FUNDAMENTO: O diabete melito tipo 2 (DM2) é um fator de risco isolado para coronariopatia, principalmente quando associado à microalbuminúria (MA). Alterações estruturais e funcionais das lipoproteínas não são totalmente esclarecidas nesse contexto. OBJETIVO: Avaliar a transferência de lípides para HDL (T) em pacientes DM2 e a associação com a presença da MA e com o tratamento com estatina ou insulina. MÉTODOS: Estudamos 33 pacientes com DM2 e 34 controles pareados para idade. Uma nanoemulsão lipídica artificial radiomarcada com ³H-Triglicéride (TG) e 14C-colesterol livre (CL) ou ³H-colesterol éster (CE) e 14C-fosfolípide (FL) foi incubada com plasma. A nanoemulsão e as lipoproteínas foram precipitadas, exceto a HDL, que teve sua radioatividade contada. RESULTADOS: A TFL (%) foi maior no grupo com DM2 que no grupo-controle (25,2±3,2 e 19,7±3,2 respectivamente; p < 0,001), assim como a TCL (%): 9,1±2,7 e 6,3±1,5 respectivamente; p < 0,001. O diagnóstico de MA não se associou a mudanças da propriedade de transferência. O uso da insulina associou-se à menor TFL (%): 23,5±2,1 contra 26,1±3,3; p = 0,018. Já o uso da estatina associou-se à queda de todas - TCE (%): 3,5±0,9; TFL (%):23,8±2,0; TTG (%): 3,9±0,8; TCL (%):7,4±1,3 - quando comparado ao grupo que não usava estatina (TCE (%):5,9±2,4; TFL (%):26,9±3,6; TTG (%):6,4±2,2; TCL (%):11,1±2,6). CONCLUSÃO: O DM2 aumentou a transferência de lípides de superfície para HDL, enquanto o uso de estatina diminuiu todas as transferências de lípides. A presença de MA não se associou às alterações das transferências de lípides.
ARTIGO ORIGINAL
DISLIPIDEMIAS
Transferências lipídicas para HDL em diabéticos tipo 2: associações com microalbuminúria, estatina e insulina
Instituto do Coração (InCor), Hospital do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP), São Paulo, SP - Brasil
O diabete melito tipo 2 (DM2) é importante fator de risco cardiovascular, sendo a aterosclerose sua principal causa de óbito. A dislipidemia do DM2 caracteriza-se por hipertrigliceridemia, HDL colesterol reduzido e aumento da subfração pequena e densa da LDL1,2. Em pacientes com DM2, o uso de estatinas reduz bastante o risco de eventos cardiovasculares3-5. A presença de microalbuminúria aumenta o maior risco de desenvolvimento de doença arterial coronária6,7.
As classes de lipoproteínas são constituídas por diferentes proporções de triglicérides e colesterol esterificado em seu núcleo hidrofóbico, e fosfolípides e colesterol livre em sua superfície anfipática, onde se localizam as apolipoproteínas. A HDL apresenta atividade antiaterosclerótica, e o mecanismo pelo qual exerce esse papel ainda não é totalmente compreendido. O transporte reverso de colesterol é o principal mecanismo aventado. No entanto, outros mecanismos como ações antiinflamatórias, antitrombóticas e antioxidativas8,9 parecem ter participação na função protetora da HDL.
O transporte reverso de colesterol é o processo no qual o excesso de colesterol dos tecidos periféricos é removido para excreção pelo fígado. A lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT) participa desse transporte ao catalisar a esterificação do colesterol, permitindo seu deslocamento para o núcleo hidrofóbico da partícula.
As lipoproteínas plasmáticas trocam lípides constantemente, processo que é facilitado pelas proteínas de transferência, como a proteína de transferência de éster de colesterol (CETP), que medeia a troca de ésteres de colesterol, triglicérides e fosfolípides entre as lipoproteínas10 e a proteína de transferência de fosfolípides (PLTP), que auxilia na transferência de fosfolípides e colesterol de outras lipoproteínas ricas para a HDL11,12.
Os pacientes com DM2 parecem ter maior atividade de PLTP13,14 e maior transferência de ésteres de colesterol15,16. Não há uma definição quanto à participação da presença de microalbuminúria na atividade das proteínas de transferências17. Por sua vez, alguns estudos mostram redução da atividade de CETP e de PLTP com o uso de estatinas18-21 e insulina22-26.
As transferências lipídicas também dependem de vários outros fatores. A concentração de cada subclasse de lipoproteína influencia nessas trocas, uma vez que estas dependem das colisões das partículas lipoprotéicas. As composições lipídica e protéica da partícula e as concentrações de diversas outras proteínas plasmáticas podem influenciar no processo.
A complexa relação entre transferência lipídica e aterogênese ainda não está esclarecida. No metabolismo plasmático da HDL, as transferências lipídicas têm um papel fundamental remodelando constantemente as partículas das lipoproteínas e, com isso, interferindo nos seus diversos aspectos funcionais.
O objetivo deste estudo foi avaliar em pacientes com DM2 a transferência simultânea para a HDL dos quatro principais lípides que constituem sua estrutura, colesterol livre, éster de colesterol, triglicérides e fosfolípides. Além disso, verificar a influência da presença de microalbuminúria e do tratamento com estatina ou insulina sobre as transferências lipídicas.
Trinta e três pacientes voluntários portadores de diabete melito tipo 2 foram selecionados dos ambulatórios do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (InCor-HCFMUSP) e do Ambulatório de Diabete do Serviço de Diabete da Disciplina de Endocrinologia e Metabologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. Foram excluídos indivíduos em uso de inibidores de proteases, drogas imunossupressoras, corticóides, transplantados, cirróticos, portadores de neoplasias, tireoidopatas e portadores de creatinina sérica > 1,5 mg/dl. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento pós-informado. As coletas de sangue e de urina foram feitas no Laboratório de Metabolismo de Lípides, no InCor. Os ensaios funcionais da HDL (transferência de lípides) foram realizados nesse mesmo laboratório. As amostras urinárias foram analisadas no Laboratório Central do Hospital das Clínicas, e as amostras de sangue tiveram as determinações bioquímicas realizadas no Laboratório do InCor.
