padronizada21. As dosagens foram realizadas no fígado e no coração.
Considerando que os dados apresentaram distribuição normal, as comparações foram feitas pelo teste t de Student. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Para a relação GSH/GSSG, os dados estão expressos em mediana e intervalo interquartil e foram analisados pelo teste de Mann-Whitney. O nível de significância foi de 5%. As análises estatísticas foram feitas com o programa SigmaStat
Ao final do estudo, 13 animais controle e 15 animais suplementados com betacaroteno sobreviveram ao período de seis meses (p > 0,05).
Os resultados do estudo ecocardiográfico estão na
Os resultados do estudo morfométrico estão na
Em relação às dosagens bioquímicas, não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto aos níveis hepáticos de GSH (C = 17 ± 7 nmol/mg de proteína, BC = 27 ± 14 nmol/mg de proteína; p = 0,250); GSSG (C = 0,3 ± 0,1 nmol/g de proteína, BC = 0,4 ± 0,2 nmol/g de proteína; p = 0,246); GSH/GSSG (C = 4377 (2738-8249), BC = 2012 (1116-4488); p = 0,286) e lipoperóxidos (C = 0,3 ± 0,1 nmol/mg de tecido, BC = 0,2 ± 0,1 nmol/mg de tecido; p = 0,159). Do mesmo modo, não foram encontradas diferenças entre os grupos em relação aos níveis cardíacos de GSH (C = 21 ± 8 nmol/mg de proteína, BC = 37 ±15 nmol/mg de proteína; p = 0,086); GSSG (C = 0,4 (0,3-0,5) nmol/g de proteína, BC = 0,8 (0,4-1,0; p = 0,19) de proteína; p = 0,246); GSH/GSSG (C = 56 ±7, BC = 53 ± 14; p = 0,709) e lipoperóxidos (C = 0,4 ± 0,2 nmol/mg de tecido, BC = 0,2 ± 0,1 nmol/mg de tecido; p = 0,086).
O objetivo deste trabalho foi analisar a participação da lipoperoxidação no processo de remodelação ventricular, após o infarto agudo do miocárdio, em ratos suplementados com betacaroteno. Nosso trabalho confirmou que a suplementação de betacaroteno intensifica a remodelação cardíaca pós-IAM. No entanto, contrariamente ao esperado, a piora da remodelação não parece ser dependente da lipoperoxidação.
O primeiro aspecto a ser considerado refere-se ao fato de que nosso trabalho confirmou os achados relatados previamente em relação aos efeitos da suplementação do betacaroteno no processo de remodelação ventricular após o IAM14. De fato, a suplementação do betacaroteno resultou em aumento dos diâmetros ventriculares, tanto sistólico como diastólico, indicando piora do processo de remodelação ventricular esquerda. O aumento da cavidade ventricular foi acompanhado pela diminuição da espessura da parede posterior do VE. Esse fato, associado ao não aumento da área seccional do miócito, pode sugerir que a suplementação de betacaroteno resulta em crescimento celular de padrão excêntrico.
O segundo aspecto relevante de nosso trabalho está associado ao conceito de que a remodelação cardíaca resulta, invariavelmente, em uma queda progressiva da função sistólica ventricular. Inicialmente, em consequência do crescimento celular, a remodelação pode contribuir para manter ou restaurar a função cardíaca. Cronicamente, entretanto, ocorrem alterações bioquímicas, genéticas e estruturais que vão resultar em disfunção sistólica ventricular progressiva2-4. Em consonância com esse conceito, nos ratos suplementados com betacaroteno, o processo de remodelação foi acompanhado pela queda da fração de variação de área. Outros sinais indiretos de disfunção ventricular foram encontrados nos animais suplementados com betacaroteno, como, por exemplo, aumento da frequência cardíaca e hipertrofia do ventrículo direito. É interessante notar que, em nosso trabalho, identificamos também alterações na função diastólica. O aumento da relação E/A foi interpretado como padrão restritivo do enchimento ventricular, caracterizando disfunção diastólica grave. O fato de que os animais suplementados apresentaram tendência a maiores valores de átrio esquerdo reforçam essa interpretação. Outro fato interessante foi que não identificamos diferenças em relação ao conteúdo de colágeno intersticial. Levando-se em conta que o colágeno é um importante modulador da função diastólica22, nossos resultados sugerem que outros fatores moduladores da função diastólica podem ter sido afetados pelo tratamento com betacaroteno.
O terceiro aspecto a ser considerado é que os mecanismos responsáveis pela intensificação do processo de remodelação cardíaca com a suplementação de betacaroteno não são conhecidos. Um dos possíveis mecanismos está relacionado com a lipoperoxidação, já que, como dito anteriormente, o betacaroteno, em situação de grande estímulo oxidativo, pode deixar de exercer atividade antioxidante e poderia passar a apresentar atividade pró-oxidante15. Outro mecanismo proposto é que o betacaroteno pode induzir a expressão do citocromo P450 e, com isso, aumentar o catabolismo do ácido retinóico, importante modulador da remodelação cardíaca23.
