abcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCSão Paulo, SP, Brazilz9BVmHKp6YDj35VYWJQmtHF00003S0066-782X2009000400003S0066-782X(09)0920040310.1590/S0066-782X2009000400003Artigos OriginaisHomocisteína e polimorfismos dos genes MTHFR e VEGF: impacto na doença arterial coronarianaGuerzoniAlexandre RodriguesBiselliPatrícia MatosGodoyMoacir Fernandes deSouzaDoroteia Rossi SilvaHaddadRenatoEberlinMarcos NogueiraPavarino-BertelliErika CristinaGoloni-BertolloEny MariaCampinasSão PauloUniversidade Estadual de CampinasFaculdade de Ciências Médicas BrazilSão José do Rio PretoSPFaculdade de Medicina de São José do Rio Preto042009924263268150620071710200727012008This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
FUNDAMENTO: Polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento da aterosclerose, angiogênese e metabolismo da homocisteína (Hcy) podem ser fatores de risco para a doença arterial coronariana (DAC). OBJETIVO: Avaliar o efeito dos polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T na DAC e a associação desses polimorfismos com a gravidade e a extensão das lesões ateroscleróticas e concentrações de Hcy. MÉTODOS: 244 indivíduos foram avaliados através de angiografia coronariana e incluídos no estudo (145 com DAC e 99 indivíduos-controle). Os polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T foram investigados através das técnicas de PCR-SSCP e PCR-RFLP, respectivamente. Os níveis de homocisteína plasmática foram mensurados através de cromatografia líquida/espectrometria de massa seqüencial (CL/EMS). RESULTADOS: Não houve diferença significante em relação à distribuição de alelos e genótipos entre os grupos, para ambos os polimorfismos. A análise univariada mostrou uma freqüência maior do genótipo VEGF -2578AA no grupo com doença em três vasos (p=0,044). Além disso, o genótipo VEGF -2578CA foi observado mais freqüentemente entre indivíduos com <95% de estenose (p=0,010). Após ajuste para outros fatores de risco para DAC em um modelo multivariado, observou-se que o polimorfismo VEGF C-2578A não era um correlato independente da DAC (p=0,688). O polimorfismo MTHFR não mostrou qualquer relação com a extensão e/ou gravidade da DAC. O polimorfismo MTHFR C677T não mostrou uma associação direta com hiperhomocisteinemia ou aumento das concentrações médias de Hcy no plasma. CONCLUSÃO: Embora haja uma aparente associação entre o polimorfismo VEGF C-2578A e o desenvolvimento de aterosclerose coronariana, essa associação não é independente dos fatores de risco cardiovasculares convencionais.
Doença de artéria coronarianaaterosclerosepolimorfismo genéticohomocisteína23062009
ARTIGO ORIGINAL
BIOLOGIA MOLECULAR
Homocisteína e polimorfismos dos genes MTHFR e VEGF: impacto na doença arterial coronariana
IFaculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP, São José do Rio Preto, SP
IIFaculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas, SP - Brasil
Correspondência
RESUMO
FUNDAMENTO: Polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento da aterosclerose, angiogênese e metabolismo da homocisteína (Hcy) podem ser fatores de risco para a doença arterial coronariana (DAC).
OBJETIVO: Avaliar o efeito dos polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T na DAC e a associação desses polimorfismos com a gravidade e a extensão das lesões ateroscleróticas e concentrações de Hcy.
MÉTODOS: 244 indivíduos foram avaliados através de angiografia coronariana e incluídos no estudo (145 com DAC e 99 indivíduos-controle). Os polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T foram investigados através das técnicas de PCR-SSCP e PCR-RFLP, respectivamente. Os níveis de homocisteína plasmática foram mensurados através de cromatografia líquida/espectrometria de massa seqüencial (CL/EMS).
RESULTADOS: Não houve diferença significante em relação à distribuição de alelos e genótipos entre os grupos, para ambos os polimorfismos. A análise univariada mostrou uma freqüência maior do genótipo VEGF -2578AA no grupo com doença em três vasos (p=0,044). Além disso, o genótipo VEGF -2578CA foi observado mais freqüentemente entre indivíduos com <95% de estenose (p=0,010). Após ajuste para outros fatores de risco para DAC em um modelo multivariado, observou-se que o polimorfismo VEGF C-2578A não era um correlato independente da DAC (p=0,688). O polimorfismo MTHFR não mostrou qualquer relação com a extensão e/ou gravidade da DAC. O polimorfismo MTHFR C677T não mostrou uma associação direta com hiperhomocisteinemia ou aumento das concentrações médias de Hcy no plasma.
CONCLUSÃO: Embora haja uma aparente associação entre o polimorfismo VEGF C-2578A e o desenvolvimento de aterosclerose coronariana, essa associação não é independente dos fatores de risco cardiovasculares convencionais.
Palavras-chave: Doença de artéria coronariana, aterosclerose, polimorfismo genético, homocisteína.
Introdução
O gene que codifica o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem sido estudado no desenvolvimento de doenças coronarianas1-3. O VEGF, presente nas paredes dos vasos, promove a proliferação das células endoteliais vasculares e a angiogênese, mas seu papel na aterosclerose ainda é pouco entendido. Há estudos que apontam o VEGF como um fator de proteção no desenvolvimento da placa aterosclerótica, ao agir como um regulador da integridade endotelial da parede arterial coronariana4,5. Por outro lado, há estudos mostrando que a neovascularização, mediada pelo VEGF, influencia a patogênese das doenças arteriais6.
Alterações das concentrações de VEGF podem ser mediadas por polimorfismos genéticos7,8. Vários polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram descritos no gene VEGF. Renner e cols.7 descreveram três polimorfismos do gene VEGF (C702T, C936T e G1612A) e observaram níveis significantemente mais baixos de VEGF no plasma em carreadores do alelo 936T, quando comparados com não-carreadores. Os polimorfismos C702T e G1612 não mostraram associação com os níveis de VEGF. Níveis elevados também foram associados com o alelo G no nucleotídeo VEGF -11548. Em um estudo com pacientes submetidos à angiografia coronariana, o polimorfismo C-2578A foi considerado um fator de risco para o desenvolvimento de aterosclerose1. Essa variação genética já foi associada com uma menor expressão do VEGF8.
A hiperhomocisteinemia, isto é, aumento da concentração de homocisteína (Hcy) no sangue, é considerada um fator de risco independente para a aterosclerose e doença arterial coronariana (DAC)9. O aumento das concentrações de Hcy é encontrado em 40% dos pacientes com doença arterial coronariana, arterial cerebral ou arterial periférica e em apenas 15% de indivíduos saudáveis10.
O mecanismo através do qual a hiperhomocisteinemia induz o desenvolvimento de lesões vasculares ainda é pouco conhecido. Evidências experimentais sugerem que a Hcy pode estar envolvida na aterogênese e trombogênese, levando à hiperplasia da célula muscular e fibrose10,11. Concentrações anormais de Hcy podem resultar da interação de fatores genéticos e nutricionais12. A enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), que tem um papel importante no metabolismo da Hcy, apresenta diminuição da atividade como resultado do polimorfismo na posição 677 do gene MTHFR e leva ao aumento das concentrações de Hcy13. A variante alélica MTHFR 677T tem sido encontrada com alta freqüência em pacientes com doenças vasculares14-17.
No presente estudo, analisamos a freqüência dos polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T em pacientes com DAC e em um grupo de indivíduos sem sinais angiográficos da doença e avaliamos a associação entre esses polimorfismos e a gravidade e extensão das lesões ateroscleróticas e as concentrações plasmáticas de Hcy.