Como grupo-controle foram selecionados 34 indivíduos que fazem parte de um banco de dados do Laboratório de Metabolismo de Lípides, pareados para idade. Esses indivíduos não apresentam comorbidades e não fazem uso de medicações. Desse grupo, foram excluídos todos os indivíduos que tivessem glicemia de jejum maior ou igual a 100 mg/dl.
A avaliação dos participantes foi feita por meio de história clínica, enfatizando a busca por antecedentes patológicos e medicações em uso. A avaliação laboratorial foi feita por meio de coleta de sangue e por duas ou três coletas de amostra urinária em dias diferentes para mensuração da relação de microalbuminúria/creatininúria.
Foram realizadas as determinações bioquímicas dos pacientes diabéticos e indivíduos-controle - colesterol total (CT), frações (VLDL, LDL e HDL), triglicérides (TG) e glicemia de jejum - em amostras de soro obtidas após 12 horas de jejum pelo método colorimétrico-enzimático, COD-PAD (Labtest). O colesterol de LDL foi determinado pela fórmula de Friedewald27:
A determinação da microalbuminúria foi feita na primeira amostra isolada de urina da manhã, pelo método de nefelometria, no Laboratório Central do Hospital das Clínicas. Na mesma amostra, era mensurada a creatinina urinária. Assim, o valor da relação albumina/creatinina urinária era expresso em mcg/mg de creatinina. Pacientes com relação albuminúria/creatininúria inferior a 30 mcg/mg eram considerados normais, enquanto microalbuminúria foi definida como valores entre 30 e 300 mcg/mg, conforme definido pela
Em estudos prévios, o Laboratório de Metabolismo de Lípides do Instituto do Coração (InCor-HCFMUSP) tem reproduzido o metabolismo da LDL por meio de uma emulsão feita artificialmente, com composição lipídica parecida com a da LDL natural (LDE)29. O objetivo principal desses estudos tem sido o uso da LDE na investigação das dislipidemias. A LDE não tem proteína, mas, ao entrar em contato com as lipoproteínas naturais, adquire apo E, que pode ser reconhecida pelo receptor da LDL, sendo assim captada pela célula29. A LDE foi preparada segundo a técnica descrita por Ginsburg e cols.30 e modificada por Maranhão e cols.29.
Amostras dos pacientes foram coletadas, após jejum de 12 horas, em EDTA (1,5 g/l), e o plasma foi obtido após 10 minutos de centrifugação, a 3.000 rpm, em centrífuga Sorval RT7. Incubaram-se 2 amostras de 200
Essa análise foi realizada com o programa SPSS (
Para testar a normalidade da distribuição das variáveis, aplicou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov. Como as variáveis apresentavam distribuição não-normal, foram utilizados testes não-paramétricos. Para avaliar a diferença entre as variáveis categóricas, utilizou-se o teste exato de Fisher ou teste do qui-quadrado.
Foram comparados os diabéticos e seus controles, além de subgrupos entre os diabéticos, conforme a presença de microalbuminúria, o uso de estatina e a utilização de insulina. As comparações de variáveis contínuas independentes foram realizadas por meio do teste de Mann-Whitney. Para testar associações, utilizou-se o teste não-paramétrico de Spearman. Foram considerados como estatisticamente significantes os valores de p < 0,05, bicaudal.
A
Não houve diferença nas concentrações plasmáticas de colesterol total, LDL-C e HDL-C entre o grupo de pacientes com DM2 e o grupo-controle, p > 0,05. A concentração plasmática dos triglicérides foi 38% maior (p < 0,001), quando comparados com os indivíduos-controle. A glicemia de jejum foi 44% maior no grupo DM2 (p < 0,001). Também o índice de massa corpórea foi 19% maior entre os pacientes DM2 (p < 0,001).
A
Não houve diferença na transferência de éster de colesterol e triglicérides da nanoemulsão para a HDL nos pacientes diabéticos, quando comparados aos indivíduos-controle. Com relação à transferência de colesterol livre e fosfolípides, estas se apresentaram aproximadamente 30% e 22% maior no grupo dos pacientes diabéticos, quando comparados com o grupo-controle, respectivamente (p < 0,001).
Entre os pacientes diabéticos, não foram encontradas diferenças significativas quanto à presença ou ausência de MA. No entanto, o grupo com MA tinha uma média de idade 13% maior que o grupo sem essa característica (p = 0,008). Idade, sexo, prevalência de hipertensão arterial, índice de massa corpórea, uso de estatina ou insulina, perfil lipídico ou glicídico não eram diferentes entre os dois grupos.
Comparando o mesmo grupo com MA com os pacientes sem MA com idade superior a 55 anos, permitiu-se uma comparação entre grupos com idades semelhantes. Mais uma vez não houve nenhuma diferença na transferência lipídica para HDL (
Utilizando a razão microalbuminúria/creatininúria como variável contínua, foi estabelecida a correlação de Spearman com todas as variáveis contínuas analisadas. Desse modo, uma maior razão microalbuminúria/creatininúria se correlacionou positivamente com idade e hemoglobina glicada, e negativamente com transferência de colesterol livre (
Quanto ao uso ou não de insulinoterapia, os grupos apresentavam idade, sexo, índice de massa corpórea, prevalência de hipertensão arterial, perfil lipídico e glicídico semelhantes. Os dois grupos apresentavam uma freqüência de uso de estatinas também semelhantes. O fato de usar insulina relacionou-se a uma transferência 10% menor de fosfolípides para HDL (p = 0,018) (
No que se refere ao uso ou não de estatina, percebeu-se que o grupo tratado com essa medicação apresentou uma transferência de todos os lípides para HDL significativamente menor que o grupo que não usava estatina (
A contribuição das proteínas associadas à HDL ao processo de geração, maturação e transporte reverso de colesterol tem sido extensivamente estudada. A CETP modula os níveis de HDL e sua composição ao mediar a troca de lípides neutros (colesterol esterificado e triglicérides) entre HDL e lipoproteínas ricas em triglicérides, além de auxiliar na transferência de fosfolípides para a HDL. A CETP é capaz também de liberar apolipoproteínas a partir da HDL na presença de ácidos graxos31,32. A própria PLTP também pode liberar apolipoproteínas da HDL33. O colesterol éster presente na HDL pode ter duas fontes: 1) pela esterificação de colesterol livre da HDL e 2) a partir de colesterol éster de outra lipoproteína34,35.
