abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil KH5yx5yVjp4kJQ95Lt3wqxM 00010 S0066-782X2009000400010 S0066-782X(09)09200410 10.1590/S0066-782X2009000400010 Artigos Originais Deleção 22q11.2 em pacientes com defeito cardíaco conotruncal e fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2 Belangero Sintia Iole Nogueira Bellucco Fernanda T.S. Kulikowski Leslie Domenici Christofolini Denise M. Cernach Mirlene C. S. P. Melaragno Maria Isabel São Paulo São Paulo Universidade Federal de São Paulo Brazil 04 2009 92 4 307 311 10 04 2008 23 01 2008 17 12 2007 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A síndrome da deleção 22q11.2 é a mais freqüente síndrome de microdeleção humana. O fenótipo é altamente variável e caracterizado por defeito cardíaco conotruncal, dismorfias faciais, insuficiência velofaríngea, dificuldade de aprendizagem e retardo mental. OBJETIVO: O objetivo deste trabalho foi investigar a freqüência da deleção 22q11.2 em uma amostra brasileira de indivíduos portadores de cardiopatia conontrucal isolada e do fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2. MÉTODOS: Vinte e nove pacientes foram estudados por meio de citogenética clássica, por hibridação in situ fluorescente (FISH) e por técnicas moleculares. RESULTADOS: A análise citogenética por meio de bandamento G revelou cariótipo normal em todos os pacientes, com exceção de um que apresentou cariótipo 47,XX,+idic(22)(q11.2). Com o uso de técnicas moleculares, a deleção foi observada em 25% dos pacientes, todos portadores do fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2. Em nenhum dos casos, a deleção foi herdada dos pais. A freqüência da deleção 22q11.2 foi maior no grupo de pacientes portadores do espectro clínico da síndrome da deleção 22q11.2 do que no grupo de pacientes com cardiopatia conotruncal isolada. CONCLUSÃO: A investigação da presença da deleção e sua correlação com os dados clínicos dos pacientes podem auxiliar os pacientes e suas famílias a terem um melhor aconselhamento genético e um seguimento clínico mais adequado.

 Deleção cromossômica fenótipo cardiopatias congênitas marcadores genéticos 23 06 2009

ARTIGO ORIGINAL

PATOLOGIAS DA AORTA

Deleção 22q11.2 em pacientes com defeito cardíaco conotruncal e fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2

Sintia Iole Nogueira Belangero; Fernanda T.S. Bellucco; Leslie Domenici Kulikowski; Denise M. Christofolini; Mirlene C. S. P. Cernach; Maria Isabel Melaragno

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A síndrome da deleção 22q11.2 é a mais freqüente síndrome de microdeleção humana. O fenótipo é altamente variável e caracterizado por defeito cardíaco conotruncal, dismorfias faciais, insuficiência velofaríngea, dificuldade de aprendizagem e retardo mental.

OBJETIVO: O objetivo deste trabalho foi investigar a freqüência da deleção 22q11.2 em uma amostra brasileira de indivíduos portadores de cardiopatia conontrucal isolada e do fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2.

MÉTODOS: Vinte e nove pacientes foram estudados por meio de citogenética clássica, por hibridação in situ fluorescente (FISH) e por técnicas moleculares.

RESULTADOS: A análise citogenética por meio de bandamento G revelou cariótipo normal em todos os pacientes, com exceção de um que apresentou cariótipo 47,XX,+idic(22)(q11.2). Com o uso de técnicas moleculares, a deleção foi observada em 25% dos pacientes, todos portadores do fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2. Em nenhum dos casos, a deleção foi herdada dos pais. A freqüência da deleção 22q11.2 foi maior no grupo de pacientes portadores do espectro clínico da síndrome da deleção 22q11.2 do que no grupo de pacientes com cardiopatia conotruncal isolada.

CONCLUSÃO: A investigação da presença da deleção e sua correlação com os dados clínicos dos pacientes podem auxiliar os pacientes e suas famílias a terem um melhor aconselhamento genético e um seguimento clínico mais adequado.

Palavras-chave: Deleção cromossômica, fenótipo, cardiopatias congênitas, marcadores genéticos.

Introdução

As síndromes de DiGeorge (DGS), velocardiofacial (VCFS) e de anomalias faciais e conotruncais (CAFS) durante muitos anos foram consideradas como sendo síndromes distintas. No entanto, por possuírem a mesma etiologia, a deleção da região q11.2 do cromossomo 22, são atualmente classificadas como sendo variações de um mesmo espectro clínico, com sobreposição de fenótipo e expressividade variável, denominado síndrome da deleção 22q11.21. Uma das características mais freqüentes dessa síndrome é a presença de malformação cardíaca conotruncal, porém outras alterações podem estar presentes, tais como palato fendido, hipoplasia de timo e de glândula paratireóide, dismorfias faciais, voz nasalada, dificuldade de aprendizagem, doenças psiquiátricas e retardo mental leve2.

A freqüência da deleção 22q11.2 é de aproximadamente 1:4000 nascidos vivos3 e está presente em cerca de 90% dos pacientes com o fenótipo da síndrome4. A deleção é esporádica em aproximadamente 90% dos casos e herdada de um dos pais em 10% deles5. A grande maioria dos pacientes (87%) apresenta uma deleção de 3Mb (megabases)4. Não é possível detectar a deleção por meio de citogenética clássica (cariótipo), sendo necessária a utilização de outras técnicas, tais como a de hibridização in situ fluorescente (FISH) e a de marcadores polimórficos de DNA.