Métodos
Sujeitos do estudo
O presente estudo foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa - CONEP, DF, Brasil. Após a obtenção do Consentimento Livre e Informado, 244 indivíduos caucasóides foram incluídos no estudo (145 com DAC e 99 sem a doença). O diagnóstico de DAC foi confirmado ou eliminado através de angiografia coronariana, analisada por dois observadores independentes em uma análise cega quantitativa feita no Laboratório de Cateterismo. Indivíduos que haviam sido submetidos à cirurgia cardíaca e aqueles com prótese coronária foram excluídos do estudo. Embora a miscigenação no Brasil seja disseminada, consideramos como Caucasóides aqueles indivíduos que não apresentavam outros grupos étnicos nas três gerações precedentes18.
A extensão da DAC foi determinada de acordo com o número de vasos coronários envolvidos (0 a 3) e a gravidade através do grau de obstrução arterial (estenose <50%, >50-75%, >75-95%, e >95%). A fração de ejeção (FE) < 40% foi considerada como dano ventricular. Angina típica foi considerada como presente ou ausente. Os fatores de risco clássicos para DAC também foram investigados. Os critérios para a definição de diabetes foram o uso de agentes hipoglicemiantes orais ou tratamento com insulina, ou níveis glicêmicos >126 mg/dl; para hipertensão, o uso de medicação anti-hipertensiva ou pressão arterial >140/90 mmHg; para sedentarismo, a ausência de exercícios regulares e controlados; para alcoolismo, a ingestão de álcool com uma freqüência definida sem uma análise quantitativa; indivíduos que haviam fumado >100 cigarros durante a sua vida e no momento fumavam todos os dias ou em alguns dias, foram considerados fumantes.
Análise bioquímica
Amostras de sangue periférico dos pacientes foram coletadas durante o exame angiográfico, após jejum de 12 horas. A separação do plasma foi feita em até uma hora após a coleta do sangue para a mensuração da Hcy, de acordo com o método de cromatografia líquida/espectrometria de massa seqüencial (CL/EMS)19. As concentrações de Hcy >15µmol/ml foram consideradas como caracterizadoras de hiperhomocisteinemia20. Os procedimentos para determinação do perfil lipídico foram Feitos No Laboratório de Análises Clínicas do Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.
Triglicérides (TG), colesterol total (CT), lipoproteínas de alta densidade (HDLc) e lipoproteínas de baixa densidade (LDLc) foram mensurados pelo método colorimétrico enzimático.
Determinação de genótipo
DNA genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico21. O polimorfismo VEGF C-2578A foi investigado através do método de Reação de Polimerase em Cadeia - Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (PCR-SSCP), de acordo com Brogan e cols.22. Trinta ciclos de amplificação (95ºC por 30s, 62ºC por 30s, e 72ºC por 60s) foram feitos para amplificar um produto de 309 pb. Então, 6 µl do produto da PCR foram denaturados a 95ºC por 5 minutos com 6 µl de solução corante para eletroforese (80% v/v formamida; 10mM NaOH; 1 mM EDTA, pH 8,0; 0,1% w/v de azul de bromofenol e 1,1% xilenocianol). Os produtos denaturados foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida e visualizados após coloração com nitrato de prata.
A genotipagem para o polimorfismo MTHFR C677T foi feita através de PCR, seguida por digestão enzimática16. Trinta e cinco ciclos (94ºC por 60s, 58ºC por 60s, e 72ºC por 60s) foram executados para amplificar um produto de 198 pb. Os produtos de PCR forma digeridos com a enzima de restrição Hinf I e os fragmentos foram analisados em gel de poliacrilamida a 9,6% após coloração com nitrato de prata. O alelo C não foi digerido, enquanto o alelo T foi cortado em dois fragmentos de 175 e 23 pb, respectivamente.
Análise estatística
Os dados são apresentados como médias ± desvios-padrão (DP) ou números (porcentagens). A comparação entre os grupos foi feita utilizando-se o teste de Qui-quadrado, teste t de Student ou teste de Mann-Whitney, como apropriado. A análise de dependência foi utilizada para examinar as diferenças das freqüências de genótipo entre os grupos com uma, duas ou três artérias afetadas, e entre grupos com diferentes graus de estenose. Os valores de Hcy foram modelados baseando-se em uma distribuição normal na escala logarítmica. A concentração de Hcy em relação ao polimorfismo MTHFR foi avaliada através de análise de variância (ANOVA). A relação independente dos polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T com os fatores de risco na presença de DAC foi testada através de análise de regressão logística múltipla. Um valor de p < 0,05 foi utilizado para estabelecer a significância estatística.
Suporte financeiro
Fundação de Apoio à Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP).
Resultados
As características da população estudada são apresentadas na Tabela 1. Os resultados significantemente diferentes obtidos para indivíduos com e sem DAC estão de acordo com os fatores de risco cardiovascular previamente estabelecidos.
Polimorfismo do gene do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
Não houve diferença significante entre os grupos em relação às freqüências de alelos (p=0.995) e genótipo (p=0.254) do polimorfismo VEGF C-2578A. Os cálculos para o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) mostraram que a distribuição genotípica observada foi similar à esperada, no grupo com DAC e no grupo controle (x21=3,12; p=0,077 e x21=0,46; p=0,496, respectivamente).
As freqüências genotípicas de acordo com o número de vasos envolvidos e o grau de obstrução arterial são apresentadas nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. Uma freqüência significantemente mais alta do genótipo VEGF -2578AA foi observada em indivíduos com três artérias afetadas (p=0,044). Em relação ao grau de obstrução arterial, o genótipo VEGF -2578CA foi observado mais freqüentemente em indivíduos com < 95% de estenose (p=0,010).
Polimorfismo do gene da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) e concentrações de homocisteína
Não houve diferença significante entre os grupos em relação às freqüências de alelos (p=0,895) e genótipo (p=0,884) do polimorfismo MTHFR C677T. A distribuição genotípica observada foi similar à esperada no grupo controle (x21=2,23; p=0,135), mas no grupo com DAC, mostrou desequilíbrio de Hardy-Weinberg, com uma diferença significante entre as freqüências observada e esperada (x21=5,76; p=0,016).
Nenhuma associação foi observada entre o polimorfismo MTHFR C677T e o número de vasos envolvidos e/ou o grau de obstrução arterial (Tabelas 2 e 3). A concentração média de Hcy não diferiu significantemente entre os grupos (p=0,222), bem como a presença de hiperhomocisteinemia (p=0,266). A média da concentração de Hcy não apresentou nenhuma associação com o número de vasos envolvidos (p= 0,793) ou o grau de obstrução arterial (p=0,700).
O polimorfismo MTHFR C677T não mostrou relação direta com a hiperhomocisteinemia (p=0,860) ou aumento da concentração média de Hcy (p=0,758).
Análise multivariada
A regressão logística múltipla foi utilizada para testar os correlatos independentes para a presença de DAC. O modelo incluiu: fumo, hipertensão, diabetes, níveis de HDLc e os polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T. Fumo (p=0,006), diabetes (p=0,041), e níveis de HDLc <40 mg/dL (p=0,0008) foram correlatos independentes da presença de DAC. A hipertensão mostrou uma tendência à associação com DAC (p=0,061). Os polimorfismos VEGF C-2578A (p=0,688) e MTHFR C677T (p=0,981) não foram preditores independentes de DAC.
Discussão
No presente estudo, a freqüência alélica e a genotípica do polimorfismo VEGF C-2578A não diferiram entre pacientes com e sem DAC. Entretanto, uma maior freqüência do genótipo VEGF-2578AA foi observada em indivíduos com três artérias afetadas. Este resultado corrobora os achados de um estudo recente de Howell e cols.1 no qual o genótipo VEGF-2578AA foi considerado um fator de risco para o desenvolvimento de aterosclerose, enquanto o genótipo VEGF -2578CC mostrou ter um efeito protetor. De acordo com esse estudo, a freqüência do genótipo VEGF -2578AA aumentou gradualmente com o número de vasos envolvidos, quando comparada com o genótipo selvagem (wild-type) VEGF -2578CC, sugerindo que a redução da expressão do VEGF resultante do genótipo VEGF-2578AA poderia promover o desenvolvimento de aterosclerose. A maior freqüência do genótipo VEGF -2578CA entre indivíduos com <95% de estenose sugere uma associação entre esse genótipo e a progressão mais lenta da lesão aterosclerótica, possivelmente devido à presença do alelo selvagem. Entretanto, nenhuma associação foi encontrada em relação ao genótipo selvagem VEGF -2578CC, possivelmente devido ao número reduzido de indivíduos na amostra.