A PLTP age transferindo fosfolípides de superfície para HDL e eventualmente deslocando apo AI das superfícies das partículas36,37. Um importante produto da HDL mediado pela PLTP são as pré-B-HDL pequenas e pobres em lípides, que agem como aceptores iniciais de colesterol livre38,39. A apo E (e não a apo AI) é capaz de converter PLTP inativa em sua forma ativa40. Esta é uma importante característica a ser lembrada, visto que a LDE é desprovida de apo e adquire a apo E quando em contato com o sangue.
O presente estudo traz a possibilidade de estimar, por meio de uma única metodologia, a atividade aceptora da HDL de todos os lípides de forma simples e ágil. Com isso, foi possível demonstrar que há maior captação de fosfolípides e colesterol livre pela HDL nos pacientes diabéticos em comparação com indivíduos-controle.
O achado de maior transferência de lípides de superfície nos pacientes diabéticos sugere maior atividade de PLTP, o que está de acordo com alguns resultados da literatura13,14. Estudos prévios mostram também aumento das taxas de transferência de colesterol éster plasmático15,16.
A relação entre microalbuminúria e dislipidemia em pacientes com diabete melito tem sido bem explorada. Neste estudo, no entanto, não foram encontradas diferenças na transferência de lípides para HDL entre pacientes com DM2 com ou sem microalbuminúria. Na literatura, a atividade de CETP não se mostrou alterada em pacientes com microalbuminúria17.
Entre os pacientes usuários de insulina, a transferência de fosfolípides para HDL foi menor do que entre os não-usuários, não havendo alteração na transferência dos outros três lípides. A PLTP é a principal responsável pela transferência de fosfolípides para a HDL e auxilia com menos intensidade a transferência de colesterol livre para esta lipoproteína. O presente estudo sugere, assim, uma possível correlação entre insulina e atividade de PLTP. Na literatura, embora não haja unanimidade, a maioria dos estudos que se propuseram a investigar a relação entre insulina e atividade de PLTP mostram uma inibição desta última22-26.
A estatina reduziu a captação de todos os lípides pela HDL. A diminuição da atividade de CETP com uso de estatina tem sido observada em outros estudos. Ela pode fazer isso por três mecanismos distintos: 1) redução da massa de CETP18, 2) redução das lipoproteínas com as quais a HDL interage19 e 3) possivelmente por redução na expressão do gene CETP20. Um subestudo do estudo DALI mostrou que o tratamento com estatina é capaz de reduzir a atividade de PLTP, embora aumente a massa de PLTP21.
Neste estudo, a atividade aceptora de lípides da HDL foi avaliada. O outro sentido da troca de lípides entre as lipoproteínas não está sendo mensurado: não se sabe qual percentual de lípides da HDL está sendo doado para as outras lipoproteínas. Paradoxalmente, a atividade aceptora da HDL foi associada diretamente com fatores de risco de aterosclerose, e o uso de estatinas reduziu a transferência de todos os lípides para HDL. Uma hipótese para justificar tal fato seria que a HDL com características de transferências mais compatíveis com bons marcadores estaria associada à menor aquisição e perda de lípides, e, portanto, seria uma HDL mais estável.
Este estudo acrescenta dados ao complexo e ainda não totalmente esclarecido mecanismo de troca de lípides entre lipoproteínas. Ao mesmo tempo, permite a identificação da associação do uso de insulina e estatinas com aspectos funcionais da HDL, bem como suas proteínas de transferência.
O diabete melito é uma patologia que pode apresentar um espectro clínico bastante amplo. Tentou-se uniformizar a população estudada, excluindo pacientes diabéticos sob tratamento exclusivamente não-farmacológico, assim como os que apresentassem evidências de insuficiência renal ou macroalbuminúria.
A despeito disso, reconhece-se como limitação ao estudo um certo grau de heterogeneidade da população dos diabéticos estudados, em que alguns apresentam doença mais avançada ou mais associada a comorbidades, que outros. Além disso, o uso de insulina, estatina ou anti-hipertensivos é observado em parte da população estudada.
Idealmente, a suspensão de medicações que interferissem no metabolismo lipídico ou na microalbuminúria deveria ter sido realizada. O fato de não serem realizadas as análises lipídicas após um período de descontinuação da estatina deveu-se ao entendimento de que ocorreria um descontrole transitório do perfil lipídico numa população com fatores de risco cardiovascular, sem que nenhum benefício pudesse advir dessa suspensão. O mesmo racional explica a não-suspensão de anti-hipertensivos ou hipoglicemiantes dos pacientes.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado por Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Este artigo é parte da tese de doutorado de Gilson Soares Feitosa-Filho, pelo Programa de Pós-Graduação em Cardiologia do InCor-HCFMUSP.
Correspondência: Gilson Soares Feitosa-Filho Alameda dos Antúrios, 212/402 - Candeal 40296-530 - Salvador, BA - Brasil E-mail:
Artigo enviado em 16/01/08; revisado recebido em 25/02/08; aceito em 04/03/08.
BACKGROUND: Type-2 diabetes mellitus (T2DM) is an isolated risk factor for coronary artery disease, especially when associated with microalbuminuria (MA). Structural and functional changes in lipoproteins have not yet been fully elucidated in this context. OBJECTIVE: To assess lipid transfer (T) to HDL in type-2 diabetic patients and its association with microalbuminuria and treatment with statins or insulin. METHODS: Thirty-three patients with type-2 diabetes mellitus and 34 age-matched control subjects were studied. A synthetic cholesterol-rich nanoemulsion radiolabeled with ³H- triglycerides (TG) and 14C-free cholesterol (FC) or ³H- cholesteryl ester (CE) and 14C-phospholipids (PL) was incubated with plasma. Both the nanoemulsion and lipoproteins were precipitated, except for HDL, which was counted for radioactivity. RESULTS: PLT (%) was higher in the T2DM group than in the control group (25.2 ± 3.2 and 19.7 ± 3.2 respectively; p < 0.001), as was free cholesterol (% FC): 9.1 ± 2.7 and 6.3 ± 1.5 respectively; p < 0.001. The diagnosis of microalbuminuria (MA) was not associated with changes in lipid transfers. Insulin therapy was associated with lower PLT rates: 23.5 ± 2.1 versus 26.1 ± 3.3; p = 0.018. Statin therapy, in turn, was associated with a drop in all lipid transfers - CET 3.5 ± 0.9; PLT: 23.8 ± 2.0; TGT: 3.9 ± 0.8; FCT: 7.4 ± 1.3 - as compared to the group that was not on statin therapy (CET: 5.9 ± 2.4; PLT: 26.9 ± 3.6; TGT: 6.4 ± 2.2; FCT: 11.1 ± 2.6). CONCLUSION:Type-2 diabetes mellitus increased lipid transfer to HDL particles, whereas statin therapy decreased all lipid transfers. The presence of MA was not associated with changes in lipid transfer.