A identificação de uma deleção esporádica implica em baixo risco de recorrência (1 a 3%), enquanto que em uma deleção herdada, há um risco de 50% de transmissão da deleção1,6. Dessa forma, investigações citogenéticas e moleculares nos indivíduos afetados e seus pais são fundamentais para um diagnóstico preciso, bem como para um aconselhamento genético adequado.

O objetivo deste estudo foi avaliar a constituição cromossômica e a freqüência da deleção 22q11.2 em pacientes portadores de cardiopatia conotruncal isolada e em portadores do espectro clínico da síndrome da deleção 22q11.2. Nos casos em que a deleção estava presente, verificamos se era a forma herdada ou não. Além disso, comparamos a eficiência das metodologias de FISH e de marcadores polimórficos de DNA para a detecção da deleção 22q11.2.

Casuística

A amostra consistia de 29 pacientes (Tabela 1). Os critérios clínicos para inclusão foram: (I) malformação cardíaca conotruncal associada a outros aspectos clínicos da síndrome da deleção 22q11.2 (13 pacientes); (II) fenótipo característico da síndrome da deleção 22q11.2, sem cardiopatia (10 pacientes); e (III) malformação cardíaca conotruncal isolada (6 pacientes). A maioria dos pacientes era proveniente do berçário e do Centro de Genética Médica, ambos do Hospital São Paulo; os outros foram provenientes de outros hospitais de São Paulo. Dezessete famílias foram compostas por probando e seus genitores, sete por probando e mãe e cinco, apenas pelo probando.

Os pais dos pacientes, quando disponíveis, também foram estudados pela técnica de marcadores de DNA e, quando a criança apresentava deleção, eles também foram estudados por FISH, com a finalidade de investigar se a deleção era herdada ou não. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo. Todas as famílias dos probandos deram o consentimento informado para participação nesta pesquisa.

Métodos

Análise citogenética

Culturas de linfócitos foram realizadas para a análise de cariótipo7. Quinze metáfases foram analisadas por indivíduo. Os cromossomos metafásicos, com resolução de 400-550 bandas cromossômicas, foram classificados conforme o ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) (2005). Técnicas adicionais de bandamento C e de coloração das regiões organizadoras de nucléolo (NOR) foram usadas quando necessário.

Hibridização in situ fluorescente (FISH)

A técnica de FISH foi realizada, a partir da cultura de linfócitos, com sonda comercial que resulta na marcação simultânea da região cromossômica da DGS que inclui o gene TUPLE1 (marcação em vermelho) e da região terminal do cromossomo 22 como controle (marcação em verde) (Cytocell®- Cambridge) (figura 1). Vinte metáfases e/ou 100 núcleos interfásicos de cada paciente foram analisados. No caso em que havia um cromossomo marcador, foi utilizada a sonda para centrômero dos cromossomos 14/22 (D14Z1/D22Z1 - Vysis®) e sondas de cosmídeos (c106e4 e c103a2) para região crítica da síndrome cat eye.

Estudo por marcadores polimórficos de DNA

O DNA foi extraído a partir de linfócitos de sangue periférico8 e a técnica de PCR9 foi realizada utilizando primers para três loci polimórficos localizados na região comumente deletada: D22S941, D22S944N e D22S26410-12 (Figura 1). Os produtos da PCR foram testados em gel de agarose a 1% para verificar a presença da amplificação e em seguida, os polimorfismos de tamanho foram avaliados em gel de poliacrilamida desnaturante de alta resolução (GeneGel HyRes-Amersham Biosciences®) corado com nitrato de prata.

Este trabalho foi financiado pela CAPES, FADA e FAPESP.

Resultados

Dentre os 29 pacientes estudados, 13 eram do sexo feminino e 16 do masculino, com idades variando entre um dia e 28 anos (Tabela 1).

A análise do cariótipo foi realizada em 28 dos 29 pacientes (não foi possível coletar sangue periférico de um dos pacientes) e todos apresentaram resultados normais, com exceção de um dos pacientes (S77) que apresentou o cariótipo 47,XX,+mar. Após a realização das técnicas de FISH e de bandamento C e NOR, esse cariótipo foi dado como 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter).

Entre os pacientes com cariótipo normal, a deleção 22q11.2 foi observada em 25% (7/28) dos pacientes estudados. Entretanto, quando analisamos os grupos separadamente, a deleção estava presente em aproximadamente 42% (5/12) dos pacientes com fenótipo da síndrome associado à cardiopatia, em 20% (2/10) dos indivíduos com fenótipo da síndrome, mas sem cardiopatia e em nenhum dos pacientes (0/6) com cardiopatia conotruncal isolada. Verificamos que nenhuma das deleções era herdada.

Considerando os dados dos três marcadores polimórficos de DNA conjuntamente, um resultado informativo quanto à presença da deleção foi obtido em 94% (16/17) das famílias compostas por pacientes e ambos os genitores, em 71% (5/7) das famílias compostas por paciente e mãe e em 25% (1/4) dos casos em que estudamos só o probando. Quando consideramos todos os casos, encontramos resultados informativos dos marcadores em 79% dos casos (22/28).

Discussão

A deleção 22q11.2 não foi detectada pela análise do cariótipo, reforçando a idéia de que essa técnica é pouco eficaz para a investigação da deleção. No entanto, o exame de cariótipo é necessário para a investigação de outras aberrações cromossômicas relacionadas à cardiopatia, como no caso da paciente que apresentou cariótipo 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter). A hipótese diagnóstica inicial para essa paciente foi a síndrome da deleção 22q11.2, devido à presença de anomalias fenotípicas e interrupção do arco aórtico tipo B, um defeito cardíaco que está presente em 50% dos casos de deleção 22q11.213. Entretanto, como o cariótipo revelou a presença de um marcador isodicêntrico derivado do cromossomo 22, o diagnóstico final foi a tetrassomia parcial do cromossomo 22 ou síndrome cat eye (CES), uma síndrome malformativa rara, cujo diagnóstico é baseado na presença de um cromossomo marcador extra, derivado do cromossomo 2214. Nesse caso, a técnica de FISH também se mostrou eficiente para o aprimoramento do diagnóstico citogenético.