Embora nossos resultados em relação ao polimorfismo do VEGF e a gravidade e extensão da DAC sejam significantes, após o ajuste para outros fatores de risco em um modelo multivariado, a associação positiva entre o polimorfismo VEGF C-2578A e a gravidade da DAC perdeu significância estatística. Já que o polimorfismo VEGF C-2578A não foi um fator de risco independente para a DAC, esses dados não confirmam a ligação casual entre o polimorfismo VEGF C-2578A e aterosclerose coronariana.
O papel do VEGF na aterosclerose é motivo de debate na literatura. Alguns estudos mostraram que a administração de VEGF humano recombinante em animais aumenta a progressão das placa aterosclerótica23, enquanto outros observaram que ele age como um fator anti-aterosclerótico, promovendo a re-endotelização, reduzindo o espessamento da camada íntima e prevenindo a formação de coágulos5.
As correlações entre genótipos e expressão não foram analisadas em nosso estudo. Entretanto, um estudo feito por Shahbazi e cols.8 com receptores de transplante renal, encontrou uma associação entre o alelo selvagem VEGF 2578C e o aumento das concentrações de VEGF. Outros polimorfismos do gene VEGF já foram associados com variações na expressão da proteína7,8. De acordo com Howell e cols.1, o genótipo VEGF -2578AA poderia ser considerado um fator de risco para aterosclerose devido à redução da expressão da proteína. Esse resultado é consistente com a ação do VEGF na regulação endógena da integridade endotelial da parede da artéria coronariana4. Por outro lado, a neovascularização da placa aterosclerótica, mediada pelo VEGF, disponibiliza nutrientes e componentes da placa, aumentando seu volume. Em paredes arteriais com oclusão total por placas ateroscleróticas, como observado em estudo prospectivo, microvasos chamados vasa vasorum foram correlacionados, em sua anatomia e quantidade, ao grau de inflamação da placa intimal24. Moulton e cols.25 observou uma redução na progressão da aterosclerose secundária à inibição da neovascularização mediada pelo VEGF. Assim, mais estudos são necessários para esclarecer o verdadeiro papel do VEGF na DAC.
Nesse estudo, as freqüências alélica e genotípica do polimorfismo MTHFR C677T não foram diferentes entre pacientes e controles. Entretanto, no grupo com DAC, a distribuição genotípica observada foi diferente da esperada de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Estudos de caso-controle com análise de SNPs mostraram fuga do EHW em pacientes, em controles ou em ambos os grupos26-28. Esse desequilíbrio pode ser esperado para várias doenças genéticas, considerando que provavelmente haja uma contribuição genética significante em doenças complexas29. Embora alguns estudos tenham encontrado evidência de associação entre o alelo polimórfico MTHFR 677T e doenças vasculares, aterosclerose carotídea, doença arterial oclusiva e infarto do miocárdio15-17,30-32, outros não confirmaram essas hipóteses11,33.
Cerca de 40% dos pacientes com DAC apresentavam hiperhomocisteinemia34. Em nosso estudo, 49,7% dos pacientes com DAC e 45,2% dos controles apresentavam concentrações de Hcy >15 µmol/l, e essa diferença não foi significante. Outro estudo brasileiro mostrou uma diferença significante em concentrações de Hcy entre o grupo controle e o grupo com ateromatose grave. Esses autores também observaram uma correlação positiva entre níveis mais altos de Hcy e DAC35. Em nosso estudo, concentrações médias mais altas de Hcy foram encontradas no grupo com DAC quando comparados com o grupo controle, mas a diferença não foi significante (dados não mostrados), o que está de acordo com os achados de Yilmaz e cols.36.
Estudos clínicos envolvendo tratamentos para reduzir os níveis de homocisteína têm demonstrado que a suplementação com folato não reduziu o risco de complicações e morte por causas cardiovasculares, apesar de uma redução substancial nos níveis plasmáticos totais de Hcy37,38. Embora estudos observacionais tenham demonstrado que o nível plasmático total de Hcy é um preditor de eventos cardiovasculares39, nenhum papel causativo da Hcy foi substanciado pelos resultados de estudos de intervenção envolvendo tratamento para redução de níveis de homocisteína.
No estudo prospectivo de Frederiksen e cols.40, a concentração média de Hcy era mais alta em portadores do genótipo MTHFR 677TT quando comparados a outros genótipos; entretanto, o polimorfismo MTHFR C677T não foi associado com doença isquêmica cardiovascular ou tromboembolismo. Observações similares foram relatadas por Huh e cols.41 e Yilmaz e cols.36 em estudos de DAC. Nas populações estudadas por nós, o polimorfismo MTHFR C677T não apresentou uma relação direta com a hiperhomocisteinemia ou aumento das concentrações médias de Hcy, nos grupos com DAC ou controle. Uma correlação entre a presença dessa mutação e a hiperhomocisteinemia também foi observada por Lima e cols.35, em um estudo brasileiro.
O tamanho da amostra é um fator importante em estudos de caso-controle, principalmente em investigações de polimorfismos genéticos com alta freqüência na população em geral. Embora o número de indivíduos avaliados nesse estudo seja suficiente para demonstrar uma diferença estatística na distribuição do genótipo entre os subgrupos com diferentes graus de obstrução arterial e número de artérias envolvidas, nenhuma diferença foi observada entre o grupo com DAC e o grupo controle. Os estudos na literatura utilizam amostras maiores, principalmente para avaliar a associação entre polimorfismos e DAC ou Hcy. Além disso, a investigação de alterações em outras enzimas envolvidas no metabolismo da Hcy e nas concentrações plasmáticas de folato e vitaminas B6 e B12, e ingestão de vitaminas, poderia fornecer dados mais consistentes para a discussão sobre o efeito dos polimorfismos nas concentrações de Hcy.
Em resumo, há uma aparente associação entre o polimorfismo VEGF C-2578A e o desenvolvimento de aterosclerose; entretanto, essa associação não é independente dos fatores de risco cardiovascular convencionais.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Celso Pereira Reis Filho pelo gerenciamento do banco de dados e ao Prof. Dr. José Antônio Cordeiro pela análise estatística e reconhecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Potencial Conflito de Interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
Fontes de Financiamento
O presente estudo foi financiado por FAPESP e CNPq.
Vinculação Acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Alexandre Rodrigues Guerzoni pela Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP.
Correspondência:
Patrícia Matos Biselli
Av. Brigadeiro Faria Lima, 5416
São Pedro, 15.090-000
São José do Rio Preto, SP - Brasil
E-mail:
patriciabiselli@famerp.br
Artigo em 15/06/07; revisado recebido 17/10/07; aceito 27/01/08.
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BACKGROUND: Polymorphisms in genes involved in the atherosclerosis development, angiogenesis, and homocysteine (Hcy) metabolism could be risk factors for coronary artery disease (CAD). OBJECTIVE: To evaluate the effect of the VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms on CAD, and the association of these polymorphisms with the severity and extension of atherosclerotic lesions and Hcy concentrations. METHODS: Two hundred and forty-four subjects were evaluated by coronary angiography and included in the study (145 with CAD and 99 controls). The VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms were investigated by the PCR-SSCP and PCR-RFLP techniques, respectively. Plasma Hcy was quantified by liquid chromatography/sequential mass spectrometry (LC-MS/MS). RESULTS: There was no significant difference in allele and genotype distribution between the groups, for both polymorphisms. The univariate analysis showed a higher frequency of the VEGF -2578AA genotype in the group with three-vessel disease (p=0.044). In addition, the VEGF -2578CA genotype was observed more frequently among individuals with <95% stenosis (p=0.010). After adjustment for other risk factors for CAD in a multivariate model, the VEGF C-2578A polymorphism was not found to be an independent correlate of CAD (p=0.688). The MTHFR polymorphism did not show any association with the extension and/or severity of the CAD. The MTHFR C677T polymorphism showed no direct association with hyperhomocysteinemia or increased mean plasma concentrations of Hcy. CONCLUSION: Although there is an apparent association between VEGF C-2578A and the development of coronary atherosclerosis, this association is not independent of conventional cardiovascular risk factors.
IFaculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP
IISão José do Rio Preto, SP; Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas, SP - Brazil
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SUMMARY
BACKGROUND: Polymorphisms in genes involved in the atherosclerosis development, angiogenesis, and homocysteine (Hcy) metabolism could be risk factors for coronary artery disease (CAD).
OBJECTIVE: To evaluate the effect of the VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms on CAD, and the association of these polymorphisms with the severity and extension of atherosclerotic lesions and Hcy concentrations.
METHODS: Two hundred and forty-four subjects were evaluated by coronary angiography and included in the study (145 with CAD and 99 controls). The VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms were investigated by the PCR-SSCP and PCR-RFLP techniques, respectively. Plasma Hcy was quantified by liquid chromatography/sequential mass spectrometry (LC-MS/MS).
RESULTS: There was no significant difference in allele and genotype distribution between the groups, for both polymorphisms. The univariate analysis showed a higher frequency of the VEGF -2578AA genotype in the group with three-vessel disease (p=0.044). In addition, the VEGF -2578CA genotype was observed more frequently among individuals with <95% stenosis (p=0.010). After adjustment for other risk factors for CAD in a multivariate model, the VEGF C-2578A polymorphism was not found to be an independent correlate of CAD (p=0.688). The MTHFR polymorphism did not show any association with the extension and/or severity of the CAD. The MTHFR C677T polymorphism showed no direct association with hyperhomocysteinemia or increased mean plasma concentrations of Hcy.
CONCLUSION: Although there is an apparent association between VEGF C-2578A and the development of coronary atherosclerosis, this association is not independent of conventional cardiovascular risk factors. (Arq Bras Cardiol 2009;92(4):249-254)
The gene encoding the vascular endothelial growth factor (VEGF) has been studied in the development of coronary diseases1-3. VEGF, present in the vessel walls, promotes the proliferation of vascular endothelial cells and angiogenesis, but its role in atherosclerosis is still obscure. There are studies pointing to VEGF as a protection factor in the atherosclerotic plaque development, by acting as a regulator of the coronary artery wall endothelial integrity4,5. On the other hand, there are studies showing that neovascularization, mediated by VEGF, influences the pathogenesis of arterial diseases6.
Alterations in the VEGF concentrations can be mediated by genetic polymorphisms7,8. Several single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been described in the VEGF gene. Renner et al7 described three polymorphisms of the VEGF gene (C702T, C936T and G1612A) and observed significantly lower VEGF plasma levels in 936T allele carriers compared to non-carriers. The C702T and G1612 polymorphisms showed no association with VEGF levels. Elevated levels were also associated with the G allele in the VEGF -1154 nucleotide8. In a study with patients undergoing coronary angiography, the C-2578A polymorphism was considered a risk factor for atherosclerosis development1. This genetic variation had already been associated with lower VEGF expression8.
Hyperhomocysteinemia, i.e., increased blood homocysteine (Hcy) concentrations, is considered an independent risk factor for atherosclerosis and coronary artery disease (CAD)9. Increased Hcy concentrations are found in 40% of patients with coronary, cerebral or peripheral artery diseases, and only in 15% of healthy individuals10. The mechanism by which hyperhomocysteinemia induces the development of vascular lesions is still obscure. Experimental evidence suggests that Hcy may be involved in atherogenesis and thrombogenesis, leading to muscle cell hyperplasia and fibrosis10,11. Abnormal Hcy concentrations can result from the interaction of genetic and dietary factors12. The enzyme methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), which plays an important role in the Hcy metabolism, presents decreased activity as a result of the polymorphism in the position 677 of the MTHFR gene, and leads to increased Hcy concentrations13. The variant allele MTHFR 677T has been found at high frequencies in patients with vascular diseases14-17.
In this study, we analyzed the frequency of the VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms in patients with CAD and in a group without angiographic signs of the disease, and evaluated the association between these polymorphisms and the severity and extension of the atherosclerotic lesions, and the plasma Hcy concentrations.
Methods
Study subjects
This study was approved by the National Research Commission - CONEP, DF, Brazil. After signing a free informed consent form, 244 Caucasoid individuals were included in the research (145 with CAD and 99 without the disease). The diagnosis of CAD was confirmed or ruled out by coronary angiography, analyzed by two independent observers in a quantitative blind analysis, performed at the Cath Lab. Individuals who had undergone heart surgery and those with a coronary prosthesis were excluded from the study. Although miscegenation is widespread in Brazil, we considered as Caucasoid those individuals who had no other ethnic groups in the three generations that preceded them18. The extension of the CAD was determined according the number of involved coronary vessels (0 to 3), and the CAD severity by the degree of arterial obstruction (<50%, >50-75%, >75-95%, and >95% stenosis). Ejection fraction (EF) < 40% was considered as ventricular damage. Typical angina was considered as present or absent.
Classical risk factors for CAD were also investigated. The criteria used for defining diabetes were the use of oral hypoglycemic agents or insulin treatment, or glycemia levels higher than 126 mg/dl; for hypertension, the use of anti-hypertensive medication or blood pressure higher than 140/90 mmHg; for sedentary lifestyle, the absence of regular and controlled exercising; for alcoholism, the intake of alcohol with a frequency defined without a quantitative analysis; individuals who had smoked >100 cigarettes throughout their lifetime and currently smoked every day or on some days were considered smokers.
Biochemical analysis
Peripheral blood samples were collected from the patients during the coronary angiographic examination, after a 12-hour fasting. Plasma separation was performed within one hour after blood collection for Hcy quantitation, according to the liquid chromatography/sequential mass spectrometry (LC-MS/MS) method19. Hcy concentrations >15μmol/ml were considered as characterizing hyperhomocysteinemia20.
The procedures for lipid profile determination were carried out at the Clinical Test Laboratory of the Base Hospital of the São José do Rio Preto Medical School. Serum triglycerides (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoproteins (HDLC), and low-density lipoproteins (LDLC) were measured by the enzymatic colorimetric method.
Genotype determination
Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes21. The VEGF C-2578A polymorphism was investigated by the Polymerase Chain Reaction-Single-Strand Conformational Polymorphism (PCR-SSCP) method, according to Brogan et al22. Thirty amplification cycles (95ºC for 30s, 62ºC for 30s, and 72ºC for 60s) were performed to amplify a 309 bp product. Then, 6 μl of the PCR product were denatured at 95ºC for 5 min with 6 μl electrophoresis staining solution (80% v/v formamide; 10mM NaOH; 1 mM EDTA, pH 8.0; 0.1% w/v of bromophenol blue; and 1.1% xylenocyanol). The denatured products were analyzed by 9.6% polyacrylamide gel electrophoresis and visualized after silver nitrate staining.
Genotyping for the MTHFR C677T polymorphism was performed by PCR followed by enzyme digestion16. Thirty-five cycles (94ºC for 60s, 58ºC for 60s, and 72ºC for 60s) were performed to amplify a 198 bp product. The PCR products were digested with the restriction enzyme Hinf I and the fragments were analyzed on a 9.6% polyacrylamide gel stained with silver nitrate. Allele C was not digested, whereas allele T was cut into two fragments of 175 bp and 23 bp, respectively.