Instituto do Coração (InCor), Hospital do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP), São Paulo, SP - Brazil
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Type-2 diabetes mellitus (T2DM) is a major cardiovascular risk factor, and atherosclerosis is the most common cause of death in diabetic patients. The dyslipidemia of T2DM is characterized by hypertriglyceridemia, decreased HDL-cholesterol, and increased small dense LDL particles1,2. Statins significantly decrease the risk of cardiovascular events in T2DM pacients3-5. The presence of microalbuminuria increases the risk of coronary artery disease6,7.
Lipoprotein are composed of different amounts of triglycerides and esterified cholesterol in their hydrophobic core and phospholipids and free cholesterol on their amphipatic surface, where apolipoproteins are located. HDL has antiatherosclerotic activity, the mechanism of which is not entirely understood. The most likely hypothesis is reverse cholesterol transport. Nevertheless, other mechanisms, such as anti-inflammatory, antithrombotic, and antioxidant properties8,9, seem to play a role in the protective effect of HDL.
Reverse cholesterol transport (RCT) is the process by which excess cholesterol is removed from peripheral tissues to the liver for subsequent excretion. Lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) contributes to this transport by catalyzing the esterification of cholesterol, thus allowing it to be transferred to the hydrophobic core of the HDL particle.
Plasma lipoproteins exchange lipids constantly, a process facilitated by transfer proteins, such as cholesteryl ester transfer protein (CETP), which mediates the exchange of cholesterol esters, triglycerides, and phospholipids between lipoproteins10, and phospholipid transfer protein (PLTP), which mediates phospholipid and cholesterol transfer from other triglyceride-rich lipoproteins to HDL11,12.
Plasma PLTP13,14 and CETP15,16 activities seem to be higher in type-2 diabetic patients. The role of microalbuminuria in transfer protein activities has yet to be defined17. Some studies, however, show that the use of statin18-21 and insulin22-26 decreases plasma CETP and PLTP.
Lipid transfers depend on several other factors as well. Plasma concentration of each lipoprotein subclass influences these exchanges, since they are brought about by collisions between lipoprotein particles. The lipid and protein content of the particle and concentrations of several other plasma proteins may play a role in this process.
The complex relationship between lipid transfer and atherogenesis remains unclear. Lipid transfer plays a critical role in plasma HDL metabolism, by constantly remodeling lipoprotein particles and, thereby, interfering with their many functional aspects.
The purpose of this study was twofold: first, to assess, in T2DM patients, the simultaneous transfer to HDL of the four major lipids that make up its structure, namely, free cholesterol, cholesterol ester, triglycerides, and phospholipids; and second, to ascertain the influence of microalbuminuria, as well as that of statin or insulin therapy, on lipid transfer.
Thirty-three volunteer patients with type-2 diabetes mellitus were recruited from the outpatient services of the Hospital das Clínicas Heart Institute of the University of São Paulo Medical School (InCor - HCFMUSP) and the Diabetes Outpatient Clinic of the Division of Diabetes of the Discipline of Endocrinology and Metabolism of the
Thirty-four age-matched subjects were selected from the database of the Laboratory of Lipid Metabolism to serve as control group. No subject in this group had any comorbidity or was taking any medication. Those with fasting plasma glucose equal to or greater than 100 mg/dl were excluded.
All participants were interviewed about their medical history, with particular emphasis on past conditions and current medications. Laboratory tests were performed on a blood sample and two or three urine samples collected on different days to measure the urinary albumin/creatinine ratio.
The following parameters were measured in diabetic and control subjects: total cholesterol (TC), lipoprotein fractions (VLDL, LDL, and HDL), and fasting plasma glucose - in serum samples obtained after 12 hours of fasting - using the enzymatic colorimetric method (COD-PAD; Labtest). LDL-cholesterol was quantified using the Friedewald formula27: LDL-C = TC-(VLDL-C+HDL-C), in mg/dL, where VLDL-C is estimated by dividing triglyceride value by 5. Glycated hemoglobin (HbA1c) was measured in whole blood by immunoturbidimetric assay at the laboratory of InCor-HCFMUSP. The presence or absence of microalbuminuria was determined in first-morning spot urine samples by the nephelometric method at the
Urine samples were collected on different days, outside of menses for women, from patients with no symptoms of urinary tract infection. If the results of the two tests did not agree, a third sample was requested.
In earlier studies, the Laboratory of Lipid Metabolism of the Heart Institute (InCor-HCFMUSP) reproduced LDL metabolism using a synthetic emulsion with a lipid composition resembling that of the native LDL (LDE)29. The primary purpose of these studies was to use LDE to gain further insight into dyslipidemias. LDE is protein-free, but when it comes into contact with native lipoproteins it acquires apo E, which may be recognized by LDL receptors and, thereby, taken up by the cell29. This emulsion was prepared according to the technique described by Ginsburg et al30 and modified by Maranhão et al29.
Blood samples were collected after a 12-hour fast in EDTA-containing tubes (1.5 g/l), and plasma was obtained after centrifugation at 3.000 rpm for 10 minutes in a Sorval RT7 centrifuge. Two 200-
Statistical analysis was performed using SPSS 13.0 for Windows (Statistical Package for Social Sciences). Continuous variables were expressed as means and standard deviations, and categorical variables as percentages and absolute values.