A freqüência da deleção 22q11.2 associada à síndrome da deleção 22q11.2 ainda não está bem estabelecida na literatura e pode variar, entre outros fatores, de acordo com a amostra estudada e com a técnica utilizada para a detecção. A análise molecular, incluindo marcadores de DNA e FISH, mostra que a deleção está presente em cerca de 80-90% dos casos da síndrome2,15,16. Em nosso estudo, a deleção 22q11.2 foi encontrada em 25% da amostra, freqüência menor do que a relatada na literatura.

Um fator que poderia explicar essa baixa freqüência da deleção é a grande variabilidade fenotípica observada nos pacientes desse estudo, uma vez que a amostra compreende desde pacientes com cardiopatia isolada até pacientes com o quadro completo da síndrome. De acordo com a literatura, a freqüência de deleção 22q11.2 entre os pacientes portadores de cardiopatia conotruncal isolada é de cerca de 29%17,18, bem menor do que a freqüência de deleção entre os pacientes com cardiopatia associada a outros sinais clínicos (80-90%)2,15,16. Em nossa casuística, nenhum dos seis pacientes com cardiopatia isolada apresentou deleção 22q11.2, um achado que corrobora o fato da deleção ser mais freqüente em pacientes que apresentam, além da cardiopatia, outros sinais fenotípicos associados17,18.

Todas as deleções foram encontradas em pacientes com o espectro clínico da síndrome, tanto em portadores de cardiopatia, como nos que não apresentavam cardiopatia. Esses dados mostram que pacientes com características fenotípicas faciais da síndrome, mesmo sem as malformações cardíacas, devem ser investigados quanto à presença da deleção.

A idade dos pacientes também pode ter influenciado a freqüência da deleção, uma vez que os pacientes selecionados apresentaram idades bem variadas e o fato de que em crianças muito pequenas o fenótipo nem sempre é tão evidente.

Vários indivíduos (15/22), apesar de serem portadores de sinais clínicos da síndrome, não apresentaram deleção detectável e, apesar de a deleção 22q11.2 ser a etiologia mais provável, outras causas podem ser responsáveis pelo fenótipo. Entre elas estão as mutações nos genes presentes nessa região (22q11.2) e em genes de outras regiões relacionadas à cardiopatias congênitas conotruncais, tais como 8p23.119e 10p1320.

Em relação ao uso de marcadores polimórficos de DNA, de acordo com nossos resultados concluímos que o ideal é estudar o probando e os dois genitores, embora o estudo isolado do paciente possa revelar resultados normais quando o indivíduo é heterozigoto, independente do estudo molecular dos pais. Assim, a avaliação molecular pode ser realizada em crianças com o fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2 como primeira triagem para se detectar a deleção 22q, antes de se utilizar a FISH. Além disso, na impossibilidade de colher sangue periférico dos pacientes, os ensaios moleculares podem ser realizados com DNA extraído de outros tecidos.

Neste trabalho, utilizamos três marcadores de DNA localizados na região que está deletada em aproximadamente 98% dos pacientes com o fenótipo da síndrome, o que aumenta a taxa de sucesso na investigação da deleção. No entanto, esses marcadores podem não detectar deleções atípicas, ou seja, deleções de segmentos que estejam fora da região tipicamente deletada, que ocorrem a uma freqüência de 2% em pacientes com o fenótipo da síndrome4.

A deleção 22q11.2 não estava presente em nenhum dos genitores das crianças com a deleção, caracterizando assim, todas as deleções dos probandos como esporádicas.

Conclusões

Os dados deste estudo sugerem que a deleção 22q11.2 é mais freqüente em pacientes portadores do quadro clínico da síndrome, do que em pacientes portadores de cardiopatia conotruncal isolada. Quanto às metodologias utilizadas para detecção, a técnica de FISH é mais precisa para se detectar deleção do que a técnica de marcadores de DNA. A técnica de FISH possibilita a investigação da presença de alterações cromossômicas nos pais de crianças portadoras da deleção, o que determina o risco reprodutivo do casal. A investigação da presença da deleção e sua correlação com os dados clínicos dos pacientes podem auxiliar o cardiologista a realizar um melhor seguimento aos pacientes.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado por FAPESP, CNPq e CAPES.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Sintia Iole Nogueira pela Universidade Federal de São Paulo.

Correspondência:

Sintia Iole Nogueira Belangero

Rua Botucatu, 740

Vila Clementino - 04023-900

São Paulo, SP - Brasil

E-mail:

sintia.morf@epm.br

Artigo recebido em 17/12/07, revisado recebido em 23/01/08; aceito em 10/04/08.

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BACKGROUND: The 22q11.2 deletion syndrome is the most frequent human microdeletion syndrome. The phenotype is highly variable, being characterized by conotruncal heart defect, facial dysmorphisms, velopharyngeal insufficiency, learning difficulties and mental retardation. OBJECTIVE: The objective of this study was to investigate the frequency of deletion 22q11.2 in a Brazilian sample of individuals with isolated conotruncal heart defect and 22q11.2 deletion syndrome phenotype. METHODS: Twenty-nine patients were studied by classical cytogenetics, by fluorescence in situ hybridization (FISH), and by molecular techniques. RESULTS: Cytogenetic analysis by G-banding revealed a normal karyotype in all patients except one who presented a 47,XX,+idic(22)(q11.2) karyotype. Using molecular techniques, a deletion was observed in 25% of the patients, all exhibiting a 22q11.2 deletion syndrome phenotype. In none of the cases the deletion was inherited from the parents. The frequency of 22q11.2 deletion was higher in patients with the clinical spectrum of the 22q11.2 deletion syndrome than in patients with isolated conotruncal heart defect. CONCLUSION: Investigating the presence of the deletion and its correlation with the patients' clinical data can help the patients and their families to have a better genetic counseling and more adequate clinical follow-up.