Statistical analysis
Data are presented as mean ± standard deviation (SD) or number (percentages). Comparison between the groups was performed using the Chi-square, Student's t-test or Mann-Whitney's test, as appropriate. Dependence analysis was used to examine differences in genotype frequency between groups with one, two, or three affected arteries, and between groups with a different degree of stenosis The Hcy values were modeled based on a normal distribution on the logarithmic scale. Hcy concentration in relation to the MTHFR polymorphism was evaluated by analysis of variance (ANOVA). The independent relationship of the VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms with risk factors in the presence of CAD was tested by multiple logistic regression analysis. A p-value < 0.05 was used to establish statistical significance.
Financial support - The State of São Paulo Research Foundation (FAPESP).
Results
The characteristics of the studied population are shown in Table 1. The significantly different results obtained for patients with and without CAD are in agreement with previously established cardiovascular risk factors.
There was no significant difference between the groups regarding allele (p=0.995) and genotype (p=0.254) frequencies of the VEGF C-2578A polymorphism. Calculations for the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) test showed that the genotype distribution observed was similar to the expected one, in both CAD and control groups (x21=3.12; p=0.077 and x21=0.46; p=0.496, respectively).
Genotype frequencies according to the number of involved vessels and degree of artery obstruction are shown in Tables 2 and 3, respectively. A significantly higher frequency of VEGF -2578AA genotype was found in individuals with three affected arteries (p=0.044). Regarding the degree of artery obstruction, the VEGF -2578CA genotype was observed more frequently in individuals with <95% stenosis (p=0.010).
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene polymorphism and homocysteine concentrations
There was no significant difference between the groups regarding allele (p=0.895) and genotype (p=0.884) frequencies of the MTHFR C677T polymorphism. The observed genotype distribution was similar to the expected one in the control group (x21=2.23; p=0.135), but it showed departure from the HWE in the CAD group, with a significant difference between the observed and the expected frequencies (x21=5.76; p=0.016).
No association was observed between the MTHFR C677T polymorphism and the number of involved vessels and/or the degree of artery obstruction (Tables 2 and 3).
The mean Hcy concentration did not significantly differ between the groups (p=0.222), nor did the presence of hyperhomocysteinemia (p=0.266). The mean Hcy concentrations did not show any association with the number of involved vessels (p=0.793) or the degree of artery obstruction (p=0.700).
The MTHFR C677T polymorphism showed no direct association with hyperhomocysteinemia (p=0.860) or increased mean concentrations of Hcy (p=0.758).
Multivariate analysis
Multiple logistic regression was used to test independent correlates for the presence of CAD. The model included: smoking, hypertension, diabetes, HDLc levels, and the VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms. Smoking (p=0.006), diabetes (p=0.041), and HDLc levels <40 mg/dl (p=0.0008) were independent correlates of the presence of CAD. Hypertension tended towards showing an association with CAD (p=0.061). The VEGF C-2578A (p=0.688) and MTHFR C677T (p=0.981) polymorphisms were not independent predictors of CAD.
Discussion
In our study, the allele and genotype frequencies of the VEGF C-2578A polymorphism did not differ between patients with and without CAD. However, the VEGF -2578AA genotype was observed at a higher frequency in individuals with three affected arteries. This result corroborates the findings of a recent study by Howell et al1, in which the VEGF -2578AA genotype was considered to be a risk factor for atherosclerosis development, whereas the VEGF -2578CC genotype showed a protective effect. According to this study, the frequency of the VEGF -2578AA genotype gradually increased with the number of involved vessels, as compared to the wild-type VEGF -2578CC genotype, suggesting that the reduction in the VEGF expression resulting from the VEGF -2578AA genotype could promote the development of atherosclerosis. The higher frequency of the VEGF -2578CA genotype among individuals with <95% stenosis suggests an association between this genotype and the slower progression of the atherosclerotic lesion, possibly due to the presence of the wild-type allele. However, no association was found regarding the wild-type VEGF -2578CC genotype, possibly because of the small sample size.
Although our results regarding VEGF polymorphism and the severity and extension of CAD were significant, after adjustment for other risk factors in a multivariate model, the positive association between VEGF C-2578A polymorphism and severity or extension of CAD lost statistical significance. Since VEGF C-2578A polymorphism was not an independent risk factor for CAD, these data do not support a casual linkage between VEGF C-2578A polymorphism and coronary atherosclerosis.
The role of VEGF in atherosclerosis is a subject of debate in the literature. Some studies showed that the administration of recombinant human VEGF in animals enhances the progression of the atherosclerotic plaque23, whereas others observed that it acts as an anti-atherosclerotic factor, promoting re-endothelization, reducing intimal thickening and preventing thrombus formation5.
Correlations between genotypes and expression were not examined in our study. However, a study by Shahbazi et al8, with renal transplant recipients, found an association between the wild-type allele VEGF -2578C and increased VEGF concentrations. Other polymorphisms of the VEGF gene have already been associated with variations in the expression of the protein7,8. According to Howell et al1, the VEGF -2578AA genotype could be considered a risk factor for atherosclerosis due to the reduction in the protein expression. This result is consistent with the action of VEGF in the endogenous regulation of the endothelial integrity of the coronary artery wall4. On the other hand, atherosclerotic plaque neovascularization, mediated by VEGF, makes nutrients and components for the plaque available, increasing its volume. In artery walls with total occlusion by atherosclerotic plaques, as observed in a prospective study, microvessels named vasa vasorum were correlated, in their anatomy and quantity, to the degree of intimal plaque inflammation24. Moulton et al25 observed a reduction in atherosclerosis progression secondary to the inhibition of VEGF-mediated neovascularization. Thus, further studies are necessary to clarify the true role of VEGF in CAD.
In this study, the allele and genotype frequencies of the MTHFR C677T polymorphism did not differentiate patients from controls. However, in the CAD group, the genotype distribution observed was different from the one expected according to the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). Case-control studies with SNP analysis have shown departure from HWE in patients, in controls or in both groups26-28. This disequilibrium can be expected for a number of genetic diseases, considering that there probably is a significant genetic contribution in complex diseases29. Although some studies found evidence of an association between the polymorphic MTHFR 677T allele and vascular diseases, carotid atherosclerosis, occlusive arterial disease and myocardial infarction15-17,30-32, others did not confirm these hypotheses11,33.
About 40% of patients with CAD present hyperhomocysteinemia34. In our study, 49.7% of the patients with CAD and 45.2% of the controls showed Hcy concentrations >15 μmol/L, and this difference was not significant. Another Brazilian study showed a significant difference in Hcy concentrations between the control group and a group with severe atheromatosis. These authors also observed a positive correlation between higher Hcy levels and CAD35. In our study, higher Hcy mean concentrations were found in the CAD group compared to the control group, but the difference was not significant (data not shown), which is in agreement with the findings of Yilmaz et al36.
Clinical trials involving homocysteine-lowering treatment have demonstrated that folate supplementation did not reduce the risk of complications and death due to cardiovascular causes, despite a substantial reduction in plasma total Hcy levels37,38. Although observation studies have demonstrated that the plasma total Hcy level is a predictor of cardiovascular events39, no causative role of Hcy has been substantiated by the results of intervention trials involving homocysteine-lowering treatment.
In the prospective study of Frederiksen et al40, the Hcy mean concentration was higher in MTHFR 677TT genotype carriers compared to the carriers of other genotypes; however, the MTHFR C677T polymorphism was not associated with ischemic cardiovascular disease or thromboembolism. Similar observations were reported by Huh et al41 and Yilmaz et al36 in CAD studies. In the population studied by us, the MTHFR C677T polymorphism did not present a direct association with hyperhomocysteinemia or increased mean Hcy concentrations, either in the CAD or in the control group. A correlation between the presence of this mutation and hyperhomocysteinemia was also not observed by Lima et al35, in another Brazilian study.
Sample size is an important factor in case-control studies, mainly in investigations of genetic polymorphisms with high frequency in the general population. Although the number of individuals evaluated in this study was sufficient to demonstrate a statistical difference in genotype distribution among the subgroups with different degrees of artery obstruction and number of involved vessels, no difference was observed between the CAD and control groups. Studies in the literature use larger samples, mainly to evaluate the association between polymorphisms and CAD or Hcy. Moreover, the investigation of alterations in other enzymes involved in Hcy metabolism, plasma folate and vitamin B6 and B12 concentrations, and vitamin intake, could provide more consistent data for the discussion about the effect of polymorphisms on Hcy concentrations.