The Kolmogorov-Smirnov test was performed for normal distribution. As variables were non-normally distributed, nonparametric tests were used. Differences between categorical variables were assessed by Fisher's exact test or the chi-square test.
Diabetic patients were compared with their controls, in addition to subgroups of diabetic patients, regarding the presence of microalbuminuria and use of statin and insulin. The Mann-Whitney test was performed to compare independent continuous variables, and Spearman's nonparametric test was used for correlations. Two tailed p values < 0.05 were considered statistically significant.
No difference was found in plasma total cholesterol, LDL-C, and HDL-C between the T2DM group and the control group,
There was no difference in cholesterol ester and triglyceride transfer from the nanoemulsion to HDL between diabetic patients and control subjects. As for free cholesterol and phospholipid transfers, these were approximately 30% and 22% higher in the diabetic group than in the control group, respectively (
Among diabetic patients, no significant differences were found regarding the presence or not of microalbuminuria. However, mean age was 13% higher in the microalbuminuric than in the non-microalbuminuric group (p = 0.008). Age, gender, hypertension prevalence, body mass index, use of statins or insulin, plus lipid and glucose levels did not differ between both groups.
Comparing the subgroups of microalbuminuric and normoalbuminuric diabetic patients aged over 55, it was possible to compare groups within the same age range. Once more, there was no significant difference in lipid transfer to HDL between these groups (
Using the urinary albumin-to-creatinine ratio as a continuous variable, a relationship was established between all variables by the Spearman correlation test. A higher urinary albumin/creatinine ratio was positively correlated with age and glycated hemoglobin and negatively correlated with free cholesterol transfer (
Regarding insulin therapy, age, gender, body mass index, hypertension prevalence, plus lipid and glucose levels were similar in the insulin and non-insulin treated groups. The frequency of statin use was also similar in both groups. Insulin therapy was associated with a 10% decrease in phospholipid transfer to HDL (p = 0.018) (
With respect to statin therapy, transfer of all lipids to HDL was significantly lower in the group receiving this drug class than in the group that was not (
The contribution of HDL-associated proteins to the generation, maturation, and reverse transport of cholesterol has been extensively studied. Cholesteryl ester transfer protein (CETP) modulates HDL levels and composition by mediating the exchange of neutral lipids (esterified cholesterol and triglycerides) between HDL and triglyceride-rich lipoproteins, in addition to promote phospholipid transfer to HDL. This protein also releases apolipoproteins from HDL in the presence of fatty acids31,32. Plasma phospholipid transfer protein (PLTP) itself can release apolipoproteins from HDL33. Cholesterol ester in HDL particles may originate from two sources: 1) esterification of HDL-free cholesterol, and 2) cholesterol ester of other lipoprotein34,35.
PLTP acts by transferring surface phospholipids to HDL and displacing apo AI from the particle's surface36,37. An important PLTP-mediated product of HDL particles are the small, lipid-poor pre-β-HDLs that act as initial acceptors of free cholesterol38,39. Apo E (but not apo AI) is capable of converting inactive PLTP into its active form40. This is a major characteristic that must be kept in mind, since LDE is devoid of apolipoproteins and acquires apo E when comes into contact with the blood.
This study provides a simple and fast manner to estimate HDL acceptor activity of all lipids using a single methodology. It allowed us to demonstrate that the uptake of phospholipids and free cholesterol by HDL is greater in diabetic patients, as compared to control subjects.
The finding of increased phospholipid transfer in diabetic patients, suggesting higher PLTP activity, is consistent with some reports in the literature13,14. Earlier studies have also shown an increase in plasma cholesteryl ester transfer15,16
The relationship between microalbuminuria and dyslipidemia in diabetic patients has been well explored. In this study, however, no differences were found in lipid transfer to HDL between normoalbuminuric and microalbuminuric T2DM patients. In the literature, no change in CETP activity was reported in microalbuminuric patients17.
Phospholipid transfer to HDL was lower in insulin-treated than in non-insulin-treated patients, with no changes in the other three lipids. PLTP is responsible for most phospholipid transfer to HDL and, to a lesser extent, facilitates the influx of free cholesterol to this lipoprotein. The present study suggests a possible correlation between insulin and PLTP activity. Most studies in the literature, though not all, that sought to investigate the relationship between insulin and PLTP activity have shown inhibition of the latter22-26.
Statin therapy was found to reduce the uptake of all lipids by HDL. Other studies have demonstrated that it decreases plasma CETP activity by three different mechanisms: 1) reducing plasma CETP mass18, 2) reducing lipoproteins with which HDL interacts19, and 3) possibly reducing CETP gene expression20. In a substudy of the DALI trial, statin therapy reduced plasma PLTP activity, despite increasing PLTP mass21. In the present study, the lipid acceptor activity of HDL was assessed. The other direction of lipid exchange between lipoproteins was not measured: the amount of lipids from HDL that is donated to the other lipoproteins is not known. Paradoxically, HDL acceptor activity was directly associated with risk factors of atherosclerosis, and statin therapy decreased all lipid transfer to HDL. This may be explained by the fact that the HDL with transfer characteristics that are more compatible with good markers is associated with less acquisition and loss of lipids and, therefore, would be a more stable HDL.
This study provides additional data regarding the complex and still incompletely understood mechanism of lipid exchange between lipoproteins. It also demonstrates that the use of insulin and statins is associated with functional aspects of HDL, as well as with its transfer proteins.
Diabetes mellitus is a condition that may have a broad clinical spectrum. An attempt was made to standardize the study population, excluding diabetic patients who were receiving exclusively non-pharmacological therapy, as well as those with evidence of renal failure or macroalbuminúria.
In spite of this, there was a degree of heterogeneity in the diabetic sample, in that diabetes mellitus was more advanced or more associated with comorbidities in some patients than in others. Moreover, part of the study sample was using insulin, statins, or anti-hypertensive drugs.
Ideally, any medication that might interfere with lipid metabolism or microalbuminuria should have been discontinued. That was not the case. Lipid measurements following discontinuation of statin therapy, therefore, were not performed, because we believe that such discontinuation would lead to a transient change in lipid levels in a population with cardiovascular risk factors without conferring any benefit. The same is true regarding anti-hypertensive and hypoglycemic drugs.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by CNPq (the National Council of Technological and Scientific Development), and FAPESP (the São Paulo State Research Foundation).