 Chromosome deletion phenotype heart defects, congenital genetic markers

ORIGINAL ARTICLE

q11.2 deletion in patients with conotruncal heart defect and delq syndrome phenotype

Sintia Iole Nogueira Belangero; Fernanda T.S. Bellucco; Leslie Domenici Kulikowski; Denise M. Christofolini; Mirlene C. S. P. Cernach; Maria Isabel Melaragno

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil

Mailling address

SUMMARY

BACKGROUND: The 22q11.2 deletion syndrome is the most frequent human microdeletion syndrome. The phenotype is highly variable, being characterized by conotruncal heart defect, facial dysmorphisms, velopharyngeal insufficiency, learning difficulties and mental retardation.

OBJECTIVE: The objective of this study was to investigate the frequency of deletion 22q11.2 in a Brazilian sample of individuals with isolated conotruncal heart defect and 22q11.2 deletion syndrome phenotype.

METHODS: Twenty-nine patients were studied by classical cytogenetics, by fluorescence in situ hybridization (FISH), and by molecular techniques.

RESULTS: Cytogenetic analysis by G-banding revealed a normal karyotype in all patients except one who presented a 47,XX,+idic(22)(q11.2) karyotype. Using molecular techniques, a deletion was observed in 25% of the patients, all exhibiting a 22q11.2 deletion syndrome phenotype. In none of the cases the deletion was inherited from the parents. The frequency of 22q11.2 deletion was higher in patients with the clinical spectrum of the 22q11.2 deletion syndrome than in patients with isolated conotruncal heart defect.

CONCLUSION: Investigating the presence of the deletion and its correlation with the patients' clinical data can help the patients and their families to have a better genetic counseling and more adequate clinical follow-up. (Arq Bras Cardiol 2009;92(4):289-293)

Key words: Chromosome deletion; phenotype; heart defects, congenital; genetic markers.

Introduction

For many years, the DiGeorge (DGS), velocardiofacial (VCFS) and conotruncal and facial anomaly (CAFS) syndromes were considered distinct syndromes. However, as they share the same etiology, i.e., deletion of the region q11.2 of chromosome 22, they are currently classified as variations of the same clinical spectrum, with phenotype overlap and variable expressivity, called the 22q11.2 deletion syndrome1. One of the most frequent characteristics of this syndrome is the presence of conotruncal heart malformation, but there can also be other alterations, such as cleft palate, hypoplasia of the thymus and parathyroid gland, facial dysmorphisms, nasal voice, learning difficulties, psychiatric diseases and mild mental retardation2.

The frequency of the 22q11.2 deletion is of approximately 1:4000 livebirths3, and it is present in about 90% of patients with the phenotype of the syndrome4. This deletion is sporadic in approximately 90% of the cases and inherited from one of the parents in 10%5. The great majority of patients (87%) present a 3Mb (megabase) deletion4. The deletion is not detectable by classical cytogenetics (karyotype); for this purpose, the use of other techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH) and polymorphic DNA markers, is required.

The identification of a sporadic deletion implies in a low recurrence risk (1 to 3%), whereas for an inherited deletion, the risk of transmission is 50%1,6. Therefore, cytogenetic and molecular investigations in affected subjects and their parents are essential for an accurate diagnosis, as well as for adequate genetic counseling.

The objective of this study was to evaluate the chromosomal constitution and the frequency of the 22q11.2 deletion in patients with isolated conotruncal heart defect and in carriers of the complete clinical spectrum of the 22q11.2 deletion syndrome. Whenever the deletion was present, we investigated whether it was inherited or not. Additionally, we compared the FISH and the polymorphic DNA marker methodologies as to their efficiency in detecting the 22q11.2 deletion.

Patients

The sample consisted of 29 patients (Table 1). The clinical inclusion criteria were: (I) conotruncal heart malformation associated with other clinical aspects of the 22q11.2 deletion syndrome (13 patients), (II) characteristic 22q11.2 deletion syndrome phenotype, without a heart defect (10 patients) and (III) isolated conotruncal heart malformation (6 patients). Most of the patients came from the nursery and the Medical Genetics Center of Hospital São Paulo and the others were referred from other hospitals in São Paulo. Seventeen families were constituted by the proband and his (her) parents, seven by the proband and his (her) mother, and five by the proband alone.

The patients' parents, whenever available, were studied by the DNA marker technique as well and, if the child had the deletion, they were also studied by FISH, so as to identify whether the deletion was inherited or not. This study was approved by the Research Ethics Committee of Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo. All proband families gave their informed consent for participation in the research.

Methods

Cytogenetic analysis

Lymphocyte cultures were made for karyotype analysis7. Fifteen metaphases were analyzed for each individual. The metaphase chromosomes, with a 400-550 chromosome band resolution, were classified according to the ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) (2005). Additional C-banding and NOR (nucleolus organizer region) staining techniques were used whenever necessary.

Fluorescence in situ hybridization (FISH)

The FISH technique was applied to lymphocyte cultures using a commercial probe that results in the simultaneous labeling of the DGS chromosome region that includes TUPLE1 gene (red labeling) and the terminal region of chromosome 22 as control (green labeling) (Cytocell® - Cambridge) (Figure 1). Twenty metaphases and/or 100 interphase nuclei from each patient were analyzed. In the case with a marker chromosome, a probe for the centromeres of chromosomes 14/22 (D14Z1/D22Z1 - Vysis®) and cosmid probes (c106e4 e c103a2) for the cat-eye-syndrome critical region were used.