In summary, there is an apparent association between the VEGF C-2578A polymorphism and atherosclerosis development; however, this association is not independent of conventional cardiovascular risk factors.
Acknowledgments
The authors thank Celso Pereira Reis Filho for database management and Prof. Dr. José Antônio Cordeiro for statistical analysis, and acknowledge the financial support granted by The State of São Paulo Research Foundation (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP).
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Sources of Funding
This study was funded by FAPESP and CNPq.
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Alexandre Rodrigues Guerzoni, from Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP.
References
Artículos OriginalesHomocisteína y polimorfismos de los genes MTHFR y VEGF: impacto en la enfermedad arterial coronaria
FUNDAMENTO: Polimorfismos en genes relacionados al desarrollo de la aterosclerosis, la angiogénesis y el metabolismo de la homocisteína (Hcy) pueden ser factores de riesgo para la enfermedad arterial coronaria (EAC). OBJETIVO: Evaluar el efecto de los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T en la EAC y la asociación de esos polimorfismos con la severidad y la extensión de las lesiones ateroscleróticas y concentraciones de Hcy. MÉTODOS: Se evaluaron a 244 individuos por medio de angiografía coronaria y se les incluyeron en el estudio (145 con EAC y 99 individuos-control). Los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T se investigaron mediante las técnicas de PCR-SSCP y PCR-RFLP, respectivamente. Se midieron los niveles de homocisteína plasmática por medio de cromatografía líquida/espectrometría de masa secuencial (CL/EMS). RESULTADOS: No hubo diferencia significante en relación con la distribución de alelos y genotipos entre los grupos, para ambos polimorfismos. El análisis univariado reveló una frecuencia mayor del genotipo VEGF-2578AA en el grupo con enfermedad en tres vasos (P=0,044). Además de ello, se observó el genotipo VEGF-2578CA con más frecuencia entre individuos con <95% de estenosis (p=0,010). Tras ajuste para otros factores de riesgo para EAC en un modelo multivariado, se evidenció que el polimorfismo VEGF C-2578A no era un correlato independiente de la EAC (p=0,688). El polimorfismo MTHFR no mostró cualquier relación con la extensión y/o severidad de la EAC. El polimorfismo MTHFR C677T no evidenció una asociación directa con hiperhomocisteinemia o aumento de las concentraciones promedio de Hcy en el plasma. CONCLUSIÓN: Si bien existe una aparente asociación entre el polimorfismo VEGF C-2578A y el desarrollo de aterosclerosis coronaria, esa asociación no es independiente de los factores de riesgo cardiovasculares convencionales.
Enfermedad de arteria coronariaaterosclerosispolimorfismo genéticohomocisteína
ARTÍCULO ORIGINAL
Homocisteína y polimorfismos de los genes MTHFR y VEGF: impacto en la enfermedad arterial coronaria
IFaculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP, São José do Rio Preto, SP
IIFaculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas, SP - Brasil
Correspondencia
RESUMEN
FUNDAMENTO: Polimorfismos en genes relacionados al desarrollo de la aterosclerosis, la angiogénesis y el metabolismo de la homocisteína (Hcy) pueden ser factores de riesgo para la enfermedad arterial coronaria (EAC).
OBJETIVO: Evaluar el efecto de los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T en la EAC y la asociación de esos polimorfismos con la severidad y la extensión de las lesiones ateroscleróticas y concentraciones de Hcy.
MÉTODOS: Se evaluaron a 244 individuos por medio de angiografía coronaria y se les incluyeron en el estudio (145 con EAC y 99 individuos-control). Los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T se investigaron mediante las técnicas de PCR-SSCP y PCR-RFLP, respectivamente. Se midieron los niveles de homocisteína plasmática por medio de cromatografía líquida/espectrometría de masa secuencial (CL/EMS).
RESULTADOS: No hubo diferencia significante en relación con la distribución de alelos y genotipos entre los grupos, para ambos polimorfismos. El análisis univariado reveló una frecuencia mayor del genotipo VEGF-2578AA en el grupo con enfermedad en tres vasos (P=0,044). Además de ello, se observó el genotipo VEGF-2578CA con más frecuencia entre individuos con <95% de estenosis (p=0,010). Tras ajuste para otros factores de riesgo para EAC en un modelo multivariado, se evidenció que el polimorfismo VEGF C-2578A no era un correlato independiente de la EAC (p=0,688). El polimorfismo MTHFR no mostró cualquier relación con la extensión y/o severidad de la EAC. El polimorfismo MTHFR C677T no evidenció una asociación directa con hiperhomocisteinemia o aumento de las concentraciones promedio de Hcy en el plasma.
CONCLUSIÓN: Si bien existe una aparente asociación entre el polimorfismo VEGF C-2578A y el desarrollo de aterosclerosis coronaria, esa asociación no es independiente de los factores de riesgo cardiovasculares convencionales. (Arq Bras Cardiol 2009;92(4):256-261)
Palabras clave: Enfermedad de arteria coronaria, aterosclerosis, polimorfismo genético, homocisteína.
Introducción
El gen que codifica el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ha sido estudiado en el desarrollo de enfermedades coronarias1-3. El VEGF, presente en las paredes de los vasos, promueve la proliferación de las células endoteliales vasculares y la angiogénesis, pero su rol en la aterosclerosis todavía está poco aclarado. Hay estudios que señalan que el VEGF es un factor de protección en el desarrollo de la placa aterosclerótica, al operar como un regulador de la integridad endotelial de la pared arterial coronaria4,5. Por otra parte, hay otros que evidencian la neovascularización, mediada por el VEGF, como el factor que influencia la patogénesis de las enfermedades arteriales6.
Alteraciones de las concentraciones de VEGF pueden ser mediadas por polimorfismos genéticos7,8. Se describieron en el gen VEGF diversos polimorfismos de nucleótido único (SNPs). Renner et al.7 describieron tres polimorfismos del gen VEGF (C702T, C936T y G1612A), además de haber observado niveles significantemente más bajos de VEGF en el plasma en portadores del alelo 936T, cuando comparados con no-portadores. Los polimorfismos C702T y G1612 no evidenciaron asociación con los niveles de VEGF. También se asociaron niveles elevados con el alelo G en el nucleótido VEGF -11548. En un estudio con pacientes sometidos a angiografía coronaria, se consideró el polimorfismo C-2578A como un factor de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis1. Ya se ha asociado esa variación genética con una menor expresión del VEGF8.
La hiperhomocisteinemia, es decir, el aumento de la concentración de homocisteína (Hcy) en la sangre, se la considera como un factor de riesgo independiente para la aterosclerosis y la enfermedad arterial coronaria (EAC)9. El aumento de las concentraciones de Hcy es encontrado en el 40% de los pacientes con una enfermedad arterial coronaria, arterial cerebral o arterial periférica y en solamente el 15% de individuos sanos10.
El mecanismo mediante el cual la hiperhomocisteinemia induce el desarrollo de lesiones vasculares es todavía poco conocido. Evidencias experimentales sugieren que la Hcy puede estar involucrada en la aterogénesis y la trombogénesis, conllevando a la hiperplasia de la célula muscular y la fibrosis10,11. Concentraciones anormales de Hcy pueden resultar de la interacción de factores genéticos y nutricionales12. La enzima metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR), que desempeña un rol importante en el metabolismo de la Hcy, presenta la reducción de la actividad como resultado del polimorfismo en la posición 677 del gen MTHFR y conlleva al aumento de las concentraciones de Hcy13. La variante alélica MTHFR 677T ha sido encontrada con alta frecuencia en pacientes con enfermedades vasculares14-17.