This article is part of the doctoral dissertation submitted by Gilson Soares Feitosa-Filho, from
FUNDAMENTO: La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es un factor de riesgo aislado para coronariopatía, principalmente cuando asociado a la microalbuminuria (MA). Alteraciones estructurales y funcionales de las lipoproteínas no están totalmente aclaradas en ese contexto. OBJETIVO: Evaluar no sólo la transferencia de lípidos hacia HDL (T) en pacientes DM2, sino también la asociación tanto con la presencia de la MA como con el tratamiento con estatina o insulina. MÉTODOS: Estudiamos a 33 pacientes con DM2 y 34 controles pareados para edad. Se incubó con plasma una nanoemulsión lipídica artificial radiomarcada con ³H-Triglicérido (TG) y 14C-colesterol libre (CL) o ³H-colesterol esterificado (CE) y 14C-fosfolípido (FL). Se procedió a la precipitación de la nanoemulsión y de las lipoproteínas, con excepción de la HDL, que tuvo su radioactividad contada. RESULTADOS: El valor de TFL (%) resultó mayor en el grupo con DM2 en confrontación con el grupo-control (25,2±3,2 y 19,7±3,2 respectivamente; p < 0,001); la TCL (%), por su vez, obtuvo los siguientes resultados: 9,1±2,7 y 6,3±1,5 respectivamente; p < 0,001. El diagnóstico de MA no se asoció a cambios de la propiedad de transferencia. El uso de la insulina se asoció al menor valor de TFL (%): 23,5±2,1 vs 26,1±3,3; p = 0,018. Ya el uso de la estatina se asoció a la baja del valor de todas las lipoproteínas - TCE (%): 3,5±0,9; TFL (%):23,8±2,0; TTG (%): 3,9±0,8; TCL (%):7,4±1,3 - si comparado al grupo que no usaba estatina (TCE (%):5,9±2,4; TFL (%):26,9±3,6; TTG (%):6,4±2,2; TCL (%):11,1±2,6). CONCLUSIONES: El DM2 aumentó la transferencia de lípidos de superficie hacia HDL, mientras que el uso de estatina disminuyó todas las transferencias de lípidos. La presencia de MA no se asoció a las alteraciones de las transferencias de lípidos.
Instituto do Coração (InCor), Hospital do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP), São Paulo, SP - Brasil
Correspondencia
La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es un importante factor de riesgo cardiovascular; la aterosclerosis es su principal causa de óbito. La dislipidemia del DM2 se caracteriza por la ocurrencia de hipertrigliceridemia, HDL colesterol reducido y incremento de la subfracción pequeña y densa de la LDL1,2. En pacientes con DM2, el uso de estatinas reduce mucho el riesgo de eventos cardiovasculares3-5. La presencia de microalbuminuria aumenta el mayor riesgo de desarrollarse la enfermedad arterial coronaria6,7.
Las clases de lipoproteínas se constituyen de diferentes proporciones de triglicéridos y colesterol esterificado en su núcleo hidrofóbico, además de fosfolípidos y colesterol libre en su superficie anfipática, donde están las apolipoproteínas. La HDL presenta actividad antiaterosclerótica, pero todavía no se comprendió totalmente el mecanismo por lo que ella ejerce ese rol. El transporte reverso de colesterol es el principal mecanismo previsto. No obstante, otros mecanismos, tales como acciones antiinflamatorias, antitrombóticas y antioxidativas8,9, parecen participar en la función protectora de la HDL.
Se denomina como transporte reverso de colesterol el proceso en el que se remueve el exceso de colesterol de los tejidos periféricos para excreción desde el hígado. La lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT) participa en ese transporte al catalizar la esterificación del colesterol, lo que permite su desplazamiento hacia el núcleo hidrofóbico de la partícula.
Las lipoproteínas plasmáticas intercambian lípidos constantemente, proceso éste facilitado por las proteínas de transferencia, tales como las proteínas de transferencia de éster de colesterol (CETP) y de fosfolípidos (PLTP). La primera media el intercambio de ésteres de colesterol, triglicéridos y fosfolípidos entre las lipoproteínas10; la segunda auxilia la transferencia de fosfolípidos y colesterol de otras lipoproteínas ricas hacia la HDL11,12.
Los pacientes con DM2 parecen presentar mayor actividad de PLTP13,14 así como mayor transferencia de ésteres de colesterol15,16. No hay una definición respecto a la participación de la microalbuminuria en la actividad de las proteínas de transferencia17. A su vez, algunos estudios evidencian reducción tanto en la actividad de CETP como en la de PLTP, a través del uso de estatinas18-21 e insulina22-26.
Las transferencias lipídicas también dependen de diversos otros factores. La concentración de cada subclase de lipoproteína interfiere en esos intercambios, una vez que éstos dependen de las colisiones de las partículas lipoproteicas. Las composiciones lipídica y proteica de la partícula, así como las concentraciones de diversas otras proteínas plasmáticas, pueden influenciar en el proceso.
La compleja relación entre transferencia lipídica y aterogénesis todavía no está aclarada. En el metabolismo plasmático de la HDL, las transferencias lipídicas ejercen un rol fundamental, en la medida que remodelan constantemente las partículas de las lipoproteínas y, con ello, interfieren en sus diversos aspectos funcionales.
El objetivo de este estudio fue evaluar, en pacientes con DM2, la transferencia simultánea hacia la HDL de los cuatro principales lípidos que constituyen su estructura: colesterol libre, éster de colesterol, triglicéridos y fosfolípidos. Además de ello, verificar la influencia de la presencia de la microalbuminuria y del tratamiento con estatina o insulina sobre las transferencias lipídicas.