Study by polymorphic DNA markers

DNA was extracted from peripheral blood lymphocytes8 and the PCR technique9 was performed using primers for three polymorphic loci located in the usually deleted region: D22S941, D22S944N and D22S26410-12 (Figure 1). The PCR products were tested on 1% agarose gel to investigate the presence of amplification, and then the size polymorphisms were evaluated on high-resolution denaturing polyacrylamide gel (GeneGel HyRes-Amersham Biosciences®) stained with silver nitrate.

This work was supported by CAPES, FADA and FAPESP.

Results

Of the 29 patients studied, 13 were female and 16 male, with ages ranging from one day to 28 years (Table 1).

Karyotype analysis was performed in 28 of the 29 patients (it was not possible to collect peripheral blood from one of the patients) and all but one presented normal results. One patient (S77) had a 47,XX,+mar karyotype. FISH and C- and NOR-banding techniques were performed and showed that the karyotype was 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter).

Among the patients with normal karyotype, a 22q11.2 deletion was observed in 25% (7/28) of the patients studied. However, when analyzing the groups separately, the deletion was present in about 42% (5/12) of the patients with the syndrome phenotype associated with a heart defect, in 20% (2/10) of the individuals with the syndrome phenotype, but without a heart defect, and in none (0/6) of the patients with isolated conotruncal heart defect. We observed that none of the deletions was inherited.

Considering the data of the three polymorphic DNA markers together, an informative result regarding the presence of the deletion was obtained in 94% (16/17) of the families consisting of a patient and both parents, in 71% (5/7) of the families consisting of a patient and his (her) mother, and in 25% (1/4) of the cases in which only the proband was studied. Considering all cases, the marker results were informative in 79% of the cases (22/28).

Discussion

The 22q11.2 deletion was not detected by karyotype analysis, reinforcing the idea that this technique is not very efficient to investigate this deletion. However, karyotype examination is necessary to investigate other chromosomal aberrations related to heart defect, as in the case of the patient with the 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter) karyotype. The initial diagnostic hypothesis for this patient was 22q11.2 deletion syndrome, due to the presence of phenotypic anomalies and type B interruption of the aortic arch, a heart defect present in 50% of the cases of 22q11.2 deletion13. However, as the karyotype revealed the presence of an isodicentric marker derived from chromosome 22, the final diagnosis was partial tetrasomy of chromosome 22 or cat eye syndrome (CES), a rare malformation syndrome of which diagnosis is based on the presence of an extra marker chromosome, derived from chromosome 2214. In this case, the FISH technique also proved to be efficient in refining the cytogenetic diagnosis.

The frequency of the 22q11.2 deletion associated with the 22q11.2 deletion syndrome has not been well established in the literature and may vary, among other factors, according to the sample studied and the technique used for its detection. Molecular analysis including DNA markers and FISH shows that the deletion is present in about 80-90% of the syndrome cases2,15,16. In our study, the 22q11.2 deletion was found in 25% of the sample, a frequency that is lower than the one reported in the literature.

A factor that might explain this low frequency of the deletion is the great phenotypic variability observed in the patients of this study, as our sample comprised from patients with isolated heart defect to patients with the complete clinical picture of the syndrome. According to the literature, the frequency of the 22q11.2 deletion among patients with isolated conotruncal heart defect is about 29%17,18, much lower than the deletion frequency among patients with a heart defect associated with other clinical signs (80-90%)2,15,16. In our series, none of the six patients with isolated heart defect presented the 22q11.2 deletion, a finding that corroborates the idea that the deletion is more frequent in patients who present, in addition to the heart defect, other associated phenotypic signs17,18.

All the deletions were found in patients with the clinical spectrum of the syndrome, both in patients with a heart defect and in patients without it. These data show that patients that present facial phenotypic characteristics of the syndrome, even without heart malformations, should be investigated for the presence of the deletion.

The patients' age may also have influenced the frequency of the deletion, as the age range of the selected patients varied greatly and the phenotype is not always so evident in very young children.

Several individuals (15/22), although bearers of the clinical signs of the syndrome, did not present a detectable deletion and, even though the 22q11.2 deletion is the most likely etiology, other causes may be responsible for this phenotype. Among them, there are mutations in the genes located in this region (22q11.2) and in genes from other regions related to congenital conotruncal heart defects, such as 8p23.119 and 10p1320.

Concerning the use of polymorphic DNA markers, our results led us to the conclusion that the ideal procedure is to study the proband and his (her) two parents, although if the patient is found to be heterozygous, this result is enough to indicate absence of the deletion, regardless of the parents' molecular study. Thus, a molecular evaluation can be performed in children with the 22q11.2 deletion syndrome phenotype as a first triage test to detect the 22q deletion, before using FISH. Moreover, when it is impossible to collect peripheral blood from the patients, molecular assays can be performed with DNA extracted from other tissues.

In this study, we used three DNA markers located in the region that is deleted in about 98% of the patients with the syndrome phenotype, which increases the success rate in the investigation of the deletion. However, these markers may not detect atypical deletions, i.e., deletions of segments which are outside the typically deleted region and which occur at a frequency of 2% in patients with the syndrome phenotype4.

The 22q11.2 deletion was not present in any of the parents of the children with the deletion, thus characterizing all the deletions detected in the probands as sporadic.

Conclusions

The data obtained in this study suggest that the 22q11.2 deletion is more frequent in patients with the clinical picture of the 22q11.2 deletion syndrome than in patients with isolated conotruncal heart defect. Regarding the detection methodologies used, the FISH technique is more accurate for detecting the deletion than the DNA marker technique. The FISH technique allows investigating the presence of chromosome alterations in the parents of children who carry the deletion, which determines the couple's reproductive risk. Investigating the presence of the deletion and its correlation with the patients' clinical data can help the cardiologist to provide a better follow-up for the patients.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESP, CNPq and CAPES.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Sintia Iole Nogueira, from Universidade Federal de São Paulo.

References

Artículos Originales Deleción 22q11.2 en pacientes con defecto cardiaco conotruncal y fenotipo del síndrome de la deleción 22q11.2

FUNDAMENTO: El síndrome de la deleción 22q11.2 es el más frecuente síndrome de microdeleción humana. El fenotipo, altamente variable, se caracteriza por defecto cardiaco conotruncal, dismorfias faciales, insuficiencia velofaríngea, dificultad de aprendizaje y retardo mental. OBJETIVO: El objetivo de este trabajo fue investigar la frecuencia tanto de la deleción 22q11.2 en una muestra brasileña de individuos portadores de cardiopatía conotrucal aislada, como del fenotipo del síndrome de la delación 22q11.2. MÉTODOS: Se estudiaron a 29 pacientes por medio de citogenética clásica, por hibridación in situ fluorescente (FISH) y también por técnicas moleculares. RESULTADOS: El análisis citogenético por medio de bandeo G reveló cariotipo normal en todos los pacientes, con excepción de uno, que presentó cariotipo 47,XX,+idic(22)(q11.2). Con la utilización de técnicas moleculares, se observó la deleción en el 25% de los pacientes, todos portadores del fenotipo del síndrome de la deleción 22q11.2. En ningún de los casos, la deleción se heredó de los padres. La frecuencia de la deleción 22q11.2 en el grupo de pacientes portadores del espectro clínico de este síndrome resultó mayor que en el grupo de pacientes con cardiopatía conotruncal aislada. CONCLUSIÓN: La investigación de la presencia de deleción y su correlación con los datos clínicos de los pacientes pueden auxiliar los pacientes y sus familias a tener un mejor aconsejamiento genético, así como un seguimiento clínico más adecuado.

 Deleción cromosómica fenotipo cardiopatías congénitas marcadores genéticos

ARTÍCULO ORIGINAL

Deleción 22q11.2 en pacientes con defecto cardiaco conotruncal y fenotipo del síndrome de la deleción 22q11.2

Sintia Iole Nogueira Belangero; Fernanda T.S. Bellucco; Leslie Domenici Kulikowski; Denise M. Christofolini; Mirlene C. S. P. Cernach; Maria Isabel Melaragno

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: El síndrome de la deleción 22q11.2 es el más frecuente síndrome de microdeleción humana. El fenotipo, altamente variable, se caracteriza por defecto cardiaco conotruncal, dismorfias faciales, insuficiencia velofaríngea, dificultad de aprendizaje y retardo mental.

OBJETIVO: El objetivo de este trabajo fue investigar la frecuencia tanto de la deleción 22q11.2 en una muestra brasileña de individuos portadores de cardiopatía conotrucal aislada, como del fenotipo del síndrome de la delación 22q11.2.

MÉTODOS: Se estudiaron a 29 pacientes por medio de citogenética clásica, por hibridación in situ fluorescente (FISH) y también por técnicas moleculares.

RESULTADOS: El análisis citogenético por medio de bandeo G reveló cariotipo normal en todos los pacientes, con excepción de uno, que presentó cariotipo 47,XX,+idic(22)(q11.2). Con la utilización de técnicas moleculares, se observó la deleción en el 25% de los pacientes, todos portadores del fenotipo del síndrome de la deleción 22q11.2. En ningún de los casos, la deleción se heredó de los padres. La frecuencia de la deleción 22q11.2 en el grupo de pacientes portadores del espectro clínico de este síndrome resultó mayor que en el grupo de pacientes con cardiopatía conotruncal aislada.

CONCLUSIÓN: La investigación de la presencia de deleción y su correlación con los datos clínicos de los pacientes pueden auxiliar los pacientes y sus familias a tener un mejor aconsejamiento genético, así como un seguimiento clínico más adecuado. (Arq Bras Cardiol 2009;92(4):298-302)

Palabras-clave: Deleción cromosómica, fenotipo, cardiopatías congénitas, marcadores genéticos.

Introducción

Durante muchos años se consideró que los síndromes de DiGeorge (DGS), velocardiofacial (VCFS) y de anomalías faciales y conotruncales (CAFS) eran síndromes distintos. Sin embargo, como presentan la misma etiología -la deleción de la región q11.2 del cromosoma 22-, dichos síndromes se clasifican como variaciones de un mismo espectro clínico, con superposición de fenotipo y expresividad variable, denominado síndrome de la deleción 22q11.21. Una de las características más frecuentes de ese síndrome es la presencia de malformación cardiaca conotruncal, pero otras alteraciones pueden presentarse, tales como paladar hendido, hipoplasia de timo y de glándula paratiroide, dismorfias faciales, voz nasalizada, dificultad de aprendizaje, enfermedades psiquiátricas y retardo mental leve2.

La deleción 22q11.2, cuya frecuencia resulta en cerca de 1:4000 nacidos vivos3, está presente en alrededor del 90% de los pacientes con el fenotipo del síndrome4. La deleción resulta esporádica aproximadamente en el 90% de los casos; el 10% de ellos la hereda de uno de los padres5. La gran mayoría de los pacientes (87%) presenta una deleción de 3Mb (megabases)4. No se puede detectar la deleción por medio de citogenética clásica (cariotipo), siendo necesaria la utilización de otras técnicas, tales como la de hibridación in situ fluorescente (FISH) y la de marcadores polimórficos de ADN.