Em relação ao estresse oxidativo, sabe-se que as espécies reativas de oxigênio são constantemente produzidas no organismo. Os potenciais danos gerados por essa produção são contrabalanceados pela ação dos sistemas de defesa antioxidantes. Entre as defesas antioxidantes, destacam-se os sistemas enzimáticos, com a participação, por exemplo, do GSH e GSSG; e os sistemas não enzimáticos, com a participação de vitaminas, entre outros. Quando o equilíbrio entre o estímulo oxidante e as defesas antioxidantes é rompido, estabelece-se a condição denominada estresse oxidativo8-11. Uma das principais consequências do estresse oxidativo seria a lipoperoxidação. Assim, tanto a relação GSH/GSSG, como os níveis de lipoperóxidos, poderiam avaliar a presença/intensidade do estresse oxidativo24,25.
Contrariamente à nossa hipótese original, a suplementação de betacaroteno não modificou as variáveis que procuraram avaliar a lipoperoxidação. De fato, a relação GSH/GSSG, e os níveis de GSH, GSSG e lipoperóxidos do grupo suplementado com betacaroteno não foram diferentes dos animais infartados sem suplementação. Devemos considerar que as concentrações de GSH e GSSG, bem como a relação entre elas, indicam o quanto da GSH foi utilizada para manter o equilíbrio antioxidante/oxidante. Ou seja, a GSH é convertida em GSSG para impedir a ação de espécies reativas no organismo. Considerando que não houve diferença nas concentrações de GSH, GSSG e em sua relação, nossos resultados não confirmam a possível atividade pró-oxidante do betacaroteno. Pelo contrário, desde que o betacaroteno por si só pode apresentar efeito antioxidante, não haveria necessidade de consumir GSH, formando GSSG, para manter o equilíbrio redox. Portanto, se considerarmos que, apesar desses fatores, houve uma consistente intensificação da remodelação cardíaca com o betacaroteno, podemos sugerir que a lipoperoxidação provavelmente não teve participação na intensificação da remodelação ventricular.
É importante ressaltar que nosso estudo, por características de metodologia disponível no momento, avaliou somente a participação da lipoperoxidação e dos sistemas relacionados diretamente com ela. Devemos considerar, entretanto, que a participação do estresse oxidativo na intensificação da remodelação não pode ser descartada apenas pela ausência de aumento na lipoperoxidação, já que outros sistemas produtores de radicais livres de oxigênio podem estar atuando, como por exemplo, os sistemas NADPH-oxidase e tioredoxina. Desse modo, os mecanismos responsáveis pela ação deletéria do betacaroteno, nesse modelo, permanecem por ser determinados.
Em conclusão, o conjunto de nossos dados sugere que a maior remodelação em animais infartados e suplementados com betacaroteno não depende da lipoperoxidação.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi parcialmente financiado por FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Leonardo A. M. Zornoff Faculdade de Medicina de Botucatu - Distrito de Rubião Jr., s/n 18618-000 - Botucatu, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 01/08/07; revisado recebido em 01/10/07; aceito em 10/10/07.
BACKGROUND: The mechanisms involved in the biggest remodeling caused by the post-infarct beta-carotene are unknown. OBJECTIVE: To analyze the role of lipoperoxidation in the ventricular remodeling after infarct of the myocardium in rats supplemented with beta-carotene. METHODS: Rats were infarcted and divided into two groups: C (control) and BC (500mg/kg/regimen). After six months, echocardiogram and biochemical evaluation were performed. The t test was used, with 5% significance. RESULTS: The animals from BC group presented highest means of the diastolic (C = 1.57 ± 0.4 mm²/g, BC = 2.09 ± 0.3 mm²/g; p < 0.001) and systolic (C = 1.05 ± 0.3 mm²/g, BC = 1.61 ± 0.3 mm²/g; p < 0.001) areas of LV, which were adapted according to the rat's body weight. The systolic function of LV, evaluated by the area variation fraction, was lower in the animals supplemented with beta-carotene (C = 31.9 ± 9.3%, BC = 23.6 ± 5.1%; p = 0.006). The animals supplemented with beta-carotene presented higher values of the E/A relation (C = 2.7 ± 2.5, BC = 5.1 ± 2.8; p = 0.036). No differences were found between the groups concerning the cardiac levels of the GSH (C = 21 ± 8 nmol/mg of protein, BC = 37 ± 15 nmol/mg of protein; p = 0.086), GSSG (C = 0.4 (0.3-0.5) nmol/g of protein, BC = 0.8 (0.4-1.0; p = 0.19) of protein; p = 0.246) and lipoperoxides (C = 0.4 ± 0.2 nmol/mg of tissue, BC = 0.2 ± 0.1 nmol/mg of tissue; p = 0.086). CONCLUSION: The highest remodeling in infarcted rats supplemented with beta-carotene does not depend on the lipoperoxidation.
IDepartamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, Botucatu, SP - Brazil
IIDepartamento de Bioquímica - Instituto de Biociências - UNESP2, Botucatu, SP - Brazil
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After the acute myocardial infarction (AMI), some alterations may happen in the ventricular architecture, assaulting both the infarcted and non-infarcted region. It is accepted that the morphological changes may be reflection of cellular, molecular and interstitial cardiac alterations, which occur as a response to determined aggression. The set of these adaptations - which are clinically detected by changes in composition, mass, volume and cardiac geometry - is called myocardial remodeling1-4.
The intensity of the ventricular remodeling process is directly associated with a worse prognosis, especially because the remodeling is related to the appearance and progression of ventricular dysfunction. Thus, several strategies have been used to prevent or diffuse the ventricular remodeling process after the AMI5-7.
One of the main modulators of the remodeling process is the oxidative stress. Among other physiopathological mechanisms, one of the principal consequences of the oxidative stress is the lipoperoxidation. In this manner, it is accepted that the oxidative stress may be an inducer of cellular damages that alter functional and structural cardiac variables, participating in the physiopathology of cardiac insufficiency, which is secondary to a lot of impulses, including AMI8-11.
Considering that the beta-carotene, for possessing the ability of slowing the reactive species of oxygen, is an antioxidant12,13, its supplementation could be beneficial after AMI. Thus, in a previous study of our laboratory, the supplementation effects of the beta-carotene in the ventricular remodeling process after AMI were evaluated. However, oppositely to the expected, the supplementation with beta-carotene resulted in intensification of the remodeling, followed by worsening of the cardiac function14. The mechanisms that are responsible for this phenomenon, however, have not been clarified yet. One of the accepted possibilities is that the beta-carotene, in a situation of great oxidative impulse, would stop practicing its antioxidant activity and start to present a pro-oxidant one15.
The purpose of this study was to evaluate the participation of lipoperoxidation in the morphological and functional alterations in the cardiac parameters, induced by the supplementation of beta-carotene in infarcted rats.
The experimental protocol of the present work was approved by the Ethics Committee of Animal Trial of our institution, and it is in accordance with the Ethics Principles in Animal Trial adopted by
Male Wistar rats were used, weighing between 200 and 250 grams. The acute infarct was produced according to the previously described method16. Briefly, the rats (n = 120) were anaesthetized with ketamine hydrochloride (50mg/kg) and xylidine hydrochloride (1mg/kg) and, then, submitted to left lateral thoracotomy. During the experiment, the animals breathed spontaneously, with oxygen supplementation of 100% by catheter. After the exteriorization of the heart, the left atrium was separated and the left coronary artery was connected with a mononylon thread 5,00, between the outlet of the pulmonary artery and the left atrium. Later on, the heart was returned to the thorax, lungs were inflated with positive pressure and the thorax was closed by sutures with cotton 10.
The animals were maintained in cages for recovery; fed with commercial ration and free access to water; with light control, in 12-hour cycles; temperature close to 25ºC and controlled humidity.
After 48 hours of infarct, the animals were randomly divided into two groups: C group (n = 25), composed by infarcted animals which were fed with standard commercial ration; and BC group (n = 27), composed by infarcted animals which received a regimen supplemented with beta-carotene in a 500mg/kg/regimen dose. All the analyses were done by examiners without knowledge of the group of animals.
After six months of treatment, the surviving animals were anaesthetized with ketamine hydrochloride (50mg/kg) and xylidine hydrochloride (1mg/kg), for the echocardiographic study. After the tricotomy of the anterior region of the thorax, the animals were positioned in dorsal decubitus in calf chute specially projected, which allows a light left lateral rotation for the realization of the exam, using Philips equipment (model TDI 5500) endowed of a multifrequential electronic transducer up to 12 MHz. The evaluation of the mitral and aortic transvalvar flows was accomplished with the same transducer, functioning in 5.0 MHz. The measures of the cardiac structures were carried out in monodimensional images that were obtained through the ultrasound sheaf guided by the bidimensional image in the parasternal lower axle position. The image of the left ventricular cavity was obtained by positioning the cursor of M-mode between the papilar muscles, right below the mitral valve plan. The images of the aortic and left atrium were obtained from the parasternal lower axle position, with the M-mode cursor, positioned in the level of the aortic valve. The record of the monodimensional image (velocity: 100 mm/s) was carried out by a printer, model UP-890MD of Sony Co. All the measures were made according to recommendations of the American Society of Echocardiography17, which were already validated in the infarcted rats model18. The left ventricular diastolic dimension (LVDD) and the thickness of the left ventricle posterior wall (LVPW) were measured concomitantly to the maximum diameter of the cavity. The LV systolic dimension (LVSD) was measured in the moment of the maximum systolic excursion of the posterior cavity wall. The diastolic (DA) and systolic (SA) areas of LV were measured in the bidimensional mode by planimetry in two parasternal planes: long and minor axle. The LV systolic function was evaluated by calculating the area variation fraction (ACF = DA-SA/DA x 100)18, obtained by the mean of values of both axles. The diastolic transmitral flow (waves E and A) was attained with the transducer in the apical position of four chambers. The measures of the flows were accomplished directly in the monitor of the echocardiograph.