Se seleccionaron a 33 pacientes voluntarios portadores de diabetes mellitus tipo 2 en los ambulatorios del Instituto do Coração del Hospital de Clínicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (InCor-HCFMUSP) y del Ambulatorio de Diabetes del Servicio de Diabetes de la Disciplina de Endocrinología y Enfermedades Metabólicas del Hospital de Clínicas de la Universidad de São Paulo. Se excluyeron primeramente a los individuos en uso de inhibidores de proteasas, drogas inmunosupresoras, corticoides; también los transplantados, cirróticos, portadores de neoplasias, pacientes con tiroidopatías y, por último, los portadores de creatinina sérica > 1,5 mg/dl. Todos los pacientes firmaron un término de consentimiento informado. Se procedieron las colectas de sangre y de orina en el Laboratorio de Metabolismo de Lípidos, en el InCor. Los ensayos funcionales de la HDL (transferencia de lípidos) se realizaron en ese mismo laboratorio. Se analizaron las muestras urinarias en el Laboratorio Central del Hospital de Clínicas, mientras que las determinaciones bioquímicas de las muestras de sangre se realizaron en el Laboratorio del InCor.
Para componerse el grupo control se seleccionaron a 34 individuos que forman parte de un banco de datos del Laboratorio de Metabolismo de Lípidos, pareados por edad. Esos individuos no presentan comorbidades y tampoco utilizan medicaciones. De este grupo, se excluyeron a todos los individuos que tuvieran glucemia de ayuno mayor o igual que 100 mg/dl.
Se orientó la evaluación de los participantes a partir de historia clínica, en cuyo análisis se enfatizó la búsqueda por antecedentes patológicos y medicaciones en uso. Ya la evaluación laboratorial se condujo tanto a través de colecta de sangre como por dos o tres recolecciones de muestra urinaria en días diferentes para medición de la relación de microalbuminuria/creatininuria.
Se realizaron las determinaciones bioquímicas de los pacientes diabéticos e individuos control –colesterol total (CT), fracciones (VLDL, LDL y HDL), triglicéridos (TG) y glucemia de ayuno– en muestras de suero obtenidas tras 12 horas de ayuno a través del método colorimétrico y enzimático, COD-PAD (Labtest). Se determinó el colesterol de LDL por medio de la fórmula de Friedewald27:
Se determinó la microalbuminuria a partir de la primera muestra aislada de orina de la mañana, a través del método de nefelometría, en el Laboratorio Central del Hospital de Clínicas. En la misma muestra se midió los niveles de la creatinina urinaria. Así, el valor de la relación albumina/creatinina urinaria se expresaba en mcg/mg de creatinina. Se consideraron normales los pacientes con relación albuminuria/creatininuria inferior a 30 mcg/mg, mientras que se definió el valor considerado normal para la microalbuminuria entre 30 y 300 mcg/mg, conforme apuntado por
En estudios previos, el Laboratorio de Metabolismo de Lípidos de InCor-HCFMUSP ha reproducido el metabolismo de la LDL por medio de una emulsión creada artificialmente, con composición lipídica semejante a la de la LDL natural (LDE)29. El objetivo principal de esos estudios ha sido el uso de la LDE en la investigación de las dislipidemias. La LDE no tiene proteína, pero, al entrar en contacto con las lipoproteínas naturales, adquiere apo E. Ésta puede ser reconocida por el receptor de la LDL, siendo por lo tanto captada por la célula29. Se preparó la LDE según la técnica descripta por Ginsburg et al.30 y modificada por Maranhão et al.29.
Se recolectaron muestras de los pacientes tras ayuno de 12 horas, en EDTA (1,5 g/l), y se obtuvo el plasma luego de 10 minutos de centrifugación, a 3.000 rpm, en centrífuga Sorval RT7. Se incubaron 2 muestras de 200
Se produjo dicho análisis por medio del programa SPSS (
Para probarse la normalidad de la distribución de las variables, se aplicó la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Como las variables presentaban distribución no normal, se utilizaron pruebas no paramétricas. Ya para evaluarse la diferencia entre las variables categóricas, se realizó la prueba exacta de Fisher o la prueba Chi-cuadrado.
Se compararon, entonces, no sólo los diabéticos y sus respectivos controles, sino también subgrupos entre los diabéticos, compuestos de acuerdo con la presencia de microalbuminuria, el uso de estatina y la utilización de insulina. Se realizaron las comparaciones de variables continuas independientes por medio de la prueba de Mann-Whitney. Para probar asociaciones, se utilizó la prueba no paramétrica de Spearman. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de p < 0,05, a dos colas.
En la
No hubo diferencia en las concentraciones plasmáticas de colesterol total, LDL-C y HDL-C entre el grupo de pacientes con DM2 y el grupo control, p > 0,05. La concentración plasmática de los triglicéridos en estos pacientes se mostró el 38% mayor (p < 0,001), cuando comparados con los individuos control. La glucemia de ayuno fue el 44% mayor en el grupo DM2 (p < 0,001). También el índice de masa corporal resultó el 19% mayor entre los pacientes DM2 (p < 0,001).
En la
No hubo diferencia en la transferencia de éster de colesterol y triglicéridos de la nanoemulsión hacia la HDL entre los pacientes diabéticos, si comparados a los individuos control. Con respecto a la transferencia de colesterol libre y fosfolípidos, éstas se presentaron aproximadamente el 30% y el 22% mayor, respectivamente, en el grupo de los pacientes diabéticos, si comparados al grupo control (p < 0,001).
Entre los pacientes diabéticos, no se notaron diferencias significativas respecto a la presencia o ausencia de MA. Sin embargo, el grupo con MA tenía un promedio de edad el 13% mayor que el grupo sin esa característica (p = 0,008). Los factores edad, sexo, prevalencia de hipertensión arterial, índice de masa corporal, uso de estatina o insulina, perfil lipídico o glucídico no se mostraban diferentes entre ambos grupos.