La identificación de una deleción esporádica implica un bajo riesgo de recurrencia (del 1 al 3%), mientras que en una deleción heredada, hay un riesgo del 50% de transmisión del síndrome1,6. De esa forma, investigaciones citogenéticas y moleculares, tanto en los individuos afectados como en sus padres, resultan fundamentales para un diagnóstico preciso, así como para un aconsejamiento genético adecuado.

El objetivo de este estudio fue evaluar la constitución cromosómica y la frecuencia de la deleción 22q11.2, tanto en pacientes portadores de cardiopatía conotruncal aislada como en portadores del espectro clínico del síndrome de la deleción 22q11.2. En los casos en que la deleción se presentaba, verificamos si era la forma heredada o no. Además de ello, comparamos la eficiencia de las metodologías de FISH y de marcadores polimórficos de ADN para detectar la deleción 22q11.2.

Casuística

La muestra estaba conformada por 29 pacientes (Tabla 1). Los criterios clínicos para inclusión fueron los siguientes: (I) malformación cardiaca conotruncal asociada a otros aspectos clínicos del síndrome de la deleción 22q11.2 (13 pacientes); (II) fenotipo característico del síndrome de la deleción 22q11.2, sin cardiopatía (10 pacientes); y (III) malformación cardiaca conotruncal aislada (6 pacientes). La mayoría de los pacientes provenía del nido de la maternidad y del Centro de Genética Médica, ambos del Hospital São Paulo; los demás provinieron de otros hospitales de São Paulo. La cantidad de 17 familias estaban compuestas por los propositus y sus genitores, siete por los propositus y su madre, y cinco sólo por los propositus.

Cuando disponibles, se estudiaron a los padres de los pacientes con la técnica de marcadores de ADN. Si el niño presentaba deleción, se estudiaron a los padres por medio de la FISH, con la finalidad de investigar si la deleción era heredada o no. El Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de São Paulo/Hospital São Paulo aprobó este estudio. Todas las familias de los popositus firmaron el formulario consentimiento informado para participar en esta investigación.

Métodos

Análisis citogenético

Se realizaron culturas de linfocitos para el análisis de cariotipo7. Se analizaron 15 metafases por individuo. Se clasificaron los cromosomas metafásicos, con resolución de 400-550 bandas cromosómicas, conforme el ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) (2005). Cuando necesario, se utilizaron técnicas adicionales de bandeo C y coloración de las regiones organizadoras de nucléolo (NOR).

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

Se realizó la técnica de FISH a partir de la cultura de linfocitos, con sonda comercial que consiste en la marcación simultánea de la región de la DGS -que incluye el gen TUPLE1 (marcación en rojo)- y de la región terminal del cromosoma 22 como control (marcación en verde) (Cytocell®- Cambridge) (Figura 1). Se analizaron 20 metafases y/o 100 núcleos interfásicos de cada paciente. En los casos que presentaron un cromosoma marcador, se utilizó la sonda para centrómero de los cromosomas 14/22 (D14Z1/D22Z1 - Vysis®) y sondas de cósmidos (c106e4 y c103a2) para región crítica del síndrome cat eye.

Estudio por marcadores polimórficos de ADN

Se extrajo el ADN a partir de linfocitos de sangre periférica8. Se realizó la técnica de PCR9, con utilización de primers para tres loci polimórficos ubicados en la región comúnmente delecionada: D22S941, D22S944N y D22S26410-12 (Figura 1). Se probaron los productos de PCR en gel de agarosa al 1% para verificar la presencia de amplificación y, enseguida, se evaluaron los polimorfismos de tamaño en gel de poliacrilamida denaturante de alta resolución (GeneGel HyRes-Amersham Biosciences®) coloreado con nitrato de plata.

Este trabajo fue financiado por CAPES (Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior), FADA (Fondo de Auxilio a los Docentes y Alumnos - UNIFESP) y FAPESP (Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo).

Resultados

Entre los 29 pacientes estudiados, 13 eran del sexo femenino y 16 del masculino, con edades que variaban entre un día y 28 años (Tabla 1).

Se realizó el análisis del cariotipo en 28 de los 29 pacientes (no se pudo colectar sangre periférica de uno de los pacientes); todos tuvieron resultados normales, con excepción de uno (S77), que presentó el cariotipo 47,XX,+mar. Tras la realización de las técnicas de FISH y de bandeo C y NOR, ese cariotipo se mostró como 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter).

Entre los pacientes con cariotipo normal, se observó la deleción 22q11.2 en el 25% (7/28) de los pacientes estudiados. Sin embargo, cuando analizamos los grupos separadamente, la deleción se presentaba: en cerca del 42% (5/12) de los pacientes con fenotipo del síndrome asociado a cardiopatía; en el 20% (2/10) de los individuos con fenotipo del síndrome, pero sin cardiopatía; y en ningún de los pacientes (0/6) con cardiopatía conotruncal aislada. Verificamos que ninguna de las deleciones era heredada.

Tomándose en consideración los datos de los tres marcadores polimórficos de ADN en su conjunto, se obtuvo un resultado informativo respecto a la presencia de la deleción en el 94% (16/17) de las familias compuestas por pacientes y ambos genitores, así como en el 71% (5/7) de las familias compuestas por paciente y madre y, también en el 25% (1/4) de los casos en que estudiamos solamente el propositus. Cuando consideramos todos los casos, encontramos resultados informativos de los marcadores en el 79% de los casos (22/28).