After the echocardiographic study, the animals were sacrificed with pentobarbital; their hearts were removed, dissected and the left and right ventricles, including the interventricular septum, were separated and weighted.
Cardiac tissue samples were settled in a 10% solution of formalin within a 48-hour period, according to an already described method19,20. The histological cuts were bleached in a flake with solution of hematoxylin-eosin (HE) for the gauging of areas of the oblique section of myocytes, engaging the microscope LEICA DM LS binded to a video camera, which sends digital images to a computer endowed of the image analysis program Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). About 50 to 70 cells were measured per ventricle analyzed. The selected myocytes were sectioned transversally, and presented round shape and visible core in the center of the cell. This care aimed at unifying at most the set of myocytes of different groups. The mean sectioned areas obtained for each group were used as indicators of the cell size.
Flakes with coronary histological cuts of 6 micras - freshed by the Picro Sirius red technique, specific for the collagen visualization - were done for evaluating the interstice of the myocardium of LV. The microscopic reading was made through the microscope LEICA DM LS joined to a video camera, which sends digital images to a computer endowed of the image analysis program named Image Pro-plus (Media Cyberetics, Silver Spring, Maryland, USA).
For a biochemical evaluation, level dosages of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSH), relation between GSH/GSSG and lipoperoxides were performed according to an already standardized technique21. The dosages were performed in the liver and heart.
As the data presented a normal distribution, the comparisons were made through the Student's t test. Data were expressed as mean ± standard deviation. For the relation GSH/GSSG, they are expressed in median and interquartile interval, and analyzed by means of Mann-Whitney's test. The significance level was 5%. Statistical analysis was accomplished through the program SigmaStat for Windows v2.03 (SPSS Inc, Chicago, IL).
In the end of the study, 13 control animals and 15 animals supplemented with beta-carotene survived to the six-month period (p > 0.05).
The results of the echocardiographic study are shown in
The results of the morphometric study are shown in
Concerning the biochemical dosages, no differences were found between the groups as the hepatic levels of GSH (C = 17 ± 7 nmol/mg of protein, BC = 27 ± 14 nmol/mg of protein; p = 0.250); GSSG (C = 0.3 ± 0.1 nmol/g of protein, BC = 0.4 ± 0.2 nmol/g of protein; p = 0.246); GSH/GSSG (C = 4377 (2738-8249), BC = 2012 (1116-4488); p = 0.286) and lipoperoxidation (C = 0.3 ± 0.1 nmol/mg of tissue, BC = 0.2 ± 0.1 nmol/mg of tissue; p = 0.159). Likewise, concerning the cardiac levels of GSH, no differences were found between the groups (C = 21 ± 8 nmol/mg of protein, BC = 37 ±15 nmol/mg of protein; p = 0.086); GSSG (C = 0.4 (0.3-0.5) nmol/g of protein, BC = 0.8 (0.4-1.0; p = 0.19) of protein; p = 0.246); GSH/GSSG (C = 56 ±7, BC = 53 ± 14; p = 0.709) and lipoperoxides (C = 0.4 ± 0.2 nmol/mg of tissue, BC = 0.2 ± 0.1 nmol/mg of tissue; p = 0.086).
The objective of this study was to analyze the participation of lipoperoxidation in the process of ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats supplemented with beta-carotene. Our study confirmed that the supplementation with beta-carotene intensifies the cardiac remodeling post-AMI. However, in contrast to the expected, worsening of the remodeling does not seem to depend on lipoperoxidation.
The first aspect to be considered refers to the fact that our study has confirmed the previously reported findings related to the supplementation effects' of beta-carotene in the ventricular remodeling process after AMI14. In fact, the beta-carotene supplementation resulted in an increase of the ventricular diameters, both systolic and diastolic, indicating worsening of the left ventricular remodeling process. The increase of the ventricular cavity was accompanied by the decrease of the thickness of the LV posterior wall. This fact, associated with the non-increase of the myocyte's sectional area, may suggest that the beta-carotene supplementation results in cellular growth with eccentric standard.
The second important aspect of our study is associated with the concept that the cardiac remodeling results, unchangeably, in a progressive fall of the systolic ventricular function. Initially, as a consequence of the cellular growth, the remodeling may contribute to the maintenance or repairment of the cardiac function. Chronically, however, there are biochemical, genetic and structural variations that will result in a progressive systolic ventricular dysfunction2-4. According to this idea, in the rats supplemented with beta-carotene, this remodeling process was accompanied by the fall of area variation fraction. Other indirect signals of ventricular dysfunction were found in animals supplemented with beta-carotene, such as the increase of cardiac frequency and the right ventricle hypertrophy. It is interesting to notice that alterations in the diastolic function were identified in this study. The increase of the E/A relation was interpreted as a restrictive standard of ventricular fulfillment, characterizing severe diastolic function. The fact that the supplemented animals presented tendency to higher values of the left atrium reinforce this interpretation. Other interesting fact is that no differences concerning the interstitial collagen content were found. Considering that the collagen is an important modulator of the diastolic function22, the results herein presented suggest that other modulating factors of the diastolic function may have been affected by the treatment with beta-carotene.