Al compararse el mismo grupo con MA con los pacientes sin MA con edad superior a 55 años, fue posible una comparación entre grupos con edades semejantes. Una vez más, no hubo ninguna diferencia en la transferencia lipídica hacia HDL (
Con la utilización de la razón microalbuminuria/creatininuria como variable continua, se estableció la correlación de Spearman con todas las variables continuas analizadas. De ese modo, una mayor razón microalbuminuria/creatininuria se correlacionó positivamente con edad y hemoglobina glicosilada, mientras que tuvo correlación negativa con transferencia de colesterol libre (
Con relación al uso o no de insulinoterapia, los grupos presentaban edad, sexo, índice de masa corporal, prevalencia de hipertensión arterial, perfil lipídico y glucídico semejantes. Ambos grupos presentaban, aún, una frecuencia de uso de estatinas también semejantes. El uso de insulina fue un factor que se relacionó a una transferencia el 10% menor de fosfolípidos hacia HDL (p = 0,018) (
En lo que toca al uso o no de estatina, se percibió que el grupo tratado con esa medicación reveló una transferencia significativamente menor de todos los lípidos hacia HDL, si comparado al que no usaba estatina (
La contribución de las proteínas asociadas a la HDL al proceso de generación, madurez y transporte reverso de colesterol ha sido extensivamente estudiada. La CETP modula los niveles de HDL, así como su composición, al mediar el intercambio de lípidos neutros (colesterol esterificado y triglicéridos) entre HDL y lipoproteínas ricas en triglicéridos, además de auxiliar en la transferencia de fosfolípidos hacia la HDL. La CETP se muestra capaz también de liberar apolipoproteínas a partir de la HDL cuando en presencia de ácidos graxos31,32. La propia PLTP también puede liberar apolipoproteínas de la HDL33. El colesterol éster presente en la HDL puede tener dos fuentes: 1. la esterificación de colesterol libre de la HDL y 2. desde el colesterol éster de otra lipoproteína34,35.
La PLTP actúa en la transferencia de fosfolípidos de superficie hacia HDL y eventualmente en el desplazamiento de apo AI de las superficies de las partículas36,37. Las pre-B-HDL pequeñas y pobres en lípidos –un importante producto de la HDL mediado por la PLTP–, actúan como aceptores iniciales de colesterol libre38,39. La apo E (y no la apo AI) se revela capaz de convertir PLTP inactiva en su forma activa40. Esta es una importante característica a acordarse, visto que la LDE no posee apo y adquiere la apo E cuando en contacto con la sangre.
El presente estudio abre la posibilidad de estimarse, por medio de una única metodología, la actividad aceptora de la HDL de todos los lípidos de forma simple y ágil. Con ello, fue posible demostrar que existe mayor captación de fosfolípidos y colesterol libre por la HDL en los pacientes diabéticos en comparación con individuos control.
El hallazgo de mayor transferencia de lípidos de superficie en los pacientes diabéticos sugiere mayor actividad de PLTP, lo que está de acuerdo con algunos resultados registrados en la literatura13,14. Estudios previos muestran también incremento de las tasas de transferencia de colesterol éster plasmático15,16.
La relación entre microalbuminuria y dislipidemia en pacientes con diabetes mellitus ha sido bien explorada. En este estudio, sin embargo, no se encontraron diferencias en la transferencia de lípidos hacia HDL entre pacientes con DM2, con o sin microalbuminuria. En la literatura, la actividad de CETP no se mostró alterada en pacientes con microalbuminuria17.
Entre los pacientes usuarios de insulina, la transferencia de fosfolípidos hacia HDL resultó menor en relación a los no usuarios, sin que hubiera alteración en la transferencia de los demás lípidos. La PLTP constituye la principal responsable por la transferencia de fosfolípidos hacia la HDL y auxilia con menor intensidad la transferencia de colesterol libre hacia esta lipoproteína. El presente estudio sugiere, por tanto, una posible correlación entre insulina y actividad de PLTP. En la literatura, aunque no hay unanimidad, la mayoría de los estudios que se propusieron a investigar la relación entre insulina y actividad de PLTP muestran una inhibición de ésta última22-26.
La estatina, por su parte, redujo la captación de todos los lípidos por la HDL. La disminución de la actividad de CETP con uso de estatina ha sido observada en otros estudios. Ella logra dicha disminución a través de tres mecanismos: 1. reducción de la masa de CETP18; 2. reducción de las lipoproteínas con las que la HDL interactúa19; y también 3. posiblemente por reducción en la expresión del gen CETP20. Un subestudio del estudio DALI evidenció que el tratamiento con estatina resulta capaz de reducir la actividad de PLTP, aunque aumenta la masa de PLTP21.
En este estudio, se evaluó la actividad aceptora de lípidos de la HDL. El otro sentido del intercambio de lípidos entre las lipoproteínas no se midió: no se sabe qué porcentaje de lípidos de la HDL se transfirió para las demás lipoproteínas. Como una paradoja, la actividad aceptora de la HDL se asoció directamente a factores de riesgo de aterosclerosis, mientras que el uso de estatinas redujo la transferencia de todos os lípidos hacia HDL. Una hipótesis para justificarse el hecho reside en que la HDL con características de transferencias más compatibles con buenos marcadores estaría asociada a la menor adquisición y pérdida de lípidos, lo que la caracteriza, por lo tanto, como una HDL más estable.
Este estudio acrecienta datos al complejo y todavía no totalmente aclarado mecanismo de intercambio de lípidos entre lipoproteínas. A la vez, permite la identificación de la asociación del uso de insulina y estatinas con aspectos funcionales de la HDL, así como sus proteínas de transferencia.
La diabetes mellitus es una patología que puede presentar un espectro clínico bastante amplio. En este sentido, se intentó uniformizarse la población estudiada, con la exclusión no sólo de pacientes diabéticos bajo tratamiento exclusivamente no farmacológico, sino también de aquellos que presentaran evidencias de insuficiencia renal o macroalbuminuria.
A pesar de ello, se reconoce como limitación al estudio un relativo grado de heterogeneidad de la población de los diabéticos estudiados: algunos presentan enfermedad más avanzada o más asociada a comorbidades que otros. Además de eso, se observó el uso de insulina, estatina o antihipertensivos en parte de la población estudiada.
Idealmente, se debería proceder a la suspensión de medicaciones que interfirieran en el metabolismo lipídico o en la microalbuminuria. El hecho de que no se haya realizado los análisis lipídicos tras un período de descontinuación de la estatina se debió a la comprensión de que ocurriría un descontrol transitorio del perfil lipídico en una población con factores de riesgo cardiovascular, sin que ningún beneficio pudiera provenir de dicha suspensión. Raciocinio semejante explica que no se hayan suspendido antihipertensivos o hipoglucemiantes de los pacientes.
Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.
El presente estudio fue financiado por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) y por la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo (FAPESP).
Este artículo forma parte de tesis de doctorado de Gilson Soares Feitosa-Filho, por el Programa de Postgrado en Cardiología del InCor-HCFMUSP.