En el presente estudio, analizamos la frecuencia de los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T en pacientes con EAC y en un grupo de individuos sin señales angiográficos de la enfermedad. Evaluamos también la asociación entre esos polimorfismos y la severidad y extensión de las lesiones ateroscleróticas y las concentraciones plasmáticas de Hcy.
Métodos
Sujetos del estudio
El presente estudio fue aprobado por la Comisión Nacional de Ética en Investigación - CONEP, DF, Brasil. Tras la obtención del Consentimiento Informado, se incluyeron en el estudio a 244 individuos caucasoides (145 con EAC y 99 sin la enfermedad). Se eliminó o se confirmó el diagnóstico de EAC mediante angiografía coronaria, analizada por dos observadores independientes en un análisis ciego cuantitativo, llevada a cabo en el Laboratorio de Cateterismo. Se excluyeron del estudio tanto a los individuos que habían sido sometidos a cirugía cardiaca como aquellos con prótesis coronaria. Aunque el mestizaje en el Brasil es ampliamente común, consideramos como caucasoides aquellos individuos que no presentaban otros grupos étnicos en las tres generaciones precedentes18.
Se determinó la extensión de la EAC de acuerdo con el número de vasos coronarios involucrados (0 a 3) y la severidad con base en el grado de obstrucción arterial (estenosis <50%, >50-75%, >75-95%, y >95%). Se consideró la fracción de eyección (FE) < 40% como daño ventricular. Se consideró la angina típica como presente o ausente. Los factores de riesgo clásicos para EAC también se investigaron. Los criterios para la definición de diabetes fueron el uso de agentes hipoglucemiantes orales o tratamiento con insulina, o niveles glucémicos > 126 mg/dL; para hipertensión, el uso de fármaco antihipertensivo o presión arterial > 140/90 mmHg; para sedentarismo, la ausencia de ejercicios regulares y controlados; para alcoholismo, la ingestión de alcohol con una frecuencia definida sin un análisis cuantitativo; a individuos que habían fumado >100 cigarrillos durante su vida y en el momento fumaban todos los días o en algunos días, se les consideraron como fumadores.
Análisis bioquímico
Se colectaron muestras de sangre periférica de los pacientes, durante el examen angiográfico, tras ayuno de 12 horas. Se hizo la separación del plasma en hasta una hora tras la colecta de la sangre para la medición de la Hcy, de acuerdo con el método de cromatografía líquida/espectrometría de masa secuencial (CL/EMS)19. Las concentraciones de Hcy >15µmol/mL se las consideraron como caracterizadoras de hiperhomocisteinemia20. Los procedimientos para determinación del perfil lipídico tuvieron lugar en el Laboratorio de Análisis Clínicos del Hospital de Base de la Facultad de Medicina de São José do Rio Preto.
Se midieron los triglicéridos (TG), el colesterol total (CT), las lipoproteínas de alta densidad (HDLc) y las lipoproteínas de baja densidad (LDLc) con el método colorimétrico enzimático.
Determinación de genotipo
Se extrajo el DNA genómico de leucocitos de sangre periférica21. Se investigó el polimorfismo VEGF C-2578A con el método de Reacción en Cadena de la Polimerasa - Polimorfismo de Conformación Monocatenaria (PCR-SSCP), de acuerdo con Brogan et al.22. Se realizaron 30 ciclos de amplificación (95ºC por 30s, 62ºC por 30s, y 72ºC por 60s) para amplificar un producto de 309 pb. Así, 6 µL del producto de la PCR se desnaturalizaron a 95ºC por 5 minutos, con 6 µl de solución colorante para electroforesis (80% v/v formamida; 10mM NaOH; 1 mM EDTA, pH 8,0; 0,1% w/v de azul de bromofenol y el 1,1% xilenocianol). Se analizaron los productos desnaturalizados por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida y tras tinción con nitrato de plata se los visualizaron.
La genotipificación para el polimorfismo MTHFR C677T se llevó a cabo por medio de PCR, seguida por digestión enzimática16. Se ejecutaron 35 ciclos (94ºC por 60s, 58ºC por 60s, y 72ºC por 60s) para amplificar un producto de 198 pb. Se digirieron los productos de PCR con la enzima de restricción Hinf I y se analizaron los fragmentos en gel de poliacrilamida a un 9,6%, tras tinción con nitrato de plata. No se digirió el alelo C, mientras que se dividió el alelo T en dos fragmentos de 175 y 23 pb, respectivamente.
Análisis estadístico
Se presentan los datos como promedios + desviaciones estándar (DE) o números (porcentajes). La comparación entre los grupos se realizó con la utilización de la prueba de Chi-cuadrado, el test t de Student o la prueba de Mann-Whitney, cuando necesario. Se utilizó el análisis de dependencia para examinar las diferencias de las frecuencias de genotipo entre los grupos con una, dos o tres arterias afectadas, y entre grupos con diferentes grados de estenosis. Se diseñaron los valores de Hcy con base en una distribución normal en la escala logarítmica. La concentración de Hcy ante el polimorfismo MTHFR se la evaluó mediante el análisis de varianza (ANOVA). Se probó por medio de análisis de regresión logística múltiple la relación independiente de los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T con los factores de riesgo en la presencia de EAC. Un valor de p < 0,05 se utilizó para establecer la significancia estadística.
Resultados
Las características de la población estudiada están detalladas en la Tabla 1. Los resultados significantemente diferentes obtenidos para individuos con y sin EAC están de acuerdo con los factores de riesgo cardiovascular previamente establecidos.
Polimorfismo del gen del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
No hubo diferencia significante entre los grupos respecto a las frecuencias de alelos (p=0.995) y genotipo (p=0.254) del polimorfismo VEGF C-2578A. Los cálculos para la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) revelaron que la distribución genotípica observada se mostró similar a la que se esperaba, en el grupo con EAC y en el grupo control (x21 = 3,12; p=0,077 y x21 = 0,46; p=0,496, respectivamente).
Las frecuencias genotípicas de acuerdo con el número de vasos involucrados y el grado de obstrucción arterial están detalladas en las Tablas 2 y 3, respectivamente. Una frecuencia significantemente más alta del genotipo VEGF -2578AA se observó en individuos con tres arterias afectadas (p=0,044). Respecto al grado de obstrucción arterial, el genotipo VEGF -2578CA se observó con mas frecuencia en individuos con < 95% de estenosis (p=0,010).
Polimorfismo del gen de la metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y concentraciones de homocisteína
No hubo diferencia significante entre los grupos respecto a las frecuencias de alelos (p=0,895) y genotipo (p=0,884) del polimorfismo MTHFR C677T. La distribución genotípica observada fue semejante a la que se esperaba en el grupo control (x21 =2,23; p=0,135). Sin embargo, en el grupo con EAC, presentó desequilibrio de Hardy-Weinberg, con una diferencia significante entre las frecuencias observada y esperada (x21 =5,76; p=0,016).
Ninguna asociación se observó entre el polimorfismo MTHFR C677T y el número de vasos involucrados y/o el grado de obstrucción arterial (Tablas 2 y 3). La concentración promedio de Hcy no difirió significantemente entre los grupos (p= 0,222), así como la presencia de hiperhomocisteinemia (p=0,266). El promedio de la concentración de Hcy no presentó ninguna asociación con el número de vasos involucrados (p= 0,793) o el grado de obstrucción arterial (p= 0,700).
El polimorfismo MTHFR C677T no evidenció una relación directa con la hiperhomocisteinemia (p=0,860) o aumento de la concentración promedio de Hcy (p=0,758).
Análisis multivariado
La regresión logística múltiple se utilizó para probar los correlatos independientes para la presencia de EAC. El modelo incluyó: tabaquismo, hipertensión, diabetes, niveles de HDLc y los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T. Tabaquismo (p=0,006), diabetes (p=0,041), y niveles de HDLc <40 mg/dL (p=0,0008) se correlacionaron independientemente de la presencia de EAC. La hipertensión evidenció una tendencia a la asociación con EAC (p=0,061). Los polimorfismos VEGF C-2578A (p=0,688) y MTHFR C677T (p=0,981) no fueron predictores independientes de EAC.