The third aspect to be considered is that the responsible mechanisms for intensifying the cardiac remodeling process with the supplementation of beta-carotene are not known. One of the possible mechanisms is related to the lipoperoxidation, since, as already said, the beta-carotene, in situations of great oxidative impulse, can stop exerting its antioxidant activity and could start to present pro-oxidant activity15. Another proposed mechanism is that the beta-carotene can induce the cytochrome P450 expression and, thus, increase the catabolism of the retinoic acid, which is an important modulator of the cardiac remodeling23.
With regard to the oxidative stress, it is known that the reactivated species of oxygen are constantly produced in the organism. The potential damages caused by this production are counterbalanced by the action of the antioxidant defense systems. Among the antioxidant defenses, the enzymatic systems can be emphasized, with the participation, for example, of the GSH and GSSG; and the non-enzymatic systems, with the participation of vitamins, among others. When the balance between the oxidant impulse and the antioxidant defenses is broken, a condition named oxidative stress is established8-11. One of the main consequences of the oxidative stress would be the lipoperoxidation. Thus, both the relation GSH/GSSG and the lipoperoxide levels could evaluate the presence or intensity of the oxidative stress24,25.
Contrarily to our original hypothesis, the supplementation of beta-carotene did not modify the variables that evaluated the lipoperoxidation. In fact, the relation GSH/GSSG, and the levels of GSH, GSSG and lipoperoxides of the group supplemented with beta-carotene were not different from the infarcted animals without supplementation. It should be considered that the concentrations of GSH and GSSG and their association indicate how much of the GSH was used to preserve the antioxidant/oxidant equilibrium. So, the GSH is converted into GSSG to stop the action of the reactive species in the organism. Since there were no differences in the concentrations of GSH, GSSG and in its relation, our results did not confirm the possible pro-oxidant activity of the beta-carotene. On the contrary, as the beta-carotene itself can only present antioxidant effect, there should be no need of consuming GSH, forming GSSG to keep the redox balance. Therefore, if we consider that, despite these factors, there was a consistent intensification of the cardiac remodeling with beta-carotene, it may be suggested that the lipoperoxidation probably did not participate in the enhancement of the ventricular remodeling.
It is important to stand out that our study, by methodological characteristics available at that moment, evaluated only the participation of lipoperoxidation and systems related directly to it. We should consider, however, that the participation of the oxidative stress in the enhancement of the remodeling must not be discarded only by the absence of lipoperoxidation increase, since other producer systems of free radicals of oxygen may be acting, for example, the NADPH-oxidase and thioredoxin systems. Hence, the mechanisms responsible for the deleterious action of beta-carotene, in this model, remain to be determined.
In conclusion, the set of our data suggests that the greatest remodeling in infarcted animals and animals supplemented with beta-carotene does not depend on the lipoperoxidation.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was partially funded by FAPESP.
This study is not associated with any post-graduation program.
FUNDAMENTO: Los mecanismos implicados en la mayor remodelación ocasionada por betacaroteno tras el infarto son desconocidos. OBJETIVO: Analizar el rol que juega la lipoperoxidación en la remodelación ventricular tras el infarto de miocardio, en ratas suplementadas con betacaroteno. MÉTODOS: Se había inducido a un infarto a las ratas y se las distribuyó en grupos: C (control) y BC (500mg/kg/dieta). Tras seis meses, se realizaron ecocardiograma y evaluación bioquímica. Utilizamos la prueba t, con significancia del 5%. RESULTADOS: Los animales del grupo BC presentaron mayores promedios de las áreas diastólicas (C = 1,57 ± 0,4 mm²/g, BC = 2,09 ± 0,3 mm²/g; p < 0,001) y sistólicas (C = 1,05 ± 0,3 mm²/g, BC = 1,61 ± 0,3 mm²/g; p < 0,001) del VI, ajustadas al peso corporal de la rata. La función sistólica del VI, evaluada por la fracción de variación de área, fue menor en los animales suplementados con betacaroteno (C = 31,9 ± 9,3 %, BC = 23,6 ± 5,1 %; p = 0,006). Los animales suplementados con betacaroteno presentaron valores mayores de la relación E/A (C = 2,7 ± 2,5, BC = 5,1 ± 2,8; p = 0,036). No se encontraron diferencias entre los grupos con relación a los niveles cardiacos de GSH (C = 21 ± 8 nmol/mg de proteína, BC = 37 ±15 nmol/mg de proteína; p = 0,086), GSSG (C = 0,4 (0,3-0,5) nmol/g de proteína, BC = 0,8 (0,4-1,0; p = 0,19) de proteína; p = 0,246) y lipoperóxidos (C = 0,4 ± 0,2 nmol/mg de tejido, BC = 0,2 ± 0,1 nmol/mg de tejido; p = 0,086). CONCLUSIÓN: La mayor remodelación en animales infartados y suplementados con betacaroteno no depende de la lipoperoxidación.
IDepartamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, Botucatu, SP - Brasil
IIDepartamento de Bioquímica - Instituto de Biociências - UNESP
Correspondencia
Tras el infarto agudo de miocardio (IAM), pueden ocurrir cambios de la arquitectura ventricular, implicando tanto la región infartada como la no infartada. Se acepta que las alteraciones morfológicas sean el reflejo de cambios celulares, moleculares e intersticiales cardiacos, que ocurren como respuesta a la determinada agresión. Al conjunto de esas adaptaciones -que se detectan clínicamente por alteraciones en la composición, masa, volumen y geometría cardiaca-, se le denomina remodelación miocárdica1-4.
La intensidad del proceso de remodelación ventricular está directamente asociada a un peor pronóstico, principalmente porque la remodelación está relacionada al surgimiento y a la progresión de la disfunción ventricular. Así, innumeras estrategias han sido utilizadas para prevenir o atenuar el proceso de remodelación ventricular tras el IAM5-7.
Uno de los principales moduladores del proceso de remodelación es el estrés oxidativo. Entre otros mecanismos fisiopatológicos, una de las principales consecuencias del estrés oxidativo es la lipoperoxidación. Así, se acepta que el estrés oxidativo pueda ser un inductor de daños celulares que alteran variables funcionales y estructurales cardiacas, participando de la fisiopatología de la insuficiencia cardiaca secundaria a diversos estímulos, incluso el IAM8-11.
Teniendo en cuenta que el betacaroteno, por poseer la habilidad de inactivar las especies reactivas de oxígeno, se lo consideran como un antioxidante12,13, la suplementación de betacaroteno podría ser benéfica tras el IAM. De esa manera, en un trabajo anterior de nuestro laboratorio, se evaluaron los efectos de la suplementación de betacaroteno en el proceso de remodelación ventricular tras el IAM. En contrario al esperado, sin embargo, la suplementación con betacaroteno resultó en intensificación de la remodelación, seguida por empeoramiento de la función cardiaca14. Los mecanismos responsables de ese fenómeno, sin embargo, todavía no están aclarados. Una de las posibilidades sería que el betacaroteno, en situación de grande estímulo oxidativo, dejaría de ejercer actividad antioxidante y pasaría a presentar actividad prooxidante15.
Por el expuesto, este trabajo tuvo por objeto evaluar la participación de la lipoperoxidación en las alteraciones morfológicas y funcionales cardiacas, inducidas por la suplementación de betacaroteno en ratas infartadas.
La Comisión de Ética en Experimentación Animal de nuestra institución aprobó el protocolo experimental del presente trabajo, estando de acuerdo con los Principios Éticos en la Experimentación Animal adoptado por el Colegio Brasileño de Experimentación Animal.
Se utilizaron ratas Wistar machos, pesando entre 200 y 250 gramos. E infarto agudo se produjo de acuerdo con el método previamente descrito16. En resumen, las ratas (n=120) se anestesiaron con clorhidrato de ketamina (50mg/ kg) y clorhidrato de xilidino (1mg/kg), y se sometieron a la toracotomía lateral izquierda. Durante el experimento, los animales respiraron espontáneamente, con suplementación de oxígeno a un 100%, ofertado por catéter. Tras la exteriorización del corazón, se apartó el atrio izquierdo y la arteria coronaria izquierda se ligó con mono nylon 5.00, entre la salida de la arteria pulmonar y el atrio izquierdo. Acto seguido, se retornó el corazón al tórax, los pulmones se inflaron con presión positiva y el tórax se cerró por suturas de algodón 10.
Los animales se los mantuvieron en jaulas para recuperación; alimentados con ración comercial estándar y libre acceso a agua; con control de luz, ciclos de 12 horas; temperatura de aproximadamente 250C y humedad controlada.
Tras 48 horas del infarto, los animales se dividieron de modo aleatorio en dos grupos: grupo C (n = 25), conformado por los animales infartados alimentados con ración comercial estándar; y grupo BC (n = 27), conformado por los animales infartados que recibieron dieta suplementada con betacaroteno en la dosis de 500mg/kg/dieta. Todos los análisis se llevaron a cabo por examinadores sin conocimiento de los grupos de los animales.
Tras seis meses de tratamiento, los animales supervivientes se anestesiaron con clorhidrato de ketamina (50mg/kg) y clorhidrato de xilidino (1mg/kg), para el estudio ecocardiográfico. Luego de la tricotomía de la región anterior del tórax, los animales se posicionaran en decúbito dorsal en canaleta especialmente proyectada, que permite la leve rotación lateral izquierda para efectuar el examen, utilizándose equipamiento de Philips (modelo TDI 5500) dotado de transductor electrónico multifrecuencial hasta 12 MHz. La evaluación de los flujos transvalvulares mitral y aórtico se realizó con el mismo transductor operando en 5,0 MHz. Las mediciones de las estructuras cardiacas se efectuaron en las imágenes monodimensionales, obtenidas con el haz de ultrasonido orientado por la imagen bidimensional, en la posición paraesternal eje menor. La imagen de la cavidad ventricular izquierda se obtuvo posicionando el cursor del modo-M entre los músculos papilares, justo abajo del plan de la válvula mitral. Las imágenes de la aorta y del atrio izquierdo se obtuvieron en la posición paraesternal eje menor, con el cursor del modo-M posicionado al nivel de la válvula aórtica. El registro de la imagen monodimensional (velocidad: 100 mm/s) se realizó por medio de la impresora modelo UP-890MD de la Sony Co. Todas las mediciones se efectuaron de acuerdo con las recomendaciones de la
Tras el estudio ecocardiográfico, a los animales se les sacrificaron con pentobarbital; se les sacaron los corazones, se los disecaron y los ventrículos derechos e izquierdo, incluyendo el septo interventricular, se los apartaron y los pesaron.
Muestras de tejido cardiaco se fijaron en solución de formol al 10% por período de 48 horas, según método ya descrito19,20. Los cortes histológicos se colorearon en lámina con solución de Hematoxilina-Eosina (HE) para evaluación de áreas de la sección transversa de los miocitos, empleándose microscopio LEICA DM LS acoplado a una cámara de video, que envía imágenes digitales a un computador dotado del programa de análisis de imágenes Image Pro-plus (
Se efectuaron láminas con cortes histológicos coronales de 6 micras -coloreados con la técnica de Picro Sirius
Para evaluación bioquímica, se realizaron dosificaciones de los niveles de glutationa reducida (GSH), glutationa oxidada (GSSH), relación GSH/GSSG y lipoperóxidos, según técnica ya estandarizada21. Las dosificaciones se efectuaron en el hígado y en el corazón.
Teniendo en cuenta que los datos presentaron distribución normal, las comparaciones se efectuaron con la prueba t de Student. Los datos se expresaron en promedio ± desviación estándar. Para la relación GSH/GSSG, los datos están expresados en mediana e intervalo intercuartil y se analizaron con la prueba de Mann-Whitney. El nivel de significancia fue del 5%. Los análisis estadísticos se hicieron con el programa SigmaStat
Al final del estudio, 13 animales control y 15 animales suplementados con betacaroteno supervivieron al período de seis meses (p > 0,05).
Los resultados del estudio ecocardiográfico están en la
Los resultados del estudio morfométrico están en la
Con relación a las dosificaciones bioquímicas, no se encontraron distinciones entre los grupos en cuanto a los niveles hepáticos de GSH (C = 17 ± 7 nmol/mg de proteína, BC = 27 ± 14 nmol/mg de proteína; p = 0,250); GSSG (C = 0,3 ± 0,1 nmol/g de proteína, BC = 0,4 ± 0,2 nmol/g de proteína; p = 0,246); GSH/GSSG (C = 4377 (2738-8249), BC = 2012 (1116-4488); p = 0,286) y lipoperóxidos (C = 0,3 ± 0,1 nmol/mg de tejido, BC = 0,2 ± 0,1 nmol/mg de tejido; p = 0,159). De igual modo, no se encontraron diferencias entre los grupos respecto a los niveles cardiacos de GSH (C = 21 ± 8 nmol/mg de proteína, BC = 37 ±15 nmol/mg de proteína; p = 0,086); GSSG (C = 0,4 (0,3-0,5) nmol/g de proteína, BC = 0,8 (0,4-1,0; p = 0,19) de proteína; p = 0,246); GSH/GSSG (C = 56 ±7, BC = 53 ± 14; p = 0,709) y lipoperóxidos (C = 0,4 ± 0,2 nmol/mg de tejido, BC = 0,2 ± 0,1 nmol/mg de tejido; p = 0,086).
Este trabajo tuvo como objeto analizar la participación de la lipoperoxidación en el proceso de la remodelación ventricular, tras el Infarto de miocardio, en ratas suplementadas con betacaroteno. Nuestro trabajo confirmó que la suplementación de betacaroteno intensifica la remodelación cardiaca post IAM. Sin embargo, contrariamente al esperado, el empeoramiento de la remodelación no parece ser dependiente de la lipoperoxidación.
El primer aspecto a tenerse en cuenta se refiere al hecho de que nuestro trabajo confirmó los hallazgos relatados previamente con relación a los efectos de la suplementación del betacaroteno en el proceso de remodelación ventricular tras el IAM14. De hecho, la suplementación del betacaroteno resultó en aumento de los diámetros ventriculares, tanto sistólico como diastólico, indicando empeoramiento del proceso de remodelación ventricular izquierdo. Junto al aumento de la cavidad ventricular se siguió la disminución del espesor de la pared posterior del VI. Ese hecho, asociado al no aumento del área seccional del miocito, puede sugerir que la suplementación de betacaroteno resulta en crecimiento celular de estándar excéntrico.
El segundo aspecto relevante de nuestro trabajo está asociado al concepto de que la remodelación cardiaca resulta, invariablemente, en un descenso progresivo de la función sistólica ventricular. Inicialmente, en consecuencia del crecimiento celular, la remodelación puede contribuir a mantener o restaurar la función cardiaca. Crónicamente, sin embargo, ocurren cambios bioquímicos, genéticos y estructurales que resultarán en disfunción sistólica ventricular progresiva2-4. De igual manera, en las ratas suplementadas con betacaroteno, el proceso de remodelación siguió asociado al descenso de la fracción de variación de área. Se encontraron otras señales indirectas de disfunción ventricular en los animales suplementados con betacaroteno, como, por ejemplo, aumento de la frecuencia cardiaca e hipertrofia del ventrículo derecho. Es interesante notar que, en nuestro trabajo, identificamos también alteraciones en la función diastólica. El aumento de la relación E/A fue interpretado como estándar restrictivo del llenado ventricular, caracterizando disfunción diastólica severa. El hecho de que los animales suplementados presentaron tendencia a mayores valores de atrio izquierdo refuerza esa interpretación. Otro hecho interesante fue que no identificamos diferencias en relación con el contenido de colágeno intersticial. Teniendo en cuenta que el colágeno es un importante modulador de la función diastólica22, nuestros resultados sugieren que otros factores moduladores de la función diastólica pueden haber sido afectados por el tratamiento con betacaroteno.
El tercer aspecto a tenerse en cuenta es que los mecanismos responsables de la intensificación del proceso de remodelación cardiaca con la suplementación de betacaroteno no se conocen aún. Uno de los posibles mecanismos está relacionado con la lipoperoxidación, ya que, como se dijo anteriormente, el betacaroteno, en situación de gran estímulo oxidativo, puede dejar de ejercer actividad antioxidante y podría pasar a presentar actividad proooxidante15. Otro mecanismo propuesto es que el betacaroteno puede inducir la expresión del citocromo P450 y, con eso, aumentar el catabolismo del ácido retinoico, importante modulador de la remodelación cardiaca23.
Con relación al estrés oxidativo, se sabe que las especies reactivas de oxígeno son constantemente producidas en el organismo. La acción de los sistemas de defensa antioxidantes contrabalancea los potenciales daños generados por esa producción. Entre las defensas antioxidantes, se destacan los sistemas enzimáticos, con la participación, por ejemplo, del GSH y GSSG; y los sistemas no enzimáticos, con la participación de vitaminas, entre otros. Cuando el equilibrio entre el estímulo oxidante y las defensas antioxidantes se rompen, se establece la condición denominada estrés oxidativo8-11. Una de las principales consecuencias del estrés oxidativo sería la lipoperoxidación. Así, tanto la relación GSH/ GSSG, como los niveles de lipoperóxidos, podrían evaluar la presencia/intensidad del estrés oxidativo24,25.
Contrariamente a nuestra hipótesis original, la suplementación de betacaroteno no modificó las variables que procuraron evaluar la lipoperoxidación. De hecho, la relación GSH/GSSG, y los niveles de GSH, GSSG y lipoperóxidos del grupo suplementado con betacaroteno no fueron diferentes de los animales infartados sin suplementación. Debemos considerar que las concentraciones de GSH y GSSG, así como la relación entre ellas, indican lo cuanto de la GSH se utilizó para mantener el equilibrio antioxidante/oxidante. O sea, la GSH se convierte en GSSG para impedir la acción de especies reactivas en el organismo. Teniendo en cuenta que no hubo diferencia en las concentraciones de GSH, GSSG y en su relación, nuestros resultados no confirman la posible actividad prooxidante del betacaroteno. Por el contrario, desde que el betacaroteno por él mismo puede presentar efecto antioxidante, no habría necesidad de consumir GSH, formando GSSG, para mantener el equilibrio redox. Por lo tanto, si tenemos en cuenta que, pese a esos factores, hubo una consistente intensificación de la remodelación cardiaca con el betacaroteno, podemos sugerir que la lipoperoxidación probablemente no tuvo participación en la intensificación de la remodelación ventricular.
Es importante resaltar que nuestro estudio, por características de la metodología disponible en el momento, evaluó solamente la participación de la lipoperoxidación y de los sistemas relacionados directamente con ella. Debemos considerar, sin embargo, que la participación del estrés oxidativo en la intensificación de la remodelación no se puede descartar solamente por la ausencia de aumento en la lipoperoxidación, ya que otros sistemas productores de radicales libres de oxígeno pueden estar actuando, como por ejemplo, los sistemas NADPH-oxidasa y tioredoxina. De ese modo, los mecanismos responsables de la acción dañosa del betacaroteno, en ese modelo, todavía necesitan determinarse.
En conclusión, el conjunto de nuestros datos sugiere que la remodelación en animales infartados y suplementados con betacaroteno no depende de la lipoperoxidación.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue parcialmente financiado por la FAPESP - Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo.
No hay vinculación de este estudio a programas de postgrado.