Discusión

No se detectó la deleción 22q11.2 a través del análisis del cariotipo, lo que refuerza la idea de que esa técnica resulta poco eficaz para la investigación de dicho defecto. No obstante, el examen de cariotipo se muestra necesario para investigarse otras aberraciones cromosómicas relacionadas a la cardiopatía, como en el caso de la paciente que presentó cariotipo 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter). La hipótesis diagnóstica inicial para dicha paciente fue el síndrome de la deleción 22q11.2, en virtud de la presencia de anomalías fenotípicas e interrupción del arco aórtico tipo B, un defecto cardiaco que está presente en el 50% de los casos de deleción 22q11.213. Sin embargo, como el cariotipo reveló la presencia de un marcador isodicéntrico derivado del cromosoma 22, el diagnóstico final fue de tetrasomía parcial del cromosoma 22 o síndrome cat eye (CES), un síndrome malformativo raro, cuyo diagnóstico se basa en la presencia de un cromosoma marcador extra, derivado del cromosoma 2214. En ese caso, la técnica de FISH también se mostró eficiente para el perfeccionamiento del diagnóstico citogenético.

Todavía no se estableció suficientemente en la literatura la frecuencia de la deleción 22q11.2 asociada al síndrome de la deleción 22q11.2. Ella puede variar, entre otros factores, de acuerdo con la muestra estudiada y con la técnica utilizada para la detección. El análisis molecular, incluidos los marcadores de ADN y FISH, muestra que la deleción está presente en cerca del 80-90% de los casos del síndrome2,15,16. En nuestro estudio, se verificó la deleción 22q11.2 en el 25% de la muestra, frecuencia menor que la relatada en la literatura.

Un factor que podría explicar esa baja frecuencia de la deleción es la gran variabilidad fenotípica observada en los pacientes de ese estudio, una vez que la muestra comprende desde pacientes con cardiopatía aislada hasta pacientes con el cuadro completo del síndrome. De acuerdo con la literatura, la frecuencia de deleción 22q11.2 entre los pacientes portadores de cardiopatía conotruncal aislada es de cerca del 29%17,18, mucho menor que la frecuencia de deleción entre los pacientes con cardiopatía asociada a otros señales clínicas (80-90%)2,15,16. En nuestra casuística, ningún de los seis pacientes con cardiopatía aislada presentó deleción 22q11.2, un hallazgo que corrobora el hecho de que dicha enfermedad sea más frecuente en pacientes que presentan, además de cardiopatía, otras señales fenotípicas asociadas17,18.

Se encontraron todas las deleciones en pacientes con el espectro clínico del síndrome, tanto en portadores de cardiopatía, como en los que no presentaban cardiopatía. Esos datos muestran que se debe investigar pacientes con características fenotípicas faciales del síndrome con relación a la presencia de deleción, aunque no presenten malformaciones cardiacas.

La edad de los pacientes también puede haber influido en la frecuencia de la deleción, una vez que los pacientes seleccionados presentaron edades bastante variadas, y si se toma en cuenta el hecho de que en niños muy pequeños el fenotipo no se muestra siempre de modo evidente.

Varios individuos (15/22), aunque eran portadores de señales clínicas del síndrome, no presentaron deleción detectable y, a pesar de que la deleción 22q11.2 sea la etiología más probable, otras causas pueden ser responsables por el fenotipo. Entre ellas están las mutaciones en los genes presentes en esa región (22q11.2), así como en genes de otras regiones relacionadas a cardiopatías congénitas conotruncales, como por ejemplo 8p23.119 y 10p1320.

Con relación al uso de marcadores polimórficos de ADN, de acuerdo con nuestros resultados concluimos que lo ideal es estudiar el propositus y sus dos genitores, aunque el estudio aislado del paciente puede revelar resultados normales cuando el individuo es heterocigoto, independientemente del estudio molecular de los padres. Así, se puede realizar la evaluación molecular en niños con el fenotipo del síndrome de la deleción 22q11.2 como primer triaje, con la finalidad de detectar la deleción 22q, antes que se utilice a la FISH. Además de ello, cuando no es posible colectar sangre periférica de los pacientes, se pueden realizar los ensayos moleculares con ADN extraído de otros tejidos.

En este trabajo, utilizamos tres marcadores de ADN ubicados en la región que está delecionada en cerca del98% de los pacientes con el fenotipo del síndrome, lo que aumenta la tasa de éxito de la investigación de la enfermedad en cuestión. Sin embargo, esos marcadores pueden no detectar deleciones atípicas, es decir, deleciones de segmentos que estén fuera de la región típicamente delecionada, lo que ocurre en un frecuencia del 2% en pacientes con el fenotipo del síndrome4.

La deleción 22q11.2 no estaba presente en ningún de los genitores de niños con dicha enfermedad, lo que caracteriza todas las deleciones de los propositus como esporádicas.

Conclusiones

Los datos de este estudio sugieren que la deleción 22q11.2 en pacientes portadores del cuadro clínico del síndrome resulta más frecuente que en aquellos portadores de cardiopatía conotruncal aislada. En cuanto a las metodologías utilizadas para detección, la técnica de FISH se muestra más precisa para detectarse la deleción, si se la compara a la técnica de marcadores de ADN. La técnica de FISH posibilita la investigación de la presencia de alteraciones cromosómicas en los padres de niños portadores de la deleción, lo que determina el riesgo reproductivo de la pareja. La investigación de la presencia de la deleción y su correlación con los datos clínicos de los pacientes puede auxiliar el cardiólogo a realizar un mejor seguimiento a los pacientes.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

FAPESP, CNPq y CAPES financiaron el presente estudio.

Vinculación Académica

Este artículo forma parte de tesis de Doctorado de Sintia Iole Nogueira por la Universidade Federal de São Paulo.

Referencias