Discusión
En el presente estudio, la frecuencia alélica y la genotípica del polimorfismo VEGF C-2578A no difirieron entre pacientes con y sin EAC. Sin embargo, se observó una mayor frecuencia del genotipo VEGF-2578AA en individuos con tres arterias afectadas. Este resultado corrobora los hallazgos de un estudio reciente de Howell et al.1 que consideró el genotipo VEGF-2578AA como un factor de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis, mientras que el genotipo VEGF -2578CC evidenció tener un efecto protector. De acuerdo con ese estudio, la frecuencia del genotipo VEGF -2578AA aumentó gradualmente con el número de vasos involucrados, cuando comparada con el genotipo salvaje (wild-type) VEGF -2578CC. Eso sugiere que la reducción de la expresión del VEGF resultante del genotipo VEGF-2578AA podría promover el desarrollo de aterosclerosis. La mayor frecuencia del genotipo VEGF-2578CA entre individuos con < 95% de estenosis sugiere una asociación entre ese genotipo y la progresión más lenta de la lesión aterosclerótica, posiblemente a causa de la presencia del alelo salvaje. No obstante, no se encontró ninguna asociación con relación al genotipo salvaje VEGF-2578CC, posiblemente en función del número reducido de individuos en la muestra.
Si bien nuestros resultados en relación con el polimorfismo del VEGF y la severidad y extensión de la EAC son significantes, tras el ajuste para otros factores de riesgo en un modelo multivariado, la asociación positiva entre el polimorfismo VEGF C-2578A y la severidad de la EAC perdió significancia estadística. Ya que el polimorfismo VEGF C-2578A no fue un factor de riesgo independiente para la EAC, esos datos no confirman la relación casual entre el polimorfismo VEGF C-2578A y la aterosclerosis coronaria.
El rol del VEGF en la aterosclerosis es motivo de discusión en la literatura. Algunos estudios evidenciaron que la administración de VEGF humano recombinante en animales aumenta la progresión de la placa aterosclerótica23. Otros observaron que el VEGF humano opera como un factor anti-aterosclerótico, y promueve la reendotelización, reduciendo el espesor de la capa íntima, lo que previene la formación de coágulos5.
No analizamos en el presente estudio las correlaciones entre genotipos y expresión. Sin embargo, un estudio realizado por Shahbazi et al.8 con receptores de transplante renal, reveló una asociación entre el alelo salvaje VEGF 2578C y el aumento de las concentraciones de VEGF. Otros polimorfismos del gen VEGF ya se asociaron a variaciones en la expresión de la proteína7,8. Según Howell et al.1, el genotipo VEGF -2578AA se podría considerar como un factor de riesgo para aterosclerosis, en función de la reducción de la expresión de la proteína. Ese resultado es consistente con la acción do VEGF en la regulación endógena de la integridad endotelial de la pared de la arteria coronaria4. Por otra parte, la neovascularización de la placa aterosclerótica, mediada por el VEGF, dispone nutrientes y componentes de la placa, aumentando su volumen. En paredes arteriales con oclusión total por placas ateroscleróticas, como observado en estudio prospectivo, se correlacionaron -en su anatomía y cantidad-, los microvasos denominados vasa vasorum, al grado de inflamación de la placa intimal24. Moulton et al.25 observaron una reducción en la progresión de la aterosclerosis secundaria a la inhibición de la neovascularización mediada por el VEGF. De ese modo, se necesitan más estudios para aclarar el verdadero rol del VEGF en la EAC.
En ese estudio, las frecuencias alélica y genotípica del polimorfismo MTHFR C677T no fueron diferentes entre pacientes y controles. Sin embargo, en el grupo con EAC, la distribución genotípica observada fue diferente de la que se esperaba de acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW). Estudios de caso-control con análisis de SNPs mostraron fuga del EHW en pacientes, en controles o en ambos grupos26-28. Se puede esperar ese desequilibrio para diversas enfermedades genéticas, considerando que haya probablemente un aporte genético significante en enfermedades complejas29. Aunque algunos estudios han encontrado evidencia de asociación entre el alelo polimórfico MTHFR 677T y enfermedades vasculares, aterosclerosis carotídea, enfermedad arterial oclusiva e infarto de miocárdio15-17,30-32, otros no confirmaron esas hipótesis11,33.
Alrededor del 40% de los pacientes con EAC presentaban hiperhomocisteinemia34. En nuestro estudio, un 49,7% de los pacientes con EAC y un 45,2% de los controles presentaban concentraciones de Hcy >15 µmol/l, y esa diferencia no fue significante. Otro estudio brasileño evidenció una diferencia significante en concentraciones de Hcy entre el grupo control y el grupo con ateromatosis severa. Esos autores también observaron una correlación positiva entre niveles más altos de Hcy y EAC35. En nuestro estudio, encontramos concentraciones promedio más altas de Hcy en el grupo con EAC cuando comparados al grupo control, pero la diferencia no fue significante (datos no revelados), lo que está de acuerdo con los hallazgos de Yilmaz et al.36.
Estudios clínicos involucrando tratamientos para reducir los niveles de homocisteína han demostrado que la suplementación con folato no redujo el riesgo de complicaciones y muerte por causas cardiovasculares, a pesar de una reducción substancial en los niveles plasmáticos totales de Hcy37,38. Aunque estudios observacionales han demostrado que el nivel plasmático total de Hcy es un predictor de eventos cardiovasculares39, ningún rol causativo de la Hcy fue substanciado por los resultados de estudios de intervención implicando tratamiento para reducción de niveles de homocisteína.
En el estudio prospectivo de Frederiksen et al.40, la concentración promedio de Hcy era más elevada en portadores del genotipo MTHFR 677TT cuando comparados a otros genotipos. Sin embargo, el polimorfismo MTHFR C677T no fue asociado con enfermedad isquémica cardiovascular o tromboembolismo. Huh et al.41 y Yilmaz et al.36 relataron observaciones semejantes en estudios de EAC. En las poblaciones estudiadas en el presente estudio, el polimorfismo MTHFR C677T no presentó una relación directa con la hiperhomocisteinemia o aumento de las concentraciones promedio de Hcy, en los grupos con EAC o control. Lima et al.35 también observaron una correlación entre la presencia de esa mutación y la hiperhomocisteinemia, en un estudio brasileño.
El tamaño de la muestra es un factor importante en estudios de caso-control, principalmente en investigaciones de polimorfismos genéticos con alta frecuencia en la población en general. Aunque el número de individuos evaluados en ese estudio es suficiente para demostrar una diferencia estadística en la distribución del genotipo entre los subgrupos con diferentes grados de obstrucción arterial y número de arterias involucradas, ninguna diferencia se observó entre el grupo con EAC y el grupo control. Los estudios en la literatura utilizan muestras mayores, principalmente para evaluarse la asociación entre polimorfismos y EAC o Hcy. Además de ello, la investigación de alteraciones en otras enzimas implicadas en el metabolismo de la Hcy y en las concentraciones plasmáticas de folato y vitaminas B6 y B12, e ingestión de vitaminas, podría suministrar datos más consistentes para la discusión sobre el efecto de los polimorfismos en las concentraciones de Hcy.
En resumen, existe una aparente asociación entre el polimorfismo VEGF C-2578A y el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, esa asociación no es independiente de los factores de riesgo cardiovasculares convencionales.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Celso Pereira Reis Filho por la gestión del banco de datos y al Prof. Dr. José Antônio Cordeiro por el análisis estadístico y reconocen el apoyo financiero de la Fundación de Amparo a la investigación del Estado de São Paulo (FAPESP).
Potencial Conflicto de Intereses
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
Fuentes de Financiación
El presente estudio fue financiado por FAPESP y CNPq.
Vinculación Académica
Este artículo forma parte de tesis de Doctorado de Alexandre Rodrigues Guerzoni, por la Facultad de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP.